CN118043350A - 抗vegf a和vegf c双特异性抗体及其用途 - Google Patents
抗vegf a和vegf c双特异性抗体及其用途 Download PDFInfo
- Publication number
- CN118043350A CN118043350A CN202280055810.XA CN202280055810A CN118043350A CN 118043350 A CN118043350 A CN 118043350A CN 202280055810 A CN202280055810 A CN 202280055810A CN 118043350 A CN118043350 A CN 118043350A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- amino acid
- acid sequence
- seq
- antibody
- polypeptide
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 108010019530 Vascular Endothelial Growth Factors Proteins 0.000 title claims abstract description 57
- 102000005789 Vascular Endothelial Growth Factors Human genes 0.000 title claims abstract 7
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims abstract description 190
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims abstract description 182
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims abstract description 179
- 108010003723 Single-Domain Antibodies Proteins 0.000 claims abstract description 140
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 57
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 53
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 48
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims abstract description 37
- 108091008324 binding proteins Proteins 0.000 claims abstract description 33
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims abstract description 33
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims abstract description 19
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims abstract description 19
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 claims abstract description 12
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 claims abstract description 12
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 claims abstract description 12
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 195
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims description 179
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 83
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims description 82
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims description 82
- 102000009524 Vascular Endothelial Growth Factor A Human genes 0.000 claims description 81
- 108010073929 Vascular Endothelial Growth Factor A Proteins 0.000 claims description 81
- 101000808011 Homo sapiens Vascular endothelial growth factor A Proteins 0.000 claims description 73
- 102100035360 Cerebellar degeneration-related antigen 1 Human genes 0.000 claims description 69
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims description 58
- 102000023732 binding proteins Human genes 0.000 claims description 32
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 claims description 31
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 claims description 31
- 206010029113 Neovascularisation Diseases 0.000 claims description 29
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 claims description 26
- 101000851007 Homo sapiens Vascular endothelial growth factor receptor 2 Proteins 0.000 claims description 25
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 21
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 18
- 102000058223 human VEGFA Human genes 0.000 claims description 17
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims description 15
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 13
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 12
- 108091008605 VEGF receptors Proteins 0.000 claims description 10
- 230000004927 fusion Effects 0.000 claims description 10
- 108091006020 Fc-tagged proteins Proteins 0.000 claims description 9
- 208000022873 Ocular disease Diseases 0.000 claims description 8
- 101000851018 Homo sapiens Vascular endothelial growth factor receptor 1 Proteins 0.000 claims description 7
- 102000009484 Vascular Endothelial Growth Factor Receptors Human genes 0.000 claims description 7
- 230000012010 growth Effects 0.000 claims description 6
- 102100033178 Vascular endothelial growth factor receptor 1 Human genes 0.000 claims description 5
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 claims description 5
- 108010054477 Immunoglobulin Fab Fragments Proteins 0.000 claims description 4
- 102000001706 Immunoglobulin Fab Fragments Human genes 0.000 claims description 4
- 206010064930 age-related macular degeneration Diseases 0.000 claims description 4
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 4
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 claims description 4
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims description 4
- 208000002780 macular degeneration Diseases 0.000 claims description 4
- 238000012217 deletion Methods 0.000 claims description 3
- 230000037430 deletion Effects 0.000 claims description 3
- 238000003780 insertion Methods 0.000 claims description 3
- 230000037431 insertion Effects 0.000 claims description 3
- 230000002265 prevention Effects 0.000 claims description 3
- 206010055665 Corneal neovascularisation Diseases 0.000 claims description 2
- 206010012689 Diabetic retinopathy Diseases 0.000 claims description 2
- 206010038903 Retinal vascular occlusion Diseases 0.000 claims description 2
- 201000000159 corneal neovascularization Diseases 0.000 claims description 2
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 claims description 2
- 230000033115 angiogenesis Effects 0.000 abstract description 4
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 abstract 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 110
- 101000742596 Homo sapiens Vascular endothelial growth factor C Proteins 0.000 description 109
- 102100038232 Vascular endothelial growth factor C Human genes 0.000 description 88
- 102100039037 Vascular endothelial growth factor A Human genes 0.000 description 56
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 46
- 102100033177 Vascular endothelial growth factor receptor 2 Human genes 0.000 description 43
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 33
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 32
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 29
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 29
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 28
- 108010053099 Vascular Endothelial Growth Factor Receptor-2 Proteins 0.000 description 26
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 26
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 25
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 24
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 24
- 102000009520 Vascular Endothelial Growth Factor C Human genes 0.000 description 23
- 108010073923 Vascular Endothelial Growth Factor C Proteins 0.000 description 23
- 101100112922 Candida albicans CDR3 gene Proteins 0.000 description 22
- 108010047041 Complementarity Determining Regions Proteins 0.000 description 22
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 22
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 22
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 21
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 18
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 18
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 description 18
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 17
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 17
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 17
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 17
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 16
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 15
- GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N fluorescein Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 15
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 15
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 15
- NFGXHKASABOEEW-UHFFFAOYSA-N 1-methylethyl 11-methoxy-3,7,11-trimethyl-2,4-dodecadienoate Chemical compound COC(C)(C)CCCC(C)CC=CC(C)=CC(=O)OC(C)C NFGXHKASABOEEW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- UQLDLKMNUJERMK-UHFFFAOYSA-L di(octadecanoyloxy)lead Chemical compound [Pb+2].CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O.CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O UQLDLKMNUJERMK-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 14
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 14
- 102000058238 human VEGFC Human genes 0.000 description 13
- 101000851030 Homo sapiens Vascular endothelial growth factor receptor 3 Proteins 0.000 description 12
- 102100033179 Vascular endothelial growth factor receptor 3 Human genes 0.000 description 12
- 241001416177 Vicugna pacos Species 0.000 description 12
- 229910002092 carbon dioxide Inorganic materials 0.000 description 12
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 12
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 12
- 210000003556 vascular endothelial cell Anatomy 0.000 description 11
- 108010053100 Vascular Endothelial Growth Factor Receptor-3 Proteins 0.000 description 10
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 10
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 10
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 10
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 9
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 9
- 108010081667 aflibercept Proteins 0.000 description 9
- 239000001569 carbon dioxide Substances 0.000 description 9
- 210000002889 endothelial cell Anatomy 0.000 description 9
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 9
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 9
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 9
- 241000282832 Camelidae Species 0.000 description 8
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 8
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 8
- 102000016663 Vascular Endothelial Growth Factor Receptor-3 Human genes 0.000 description 8
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 8
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 8
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 8
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 8
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 8
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 8
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 8
- 230000002792 vascular Effects 0.000 description 8
- 208000005590 Choroidal Neovascularization Diseases 0.000 description 7
- 206010060823 Choroidal neovascularisation Diseases 0.000 description 7
- 230000009824 affinity maturation Effects 0.000 description 7
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 7
- 210000004602 germ cell Anatomy 0.000 description 7
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 7
- 238000012014 optical coherence tomography Methods 0.000 description 7
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 7
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 7
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 7
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 7
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 7
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 6
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 6
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 6
- 238000010609 cell counting kit-8 assay Methods 0.000 description 6
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 6
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 6
- 230000036541 health Effects 0.000 description 6
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 6
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 6
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 6
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 6
- 238000002823 phage display Methods 0.000 description 6
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 6
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 6
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 6
- 108010075254 C-Peptide Proteins 0.000 description 5
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 5
- 102000006496 Immunoglobulin Heavy Chains Human genes 0.000 description 5
- 108010019476 Immunoglobulin Heavy Chains Proteins 0.000 description 5
- 229920002873 Polyethylenimine Polymers 0.000 description 5
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 5
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 5
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 5
- 238000001516 cell proliferation assay Methods 0.000 description 5
- 238000011161 development Methods 0.000 description 5
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 5
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 5
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 5
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 5
- 230000002207 retinal effect Effects 0.000 description 5
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 5
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 4
- 241000282836 Camelus dromedarius Species 0.000 description 4
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 4
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 4
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 description 4
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 description 4
- 206010027476 Metastases Diseases 0.000 description 4
- 108010087230 Sincalide Proteins 0.000 description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 230000003042 antagnostic effect Effects 0.000 description 4
- 210000001106 artificial yeast chromosome Anatomy 0.000 description 4
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 4
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 4
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 4
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 4
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 4
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 4
- 239000006185 dispersion Substances 0.000 description 4
- 229940051306 eylea Drugs 0.000 description 4
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 description 4
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 4
- 238000005305 interferometry Methods 0.000 description 4
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 4
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 4
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 4
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 4
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 4
- 230000009401 metastasis Effects 0.000 description 4
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 4
- 229960003876 ranibizumab Drugs 0.000 description 4
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 4
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 4
- IZTQOLKUZKXIRV-YRVFCXMDSA-N sincalide Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(N)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O)C1=CC=C(OS(O)(=O)=O)C=C1 IZTQOLKUZKXIRV-YRVFCXMDSA-N 0.000 description 4
- 241000894007 species Species 0.000 description 4
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 4
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 4
- -1 (G4S) n or G (G4S) n Chemical compound 0.000 description 3
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 206010061818 Disease progression Diseases 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 3
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 3
- 102000009786 Immunoglobulin Constant Regions Human genes 0.000 description 3
- 108010009817 Immunoglobulin Constant Regions Proteins 0.000 description 3
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 3
- 241000699660 Mus musculus Species 0.000 description 3
- 102100024616 Platelet endothelial cell adhesion molecule Human genes 0.000 description 3
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 3
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 3
- 208000017442 Retinal disease Diseases 0.000 description 3
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 3
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 3
- 229960002833 aflibercept Drugs 0.000 description 3
- 238000002583 angiography Methods 0.000 description 3
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 description 3
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 3
- 239000002981 blocking agent Substances 0.000 description 3
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 3
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 3
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 3
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 3
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 3
- 239000012897 dilution medium Substances 0.000 description 3
- 230000005750 disease progression Effects 0.000 description 3
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 3
- 230000009977 dual effect Effects 0.000 description 3
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 3
- RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N imidazole Natural products C1=CNC=N1 RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 3
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 3
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 3
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 3
- 108020001756 ligand binding domains Proteins 0.000 description 3
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 3
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 3
- 229940076783 lucentis Drugs 0.000 description 3
- 230000035168 lymphangiogenesis Effects 0.000 description 3
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 3
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 3
- 238000011580 nude mouse model Methods 0.000 description 3
- 238000004091 panning Methods 0.000 description 3
- 230000000649 photocoagulation Effects 0.000 description 3
- 238000012809 post-inoculation Methods 0.000 description 3
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 description 3
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 3
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 3
- 230000004268 retinal thickening Effects 0.000 description 3
- 238000002791 soaking Methods 0.000 description 3
- 230000008719 thickening Effects 0.000 description 3
- 230000004614 tumor growth Effects 0.000 description 3
- 210000003606 umbilical vein Anatomy 0.000 description 3
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 2
- ZNVLEAPAWPQEIC-UHFFFAOYSA-N 6-aminoquinoline-5,8-dione Chemical group C1=CC=C2C(=O)C(N)=CC(=O)C2=N1 ZNVLEAPAWPQEIC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 2
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 2
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 2
- 238000000116 DAPI staining Methods 0.000 description 2
- 101100372758 Danio rerio vegfaa gene Proteins 0.000 description 2
- 238000012286 ELISA Assay Methods 0.000 description 2
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 241000701959 Escherichia virus Lambda Species 0.000 description 2
- 108010067060 Immunoglobulin Variable Region Proteins 0.000 description 2
- 102000017727 Immunoglobulin Variable Region Human genes 0.000 description 2
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- 241000713666 Lentivirus Species 0.000 description 2
- 241000282567 Macaca fascicularis Species 0.000 description 2
- 241000282560 Macaca mulatta Species 0.000 description 2
- 102000006833 Multifunctional Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108010047290 Multifunctional Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 2
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 2
- 201000010183 Papilledema Diseases 0.000 description 2
- 206010038886 Retinal oedema Diseases 0.000 description 2
- 206010038923 Retinopathy Diseases 0.000 description 2
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 2
- 108010053096 Vascular Endothelial Growth Factor Receptor-1 Proteins 0.000 description 2
- 102000016549 Vascular Endothelial Growth Factor Receptor-2 Human genes 0.000 description 2
- 101150030763 Vegfa gene Proteins 0.000 description 2
- 101150036482 Vegfc gene Proteins 0.000 description 2
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 2
- 108010076089 accutase Proteins 0.000 description 2
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 2
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 2
- 230000002491 angiogenic effect Effects 0.000 description 2
- 230000003510 anti-fibrotic effect Effects 0.000 description 2
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 description 2
- 229960000397 bevacizumab Drugs 0.000 description 2
- 239000012148 binding buffer Substances 0.000 description 2
- 239000007894 caplet Substances 0.000 description 2
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 2
- 230000012292 cell migration Effects 0.000 description 2
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 2
- 210000003161 choroid Anatomy 0.000 description 2
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 2
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 2
- 239000013068 control sample Substances 0.000 description 2
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 2
- 229940127089 cytotoxic agent Drugs 0.000 description 2
- 238000013461 design Methods 0.000 description 2
- 238000013400 design of experiment Methods 0.000 description 2
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 2
- 238000006471 dimerization reaction Methods 0.000 description 2
- 239000002612 dispersion medium Substances 0.000 description 2
- 230000003511 endothelial effect Effects 0.000 description 2
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 2
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 2
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 2
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 238000007490 hematoxylin and eosin (H&E) staining Methods 0.000 description 2
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- 230000002998 immunogenetic effect Effects 0.000 description 2
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 2
- 239000003018 immunosuppressive agent Substances 0.000 description 2
- 229940124589 immunosuppressive drug Drugs 0.000 description 2
- 238000000099 in vitro assay Methods 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 2
- 239000007928 intraperitoneal injection Substances 0.000 description 2
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 2
- 238000003670 luciferase enzyme activity assay Methods 0.000 description 2
- 230000001926 lymphatic effect Effects 0.000 description 2
- 210000005073 lymphatic endothelial cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 2
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 2
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 2
- 230000003278 mimic effect Effects 0.000 description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 2
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 2
- 238000000465 moulding Methods 0.000 description 2
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 description 2
- 238000007857 nested PCR Methods 0.000 description 2
- 239000004090 neuroprotective agent Substances 0.000 description 2
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 2
- 231100000915 pathological change Toxicity 0.000 description 2
- 230000036285 pathological change Effects 0.000 description 2
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 description 2
- 238000011321 prophylaxis Methods 0.000 description 2
- 238000000159 protein binding assay Methods 0.000 description 2
- 230000005180 public health Effects 0.000 description 2
- 238000002601 radiography Methods 0.000 description 2
- 230000000754 repressing effect Effects 0.000 description 2
- 210000001525 retina Anatomy 0.000 description 2
- 201000011195 retinal edema Diseases 0.000 description 2
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 2
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 2
- 238000001542 size-exclusion chromatography Methods 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 2
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 2
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 2
- 230000001256 tonic effect Effects 0.000 description 2
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 2
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 2
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 2
- 239000001993 wax Substances 0.000 description 2
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000009792 yinqiao Substances 0.000 description 2
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- BJHCYTJNPVGSBZ-YXSASFKJSA-N 1-[4-[6-amino-5-[(Z)-methoxyiminomethyl]pyrimidin-4-yl]oxy-2-chlorophenyl]-3-ethylurea Chemical compound CCNC(=O)Nc1ccc(Oc2ncnc(N)c2\C=N/OC)cc1Cl BJHCYTJNPVGSBZ-YXSASFKJSA-N 0.000 description 1
- WLKSPGHQGFFKGE-UHFFFAOYSA-N 1-chloropropan-2-yl n-(3-chlorophenyl)carbamate Chemical compound ClCC(C)OC(=O)NC1=CC=CC(Cl)=C1 WLKSPGHQGFFKGE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IIZPXYDJLKNOIY-JXPKJXOSSA-N 1-palmitoyl-2-arachidonoyl-sn-glycero-3-phosphocholine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C)OC(=O)CCC\C=C/C\C=C/C\C=C/C\C=C/CCCCC IIZPXYDJLKNOIY-JXPKJXOSSA-N 0.000 description 1
- NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 2,3-bis(butanoylsulfanyl)propyl butanoate Chemical compound CCCC(=O)OCC(SC(=O)CCC)CSC(=O)CCC NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DLZKEQQWXODGGZ-KCJUWKMLSA-N 2-[[(2r)-2-[[(2s)-2-amino-3-(4-hydroxyphenyl)propanoyl]amino]propanoyl]amino]acetic acid Chemical compound OC(=O)CNC(=O)[C@@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 DLZKEQQWXODGGZ-KCJUWKMLSA-N 0.000 description 1
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 4',6-Diamino-2-phenylindol Chemical compound C1=CC(C(=N)N)=CC=C1C1=CC2=CC=C(C(N)=N)C=C2N1 FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LGZKGOGODCLQHG-CYBMUJFWSA-N 5-[(2r)-2-hydroxy-2-(3,4,5-trimethoxyphenyl)ethyl]-2-methoxyphenol Chemical compound C1=C(O)C(OC)=CC=C1C[C@@H](O)C1=CC(OC)=C(OC)C(OC)=C1 LGZKGOGODCLQHG-CYBMUJFWSA-N 0.000 description 1
- 241001075517 Abelmoschus Species 0.000 description 1
- 235000002198 Annona diversifolia Nutrition 0.000 description 1
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 101100381481 Caenorhabditis elegans baz-2 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000282465 Canis Species 0.000 description 1
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- 206010008342 Cervix carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 241000282552 Chlorocebus aethiops Species 0.000 description 1
- 108091062157 Cis-regulatory element Proteins 0.000 description 1
- 208000001333 Colorectal Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 241000699800 Cricetinae Species 0.000 description 1
- 230000006820 DNA synthesis Effects 0.000 description 1
- 241000702421 Dependoparvovirus Species 0.000 description 1
- 241000283086 Equidae Species 0.000 description 1
- 206010015548 Euthanasia Diseases 0.000 description 1
- 101150009958 FLT4 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 1
- 206010016654 Fibrosis Diseases 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010093488 His-His-His-His-His-His Proteins 0.000 description 1
- 101000595923 Homo sapiens Placenta growth factor Proteins 0.000 description 1
- 101000742579 Homo sapiens Vascular endothelial growth factor B Proteins 0.000 description 1
- 101000742599 Homo sapiens Vascular endothelial growth factor D Proteins 0.000 description 1
- 102000018071 Immunoglobulin Fc Fragments Human genes 0.000 description 1
- 108010091135 Immunoglobulin Fc Fragments Proteins 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 241000282838 Lama Species 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012515 MabSelect SuRe Substances 0.000 description 1
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 1
- 101100297639 Mus musculus Pigf gene Proteins 0.000 description 1
- 101600105505 Mus musculus Vascular endothelial growth factor C (isoform 1) Proteins 0.000 description 1
- 206010030113 Oedema Diseases 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 108090000526 Papain Proteins 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- QGMRQYFBGABWDR-UHFFFAOYSA-M Pentobarbital sodium Chemical compound [Na+].CCCC(C)C1(CC)C(=O)NC(=O)[N-]C1=O QGMRQYFBGABWDR-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 102000057297 Pepsin A Human genes 0.000 description 1
- 108090000284 Pepsin A Proteins 0.000 description 1
- 102100035194 Placenta growth factor Human genes 0.000 description 1
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 1
- 108010040201 Polymyxins Proteins 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 1
- 241000288906 Primates Species 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 1
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 1
- 241000700157 Rattus norvegicus Species 0.000 description 1
- 101100372762 Rattus norvegicus Flt1 gene Proteins 0.000 description 1
- 102000004278 Receptor Protein-Tyrosine Kinases Human genes 0.000 description 1
- 108090000873 Receptor Protein-Tyrosine Kinases Proteins 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 1
- 206010039509 Scab Diseases 0.000 description 1
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 1
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000035896 Twin-reversed arterial perfusion sequence Diseases 0.000 description 1
- 208000006105 Uterine Cervical Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000016548 Vascular Endothelial Growth Factor Receptor-1 Human genes 0.000 description 1
- 102100038217 Vascular endothelial growth factor B Human genes 0.000 description 1
- 102100038234 Vascular endothelial growth factor D Human genes 0.000 description 1
- 208000000208 Wet Macular Degeneration Diseases 0.000 description 1
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 1
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 1
- 239000003070 absorption delaying agent Substances 0.000 description 1
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 1
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 1
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000006687 ag medium Substances 0.000 description 1
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 239000005557 antagonist Substances 0.000 description 1
- 230000009830 antibody antigen interaction Effects 0.000 description 1
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 1
- 210000000702 aorta abdominal Anatomy 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010420 art technique Methods 0.000 description 1
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 1
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 1
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 1
- 230000005784 autoimmunity Effects 0.000 description 1
- 229940120638 avastin Drugs 0.000 description 1
- 210000001099 axilla Anatomy 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002146 bilateral effect Effects 0.000 description 1
- 238000013357 binding ELISA Methods 0.000 description 1
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 1
- 238000001574 biopsy Methods 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 210000004204 blood vessel Anatomy 0.000 description 1
- 210000000481 breast Anatomy 0.000 description 1
- 210000005252 bulbus oculi Anatomy 0.000 description 1
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 239000012830 cancer therapeutic Substances 0.000 description 1
- 238000000423 cell based assay Methods 0.000 description 1
- 210000003855 cell nucleus Anatomy 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 1
- 230000005754 cellular signaling Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 201000010881 cervical cancer Diseases 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- LGZKGOGODCLQHG-UHFFFAOYSA-N combretastatin Natural products C1=C(O)C(OC)=CC=C1CC(O)C1=CC(OC)=C(OC)C(OC)=C1 LGZKGOGODCLQHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004590 computer program Methods 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 1
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 1
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 1
- 230000009260 cross reactivity Effects 0.000 description 1
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 1
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 1
- 208000035250 cutaneous malignant susceptibility to 1 melanoma Diseases 0.000 description 1
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 230000001627 detrimental effect Effects 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 229910003460 diamond Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010432 diamond Substances 0.000 description 1
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 1
- 238000001647 drug administration Methods 0.000 description 1
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 239000012149 elution buffer Substances 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 125000001495 ethyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 1
- 210000001508 eye Anatomy 0.000 description 1
- 229940116862 faricimab Drugs 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- 210000001105 femoral artery Anatomy 0.000 description 1
- 230000004761 fibrosis Effects 0.000 description 1
- 239000000834 fixative Substances 0.000 description 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 230000005714 functional activity Effects 0.000 description 1
- 210000004220 fundus oculi Anatomy 0.000 description 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 1
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 1
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 1
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 238000010562 histological examination Methods 0.000 description 1
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 1
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 1
- 206010020718 hyperplasia Diseases 0.000 description 1
- 230000003463 hyperproliferative effect Effects 0.000 description 1
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 1
- 229940127121 immunoconjugate Drugs 0.000 description 1
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 1
- 230000016784 immunoglobulin production Effects 0.000 description 1
- 230000002055 immunohistochemical effect Effects 0.000 description 1
- 238000005462 in vivo assay Methods 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 239000007972 injectable composition Substances 0.000 description 1
- 229940102223 injectable solution Drugs 0.000 description 1
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 1
- 238000001361 intraarterial administration Methods 0.000 description 1
- 239000007927 intramuscular injection Substances 0.000 description 1
- 238000010253 intravenous injection Methods 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 1
- 239000007951 isotonicity adjuster Substances 0.000 description 1
- 239000000787 lecithin Substances 0.000 description 1
- 235000010445 lecithin Nutrition 0.000 description 1
- 229940067606 lecithin Drugs 0.000 description 1
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 1
- 231100001231 less toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 239000008297 liquid dosage form Substances 0.000 description 1
- 239000006193 liquid solution Substances 0.000 description 1
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 1
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 1
- 208000020816 lung neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 210000001365 lymphatic vessel Anatomy 0.000 description 1
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 1
- 210000002189 macula lutea Anatomy 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 108010082117 matrigel Proteins 0.000 description 1
- 206010061289 metastatic neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 239000004530 micro-emulsion Substances 0.000 description 1
- 239000011259 mixed solution Substances 0.000 description 1
- 239000003471 mutagenic agent Substances 0.000 description 1
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 1
- 229940055729 papain Drugs 0.000 description 1
- 235000019834 papain Nutrition 0.000 description 1
- 239000012188 paraffin wax Substances 0.000 description 1
- 238000007911 parenteral administration Methods 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 229960002275 pentobarbital sodium Drugs 0.000 description 1
- 229940111202 pepsin Drugs 0.000 description 1
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 1
- 238000004393 prognosis Methods 0.000 description 1
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000009465 prokaryotic expression Effects 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 1
- 210000001938 protoplast Anatomy 0.000 description 1
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 description 1
- 238000010791 quenching Methods 0.000 description 1
- 230000000171 quenching effect Effects 0.000 description 1
- 230000003439 radiotherapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 238000002708 random mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 1
- 108700015048 receptor decoy activity proteins Proteins 0.000 description 1
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 description 1
- 238000010188 recombinant method Methods 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 230000004281 retinal morphology Effects 0.000 description 1
- 230000001177 retroviral effect Effects 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 1
- 210000000582 semen Anatomy 0.000 description 1
- 239000008299 semisolid dosage form Substances 0.000 description 1
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 1
- 239000008354 sodium chloride injection Substances 0.000 description 1
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 1
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000007909 solid dosage form Substances 0.000 description 1
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 239000012192 staining solution Substances 0.000 description 1
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 1
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 230000008093 supporting effect Effects 0.000 description 1
- 239000000829 suppository Substances 0.000 description 1
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 238000004114 suspension culture Methods 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 230000002195 synergetic effect Effects 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 125000000341 threoninyl group Chemical group [H]OC([H])(C([H])([H])[H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 1
- 238000011200 topical administration Methods 0.000 description 1
- 238000010361 transduction Methods 0.000 description 1
- 230000026683 transduction Effects 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 1
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 1
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 1
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 1
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 1
- 230000006459 vascular development Effects 0.000 description 1
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
- 210000004127 vitreous body Anatomy 0.000 description 1
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/22—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against growth factors ; against growth regulators
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Mycology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
一种特异性结合VEGF C的单域抗体多肽及其构建体，抗VEGF C/VEGF A双特异性结合蛋白，以及编码所述多肽和蛋白的多核苷酸、表达载体和宿主细胞，及其药物组合物，和治疗新生血管化相关疾病的方法和用途。
Description
本发明涉及特异性结合VEGF C的单域抗体多肽、及其构建体，尤其是抗VEGF C/VEGF A双特异性结合蛋白。本发明也涉及编码所述多肽和蛋白的多核苷酸、表达载体和宿主细胞，及其药物组合物，和治疗新生血管化相关疾病的方法和用途。
血管内皮生长因子(VEGF)是成人中健康和疾病期间血管发育和血液及淋巴管功能的主要调节因子。目前已知VEGF家族由五个结构相关因子组成：VEGFA(也称为VEGFA165)，VEGFB，VEGFC，VEGFD和胎盘生长因子(PlGF)。VEGF家族成员主要以同型二聚体多肽形式存在，通过与相关VEGF受体结合来诱导信号传导和引发相应的生物学效应。
血管内皮生长因子A(VEGF-A)作为血管发生细胞因子，通过与两个高亲和力跨膜酪氨酸激酶受体(VEGFR-1和VEGFR-2)的相互作用，参与正常和异常的血管发生过程。目前已经提出了多种不同方式来阻断VEGF-A路径，以改善与新生血管化相关的疾病。已经提出的VEGF-A阻断剂/拮抗剂包括：靶向VEGF-A的中和性抗体，和阻止VEGF-A与其正常受体结合的可溶性诱饵受体和Trap分子。例如，人源化单克隆抗VEGF-A抗体bevacizumab(商品名Avastin)已经批准用于治疗结肠直肠癌、乳腺癌和肺癌。Ranibizumab(雷珠单抗，商品名Lucentis)是来自与bevacizumab相同的亲本鼠源抗体的单克隆抗体片段，其比亲本分子小得多且已经经过亲和力成熟从而提供更强的VEGF-A结合性质(WO98/45331)。Ranibizumab已经被批准用于治疗湿型年龄相关性黄斑变性。Aflibercept(也称作阿柏西普，VEGFA-Trap，商品名Elyea)是由来自人VEGF受体1和2的配体结合结构域与人IgG1Fc区融合形成的重组融合蛋白，已被批准用于治疗新生血管化相关的视网膜疾病如老年黄斑变性，并正在临床试验中用于实体瘤治疗。
血管内皮生长因子C(VEGF-C)被鉴定为淋巴管发生相关细胞因子，通过酪氨酸激酶受体VEGFR2和VEGFR3发挥作用。VEGF-C通过结合血管内皮细胞上的VEGFR2，参与新生血管化过程。此外，VEGF-C通过结合受体VEGFR3，刺激淋巴管发生和淋巴内皮细胞生长和迁移。VEGFR3尽管在结构上与VEGFR1和2相似，但不结合VEGF-A。已经发现，除了在淋巴管细胞上，VEGFR3也在血管内皮细胞中高表达。阻断VEGF-C/VEGFR3信号通路已经被提出用于在多种转移性肿瘤模型中抑制肿瘤的淋巴管发生和转移。此外，目前已经开发VEGF-C Trap分子，例如Opthea有限公司开发的OPT-032(由来自VEGFR3的配体胞外结构域构建的VEGFC/D抑制剂)，用于新生脉管化相关视网膜病变治疗。
在许多疾病过程中已经鉴定到涉及新生脉管化发生，所述疾病过程包括例如癌症，自身免疫，和视网膜病变等。鉴于VEGF-A和VEGF-C在血管和淋巴管生长中的作用，已经提出，在新生脉管化相关疾病例如肿瘤的生长和转移中，VEGF-A和VEGF-C可能彼此具有协同促进效应。因此，本领域存在着开发新的抗新生脉管化分子，尤其是同时能够靶向VEGF-A和VEGF-C的双特异性分子的需求。这样的双特异性分子将有助于同时阻断血管内皮生长因子A和C来遏制新生脉管化相关性疾病的发展。相比于单独的抗VEGF-A分子和抗VEGF-C分子的联用，这样的双特异性分子在施用上也将带来优势。目前在眼 部疾病的治疗中，多种单独的抗VEGF-A分子例如阿柏西普、雷珠单抗以及康柏西普表现出局限性，即作为注射液剂型，需要通过玻璃体内给药，施用不便，这也导致患者的依从性较差，治疗负担大。因此，设计可以替代这种联合用药的双特异性分子，以同时强效及特异性结合并中和VEGF-A和VEGF-C，将是有利的。
发明概述
为了满足上述需求，本发明人经过深入研究，在筛选噬菌体展示文库的基础上，通过人源化和亲和力成熟提供了新颖的高亲和力抗VEGF-C单域scAb抗体多肽；并利用所述单域抗体多肽作为组件，结合抗VEGF-A分子，构建产生了具有优异的双重VEGF-A和VEGF-C拮抗活性和抗新生脉管化功效的双特异性分子。
因此，在一个方面，本发明提供特异性结合人VEGF-C的单域抗体(sdAb,single domain antibody)。在一个实施方案中，本发明的抗VEGF-C单域抗体包含具有下式的VHH结构域:FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4,其中所述CDR1-3分别包含或由选自以下氨基酸序列组成：
(1)SEQ ID NO：1，2和3所示的氨基酸序列；
(2)SEQ ID NO：9，10和11所示的氨基酸序列；
(3)SEQ ID NO：17，18和19所示的氨基酸序列；
(4)SEQ ID NO：21，22和23所示的氨基酸序列。
在再一个方面，本发明提供包含至少本发明单域抗体的蛋白，优选地，所述蛋白是融合蛋白或嵌合多肽，例如VHH-Fc抗体。
在再一个方面，本发明提供双特异性结合蛋白，其包含
(i)与人VEGF C特异性结合的第一抗原结合组分；和
(ii)与人VEGF A特异性结合的第二抗原结合组分，
其中所述第一抗原结合组分包含本发明的单域抗体多肽；且
所述双特异性结合蛋白具有双重拮抗活性，抑制VEGF A与其VEGF受体结合并抑制VEGF C与其VEGF受体结合。
在再一方面，本发明提供编码本发明分子(单域抗体多肽、蛋白或双特异性结合蛋白)的多核苷酸、载体、宿主细胞；以及包含本发明分子的药物组合物、药物联合和试剂盒。
在再一方面，本发明提供利用本发明分子(单域抗体多肽、蛋白或双特异性结合蛋白)预防和/或治疗疾病的用途，所述疾病为例如新生脉管化相关疾病，如肿瘤和眼部疾病。
在再一方面，本发明也提供本发明分子(单域抗体多肽、蛋白或双特异性结合蛋白)的诊断用途。
附图简述
图1A-1D显示，anti-VEGFC VHH抗体阻断VEGFC与受体VEGFR2/VEGFR3结合的ELISA实验。A：anti-VEGFC VHH的VEGFR2阻断实验，B：anti-VEGFC VHH的VEGFR3阻断实验，C：anti-VEGFC人源化VHH的VEGFR3阻断实验，D：anti-VEGFC亲和力成熟VHH的VEGFR3阻断实 验。
图2显示，anti-VEGFCVHH抗体阻断VEGFC诱导的HEK 293 KDR报道分子激活实验。
图3显示，anti-VEGFCVHH抗体阻断VEGFC诱导的Baf3-FLT4增殖实验。
图4A-4B显示，人源化anti-VEGFC VHH抗体阻断VEGFC诱导的HEK 293 KDR报道分子激活实验。
图5A-5B显示，人源化anti-VEGFC VHH抗体阻断VEGFC诱导的Baf3-FLT4增殖实验。
图6A-6B显示，亲和力成熟分子anti-VEGFC VHH抗体阻断VEGFC诱导的HEK 293 KDR报道分子激活实验。
图7A-7B显示，亲和力成熟anti-VEGFC VHH抗体阻断VEGF-C诱导的Baf3-FLT4增殖实验。
图8显示，双特异性抗体分子阻断VEGFA诱导的HEK 293 KD报道分子激活实验。
图9显示，双特异性抗体分子阻断VEGFC诱导的HEK 293 KDR reporter激活实验。
图10A-10C显示，双特异性抗体分子抑制VEGFC诱导的BaF3-FLT4增殖实验。
图11A-11B显示，双特异性抗体分子抑制VEGFA+C诱导的HUVEC增殖实验。
图12A-12B显示，双特异性抗体分子抑制VEGFA+C诱导的HUVEC管腔形成实验。A：管腔形成图像；B：管腔形成统计结果。
图13A-13C显示，双特异性抗体分子抑制A375皮下瘤模型新生血管形成实验。A：A375肿瘤质量统计；B：A375肿瘤体积统计；C：A375肿瘤CD31染色图像。
图14显示，双特异性抗体分子抑制激光诱导的CNV实验。
图15显示，anti-VEGFA/VEGF C双特异性抗体抑制激光诱导的脉络膜新生血管化眼底造影图像。
图16显示，anti-VEGFA/VEGF C双特异性抗体抑制激光诱导的视网膜增厚OCT图像。
图17A-17B显示，anti-VEGFA/VEGF C双特异性抗体抑制激光诱导的脉络膜新生血管化模型病理学改变。
图18A-18B显示，利用VEGF-A结合结构域-Fc融合蛋白和抗VEGF-A Fab抗体，组合抗VEGF-C VHH抗体作为组件，构建的两种双特异性抗体的结构示意图。
图19显示，本发明抗VEGF-C VHH单域抗体的CDR1-3序列和VHH序列。
发明详述
除非另外限定，否则本文中所用的全部技术与科学术语具有如本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。本文所提及的全部出版物、专利申请、专利和其他参考文献通过引用的方式完整地并入。此外，本文中所述的材料、方法和例子仅是说明性的并且不意在是限制性的。本发明的其他特征、目的和优点将从本说明书及附图并且从后附的权利要求书中显而易见。
定义
术语“约”在与数字数值联合使用时意为涵盖具有比指定数字数值小5％的下限和比指定数字数值大5％的上限的范围内的数字数值。
如本文中所用，术语“包含”或“包括”意指包括所述的要素、整数或步骤，但是不排除任意其他要素、整数或步骤。
术语“抗体”在本文中以最广义使用，指包含抗原结合位点的蛋白质，涵盖各种结构的天然抗体和人工抗体，包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)、单链抗体、单域抗体、全长抗体和抗体片段。
术语“全抗体”或“全长抗体”在本文中可互换使用，是指具有天然免疫球蛋白分子结构的抗体分子。在常规四链IgG抗体的情况下，全长抗体包含由二硫键相互连接的两条重链(H)和两条轻链(L)。在仅具有重链而缺乏轻链的重链抗体情况下，全长抗体包含由二硫键相互连接的两条重链(H)。
对于常规四链IgG抗体，全长抗体重链通常由重链可变区(本文中缩写为VH)和重链恒定区组成，其中重链恒定区至少包含3个结构域CH1、CH2和CH3。全长抗体轻链由轻链可变区(本文中缩写为VL)和轻链恒定区组成，其中轻链恒定区由一个结构域CL组成。每个重链可变区VH和每个轻链可变区都由三个CDR和4个FR组成，从氨基端到羧基端以如下顺序排列：FR1,CDR1,FR2,CDR2,FR3,CDR3,FR4。
对于重链抗体，全长抗体重链通常由重链可变区(本文中缩写为VHH)和重链恒定区组成。重链恒定区由结构域CH2和CH3组成。每个VHH由三个CDR和4个FR组成，从氨基端到羧基端以如下顺序排列：FR1,CDR1,FR2,CDR2,FR3,CDR3,FR4。
术语抗体的“抗原结合片段”是比全抗体或全长抗体的氨基酸残基数要少的全长或全抗体的一部分或一段，但其能结合抗原或与全长抗体(即与抗原结合片段所来源的全长抗体)竞争结合抗原。可以通过重组DNA技术、或通过酶或化学切割完整的抗体制备抗原结合片段。抗原结合片段包括但不限于Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv、单链Fv、双体抗体(diabody)、单域抗体(sdAb)、纳米抗体。例如，通过木瓜蛋白酶消化全长抗体能够获得Fab片段。此外，通过胃蛋白酶在铰链区的二硫键下面消化完全抗体产生F(ab')2，其为Fab’的二聚体，是二价的抗体片段。F(ab')2可以在中性条件下通过破坏铰链区中的二硫键而被还原，由此将F(ab')2二聚体转化为Fab'单体。Fab'单体基本上是具有铰链区的Fab片段。Fv片段由抗体单臂的VL和VH结构域组成。Fv片段的两个结构域VL和VH可以由独立的基因编码，但是也可以使用重组方法，使用合成性连接肽连接这两个结构域以使其作为单条蛋白链产生，并且在所述单条蛋白链中VL区和VH区配对以形成单链Fv(scFv)。
术语抗体的“可变区”或“可变结构域”是指参与抗体与抗原结合的抗体重链或轻链的结构域。在重链抗体例如来自骆驼科重链抗体的情况下，单个VH结构域可以足以给予抗原结合特异性。天然重链抗体的VHH与天然的IgG抗体的重链可变区VH一样，具有相似的结构，即包含四个保守的框架区(FR)和三个互补决定区(CDR)，并具有结构：FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4。
抗体的“互补决定区”或“CDR区”或“CDR”或“高变区”，是抗体可变结构域(VH或VHH)中在序列上高度可变并且形成在结构上确定的环(“超变环”)和/或含有抗原接触残基(“抗原接触点”)的区域。CDR主要负责与抗原表位结合。重链和轻链的CDR从N-端开始顺序编号，通常称作CDR1、CDR2和CDR3。位于抗体重链可变结构域内的CDR也称作HCDR1、HCDR2和HCDR3，而位于抗体轻链可变结构域内的CDR则称作LCDR1、LCDR2和LCDR3。在一个给定的轻链可变区或重链可变区氨基酸序列中，可以采用本领域公知的多种方案确定其CDR序列，例如：基于抗体的三维结构和CDR环的拓扑学的Chothia，基于抗体序列可变性的Kabat(Kabat等人,Sequences of Proteins of Immunological Interest,第4版,U.S.Department of Health and Human Services,National Institutes of Health(1987)),AbM(University of Bath)，Contact(University College London)，国际ImMunoGeneTics database(IMGT)(国际免疫遗传学信息系统,万维网imgt.cines.fr/)，以及基于利用大量晶体结构的近邻传播聚类(affinity propagation clustering)的North CDR 定义(North等，“A New Clustering of Antibody CDR Loop Con格式ions”，Journal of Molecular Biology，406，228-256(2011))。
以下为采用kabat、AbM、Chothia、Contact和IMGT方案定义的CDR的区域范围。
除非另有说明，否则在本发明中，术语“CDR”或“CDR序列”涵盖以上述任一种方式确定的CDR序列。
CDR也可以基于与参考CDR序列具有相同的Kabat编号位置而确定。除非另有说明，否则在本发明中，当提及抗体可变区中的残基位置(包括重链可变区残基和轻链可变区残基)时，是指根据Kabat编号系统(Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest,5
th Ed.Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1991))的编号位置。
术语“Fc结构域”或“Fc区”在本文中用来定义免疫球蛋白重链的含有至少一部分恒定区的C端区域。该术语包括天然序列Fc区和变体Fc区。天然的免疫球蛋白“Fc结构域”包含两个或三个恒定结构域，即CH2结构域、CH3结构域和可选的CH4结构域。例如，在天然抗体中，免疫球蛋白Fc结构域包含源自IgG、IgA和IgD类抗体的两条重链的第二和第三恒定结构域(CH2结构域和CH3结构域)；或者包含源自IgM和IgE类抗体的两条重链的第二、第三和第四恒定结构域(CH2结构域、CH3结构域和CH4结构域)。除非本文中另外说明，否则Fc区或重链恒定区中的氨基酸残基编号根据如Kabat等人,Sequences of Proteins of Immunological Interes,第5版,Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD,1991中所述的EU编号体系(也称作EU索引)进行编号。在本文中，术语“Fc区”、“Fc部分”和“Fc片段”不包括免疫球蛋白的重链可变区VH和轻链可变区VL以及重链恒定区CH1和轻链恒定区CL，但在一些情况下可以包括在重链恒定区N端的铰链区。
术语“嵌合抗体”是这样的抗体分子，其中(a)将恒定区或其部分进行改变、替换或交换，从而抗原结合位点与具有不同的或改变的类别、效应子功能和/或物种来源的恒定区连接、或与赋予嵌合抗体新性能的完全不同的分子(例如，酶、毒素、激素、生长因子、药物)等连接；或(b)将可变区或其部分用具有不同或改变的抗原特异性的可变区改变、替换或交换。例如，驼源重链抗体可以通过将其恒定区更换为来自人免疫球蛋白的恒定区进行修饰。由于更换为人类恒定区，该嵌合抗体可以保留其在识别抗原方面的特 异性，同时与原始驼源抗体相比，具有在人类中降低的抗原性。
如本文所用，“人源化抗体”是一种保留非人类抗体(例如羊驼单克隆抗体)的抗原特异反应性，同时作为治疗药对人施用时免疫原性较低的抗体。这可以例如通过保留非人抗原结合位点并将抗体的剩余部分替换成它们的人类相应部分(即，将恒定区以及可变区中不参与结合的部分替换为人类抗体的相应部分)来实现。
如本文所用，术语“融合蛋白”与“嵌合多肽”可互换使用，是指由至少两个异源多肽序列，任选地通过接头，融合形成的更大多肽。融合蛋白可以通过重组表达产生。
术语“异源”在涉及融合蛋白或嵌合多肽时是指，所述融合蛋白或嵌合多肽包含两个或更多个子序列，这些子序列在自然界中并不存在于同一蛋白或多肽中。
术语“重组”在本文中是指多肽或蛋白通过生物宿主产生。所述宿主可以选自，包括但不限于，哺乳动物表达系统，昆虫细胞表达系统，酵母表达系统和细菌表达系统。在一个实施方案中，本发明的多肽/蛋白是在原核生物(例如大肠杆菌细胞)或真核生物宿主细胞(例如哺乳动物宿主细胞)中表达产生的重组多肽/蛋白。
如本文所用，术语“单特异性”指，具有一个或多个抗原结合位点的多肽/蛋白分子，所述位点中的每一个位点与相同抗原的相同表位结合。如本文所用，术语“多特异性”指，具有与不同表位(同一抗原上的不同表位或不同抗原上的不同表位)结合的至少两个抗原结合位点的多肽/蛋白分子。在一些实施方案中，本发明提供包含本发明单域抗体的单特异性结合分子，在一些实施方案中，所述分子是单价的，例如仅具有单个VHH结构域的单个VHH-Fc多肽，在另一些实施方案中，所述分子是多价的，例如由两个VHH-Fc多肽通过Fc区二聚化形成的重链抗体。在一些实施方案中，本发明提供双特异性结合分子，所述分子的两个抗原结合特异性分别针对抗原VEGF-A和VEGF-C，尤其是人VEGFA和人VEGFC，优选地其中至少一个抗VEGF-C特异性由本发明单域抗体提供。
如本文所用的术语“抗原结合位点”与“抗原结合结构域”可以互换使用，表示分子中与目的抗原实际结合的区域。抗原结合位点的示例包括例如不限于，抗体的可变结构域、受体的胞外配体结合结构域等。优选地，用于本发明双特异性结合蛋白中的VEGFC抗原结合位点由抗VEGFC重链抗体的可变结构域(即，“VHH”)提供；用于本发明双特异性结合蛋白中的VEGFA抗原结合位点由抗VEGFA抗体的配对重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)提供，或由特异性结合VEGFA的VEGF受体胞外域多肽片段提供、或由人工配体“Trap”分子提供。
如本文所用，术语配体“Trap”分子，是包含受体的配体相互作用胞外结构域与人IgG Fc区的融合蛋白。目前已经开发出多种“捕获”VEGF配体，包括VEGFA和VEGFC的trap分子。这些Trap分子可以用于结合细胞外环境中的相应配体并降低其浓度。在一个实施方案中，本发明抗VEGFA组分包含“捕获”VEGFA的Fc融合蛋白形式的trap分子。该trap分子能够与天然VEGFA细胞受体竞争结合VEGFA，从而抑制VEGFA诱导的信号传导。在一个实施方案中，Fc融合蛋白形式的trap分子包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列。该VEGFA-trap分子通过将来自VEGF受体1和2的胞外配体结合结构域融合在人IgG1的Fc部分上形成，具有完全来自人的氨基酸，从而最小化分子在人体中的免疫原性。
如本文所用，术语“VEGFA”或“VEGF-A”指血管内皮生长因子A(例如，登录号UniProt P15692下的人VEGFA蛋白)。VEGFA与受体VEGFR1(也称作FLT1)和VEGFR2(也称作KDR)结合。在本文中，“针 对VEGFA的抗原结合特异性”是指分子中特异性结合人VEGFA的结合位点或结合结构域。
术语“VEGFC”或“VEGF-C”指血管内皮生长因子C(例如，登录号UniProt P49767下的人VEGFC蛋白)。VEGFC与受体VEGFR2(也称作KDR)和VEGFR3(也称作FLT4)结合。在本文中，“针对VEGFC的抗原结合特异性”是指分子中特异性结合人VEGFC的结合位点或结合结构域。在一个实施方案中，通过生物膜薄层干涉技术检测，本发明分子中结合VEGFC的VHH抗原结合位点对人VEGFC具有高亲和结合活性，例如，大约1-10nM的单价结合亲和力KD值，或大约0.1-0.7nM的双价结合亲合力。
“抗VEGF-C组分”在本文中是指能够与VEGF-C蛋白结合的多肽。例如，抗VEGF-C组分可以是包含本发明VHH结构域的多肽。在一个实施方案中，抗VEGF-C组分是结合VEGF-C的单域抗体。在再一实施方案中，抗VEGF-C组分包含与选自SEQ ID NOs:4,8,12,16,20,24的氨基酸序列具有至少80％,85％,90％,91％,92％,93％,94％,95％,96％,97％,98％,99％,或大约100％同一性的氨基酸序列。优选地，所述抗VEG-C组分包含选自SEQ ID NOs:4,8,12,16,20,和24所示氨基酸序列的VHH结构域的3个CDR序列，其中所述CDR序列根据Kabat定义；或根据Chothia定义；或其中CDR1根据Kabat和Chothia的组合定义，CDR2和CDR3根据Kabat定义。
“抗VEGF-A组分”在本文中是指能够与VEGF-A蛋白结合的多肽。例如，抗VEGF-A组合可以是包含VEGFA受体胞外域多肽以及与其C端融合的Fc部分的嵌合多肽/融合蛋白；也可以是包含重链和轻链的抗VEGFA抗体，例如Fab抗体或其他全长抗体的片段。在一个实施方案中，抗VEGF-A组分由Fc融合蛋白形式的trap分子提供，并通过Fc区二聚化而形成二聚体。在另一实施方案中，抗VEGF-A组分由Fab形式的抗VEGFA抗体提供，其中Fab的重链(即，包含重链恒定区的多肽链)与Fab的轻链(即，包含轻链恒定区的多肽链)配对形成二聚体。
“Fab片段”或“Fab”或“Fab抗体”在本文中可互换使用，用于指，由两条多肽链组成的、包含免疫球蛋白重链可变结构域VH、重链恒定结构域CH1、轻链可变结构域VL和轻链恒定结构域CL的免疫球蛋白片段，其中，一条多肽链从N端到C端包含VH和选自CH1和CL的一个恒定区，另一条多肽链从N端到C端包含VL和选自CL和CH1的另一恒定区，其中所述VH结构域和VL结构域配对形成抗原结合位点。在本文中，当Fab的一条多肽链包含与CL连接的VH且另一多肽链包含与CH1连接的VL时，该Fab也称作crossFab。
在本文中，包含重链恒定区CH1的Fab多肽链也称作Fab重链；相应地，包含轻链恒定区CL的Fab多肽链也称作Fab轻链。因此，对于一个Fab抗体，在Fab重链中CH1可以与VH或CL连接，在Fab轻链中CL可以与VL或VH连接，但条件是所述VH与VL能够配对形成特异性结合目的抗原的抗原结合位点。
术语“VHH结构域”在本文中用于指，从缺乏轻链的重链抗体(在本文中，有时也称作HcAb抗体)衍生的重链可变结构域，也称作单可变域片段或纳米抗体。因此，VHH结构域与四链免疫球蛋白的常规VH结构域不同，其无需与轻链可变结构域配对来形成抗原结合位点。这种VHH结构域分子可以衍生自骆驼科物种(例如骆驼、羊驼、单峰驼、驼羊和原驼)中产生的抗体。除骆驼科之外的其他物种也可以产生天然缺乏轻链的重链抗体，这类VHH也处于本发明的范围内。在一些情况下，对于VHH结构域的治疗应用，期望的是降低其免疫原性。因此，优选地，在一个实施方案中，本发明使用的VHH结构域是人源 化VHH结构域或其进一步序列优化形式(例如，以增加结合亲和力的亲和力成熟形式)。
“单域抗体”或“sdAb”在本文中用于指，通过单个可变抗体结构域，例如VHH或单个VH或单个VL，来识别并结合目的抗原的抗体多肽。单域抗体的单个可变抗体结构域无需与另一抗体可变结构域配对，即能够识别和结合目的抗原。在本文中，包含重链抗体的重链可变结构域(VHH)的单域抗体也称作VHH单域抗体。本发明中使用的VHH单域抗体优选来自骆驼科动物，例如羊驼，或是其人源化形式或序列优化形式。在一些实施方案中，本发明的VHH单域抗体为由或基本上由单个VHH结构域组成的单价单特异性多肽分子。
本发明的单域抗体或VHH结构域也可以包含在更大的多肽/蛋白中。可以提及的包含本发明单域抗体的多肽/蛋白例子包括但不限于，重链抗体(HcAb)，例如，具有源自骆驼科动物(美洲驼、骆驼，尤其是羊驼)的构架区和/或重链恒定区的重链抗体，其人源化形式或其序列优化形式(亲和力成熟形式)、或其片段(例如包含至少部分恒定区的片段)；由来自该重链抗体的VHH结构域作为组件形成的融合蛋白，例如与(部分)免疫球蛋白恒定区(例如Fc区)的融合蛋白。在一个实施方案中，本发明的VHH结构域与Fc区，例如人IgG1Fc区，融合形成VHH-Fc抗体。
在本文中，术语“柔性连接肽”或“连接肽”或“接头”是指由氨基酸组成的短氨基酸序列，例如单独或组合使用的甘氨酸(G)和/或丝氨酸(S)和/或苏氨酸残基(T)，或来自免疫球蛋白的铰链区。在一个实施方案中，连接肽具有5-50个氨基酸长度，例如，10,15,20,25,30个氨基酸长度。在一个实施方案中，连接肽包含氨基酸序列(G4S)n，其中n是等于或大于1的整数，例如，n是2,3,4,5,6或7的整数。在一个实施方案中，连接肽包含氨基酸序列TS(G4S)n,其中n是等于或大于1的整数，例如，n是2,3,4,5,6或7的整数。在一个实施方案中，连接肽包含氨基酸序列G(G4S)n,其中n是等于或大于1的整数，例如，n是2,3,4,5,6或7的整数。在再一实施方案中，连接肽为来自免疫球蛋白的铰链区，例如包含“CPPC”的铰链区氨基酸序列，例如，氨基酸序列“EPKSCDKTHTCPPCP”或“EPKSSDKTHTCPPCP”。可以用于本发明抗体分子连接各结构域的连接肽还可以是，例如但不限于，如下氨基酸序列：GGG；DGGGS；TGEKP；GGRR；EGKSSGSGSESKVD；KESGSVSSEQLAQFRSLD；GGRRGGGS；LRQRDGERP；LRQKDGGGSERP；和GSTSGSGKPGSGEGSTKG。或者，可以使用计算机程序模拟蛋白和肽的三维结构，或通过噬菌体展示方法，来合理地设计合适的柔性连接肽。
如本文所用，术语“结合”或“特异性结合”意指结合作用对抗原是选择性的并且可以与不想要的或非特异的相互作用区别。抗原结合位点与特定抗原结合的能力可以通过酶联免疫吸附测定法(ELISA)或本领域已知的常规结合测定法测定。
“亲和力”或“结合亲和力”指反映结合对子的成员之间相互作用的固有结合亲和力。分子X对其配偶物Y的亲和力可以通常由解离常数(KD)代表，解离常数是解离速率常数和缔合速率常数(分别是kdis和kon)的比例。亲和力可以由本领域已知的常见方法测量。用于测量亲和力的一个具体方法是本文中的ForteBio动力学结合测定法。
氨基酸序列的“同一性百分数(％)”是指将候选序列与本说明书中所示的具体氨基酸序列进行比对并且如有必要的话为达到最大序列同一性百分数而引入空位后，并且不考虑任何保守置换作为序列同一性的一部分时，候选序列中与本说明书中所示的具体氨基酸序列的氨基酸残基相同的氨基酸残基百分数。在一些实施方案中，本发明考虑本发明抗体分子的变体，所述变体相对于在本文中具体公开的抗体分子及其序列而言具有相当程度的同一性，例如同一性为至少80％,85％,90％,95％,97％,98％或99％或更高。所述变体可以包含保守性修饰。
对于多肽序列，“保守性修饰”包括对多肽序列的置换、缺失或添加，但不实质性改变多肽序列的期望功能活性。例如，保守性取代常常导致某个氨基酸置换为化学上相似的氨基酸。提供功能上相似氨基酸的保守性置换表是本领域熟知的。以下列出了8组含有互为保守替换的氨基酸：1)丙氨酸(A)、甘氨酸(G)；2)天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)；3)天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)；4)精氨酸(R)、赖氨酸(K)；5)异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、缬氨酸(V)；6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)；7)丝氨酸(S)、苏氨酸(T)；和8)半胱氨酸(C)、甲硫氨酸(M)。在一些实施方案中，术语“保守序列修饰”用于指不显著影响或改变含有氨基酸序列的本发明抗体分子或结合蛋白分子的目的抗原结合特征的氨基酸修饰。例如保守修改变体相对于亲本抗体或结合蛋白保持对目的抗原至少80％,85％,90％,95％,98％,99％或更高，例如100-110％或更高的结合亲和力。
术语“宿主细胞”指已经向其中引入外源多核苷酸的细胞，包括这类细胞的子代。宿主细胞包括“转化体”和“转化的细胞”，这包括原代转化的细胞和从其衍生的子代。宿主细胞是可以用来产生本发明抗体分子的任何类型的细胞系统，包括真核细胞，例如，哺乳动物细胞、昆虫细胞、酵母细胞；和原核细胞，例如，大肠杆菌细胞。宿主细胞包括培养的细胞，也包括转基因动物、转基因植物或培养的植物组织或动物组织内部的细胞。
术语“表达载体”是指包含重组多核苷酸的载体，其包含有效连接要表达的核苷酸序列的表达控制序列。表达载体包含足够的用于表达的顺式作用元件；用于表达的其它元件可以由宿主细胞提供或在体外表达系统中。表达载体包括本领域已知的所有那些，包括被掺入重组多核苷酸的粘粒、质粒(例如，裸的或包含在脂质体中)和病毒(例如，慢病毒、逆转录病毒、腺病毒和腺伴随病毒)。
术语“个体”或“受试者”可互换地使用，是指哺乳动物。哺乳动物包括但不限于驯化动物(例如，奶牛、绵羊、猫、犬和马)、灵长类(例如，人和非人灵长类如猴)、兔和啮齿类(例如，小鼠和大鼠)。特别地，个体是人。
术语“治疗”指意欲改变正在接受治疗的个体中疾病之天然过程的临床介入。想要的治疗效果包括但不限于防止疾病出现或复发、减轻症状、减小疾病的任何直接或间接病理学后果、防止转移、降低病情进展速率、改善或缓和疾病状态，以及缓解或改善预后。在一些实施方案中，本发明的抗体分子用来延缓疾病发展或用来减慢疾病的进展。
术语“抗肿瘤作用”或”抑瘤作用”指,可以通过多种手段展示的生物学效果，包括但不限于例如，肿瘤体积减少、肿瘤细胞数目减少、肿瘤细胞增殖减少或肿瘤细胞存活减少。术语“肿瘤”和“癌症”在本文中互换地使用，涵盖各种实体瘤。
在本文中，术语“新生脉管化相关疾病”是指，疾病的发生、发展和/或进程涉及新生脉管发生(包括新生血管发生、新生淋巴管发生、和/或两者)的疾病、病症和/或病况。此类疾病、病症或病况将受益于VEGF-C或VEGF-A或两者的生物活性阻断。
以下就本发明的各方面进行详细描述。
I.单域抗体多肽及其衍生物
单域抗体或VHH结构域具有人IgG分子大约十分之一的分子量，以及仅几纳米的物理直径。由于小的分子尺寸，单域单抗相比常规的四链抗体具有如下优势：高稳定性和溶解性，以及能够识别隐藏抗原性位点。此外，单域抗体在制备上也比常规的四链抗体更为便宜，可以容易地在大肠杆菌中以更高表达水平表达和纯化。除了作为单独分子应用外，单域抗体也是构建多特异性分子的适宜组件。
经过深入研究，本发明在一个方面提供了单域抗体及其衍生物。本发明的单域抗体特异性结合人 VEGFC，并优选地阻断其与受体的结合和由此诱导的信号传导。在一些实施方案中，本发明单域抗体具有选自如下任一项或多项的生物学活性：
(i)以高亲和力与人VEGF-C(hVEGF-C)结合，优选地，采用生物膜薄层干涉技术测定，例如实施例3所述的方法测定，单价结合亲和力KD值为大约1-10nM，如大约5-6nM，双价结合亲合力KD值为大约0.1-1nM之间，例如大约0.6nM；
(ii)阻断hVEGF-C与受体VEGFR2结合，优选地，采用ELISA测定法，例如实施例4所述的方法测定，阻断结合的IC50值为大约0.1-0.5nM，更优选大约0.01-0.05nM；
(iii)阻断hVEGF-C与受体VEGFR3结合，优选地，采用ELISA测定法，例如实施例4所述的方法测定，阻断结合的IC50值为大约0.1-0.5nM，更优选大约0.01-0.05nM；
(iv)抑制由VEGFC-C结合VEGFR2介导的信号通路激活，优选地，采用受体-报道分子体系，例如实施例5所述的方法测定；
(v)抑制由VEGFC-C结合VEGFR3介导的信号通路激活，
(vi)阻抑VEGFC与VEGFR2结合诱导的血管内皮相关活性，例如血管内皮细胞存活、增殖和/或迁移，新生血管发生和/或血管渗漏；
(vii)阻抑VEGFC与VEGFR3结合诱导的血管内皮细胞和/或淋巴管内皮细胞的存活和/或增殖。
在结构上，与其他的常规抗体一样，本发明sdAb具有模块结构，其中VHH可变区序列包含三个CDR与高度保守的4个构架区中，并且通常具有下式的结构：FR1-CDR-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4，其中FR1至FR4指构架区1至4；CDR1至CDR3指互补决定区1-3。VHH可变区中的CDR序列可以按照“定义”部分描述的任何CDR定义方案进行确定，优选可以通过Kabat、Chothia或其组合方式来定义sdAb可变区序列中的三个CDR的边界。
在一些实施方案中，本发明提供在原核宿主细胞中，例如大肠杆菌中，表达并分离的单域抗体。在再一些实施方案中，本发明提供在真核宿主细胞中，例如哺乳动物细胞，例如CHO细胞或293细胞中，表达并分离的单域抗体。
在一些实施方案中，本发明的单域抗体包含源自通过免疫驼科动物(例如羊驼)产生的驼科重链抗体的CDR氨基酸序列和/或构架(FR)氨基酸序列。在一些实施方案中，源自驼科重链抗体的本发明单域单抗可以进行工程化，例如，以包含源自人氨基酸序列(即，人抗体)或其他非驼科哺乳动物物种的构架区和/或恒定区序列。例如，可以在所述抗体中包括来自人或非人灵长类的构架区、部分或全部重链恒定区(例如单独的CH1、CH2、或CH3区，或其任何组合，例如CH2-CH3区)、免疫球蛋白Fc区或其片段、和/或铰链区或部分铰链区。在一个实施方案中，为进一步改善工程化抗体的性质(例如亲和力)，可以在工程化抗体中，在一个或多个位置(例如构架区)，通过回复突变，引入在亲本驼源抗体中位于相应位置的驼源氨基酸残基。
在一个实施方案中，本发明的单域抗体或VHH结构域是人源化的。人源化可以通过如下方式实现：将非人源的天然VHH序列(例如来自驼科动物或羊驼免疫的VHH序列)中的一个或多个氨基酸残基，尤其是构架区序列，置换成来自人的常规抗体的重链VH相应位置的残基。人源化单域单抗的方法在本领域中是熟知的。典型地，人源化置换以保持单域抗体的有利结合性质的方式进行。本领域熟知用于确定人源化单域抗体的生物学性质，例如结合亲和力等的试验，以确定和选择适宜的人源化残基突变或突变组合。
在一些实施方案中，可以通过包括如下步骤的方法，获得本发明人源化的单域抗体：
①确定亲本单域抗体(例如来自噬菌体展示文库筛选的驼源VHH抗体)的CDR环结构；
②在人种系序列数据库为每个V/J区域找到最接近的同源序列；
③筛选与重链最匹配的人种系以及最低量的回复突变；
④将嵌合抗体的CDR区构建至人的骨架区上；
⑤使用序列和结构特征，确定骨架区中起到维持CDR功能的氨基酸位置；
⑥在确定为重要的序列位置进行回复突变(返回到输入氨基酸类型)；
⑦优化风险位点的氨基酸；和
⑧获得人源化抗体，任选地测序抗体VHH序列。
在一些实施方案中，本发明也提供本发明单域抗体的功能性变体。所述功能性变体可以采用本发明熟知的方法，例如通过随机或定点诱变，将突变引入本发明的示例性单域抗体的编码核酸序列中，例如引入CDR序列和/或FR序列中，并随后筛选(例如通过噬菌体展示文库筛选)保持期望性质的变体，来获得功能性变体。典型地，功能性变体保持与亲本单域抗体(或VHH结构域)显著的序列的同一性。优选地，功能性变体保持亲本单域抗体(或VHH结构域)的期望生物学性质，例如，相对于亲本的生物活性，变体具有岘相当(例如，至少50％，60％，70％，80％，优选地90％以上)的生物活性，或改善的生物活性(例如110-150％或更高)的生物活性。所述的期望生物学性质包括例如，但不限于，目的抗原结合亲和力(如通过KD值量度),阻断目的抗原与受体结合的活性(例如通过IC50值量度)，阻断目的抗原诱导的信号通路激活的抑制活性(例如通过IC50值量度),在体外或体内实验中阻断新生血管化和/或血管渗漏，在体外或体内实验中抑制肿瘤生长/存活。
在一些实施方案中，本发明提供本发明单域抗体多肽的亲和力变体。优选地，所述亲和力变体表现出相对于其来源亲本单域抗体在氨基酸序列上的一个或多个氨基酸变化，其中亲和力变体相比亲本抗体具有改变的对目的抗原的结合亲和力。典型地，亲和力变体表现出优于亲本的改善的抗原结合亲和力。所述改善可以是，但不限于，较低的KD值，更快的解离速率，或增加(或降低)与目的抗原的非人物种同源蛋白的交叉反应性。亲和力变体相比亲本往往在CDR中具有一个或多个氨基酸残基取代。该取代可以是保守取代或非保守取代。在一个实施方案中，本发明的亲和力变体相对于亲本在CDR1-3中总共具有不超过10个，不超过6个，或1-5个，例如1个，2个，3个，4个或5个氨基酸取代。在一些实施方案中，亲和力变体相对于亲本在CDR2中引入突变。在另一实施方案中，亲和力变体相对于亲本在CDR2 和CDR3中引入突变。亲和力变体可以通过本领域已知的多种亲和力成熟方法获得，包括突变CDR，链该组,使用大肠杆菌增变株，DNA改组,噬菌体展示等。
“互补决定区”或“CDR区”或“CDR”(在本文中与超变区“HVR”可以互换使用)，是抗体可变区中主要负责与抗原表位结合的氨基酸区域。在本文中，单域抗体或VHH结构域的CDR通常被称作CDR1、CDR2和CDR3，从N-端开始顺序编号。在一些实施方案中，本发明提供了抗VEGFC单域抗体，其中所述抗体包含具有如下CDR序列的VHH结构域：
(i)SEQ ID NO:4的VHH序列的三个CDR序列，
(ii)SEQ ID NO:8的VHH序列的三个CDR序列，
(iii)SEQ ID NO:12的VHH序列的三个CDR序列，
(iv)SEQ ID NO:16的VHH序列的三个CDR序列，
(v)SEQ ID NO:20的VHH序列的三个CDR序列，
(vi)SEQ ID NO:24的VHH序列的三个CDR序列，
优选地，CDR序列根据kabat定义，或Chothia定义；或CDR1根据Kabat和Chothia的组合定义，CDR2和CDR3根据Kabat定义；
或者，
其中所述抗体包含选自上述(i)-(vi)任一项的CDR序列的变体，例如相对于上述(i)-(vi)任一项的CDR序列，所述变体具有1-8个，1-5个,或1个，2个，3个，4个，5个，6个氨基酸改变，优选地保守氨基酸替换。
在一些实施方案中，本发明提供抗VEGFC单域抗体，其包含由3个CDR和4个FR组成的下式的VHH结构域，FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4；其中
(i)CDR1包含或由SEQ ID NO:1所示氨基酸序列组成，CDR2包含或由SEQ ID NO:2所示氨基酸序列组成，和CDR3包含或由SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列组成；
(ii)CDR1包含或由SEQ ID NO:9所示氨基酸序列组成，CDR2包含或由SEQ ID NO:10所示氨基酸序列组成，和CDR3包含或由SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列组成；
(iii)CDR1包含或由SEQ ID NO:17所示氨基酸序列组成，CDR2包含或由SEQ ID NO:18所示氨基酸序列组成，和CDR3包含或由SEQ ID NO:19所示的氨基酸序列组成；或
(iv)CDR1包含或由SEQ ID NO:21所示氨基酸序列组成，CDR2包含或由SEQ ID NO:22所示氨基酸序列组成，和CDR3包含或由SEQ ID NO:23所示的氨基酸序列组成；
或者
其中所述抗体包含选自上述(i)-(vi)任一项的CDR序列的变体，例如相对于上述(i)-(vi)任一项的CDR序列，所述变体具有1-8个，1-5个,或1个，2个，3个，4个，5个，6个氨基酸改变，优选地保守氨基酸替换。
优选地，本发明的抗VEGFC单域抗体包含下式的VHH结构域，FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4；其中CDR1包含或由SEQ ID NO:17所示氨基酸序列组成，CDR2包含或由SEQ ID NO:18所示氨基酸序列组成，和CDR3包含或由SEQ ID NO:19所示的氨基酸序列组成。
更优选地，本发明的抗VEGFC单域抗体包含下式的VHH结构域，FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4；其中CDR1包含或由SEQ ID NO:21所示氨基酸序列组成，CDR2包含或由SEQ ID NO:22 所示氨基酸序列组成，和CDR3包含或由SEQ ID NO:23所示的氨基酸序列组成。
单域抗体的“可变区”或“可变结构域”是单域抗体中参与抗原结合的区域。单域抗体中重链可变结构域在本文中也称作VHH结构域。本领域已知，可以对VHH可变区中的一个或多个残基进行修饰，例如，对一个或多个CDR区和/或对一个或多个构架区进行残基修饰，尤其是保守残基取代，而修饰后的抗体仍基本上保持改变之前的抗体分子的至少一个生物学特性(例如，抗原结合能力)。
例如，可以突变CDR区的残基，改善抗体的一种或多种结合性质(例如亲和性)。可以在体外或体内测定试验中，评估突变后的抗体的抗原结合性质或其它功能性质。优选地，引入保守替代。优选地，在CDR区中引入的残基改变不超过1个、2个、3个、4个或5个。此外，可以突变构架区残基，例如以改善抗体的性质。例如，可以将一个或多个构架残基“回复突变”为对应的种系序列残基。
CDR移植是本领域已知的另一种抗体可变区修饰方式。由于CDR序列负责大多数抗体-抗原相互作用，故可以构建模拟已知抗体的性质的重组抗体变体。在该抗体变体中，来自已知抗体的CDR序列被移植到具有不同性质的不同抗体的构架区上。因此，在一个实施方案中，本发明涉及这样的抗VEGFC单域抗体，所述抗体包含来自图19中示例性VHH单域抗体之一的重链可变区的CDR序列，但具有不同的构架区序列。可以从公共DNA数据库，包括种系抗体基因序列，或从公开文献报道的VEGFC抗体序列，获得用于替换的构架区序列。例如，可以从GenBank数据库获得编码人重链可变区基因的种系DNA。可以将抗体蛋白序列与数据库中的蛋白序列，使用序列相似性检索工具，例如Gapped BLAST，进行比较。优选，用于替代的构架序列，与选择进行改变的本发明抗体的构架序列，具有结构相似性，例如，具有序列同一性至少80％，85％，90％，或95％、96％、97％、98％、99％以上的构架序列。在一些实施方案中，可以按照实施例7的方式进行抗体的人源化。
因此，在一个实施方案中，本发明提供了抗VEGFC单域抗体，其包含或由选自SEQ ID NOs:4,8,12,16,20和24的氨基酸序列，或与其具有至少70,71,72,73,74,75,76,77,78,79,80,81,82,83,84,85,86,87,88,89,90,91,92,93,94,95,96,97,98,或99％，或更高同一性的氨基酸序列组成。
在另一实施方案中，本发明提供抗VEGFC单域抗体，所述抗体：
(i)包含SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列的VHH序列或其变体，或者
(ii)包含SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列的VHH序列或其变体，或者
(iii)包含SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列的VHH序列或其变体，或者
(iv)包含SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列的VHH序列或其变体，或者
(v)包含SEQ ID NO:20所示的氨基酸序列的VHH序列或其变体；或者
(vi)包含SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列的VHH序列或其变体,
其中所述变体在氨基酸序列上，与参考VHH序列相比，(优选地，在全长上或在CDR1、2和3三个区域上)，具有至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高同一性。在一个实施方案中，变体在氨基酸序列上，与参考VHH序列相比，(优选地，在全长上或在CDR1、2和3三个区域上)，包含至少一个且不超过30个、10个、或5、4、3、2、1、0氨基酸改变(优选氨基酸取代，优选保守取代)。优选地变体与参考VHH序列的差异不在CDR区中。
优选地，本发明的抗VEGFC单域抗体包含SEQ ID NO:20所示的氨基酸序列，或由所述氨基酸序列组成。更优选地，本发明的抗VEGFC单域抗体包含SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列，或其所述氨基酸序列组成。
II.融合蛋白/嵌合多肽
在再一方面，本发明提供包含至少一个本发明单域抗体或VHH结构域的多肽，其中所述多肽包含本发明单域单抗或VHH结构域及连接在其N端或C端或N和C端的其它肽/多肽序列。
在一些实施方案中，可以将本发明的单域抗体或VHH结构域(例如驼源VHH结构域或其人源化形式)，与人抗体的恒定区例如Fc区连接，以产生VHH-Fc多肽。在一个实施方案中，所述VHH-Fc多肽为包含本发明单域抗体和位于其C端的Fc部分。
在再一个实施方案中，所述VHH-Fc多肽包含来自驼科动物的Fc部分。在一个实施方案中，通过免疫所述驼科动物例如羊驼产生并分离所述的VHH-Fc多肽。本领域已知多种方式可用于免疫驼科动物和分离产生的针对目的抗原的VHH抗体。
在再一些实施方案中，所述VHH-Fc多肽包含来自人或非人灵长类动物的Fc部分。在再一实施方案中，所述VHH-Fc多肽包含人IgG Fc区，例如人IgG1Fc区，如包含SEQ ID NO:27氨基酸序列或与之具有至少85,86,87,88,89,90,91,92,93,94,95,96,97,98,或99％，或更高同一性的氨基酸序列的Fc区。
在一个实施方案中，根据本发明的VHH-Fc多肽包含通过连接肽，例如铰链区，与单域单抗C端融合的Fc部分。
在再一个实施方案中，根据本发明的VHH-Fc多肽可以通过Fc部分，与包含Fc部分的另一多肽链(例如相同或不同的另一VHH-Fc多肽)二聚化。因此，在再一实施方案中，本发明也提供了包含本发明VHH-Fc多肽的同源或异源多聚体蛋白质。在一个优选的实施方案中，优选所述蛋白包含两条相同VHH-Fc多肽链配对形成的重链抗体。
除了上述VHH-Fc多肽及重链抗体，本发明也提供包含至少一个根据本发明的单域抗体多肽的其他融合蛋白/嵌合多肽。
在一些实施方案中，本发明的融合蛋白/嵌合多肽包含单个根据本发明的单域抗体或VHH结构域。在另一实施方案中，本发明的融合蛋白/嵌合多肽包含多个根据本发明的单域抗体或VHH结构域。根据本发明的融合蛋白可以是单特异性的；或可以是多特异性的。在一些实施方案中，本发明的融合蛋白/嵌合多肽仅包含针对VEGFC的特异性。在再一实施方案中，本发明的融合蛋白/嵌合多肽，除了包含针对VEGFC的本发明单域抗体或VHH结构域(一个或多个)，还包含针对另一抗原的特异性，例如针对VEGFA的特异性。
如本领域技术人员理解，融合蛋白中的各组件可操作连接，以允许其分别发挥其预期功能。在一个实施方案中，融合蛋白的组件之间可以直接连接，或通过连接肽或接头连接。在一些实施方案中，接头包含来自免疫球蛋白铰链区的氨基酸序列，或包含柔性氨基酸序列，例如由甘氨酸和丝氨酸组成的序 列，例如(G4S)n或G(G4S)n，其中n＝1,2,3,4,5,6或7，优选2,3,4。
III.双特异性结合分子
在再一方面，本发明提供抗VEGFC/VEGFA双特异性结合分子,其包含：
(i)与VEGF-C特异性结合的第一抗原结合组分；和
(ii)与VEGF-A特异性结合的第二抗原结合组分。
本发明的双特异性分子提供对VEGF-A和VEGF-C的双重拮抗活性。
在一些实施方案中，本发明双特异性结合分子具有选自如下任一项或多项的生物学活性：
(i)阻断由hVEGF-A单独诱导的VEGFR2信号通路激活，优选地，可以采用KDR报道分子测定试验，例如实施例10所述的方法测定抑制活性IC50值来确定，其中所述IC50值为例如0.1-10nM，例如大约0.2-1nM,如0.6nM,或大约1-3nM,如大约1nM；
(ii)阻断由hVEGF-C单独诱导的VEGFR2信号通路激活，优选地，可以采用KDR报道分子测定试验，例如实施例10所述的方法测定抑制活性IC50值来确定，其中所述IC50值为0.1-1nM，例如大约0.2-0.6nM；
(iii)抑制hVEGF-C诱导的淋巴管细胞增殖，优选地，可以采用细胞增殖测定试验，例如实施例11所述的方法测定抑制活性IC50值来确定，其中所述IC50值为0.01-0.5nM，例如大约0.1-0.5nM；
(iv)抑制hVEGF-C和hVEGF-A共同诱导的内皮细胞存活和增殖，抑制水平达到至少80％、85％、90％、95％、或大约100％，优选地，可以采用细胞增殖测定试验，例如实施例12所述的方法测定抑制活性IC50值来确定，其中所述IC50值为0.1-0.5nM，例如大约0.2nM；
(v)抑制hVEGF-C和hVEGF-A共同诱导的新生血管结构形成，抑制水平达到至少80％、85％、90％、95％、或大约100％，优选地，可以采用内皮细胞管腔形成试验，例如实施例13所述的方法测定抑制活性来确定；
(vi)抑制肿瘤(例如实体瘤，例如黑素瘤)的新生血管化；
(vii)抑制肿瘤(例如实体瘤，例如黑素瘤)的生长，例如在荷瘤动物模型中，例如实施例14所述的荷瘤动物模型中，单药施用肿瘤抑制率达到50％以上；
(viii)阻抑新生血管化相关眼部疾病的发生和/或发展，例如降低新生血管化水平，减少血管渗漏，抑制新生血管化引起的眼底视网膜水肿和/或增厚。
因此，在一些实施方案中，本发明提供了可用于治疗新生脉管化相关疾病，例如癌症(例如实体瘤)和眼部疾病(例如黄斑变性AMD)的抗VEGFA/VEGFC双特异性结合分子。
根据本发明的抗VEGFA/VEGFC双特异性结合分子的抗VEGFC组分可以包含上述任何本发明的抗VEGFC单域抗体多肽或根据本发明的任何抗VHGFC VHH结构域。优选地，所述抗VEGFC组分包含或由根据本发明的抗VEGFC VHH结构域组成，更优选地所述VHH结构域是人源化VHH结构域。在一个实施方案中，所述VHH结构域包含分别SEQ ID NO:1,2和3所示的CDR1，CDR2和CDR3氨基酸序 列；在一个实施方案中，所述VHH结构域包含SEQ ID NO:9,10,11所示的CDR1，CDR2和CDR3氨基酸序列；在一个优选的实施方案中，所述VHH结构域包含SEQ ID NO:17,18和19所示的CDR1，CDR2和CDR3氨基酸序列；在再一优选的实施方案中，所述VHH结构域包含SEQ ID NO:21,22,和23所示的CDR1，CDR2和CDR3氨基酸序列。在再一实施方案中，所述VHH结构域包含选自(i)SEQ ID NO:4,8,12,16,20,或24的氨基酸序列，或(ii)与(i)的氨基酸序列具有至少80％,85％,90％,91％,92％,93％,94％,95％,96％,97％,98％,99％或以上的同一性的氨基酸序列，或(iii)相对于(i)的氨基酸序列具有至少1-30个，或1-20个，或1-15个，或1-10个，或1-5个氨基酸改变(例如，替代，缺失和/或插入，优选替代，更优选保守替代)的氨基酸序列。在一个优选的实施方案中，所述VHH结构域包含或由SEQ ID NO：20或24的氨基酸序列组成。在一个实施方案中，根据本发明的抗VEGFA/VEGFC双特异性结合分子包含至少一个，例如两个或两个以上(优选地两个)本发明的抗VEGFC单域抗体或VHH结构域。
根据本发明的抗VEGFA/VEGFC双特异性结合分子的抗VEGFA组分可以由包含VEGFA结合结构域的任何分子提供；例如但不限于，抗VEGFA抗体，例如单链Fv抗体、Fab抗体、Fab'抗体、(Fab)2抗体、单域抗体和纳米抗体；抗VEGFA Trap分子，例如包含VEGFA受体VEGFR1的胞外结构域的Trap分子，包含VEGFA受体VEGFR2的胞外结构域的Trap分子，或包含VEGFR1和VEGFR2的胞外结构域的Trap分子；以及VEGFA结合结构域与免疫球蛋白的Fc部分的融合蛋白或嵌合多肽。在根据本发明的双特异性抗体分子中，抗VEGAC组分连接或融合在抗VEGA组分的C端或N端。在一些实施方案中，抗VEGFC组分可以直接或，优选地通过接头序列，共价连接在抗VEGFA组分的N末端或C末端，优选C末端。在一些实施方案中，根据本发明的抗VEGFA组分与人VEGFA结合并抑制VEGFA与其受体VEGFR1和/或VEGFR2的结合和由此诱导的信号传导。
在一些优选实施方案中，根据本发明的抗VEGA组分由包含VEGFA结合结构域的Fc嵌合多肽提供，由此所述抗VEGA组分包含Fc融合蛋白形式的VEGFA结合结构域。在另一些优选实施方案中，抗VEGA组分由抗VEGFA Fab抗体提供，由此所述抗VEGA组分包含Fab抗体形式的VEGFA结合结构域。在抗VEGA组分为Fc融合蛋白的实施方案中，优选地，VEGFA结合结构域可以位于Fc部分的N端或C端；且抗VEGFC组分连接在Fc部分的相对端。在抗VEGFA组分为Fab抗体的实施方案中，优选，抗VEGFC组分连接在Fab抗体的C端。
在一些实施方案中，根据本发明的本发明的双特异性结合蛋白可以包括连接抗VEGA组分和抗VEGFC组分的接头。在一个实施方案中，接头是大约6个至大约30个氨基酸长度的肽，例如10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25.26.27.28,29或30个氨基酸长。优选地，接头包含G(G4S)n或G(G4S)n氨基酸序列，n＝1,2,3,4,或5的整数，优选n＝2或3或4。
Fc融合蛋白形式的双特异性结合分子
在一些实施方案中，因此，本发明提供了抗VEGFA/VEGFC双特异性结合分子，其中所述结合分子 包含Fc融合蛋白形式的抗VEGFA组分和抗VEGFC组分，其中所述抗VEGFA组分包含与免疫球蛋白Fc区融合的VEGF-A结合结构域，且所述抗VEGF-C组分包含本发明中描述的任何抗VEGF-C单域抗体多肽，尤其是由本发明中描述的任何抗VEGF-C VHH结构域组成的VHH单域抗体多肽。在一个实施方案中，所述抗VEGFC组分通过抗VEGFA组分的Fc区与之连接，优选共价连接，更优选地通过接头连接。在再一实施方案中，所述VEGF-A结合结构域与所述抗VEGF-C VHH结构域分别位于Fc区的两端。在一些优选实施方案中，所述VEGF-A结合结构域位于Fc区N端，且所述抗VEGF-C VHH结构域位于Fc区的C端。
在一个实施方案中，所述VEGF-A结合结构域是VEGF-A结合性多肽。在再一实施方案中，所述VEGF-A结合性多肽包含来自VEGFA受体，例如VEGFR1和/或VEGFR2的胞外VEGFA结合结构域。在一个实施方案中，所述VEGFA结合性多肽包含与VEGFR1的第二Ig结构域遗传融合的VEGFR2的第三Ig结构域。在一个实施方案中，所述VEGF-A结合性多肽包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:26，或与其具有至少90,91,92,93,94,95,96,97,98,99％或更高同一性的氨基酸序列组成。优选，所述VEGF-A结合性多肽包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:26组成。
在一个实施方案中，所述Fc区为人IgG的Fc区，例如人IgG1Fc区，优选包含或由SEQ ID No:27的氨基酸序列，或与其具有至少90,91,92,93,94,95,96,97,98,99％或更高同一性的氨基酸序列组成。
在一个实施方案中，包含VEGFA结合性多肽和Fc区的抗VEGFA组分包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:25，或与其具有至少90,91,92,93,94,95,96,97,98,99％或更高同一性的氨基酸序列组成。
在一些实施方案中，本发明的抗VEGFA/VEGFC双特异性结合分子通过Fc区的二聚化作用形成二聚体。
在一个优选的实施方案中，在本发明的抗VEGFA/VEGFC双特异性结合分子中，根据本发明的抗VEGFA结合多肽与根据本发明的抗VEGFC VHH结构域分别融合在免疫球蛋白Fc区的N端和C段，并且由此形成的融合多肽链通过Fc区二聚化而形成二聚体。因此，在一个优选的实施方案中，本发明提供抗VEGFA/VEGFC双特异性结合分子，其包含第一多肽链和第二多肽链，其中所述第一多肽链和第二多肽链各自包含根据本发明的抗VEGFA结合多肽与根据本发明的抗VEGFC VHH结构域分别融合在免疫球蛋白Fc区的N端和C段而形成的融合多肽，其中所述第一多肽链和第二多肽链可以相同或不同。优选地，第一多肽链和第二多肽链相同，本发明的抗VEGFA/VEGFC双特异性结合分子为包含第一多肽链和第二多肽链的同二聚体蛋白。在一个实施方案中，第一多肽链和第二多肽链相同，各自包含由氨基酸序列SEQ ID NO:26，或与其具有至少90,91,92,93,94,95,96,97,98,99％或更高同一性的氨基酸序列组成的VEGF-A结合性多肽。在再一实施方案中，第一多肽链和第二多肽链相同，各自包含含有选自氨基酸序列SEQ ID NO:4,8,12,16,20,或24中的CDR1，CDR2和CDR3序列的抗VEGF-C VHH结构域；优选地，所述VHH结构域包含SEQ ID NOs:1-3或SEQ ID NOs:9-11或SEQ ID NOs:17-19或SEQ ID NOs:21-23的CDR1,CDR2和CDR3序列；更优选地，所述VHH结构域包含选自SEQ ID NO:4,8,12,16,20,或24的氨基酸序列，或与其具有至少90,91,92,93,94,95,96,97,98,99％或更高同一性的氨基酸序列，或由其组成。在再一实施方案中，第一多肽链和第二多肽链相同，各自包含来自人IgG1的Fc区。在再一实施方案中，第一多肽链和第二多肽链相同，且其中根据本发明的抗VEGFC VHH结构域通过接头融 合在免疫球蛋白Fc区的C末端。在一个实施方案中，接头包含G(G4S)n或G(G4S)n氨基酸序列，n＝1,2,3,4,或5的整数，优选n＝2或3或4。在再一实施方案中，第一多肽链和第二多肽链相同，且各自包含选自SEQ ID NOs:40-41和44-47的氨基酸序列或与其具有至少85％,90％,95％,96％,97％,98％,99％序列同一性的氨基酸序列。优选地，第一多肽链和第二多肽链相同并各自包含SEQ ID NO:47所示的氨基酸序列。
Fab抗体形式的双特异性结合分子
在再一些实施方案中，本发明提供抗VEGFA/VEGFC双特异性结合分子，其中所述结合分子包含Fab抗体形式的抗VEGFA组分和抗VEGFC组分，其中所述抗VEGFA组分包含配对形成VEGF-A结合结构域的重链可变区VH和轻链可变区VL，其分别与免疫球蛋白重链恒定区CH1和轻链恒定区CL融合以形成抗VEGFA Fab抗体。在再一些实施方案中，抗VEGFC组分通过抗VEGFA Fab抗体的CH1和/或CL恒定区C端，与Fab抗体形式的抗VEGFA组分连接，优选共价连接，更优选地通过接头连接。在再一实施方案中，抗VEGFA Fab抗体分别在CH1恒定区和CL恒定区的C末端各自连接一个抗VEGF-C组分。优选地，所述抗VEGF-C组分包含本发明中描述的任何抗VEGF-C单域抗体多肽，尤其是由本发明中描述的任何抗VEGF-C VHH结构域组成的VHH单域抗体多肽。
在根据本发明的双特异性结合分子的一些实施方案中，根据本发明的抗VEGFA Fab抗体包含：由重链可变区VH与免疫球蛋白重链恒定区CH1连接形成的Fab重链，和由轻链可变区VL与免疫球蛋白恒定区VL形成的Fab轻链。在另一实施方案中，根据本发明的抗VEGFA Fab抗体包含：重链可变区VH与免疫球蛋白恒定区VL连接形成的Fab轻链，所述轻链可变区VL与免疫球蛋白重链恒定区CH1连接形成的Fab重链。
在一些实施方案中，根据本发明的抗VEGFA Fab抗体包含重链可变区VH和轻链可变区VL，其中所述VH包含SEQ ID NOs:34-36的HCDR1-3的氨基酸序列且所述VL包含SEQ ID NOs:37-39的LCDR1-3的氨基酸序列。在再一实施方案中，抗VEGFA Fab抗体为嵌合抗体或人源化抗体，优选为人源化抗体。在再一实施方案中，所述VEGF Fab抗体包含重链可变区VH和轻链可变区VL，其中所述VH包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列或与其具有至少80,85,90,91,92,93,94,95,96,97,98,99％或更高同一性的氨基酸序列，且所述VL包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列或与其具有至少80,85,90,91,92,93,94,95,96,97,98,99％或更高同一性的氨基酸序列；优选地所述VH包含SEQ ID NO：29的氨基酸序列且所述VL包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列。
在再一些实施方案中，根据本发明的抗VEGFA Fab抗体包含人免疫球蛋白IgG1的CH1恒定区。在另一实施方案中，根据本发明的抗VEGFA Fab抗体包含人κ轻链恒定区CL。在一个实施方案中，所述抗VEGFA Fab抗体包含具有SEQ ID NO:30的氨基酸序列或与其具有至少80,85,90,91,92,93,94,95,96,97,98,99％或更高同一性的氨基酸序列的重链CH1恒定区。在再一实施方案中，所述抗VEGFA Fab抗体包含具有SEQ ID NO:33的氨基酸序列或与其具有至少80,85,90,91,92,93,94,95,96,97,98,99％或更高同一性的氨基酸序列的轻链CL恒定区。
在一些实施方案中，优选地，根据本发明的抗VEGFA Fab抗体包含由根据本发明的VH和CH1组成 的Fab重链(VH-CH1链)和由根据本发明的VL和CL组成的Fab轻链(VL-CL链)。更优选地，根据本发明的抗VEGFA Fab抗体包含具有SEQ ID NO:28的氨基酸序列或与其具有至少80,85,90,91,92,93,94,95,96,97,98,99％或更高同一性的氨基酸序列的Fab重链；和具有SEQ ID NO:31的氨基酸序列或与其具有至少80,85,90,91,92,93,94,95,96,97,98,99％或更高同一性的氨基酸序列的Fab轻链。更优选地，根据本发明的抗VEGFA Fab抗体包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列和SEQ ID NO:31的氨基酸序列。
在根据本发明的双特异性结合分子的再一些实施方案中，根据本发明的抗Fab抗体在CH1和CL的C末端分别与本发明的抗VEGFC单域抗体或本发明的抗VEGFC VHH结构域，直接或优选地通过接头连接。因此，在一个的实施方案中，本发明提供抗VEGFA/VEGFC双特异性结合分子，其包含第一多肽链和第二多肽链，其中所述第一多肽链包含根据本发明的抗VEGFA Fab抗体的Fab重链和与其CH1的C末端连接的抗VEGFC VHH结构域；第二多肽链包含根据本发明的抗VEGFA Fab抗体的Fab轻链和与其CL的C末端连接的抗VEGFC VHH结构域。优选地，所述Fab重链由VH和CH1组成(VH-CH1)；所述Fab轻链由VL和CL组成(VL-CL)。
在一个优选实施方案中，本发明提供抗VEGFA/VEGFC双特异性结合分子，其包含第一多肽链和第二多肽链，其中第一多肽链从N端到C端包含VH-CH1-接头-VHH；且第二多肽链从N端到C端包含VL-CL-接头-VHH，其中所述VHH为本发明的抗VEGFA VHH结构域；所述VH-CH1和VL-CL配对形成本发明的抗VEGF-A Fab抗体，任选地其中CH1和CL也可以无需接头而直接与VHH结构域连接。在一些实施方案中，所述VHH结构域包含选自SEQ ID NO:4,8,12,16,20,或24的氨基酸序列中的CDR1，CDR2和CDR3序列；优选地，所述VHH结构域包含SEQ ID NOs:1-3或SEQ ID NOs:9-11或SEQ ID NOs:17-19或SEQ ID NOs:21-23的CDR1,CDR2和CDR3序列；更优选地，所述VHH结构域包含选自SEQ ID NO:4,8,12,16,20,或24的氨基酸序列，或与其具有至少90,91,92,93,94,95,96,97,98,99％或更高同一性的氨基酸序列，或由其组成；再优选地，所述VHH结构域包含SEQ ID NO:20或24的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述VH包含SEQ ID NOs:34-36的HCDR1-3的氨基酸序列且所述VL包含SEQ ID NOs:37-39的LCDR1-3的氨基酸序列；优选地所述VH和VL为人源化的；再优选地，所述VH包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列或与其具有至少80,85,90,91,92,93,94,95,96,97,98,99％或更高同一性的氨基酸序列，且所述VL包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列或与其具有至少80,85,90,91,92,93,94,95,96,97,98,99％或更高同一性的氨基酸序列；更优选地所述VH包含SEQ ID NO：29的氨基酸序列且所述VL包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述CH1包含人免疫球蛋白IgG1的CH1恒定区。在另一实施方案中，所述CL包含人κ轻链恒定区CL。在一个实施方案中，所述CH1包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列或与其具有至少80,85,90,91,92,93,94,95,96,97,98,99％或更高同一性的氨基酸序列。在再一实施方案中，所述CL包含具有SEQ ID NO:33的氨基酸序列或与其具有至少80,85,90,91,92,93,94,95,96,97,98,99％或更高同一性的氨基酸序列。在一个实施方案中，接头包含G(G4S)n或G(G4S)n氨基酸序列，n＝1,2,3,4,或5的整数，优选n＝2或3或4。
在再一个优选实施方案中，本发明提供抗VEGFA/VEGFC双特异性结合分子，其包含第一多肽链和第二多肽链，其中第一多肽链和第二多肽链选自：
-包含SEQ ID NO:42的氨基酸序列或与其具有至少85％,90％,95％,96％,97％,98％,99％序列同一性的氨基酸序列的第一多肽链，和包含SEQ ID NO:43的氨基酸序列或与其具有至少85％,90％,95％,96％,97％,98％,99％序列同一性的氨基酸序列的第二多肽链；
-包含SEQ ID NO:48的氨基酸序列或与其具有至少85％,90％,95％,96％,97％,98％,99％序列同一性的氨基酸序列的第一多肽链，和包含SEQ ID NO:49的氨基酸序列或与其具有至少85％,90％,95％,96％,97％,98％,99％序列同一性的氨基酸序列的第二多肽链；
-包含SEQ ID NO:50的氨基酸序列或与其具有至少85％,90％,95％,96％,97％,98％,99％序列同一性的氨基酸序列的第一多肽链，和包含SEQ ID NO:51的氨基酸序列或与其具有至少85％,90％,95％,96％,97％,98％,99％序列同一性的氨基酸序列的第二多肽链，
在一个优选实施方案中，所述第一多肽链包含SEQ ID NO:48所示氨基酸序列且所述第二多肽链包含SEQ ID NO:49所示氨基酸序列；或者，所述第一多肽链包含SEQ ID NO:42的氨基酸序列且所述第二多肽链包含SEQ ID NO:43的氨基酸序列；或者，所述第一多肽链包含SEQ ID NO:48的氨基酸序列且所述第二多肽链包含SEQ ID NO:49的氨基酸序列；或者，所述第一多肽链包含SEQ ID NO:50的氨基酸序列且所述第二多肽链包含SEQ ID NO:51的氨基酸序列。更优选，所述第一多肽链包含SEQ ID NO:48的氨基酸序列且所述第二多肽链包含SEQ ID NO:49的氨基酸序列。
本发明也提供包含本发明单域抗体、融合蛋白和双特异性结合分子的免疫缀合物(例如与毒素或化学小分子缀合)、以及药物组合物和药物联合。在药物组合物或药物联合中，本发明的单域抗体、融合蛋白和双特异性结合分子可以包含另一治疗剂，例如，可以用于本发明单域抗体、融合蛋白和双特异性结合分子的预期用途的另一治疗剂，例如化疗剂、放疗剂、抗新生血管化分子、免疫抑制药物、抗纤维化药物、神经保护药物、和抑瘤分子。
IV.多核苷酸、载体和宿主
本发明提供编码以上任何本发明分子(单域抗体、融合蛋白和双特异性结合分子)的核酸。还提供包含所述核酸的载体。在一个实施方案中，载体是表达载体。还提供包含所述核酸或所述载体的宿主细胞。在一个实施方案中，宿主细胞是真核的。在另一个实施方案中，宿主细胞选自酵母细胞、哺乳动物细胞(例如CHO细胞或293细胞)。在另一个实施方案中，宿主细胞是原核的。
在一方面，本发明提供编码以上任何抗VEGFC单域抗体或VHH结构域的核酸。当从适宜的表达载体表达时，由所述核酸编码的多肽能够显示人VHGFC抗原结合能力。在一些实施方案中，所述核酸在读框中与编码另一肽/多肽的核酸可操作连接，从而当从适宜的表达载体表达时，产生包含所述单域抗体或VHH结构域与另一肽/多肽的融合蛋白或嵌合多肽。为了便于生产和纯化，单域抗体或VHH结构域可以在N端融合分泌性信号肽，和/或利于纯化的标签肽，如六组氨酸标签。单域抗体或VHH结构域也可以在C端融合免疫球蛋白Fc部分，形成VHH-Fc抗体。
在再一方面，本发明提供编码以上任何抗VEGFA/VEGFC双特异性结合分子的核酸。当从适宜的表达载体表达时，由所述核酸编码的多肽能够显示人VHGFA和人VEGFC抗原结合能力。在一个实施方案中，编码双特异性抗体分子的第一多肽链和第二多肽链的核酸可以在相同的载体中或在不同的载体中。在再一实施方案中，编码双特异性抗体分子的第一多肽链和第二多肽链的核酸可以引入相同或不同的宿主细胞以表达。因此，在一些实施方案中，本发明的双特异性结合分子的生产方法包括步骤：在适于表达所述分子 的第一多肽链和第二轻链多肽链的条件下，培养包含编码所述第一多肽链和第二多肽链的核酸的宿主细胞，产生本发明双特异性结合分子。
如本领域技术人员明了的，因为密码子简并性，每一个抗体或多肽氨基酸序列可以由多种核酸序列编码。
编码本发明分子的核酸序列可以采用本领域熟知的方法，例如通过从头固相DNA合成，或通过PCR扩增而产生。
在一个实施方案中，提供包含本发明核酸的一个或多个载体。在一个实施方案中，载体是表达载体，例如原核表达载体或真核表达载体。载体包括但不限于病毒、质粒、粘粒、λ噬菌体或酵母人工染色体(YAC)。
在一个实施方案中，提供了包含一种或多种本发明多核苷酸的宿主细胞。在一些实施方案中，提供了包含本发明表达载体的宿主细胞。如本文所用，术语“宿主细胞”指可以工程化以产生本发明的抗体分子的任何种类的细胞系统。适于复制和支持本发明的抗体分子表达的宿主细胞是本领域熟知的。根据需要，这类细胞可以用特定表达载体转染或转导，并且可以培育大量含有载体的细胞用于接种大规模发酵器以获得足够量的本发明分子用于临床应用。合适的宿主细胞包括原核微生物，如大肠杆菌，真核微生物如丝状真菌或酵母，或各种真核细胞，如中国仓鼠卵巢细胞(CHO)、昆虫细胞等。可以使用适于悬浮培养的哺乳动物细胞系。有用的哺乳动物宿主细胞系的例子包括SV40转化的猴肾CV1系(COS-7)；人胚肾系(HEK 293或293F细胞)、幼仓鼠肾细胞(BHK)、猴肾细胞(CV1)、非洲绿猴肾细胞(VERO-76)、人宫颈癌细胞(HELA)、犬肾细胞(MDCK)、布法罗大鼠肝脏细胞(BRL 3A)、人肺细胞(W138)、人肝脏细胞(Hep G2)、CHO细胞、NSO细胞、骨髓瘤细胞系如YO、NS0、P3X63和Sp2/0等。适于产生蛋白质的哺乳动物宿主细胞系的综述参见例如Yazaki和Wu，Methods in Molecular Biology，第248卷(B.K.C.Lo编著，Humana Press，Totowa，NJ)，第255-268页(2003)。在一个优选的实施方案中，所述宿主细胞是CHO、HEK293或NSO细胞。
V.本发明分子的生产和纯化
再一方面，本发明提供用于生产本发明分子(单域抗体、融合蛋白和双特异性结合分子)的方法，所述方法包括：在适于表达所述分子的多肽链的条件下培养包含编码所述多肽链的宿主细胞；和在适于所述多肽链装配为所述分子的条件下使多肽链装配产生所述分子。
为了重组生产，可以将编码本发明分子的多肽链的多核苷酸插入一个或多个载体中以便进一步在宿主细胞中克隆和/或表达。可以使用本领域技术人员熟知的方法来构建表达载体。表达载体包括但不限于病毒、质粒、粘粒、λ噬菌体或酵母人工染色体(YAC)。一旦已经制备了用于表达的包含本发明的一种或多种多核苷酸的表达载体，则可以将表达载体转染或引入适宜的宿主细胞中。多种技术可以用来实现这个目的，例如，原生质体融合、磷酸钙沉淀、电穿孔、逆转录病毒的转导、病毒转染、基因枪、基于脂质体的转染或其他常规技术。
如本文所述制备的抗体分子可以通过已知的现有技术如高效液相色谱、离子交换层析、凝胶电泳、亲和层析、大小排阻层析等纯化。用来纯化特定蛋白质的实际条件还取决于如净电荷、疏水性、亲水性等因素，并且这些对本领域技术人员是显而易见的。
在一个实施方案中，本发明的单域抗体或VHH结构域可在细菌，例如大肠杆菌中产生。在一个实施方案中，单域抗体在细菌的周质腔中表达后，可以本领域已知的方法分离，以及任选地进一步纯化。此外，单域抗体、VHH结构域、融合多肽和双特异性分子也可以在真核细胞中表达。在一个实施方案中，所述细胞为293细胞，并在表达后例如通过蛋白A柱分离和纯化。
可以通过多种熟知分析方法中的任一种方法确定本发明的抗体分子的纯度，所述熟知分析方法包括大小排阻层析、凝胶电泳、高效液相色谱等。可以通过本领域已知的多种测定法，鉴定、筛选或表征本 文提供的抗体分子的物理/化学特性和/或生物学活性。
VI.测定法
可以通过本领域中已知的多种测定法对本文中提供的分子(单域抗体、融合蛋白和双特异性分子)进行鉴定，筛选，或表征其物理/化学特性和/或生物学活性。
对于本发明分子与人VEGFA和/或人VEGFC的结合，可以通过本领域已知的方法，诸如ELISA，Western印迹等，或本文实施例公开的例示性方法来测定。例如，可以使用重组VEGFA和/或人VEGFC蛋白，在生物光干涉测定法中测定分子的结合动力学(例如K
D值)。在一些实施方案中，使用生物光干涉测定法(例如Fortebio亲和测量)，例如实施例3所示的方法，在温度30℃，测定分子与人VEGFA和/或人VEGFC的结合平衡解离常数，例如单价结合亲和力或双价结合亲合力。
对于本发明分子的VEGFA和/或VEGFC拮抗/抑制活性，可以通过本领域已知的方法，诸如ELISA阻断试验，受体荧光报道分子激活试验，细胞增殖试验，或本文实施例公开的例示性方法来测定。例如，可以使用ELISA阻断试验，例如实施例4所示的方法，测定分子阻断人VEGFA和/或人VEGFC与其相关受体结合的阻断活性。也可以采用基于细胞的受体报道分子测定试验，例如实施例5或10所述的方法，使用例如NFAT-RE-luc2P/KDR HEK293细胞，测定分子阻断由hVEGF-A单独或hVEGF-单独或其组合诱导的VEGFR2信号通路激活。也可以采用细胞增殖测定试验，如CCK-8试验，例如实施例6或11所述的方法，使用淋巴细胞或内皮细胞，测定分子在体外抑制hVEGF-A单独或hVEGF-单独或其组合诱导的细胞存活和/或增殖。
对于本发明分子的抗新生血管化作用，可以通过本领域已知的方法，诸如体外试验和/或体内动物实验来测量。例如，可以使用体外内皮细胞成管实验，例如实施例13所示的方法，采用VEGFA和VEGF C诱导人脐静脉内皮细胞(HUVEC)管腔形成，并检测分子对VEGF A和VEGF C诱导的原代细胞管腔形成的抑制作用。也可以例如在荷瘤小鼠模型中，例如按照实施例14所示的方法，检测分子的抗新生血管化和/或抗肿瘤作用。或者备选地，可以采用例如激光诱导的脉络膜新生血管化动物模型，在施用分子后，通过例如眼底彩色照相、荧光素眼底血管造影，光学相干断层扫描检查，观察分子对脉络膜新生血管的抑制情况。
VII.药物组合物、药物联合和试剂盒
在一个方面，本发明提供了组合物，例如，药物组合物，所述组合物包含与可药用载体配制在一起的本发明分子(单域抗体、融合蛋白或双特异性分子)。如本文所用，“可药用载体”包括生理上相容的任何和全部溶剂、分散介质、等渗剂和吸收延迟剂等。本发明的药物组合物适于静脉内、肌内、皮下、肠胃外、直肠、脊髓或表皮施用(例如，通过注射或输注)。在一个实施方案中，本发明分子配制为适用于注射给药的药物组合物。在一些实施方案中，本发明分子配制为适用于腹腔注射的药物组合物。在再一些实施方案中，本发明分子配制为适用于眼部注射给药(例如玻璃体注射给药)的药物组合物。在一些实施方案中，本发明分子是药物组合物中的唯一活性成分。在另一些实施方案中，药物组合物可以包含本文所述的抗体分子与一种以上治疗剂。
在另一方面，本发明也提供包含本发明分子(单域抗体、融合蛋白或双特异性分子)与一种以上治疗剂的药物联合。
适用于本发明的药物组合物和药物联合中的治疗剂可以为选自以下类别中任一的治疗剂：(i)抗新生血管化药物；(ii)免疫抑制药物；(iii)抗纤维化药物；(iv)神经保护药剂；和(v)具有抑制肿瘤作用的药物。
本发明的组合物可以处于多种形式。这些形式例如包括液体、半固体和固体剂型，如液态溶液剂(例如，可注射用溶液剂和可输注溶液剂)、分散体剂或混悬剂、脂质体剂和栓剂。优选的形式取决于预期的施用模式和治疗用途。常见的优选组合物处于可注射用溶液剂或可输注溶液剂形式。优选的施用模式是肠胃外(例如，静脉内、皮下、腹腔(i.p.)、肌内)注射。在一个优选实施方案中，通过静脉内输注或注射施用抗体分子。在另一个优选实施方案中，通过肌内、腹腔或皮下注射施用抗体分子。
如本文所用的短语“肠胃外施用“和“肠胃外方式施用”意指除了肠施用和局部施用之外的施用模式，通常通过注射施用，并且包括但不限于静脉内、肌内、动脉内、皮内、腹腔、经气管、皮下注射和输注。
治疗性组合物一般应当是无菌的并且在制造和储存条件下稳定。可以将组合物配制为溶液、微乳液、分散体、脂质体或冻干形式。可以通过将活性化合物(即抗体分子)以要求的量加入适宜的溶剂中，随后过滤消毒，制备无菌可注射溶液剂。通常，通过将所述活性化合物并入无菌溶媒中来制备分散体，所述无菌溶媒含有基础分散介质和其他成分。可以使用包衣剂如卵磷脂等。在分散体的情况下，可以通过使用表面活性剂来维持溶液剂的适宜流动性。可以通过在组合物中包含延迟吸收的物质例如单硬脂酸盐和明胶而引起可注射组合物的延长吸收。
本发明的药物组合物可以包含“治疗有效量”或“预防有效量”的本发明分子。“治疗有效量”指以需要的剂量并持续需要的时间段，有效实现所需治疗结果的量。可以根据多种因素如疾病状态、个体的年龄、性别和重量等变动治疗有效量。治疗有效量是任何有毒或有害作用不及治疗有益作用的量。相对于未治疗的受试者，“治疗有效量”优选地抑制可度量参数(例如肿瘤生长率)至少约20％、更优选地至少约40％、甚至更优选地至少约60％和仍更优选地至少约80％。可以在预示人肿瘤中的功效的动物模型系统中评价本发明分子抑制可度量参数(例如，肿瘤体积)的能力。
“预防有效量”指以需要的剂量并持续需要的时间段，有效实现所需预防结果的量。通常，由于预防性剂量在受试者中在疾病较早阶段之前或在疾病较早阶段使用，故预防有效量小于治疗有效量。
包含本文所述抗体分子的试剂盒也处于本发明的范围内。试剂盒可以包含一个或多个其他要素，例如包括：使用说明书；其他试剂，例如标记物或用于偶联的试剂；可药用载体；和用于施用至受试者的装置或其他材料。
VIII.本发明分子的用途和方法
在一个方面，本发明提供了本发明分子的体内、体外用途和应用方法。
在一些实施方案中，本发明的用途和方法涉及将本发明分子在体内和/或体外应用于：
-结合VEGFA抗原和/或VEGFC抗原，
-阻断VEGFA和/或VEGFC与其相关受体，例如VEGFR2和/或VEGFR3的结合；
-抑制VEGFA和/或VEGFC诱导的VEGFR2和/或VEGFR3细胞信号传导激活；
-抑制VEGFA和/或VEGFC诱导的血管内皮细胞存活、增殖和/或迁移；
-抑制VEGFC诱导的淋巴细胞存活和/或增殖；
-抑制VEGFC诱导的淋巴管发生和淋巴内皮细胞生长和迁移；
-抑制VEGFA和/或VEGFC诱导的新生血管化和/或血管渗漏；
-抑制肿瘤的新生血管化和/或生长和/或转移。
在一些实施方案中，本发明抗体分子或包含本发明抗体分子的药物组合物用作在个体中治疗和/或预防疾病的药物或用作疾病的诊断工具，优选地，所述个体是哺乳动物，更优选地是人。
在一些实施方案中，本发明提供了治疗新生血管化相关疾病的方法，包括向受试者施用本发明的分子(单域抗体多肽或其融合蛋白或双特异性结合蛋白)或其药物组合物。在一些实施方案中，所述疾病为实体瘤，优选黑素瘤，其中所述双特异性结合蛋白的施用抑制肿瘤内的新生血管形成和/或肿瘤的生长。在另一些是实施方案中，所述疾病为眼部疾病，优选老年黄斑变性，糖尿病性视网膜病变，视网膜血管阻塞和角膜新生血管化。
在一些实施方案中，本发明提供了本发明的单域抗体多肽或其融合蛋白或本发明的双特异性结合分子在制备在受试者中治疗和/或预防疾病的药物和/或用于制备诊断疾病的诊断工具的用途，其中所述疾病优选为新生血管化相关疾病，例如实体瘤和眼部疾病。
在任何上述实施方案中，一种或多种另外的活性剂，例如化疗剂和/或癌症治疗剂或抗新生血管疗法，可以进一步与本发明的单域抗体多肽或双特异性结合蛋白组合施用。组合施用的形式可以是同时施用、并行施用、或以任何顺序的相继施用。
在再一个方面，本发明也提供了体外或体内检测生物样品，例如血清、精液或尿或组织活检样品(例如，来自过度增生性或癌性病灶)中存在相关抗原的诊断方法。该诊断方法包括：(i)在允许相互作用发生的条件下使样品(和任选地，对照样品)与(标记或未标记的)本发明的分子(单域抗体、融合蛋白、或双特异性结合分子)接触或向受试者施用所述抗体分子和(ii)检测所述分子和样品(和任选地，对照样品)之间复合物的形成。复合物的形成表示存在相关抗原，并且在一些情况下，可以显示本文所述治疗和/或预防的适用性或需求。
实施例1.噬菌体免疫库的制备
羊驼免疫或合成库构建
1.1选取健康成年羊驼(成都阿帕克公司)2只，将0.5mg重组蛋白抗原人VEGF C(北京义翘公司)与弗氏佐剂按1:1比例混匀，背部皮下多点注射的方式免疫羊驼，共免疫四次，免疫间隔为2周。
1.2采集50ml羊驼外周血，分离淋巴细胞，按照每2.5×10
7个活细胞加入1mL Trizol试剂(THERMO公司)，采用氯仿/异丙醇沉淀方法抽提总RNA。取10ug RNA作为模板，使用PrimeScript逆转录试剂盒(Takara公司)进行反转录。将cDNA作为模板，通过PCR扩增产生VHH编码核酸，之后插入噬菌体展示载体，所述载体将表达并展示带有Flag标签和六组氨酸标签的VHH片段与噬菌体gpIII蛋白的融合多肽；以展示载体转化大肠杆菌TG1感受态细胞，构建产生VHH抗体文库。
简言之，以cDNA为模板，进行第一轮PCR反应和第二轮PCR反应(具体方法参考J Immunol Methods.2007 July 31；324(1-2):13–25)。将pC3-HF载体和第二轮PCR产物分别使用SacI和SalI(Thermo公司)进行双酶切，酶切产物加入T4连接酶(Thermo公司)反应，电转化TG1感受态细胞，构建VHH抗体文库，将菌液在-80℃冻存。
取复苏的菌液接种至100ml YT-AG培养基(上海生工公司)中，加入辅助噬菌体进行感染，用2×YT-AK培养基(上海生工公司)重悬菌体，37℃200rpm培养过夜。收集培养上清，采用PEG/NaCl沉淀方法制备重组噬菌体。
1.3重组噬菌体使用生物素标记抗原VEGFC(北京义翘公司)进行3轮淘洗实验。每管加入50ul Dynabeads
TMM280磁珠(Thermo公司)和适量生物素标记抗原，室温孵育30分钟后，加入1x10
12cfu重组噬菌体室温孵育1小时。将获得的混合物加入1ml PBST洗涤10次，每次洗涤时间5分钟。最后加入0.5ml pH2.5甘氨酸缓冲液，洗脱抗原结合的重组噬菌体，侵染TG1过夜培养，通过辅助噬菌体感染，制 备重组噬菌体，用于下一轮淘洗实验并且鉴定包含阳性VHH的TG1细菌克隆。
1.4 Binding ELISA检测结合活性和克隆测序。
提前取VEGFC抗原(北京义翘公司)用PBS缓冲液稀释成0.5ug/ml，包被96孔ELISA板，4℃冰箱过夜。抗原包被板用PBST洗3遍，加入封闭剂至300ul/孔，室温静置封闭1小时。PBST洗3遍，加入80ul封闭剂+20ul上述1.3鉴定的阳性VHH的TG1菌的表达上清，室温振荡1小时。
PBST洗3遍，加入封闭剂稀释的Anti-Flag/HRP二抗(Sigma公司)100ul/孔，室温震荡40分钟。PBST洗6遍，加入TMB显色液至100ul/孔，避光显色5-15分钟。再加入100ul/孔终止液。酶标仪读数，测定OD450nm吸光值。选取读值大于0.5的细菌克隆送金唯智测序，选取含有各个对应VHH序列的TG1菌单克隆加入甘油，冻于-80℃冰箱。
实施例2.原核抗体的生产和纯化
利用上述获得的含有阳性VHH的TG1单克隆表达纯化获得VHH抗体蛋白。
取实施例1鉴定的含有VHH表达质粒的TG1菌，接种到800ml LB-Amp培养基中，37℃200rpm培养至OD600值0.5-0.6。菌液加入1mM IPTG诱导VHH片段表达，28℃200rpm培养过夜。收集培养上清，离心后加入15ml PB+1mg/ml多粘菌素重悬,裂解细菌周质腔，再次离心，0.22um滤膜过滤。将周质腔裂解液流过1ml Ni Sepharose预装柱，加入PBS洗涤2次，加入0.5M咪唑洗脱目标蛋白，用紫外法测定蛋白浓度。洗脱的目标蛋白用紫外法测定蛋白浓度，分装多管置于-40度冰箱保存。
通过羊驼VHH文库筛选获得共有如下HCDR基序的2个抗VEGF C VHH抗体(LA49G9和LA63G12)：
HCDR1：GSXFSXYAMG；
HCDR2：ATTSGGSTLYADSVKG；
HCDR3：XWRGSDPENY。
在获得的此2个VHH抗体基础上，产生人源化VHH抗体(LA49G9.2和LA63G12.1)和亲和力成熟的人源化VHH抗体(am63G12-14B11和am63G12-5G8-18B9)。
本发明VHH抗体的CDR氨基酸序列和VHH氨基酸序列，以及序列编号请参见序列表和图19。
在以下实施例的VHH抗体生物活性检测实验中，人源化LA49G9.2和LA63G12.1分子相关实验使用二聚化VHH-Fc抗体进行，其余使用VHH单域抗体进行。
实施例3生物膜薄层干涉技术测定本发明抗体与抗原的结合动力学
采用生物膜薄层干涉测定技术(ForteBio)测定本发明抗体结合人VEGF C的平衡解离常数(KD)。ForteBio亲和力测定按照现有的方法(Estep,P等人，High throughput solution Based measurement of antibody-antigen affinity and epitope binning.MAbs,2013.5(2):第270-8页)进行。
实验开始前半个小时，根据样品数量，取合适数量的AMQ(Pall，1506091)(用于样品检测)或AHQ(Pall，1502051)(用于阳性对照检测)传感器浸泡于SD buffer(PBS 1×，BSA 0.1％，Tween-20 0.05％)中。
取100μl的SD缓冲液、抗体、抗原(人VEGF C(北京义翘))，加入到96孔黑色聚苯乙烯半量微孔板(Greiner，675076)中。根据样品位置布板，选择传感器位置。仪器设置参数如下：运行步骤：Baseline、Loading～1nm、Baseline、Association和Dissociation；各个步骤运行时间取决于样品结合和解离速度，转速为400rpm，温度为30℃。使用ForteBio分析软件分析K
D值。
在以上测定法所述的实验中，抗体的亲和力如表1所示：
表1.ForteBio检测抗原抗体单价结合的亲和力(affinity)常数(平衡解离常数)
表2.ForteBio检测抗原抗体双价结合的亲合力(avidity)常数(平衡解离常数)
*代表解离常数超过ForteBio检测极限
在以上试验中，抗体LA49G9、LA63G12与人VEGFC的单价KD值分别为1.00E-08M、1.64E-08M，亲和力成熟的抗体Am63G12-14B11和Am63G2-5G8-18B9的结合亲和力有进一步提升，单价KD值分别为6.21E-09M、5.70E-09M。抗体LA49G9、LA49G9.2、LA63G12、LA63G12.1与人VEGFC双价亲合力的KD值分别为6.13E-10M、6.45E-10M、6.56E-10M、6.22E-10M。
实施例4 anti-VEGFC VHH抗体ELISA阻断实验
测定本发明抗体对于hVEGFC与受体KDR结合的阻断作用。
将SA(链霉亲和素，streptavidin)稀释成1ug/ml，100ul/孔铺于酶标版中4℃过夜。PBST洗3遍，加入3％BSA封闭1.5h。PBST洗3遍，加入50ng/ml VEGFC-biotin(生物素标记的人VEGF C)，孵育1.5h。提前将抗体50ul与VEGFR2-Fc(终浓度0.2ug/ml，北京义翘)或VEGFR3-Fc(终浓度0.2ug/ml，北京义翘)孵育20min后加入板中。PBST洗3遍，加入抗human FcHRP抗体(1:10000稀释BETHYL)孵育30min。PBST洗6遍，TMB(SOLARBIO)显色5min，终止后OD450nm读数。
本发明获得的抗VEGF VHH抗体的阻断结果如图1所示。候选分子LA49G9,LA63G12及人源化抗体LA63G12.1和亲和力成熟分子Am63G12-14B11和Am63G2-5G8-18B9抗体，均能够阻断VEGFC与VEGFR2及VEGFR3结合，两个亲和力成熟分子与阳性对照分子OPT-302(VEGF-C-trap，SEQ ID NO:52)具有基本相当的阻断IC50值。
实施例5 anti-VEGFCVHH抗体阻断VEGFC诱导的HEK293 KDR reporter激活实验
VEGFC可以与相关受体VEGFR2(KDR)结合，激活VEGFR2信号通路，诱导血管内皮细胞存活，增殖和迁移等作用。本研究利用KDR reporter实验体系，使用NFAT-RE-luc2P/KDR HEK293细胞(Promega Cat CS181401)，检测梯度稀释的抗体对VEGFC激活相关受体信号通路的阻断作用。
实验方法参考供应商说明：
将提前3天换成实验培养基(含10％FBS的DMEM培养基)的NFAT-RE-luc2P/KDR HEK293细胞取出，吸除旧培养基，用PBS洗涤一次，之后用1ml Accutase solution(Sigma公司)消化细胞，直至细胞变圆脱壁，用5ml稀释培养基(含10％FBS的DMEM培养基)终止反应，吸取细胞至离心管中，1000rpm离心5min，弃去培养基，加入10ml稀释培养基重悬细胞，混匀后计数，细胞活率应在90％以上。用稀释培养基调整细胞密度至0.8×10
6个/ml，50μl/孔按照实验布局加入96孔白色细胞培养板中。
配置浓度为200ng/ml hVEGFC(R&D)和梯度稀释的待测抗体(包括本发明VHH抗体、阳性对照分子(OPT-302)和阴性对照抗体(IgG同种型对照抗体))混合液，静置30min，然后以50μl/孔加入含有细胞的96孔白色细胞培养板中，放入37℃、5％二氧化碳培养箱中孵育6h。同时设置不加任何抗体和VEGFC的空白(blank)对照组；以及仅加入VEGFC而不加入任何抗体的VEGF-C实验组。
从二氧化碳培养箱中取出已孵育6h的96孔白色细胞培养板，平衡10～15min至室温。将提前拿出平衡至室温的Bio-Glo Luciferase Assay System(Promega)按照实验布局以100μl/孔加入96孔白色细胞培养板中，室温避光孵育5min。
使用多功能酶标仪进行荧光读值，读板模式选择化学发光模式、读板类型选择终点法、波长设定为全波长，逐列收集荧光，每列收集时间为1000ms。
结果如图2所示，LA63G12和LA49G9可完全抑制VEGFC诱导的KDR信号通路激活。
实施例6 anti-VEGFC VHH抗体抑制VEGFC诱导的BaF3-FLT4细胞增殖实验
本研究将抗体和重组人VEGFC蛋白共同孵育过表达FLT4(VEGFR3)的BaF3细胞(中国医学科学院基础医学研究所)，BaF3-FLT4。通过CCK-8试剂盒(同仁化学)检测活细胞数量，从而反映出不同抗体对VEGFC诱导的BaF3-FLT4增殖的抑制作用。
使用携带FLT4基因的慢病毒感染BaF3细胞，获得过表达FLT4的BaF3细胞BaF3-FLT4。
按照CCK-8试剂盒说明书进行细胞增殖抑制试验。使用含10％FBS的1640培养基配置实验培养基。测试抗体(包括本发明VHH抗体、阳性对照分子(OPT-302)和阴性对照抗体(IgG同种型对照抗体))最高终浓度为20ug/ml，依次1:3等比稀释。同时设置不加任何抗体和VEGFC的空白对照组(blank)；以及仅加入VEGFC而不加入任何抗体的VEGF-C实验组。在测试体系中，hVEGFC(R&D)终浓度为20ng/ml，BaF3-FLT4细胞终浓度为2*10
5cell/ml。在96孔板中用每孔体系100ul，37摄氏度CO2培养箱孵育72h。
之后，每孔加入15ul CCK-8，37摄氏度CO2培养箱孵育4h。采用双波长测定吸光度值检测波长为450nm，参考波长为620nm。测定OD450-OD620值。
实验结果如图3所示。本发明的抗体LA63G12和LA49G9均可以在体外有效抑制hVEGFC诱导的BaF3-FLT4存活和增殖。
实施例7 anti-VEGFC VHH抗体人源化及活性检测及蛋白表达纯化
LA49G9和LA63G12抗体经过以下步骤进行人源化：
①确定CDR环结构；
②在人种系序列数据库为每个V/J区域找到最接近的同源序列；
③筛选与重链最匹配的人种系以及最低量的回复突变；
④将嵌合抗体的CDR区构建至人的骨架区上；
⑤使用序列和结构特征，确定骨架区中起到维持CDR功能的氨基酸位置；
⑥在确定为重要的序列位置进行回复突变(返回到输入氨基酸类型)；
⑦优化风险位点的氨基酸。
获得人源化抗体LA49G9.2和LA63G12.1并测序抗体序列。
制备包含编码抗VEGFC抗体的核酸的质粒用于293细胞转染和表达VHH单域抗体或VHH-Fc抗体。根据所需转染体积传代expi-293细胞(Invitrogen)，转染前一天将细胞密度调整至1.5×10
6个细胞/ml。转染当天细胞密度约为3×10
6个细胞/ml。取终体积1/10的F17培养基(Gibco，A13835-01)作为转染缓冲液，加入适当的质粒，混匀。加合适的聚乙烯亚胺(PEI)(Polysciences，23966)到质粒中(质粒与PEI的比例在293F细胞中为1:3)，混匀后室温孵育10min，获得DNA/PEI混合物。用DNA/PEI混合物重悬细胞后，36.5℃，8％的CO2，孵育24h，之后补加转染体积2％的FEED(Sigma)，于36.5℃，120rpm，8％的CO2条件下培养。连续培养至第6天或者细胞活力≤60％时，收集细胞上清进行纯化。
纯化前将收集的培养基4500rpm离心30min，弃掉细胞。再将上清使用0.22μl的滤器过滤。使用10 ml结合缓冲液(磷酸钠20mM.NaCl 150mM,PH7.0)平衡Protein A柱(Hitrap Mabselect Sure 5*5ml，GE，11-0034-95)。将过滤后的上清加入纯化柱后使用15ml结合缓冲液再平衡。加5ml洗脱缓冲液(柠檬酸+柠檬酸钠0.1M,pH3.5)，收集洗脱液，每1ml的洗脱液加入80μl Tris-HCl。将收集的抗体超滤浓缩交换到PBS(Gibco，70011-044)中，并检测浓度。
按照实施例3-6所描述的方法，测定人源化抗体的活性。结果分别显示在上表1和2以及图1和图4和图5中。结果表明，人源化抗体与亲本抗体具有相当的抗原hVEGF C结合活性和VEGFR2/VEGFR3受体阻断活性；在基于细胞的试验中阻断VEGF C诱导的VEGFR2信号通路激活(图4)，并阻断VEGFC结合VEGFR3诱导的Baf3-FLT4细胞增殖(图5)。
实施例8 anti-VEGF C VHH亲和力成熟
选取LA63G12.1人源化单域抗体基因为模板，针对抗原结合区(CDR)引入氨基酸随机突变，设计和合成含有NNK密码子的兼并引物(Genewiz公司)，以及框架区特异性引物。采用重叠延伸PCR(OE-PCR)方法扩增抗体突变体基因文库。采用同实施例1相同的方法进行PCR片段和载体酶切，连接，转化TG1菌，制备重组噬菌体文库，进行3轮噬菌体淘洗，并按照实施例2进行原核蛋白表达，ELISA检测克隆结合活性和测序分析。最终选择2个亲和力明显提高的突变体，克隆号am63G12-14B11，和am63G12-5G8-18B9。按照实施例7进行真核VHH单域抗体表达。
亲和力成熟VHH检测方法如实施例4，实施例5，实施例6描述进行。结果分别显示在图1，图6和图7中。结果表明，亲和力成熟抗体相对于亲本抗体，在抗VEGFC生物学活性上有进一步提升。
实施例9 anti-VEGFA/VEGF C双特异性抗体构建
以LA63G12，LA63G12.1，am63G12-14B11，am63G12-5G8-18B9构建抗VEGFA/VEGFC双特异性抗体，并按照实施例7在293细胞中进行真核蛋白表达。简言之：
将VHH单域抗体通过接头连接在VEGF-Trap(Aflibercept,Eylea,阿柏西普)的Fc区C末端，构建图18A所示的包含第一多肽链和第二多肽链的双特异性抗体。VEGF-Trap是由来自人VEGF受体1和2的VEGF-A结合结构域部分(SEQ ID No:26)在C端融合人IgG1Fc区(SEQ ID No:27)组成的重组融合蛋白(SEQ ID No:25)；以二聚体形式，提供高亲和力VEGF_A结合并阻断VEGF_A诱导的VEGFR信号通路激活。
将VHH单域抗体通过接头连接在抗VEGF_A抗体Lucentis(ranibizumab)的Fab部分的C末端，构建图18B所示的包含第一多肽链和第二多肽链的双特异性抗体。Lucentis是重组人源化IgG1kappa同种型单克隆抗体，其中具有SEQ ID NO:28所示氨基酸序列的VH-CH1多肽链与具有SEQ ID NO:29所述氨基酸序列的VL-CL多肽链配对形成Fab，结合并抑制人VEGF-A的生物学活性。
下表3列出了构建的双特异性抗体及其组成。
实施例10 anti-VEGFA/VEGF C双特异性抗体阻断VEGFA或C诱导的HEK293 KDR reporter激活实验
VEGFA或VEGF C可以与相关受体VEGFR2(KDR)结合，激活VEGFR2信号通路，诱导血管内皮细胞存活，增殖和迁移等作用。本研究利用KDR reporter实验体系，使用NFAT-RE-luc2P/KDR HEK293细胞(Promega Cat CS181401)，检测梯度稀释的抗体对VEGFA和VEGF C激活相关受体信号通路的阻断作用。实验方法基本按照实施例5中的描述进行。简言之，准备含有NFAT-RE-luc2P/KDR HEK293细胞(0.8×10
6个/ml，50μl/孔)的96孔白色细胞培养板。配置浓度为100ng/ml hVEGFA(R&D)或200ng/ml hVEGFC(R&D)和梯度稀释的待测抗体混合液，静置30min。将50μl/孔混合液加入含有NFAT-RE-luc2P/KDR HEK293细胞的96孔白色细胞培养板中，放入37℃、5％二氧化碳培养箱中孵育6h。同时设置不加任何抗体和VEGFC的空白对照组(blank)；以及仅加入VEGFC而不加入任何抗体的实验组；以及加入VEGFC和IgG同种型对照抗体的实验组。作为比较，也检测了抗VEGF A分子IBI304(SEQ ID NO:53)和双特异性抗体Faricimab(抗Ang-2/抗VEGF-A)的VEGF-A信号通路阻断活性；以及抗VEGF-C分子OPT-302的VEGF-C信号通路阻断活性。
从二氧化碳培养箱中取出已孵育6h的96孔白色细胞培养板，平衡10～15min至室温。将提前拿出平衡至室温的Bio-Glo Luciferase Assay System(Promega)按照实验布局以100μl/孔加入96孔白色细胞培养板中，室温避光孵育5min。
使用多功能酶标仪进行荧光读值，读板模式选择化学发光模式、读板类型选择终点法、波长设定为全波长，逐列收集荧光，每列收集时间为1000ms。
检测结果在图8中显示和图9显示。测试的anti-VEGFA和anti-VEGFC双特异性抗体均可阻断VEGFA(图8)或VEGFC(图9)诱导的KDR信号通路激活。
实施例11 anti-VEGFA/VEGF C双特异性抗体抑制VEGFC诱导的BaF3-FLT4增殖实验
将本发明上述双特异性抗体应用于BaF3-FLT4增殖实验体系中检测抗体对VEGFC诱导的BaF3-FLT4增殖的影响。实验方法基本按照实施例6中描述进行。
使用含10％FBS的1640培养基配置实验培养基。测试抗体最高终浓度为10nM，依次1:3等比等比稀释。在测试体系中，hVEGFC(R&D)终浓度为20ng/ml，BaF3-FLT4细胞终浓度为2*10
5cell/ml。
在测定中，设置不加任何抗体和VEGFC的空白对照组(blank)；以及仅加入VEGFC而不加入任何抗体的实验组；和加入VEGFC和IgG同种型对照抗体的实验组。同时作为比较，也检测了抗VEGF-C分子OPT-302对VEGFC诱导的BaF3-FLT4细胞增殖的抑制活性。
检测结果如图10显示，测试的anti-VEGFA/VEGFC双特异性抗体均可抑制VEGFC诱导的BaF3-FLT4细胞增殖。
实施例12 anti-VEGFA/VEGF C双特异性抗体抑制VEGFA+VEGFC诱导的HUVEC增殖实验
VEGFA和VEGFC可作用于血管内皮细胞中VEGFR等相关的受体，促进血管内皮细胞存活，增殖和迁移，进而诱导新生血管化，本实验采用VEGFA和VEGFC共同诱导人脐静脉内皮细胞(HUVEC)存活和增殖，检测抗体对VEGFA和VEGFC诱导的原代细胞存活和增殖的抑制作用。本实施例通过CCK-8测定HUVEC的存活和增殖，具体方法如下：提前一天处理细胞，2000cell/孔铺于96孔培养板中，放入37℃、5％二氧化碳培养箱中孵育24小时。待细胞贴壁后，配置含或不含终浓度为5ng/ml VEGF A和50ng/ml VEGFC和/或梯度稀释的抗体的实验培养基(DMEM培养基)，置换96孔板中内皮细胞培养基，放入37℃、5％二氧化碳培养箱中孵育72小时。实验分组如下：
Blank组：DMEM培养基
VEGFA组：DMEM培养基+5ng/ml VEGF A
VEGFC组：DMEM培养基+50ng/ml VEGF C
VEGFA+VEGFC组：DMEM培养基+5ng/ml VEGF A+50ng/ml VEGF C
IgG组：DMEM培养基+5ng/ml VEGFA+50ng/ml VEGF C+同种型对照IgG
IBI304+OPT-302组:DMEM培养基+5ng/ml VEGF A+50ng/ml VEGF C+IBI304+OPT-302(IBI304与OPT-302按1:1摩尔浓度比组合)；
双特异性抗体组：EGM-2培养基+5ng/ml VEGF A+50ng/ml VEGF C+待测双特异性抗体。
细胞用实验培养基孵育后，以10μl/孔加入CCK-8检测液(同仁化学)，放入37℃、5％二氧化碳培养箱中孵育12～24小时。使用多功能酶标仪进行吸光度OD
450-OD
620读值。
在以上测定法所述的实验中，检测结果如图11所示。测试的anti-VEGFA和anti-VEGFC双特异性抗体能够完全抑制VEGFA+VEGFC诱导HUVEC细胞增殖和存活。
实施例13 anti-VEGFA/VEGF C双特异性抗体抑制VEGFA+VEGFC诱导的HUVEC成管实验
VEGF A和VEGF C可作用于血管内皮细胞，促进血管内皮细胞形成管腔样结构，进而诱导新生血管结构形成。本实验采用VEGFA和VEGF C诱导人脐静脉内皮细胞(HUVEC)管腔形成，检测抗体对VEGF A和VEGF C诱导的原代细胞管腔形成的抑制作用。
本实施例通过HUVEC的管腔实验检测anti-VEGFA/VEGF C双特异性抗体抑制HUVEC管腔形成，具体方法如下：提前一天将matrigel(BD)放置于冰上融化，每孔加入100ul于96孔板，并放置在37℃O2培养箱固化半小时。Accutase solution处理细胞，20000cell/孔铺于96孔培养板中，放入37℃、5％二氧化碳培养箱中孵育24小时。配置含或不含终浓度为10ng/ml VEGF A和50ng/ml VEGF C和/或梯度稀释的抗体的实验培养基(EGM2)。使用不同的实验培养基重悬HUVEC细胞，20000cell/孔铺于96孔培养板中，放入37℃、5％二氧化碳培养箱中孵育24小时。实验分组如下：
Blank组：EGM-2培养基
VEGFA组：EGM-2培养基+5ng/ml VEGFA
VEGFC组：EGM-2培养基+50ng/ml VEGFC
VEGFA+VEGFC组：EGM-2培养基+5ng/ml VEGFA+50ng/ml VEGFC
IgG组：EGM-2培养基+5ng/mlVEGFA+50ng/mlVEGFC+20nM同种型对照IgG
IBI304+OPT-302组:EGM-2培养基+5ng/ml VEGFA+50ng/ml VEGFC+20nM IBI304+20nM OPT-302
IEX04-056组:EGM-2培养基+5ng/ml VEGFA+50ng/ml VEGFC+20nM IEX04-056
IEX04-067组:EGM-2培养基+5ng/ml VEGFA+50ng/ml VEGFC+20nM IEX04-067。
显微镜拍摄图像计算管腔数量。检测结果如图12所示。图12A显示管腔形成图像；图12B显示管腔形成统计结果。anti-VEGF A和anti-VEGF C双特异性抗体能够完全抑制VEGF A+VEGF C诱导的HUVEC细胞管腔形成。
实施例14 anti-VEGFA/VEGFC双特异性抗体抑制A375肿瘤新生血管化实验
肿瘤细胞过表达VEGFA和VEGFC可在体内诱导新生血管化形成，并促进肿瘤生长。
本实施例通过将A375人恶性黑色素瘤细胞以3*10
6cell接种每只小鼠，在nude小鼠中测定本发明的抗VEGFA/VEGF C抗体的抗新生血管化和抗肿瘤作用。
人nude小鼠：
雌性BALB/c背景的nude小鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司,等级为SPF级。小鼠在到达后驯化7天，随后开始研究。
细胞：
人A375细胞购自ATCC(CAT#:CRL-1619)，并严格按照说明书进行常规传代培养用于后续体内实验。离心收集细胞，在无菌PBS中重悬细胞并调整细胞密度为1.5×10
7个/ml。在第0天取0.2ml细胞悬液皮下接种至人小鼠腋下建立A375荷瘤小鼠模型。
给药：
小鼠随机分组(每组6只小鼠)。肿瘤细胞接种7天和21后检测各只小鼠瘤体积。给药剂量和方式如 表4所示，PBS(购自Gibco)作为阴性对照，分别在接种后第1、3、5、7、9、11、13、15、17、19天给药，每周2次监测小鼠瘤体积与体重。在每次给药前测定体重和肿瘤体积，接种后第21天计算相对肿瘤抑制率(TGI％)，计算公式如下：TGI％＝100％*(对照组肿瘤体积-治疗组肿瘤体积)/(对照组肿瘤体积-对照组给药前肿瘤体积)。肿瘤体积测定：采用游标卡尺测定肿瘤的最大长轴(L)和最大宽轴(W)，肿瘤体积按如下公式计算：V＝L×W
2/2。采用电子天平测定体重。
表4.实验设计
肿瘤抑制率结果如图13A和B和表5所示：在接种后第21天，IEX04-056单药不同剂量均显示肿瘤抑制效果。接种后第21天1mg/kg肿瘤抑制率为54％，5mg/kg肿瘤抑制率分别为71％,25mg/kg肿瘤抑制率分别为74％。因此，本发明针对VEGF A和VEGFC双特异性结合分子对肿瘤有明显的抑制效果。
表5.第21天肿瘤抑制率
对接种后第7天和第21天的肿瘤组织进行切片和CD31(血管内皮标志物)染色，显示肿瘤组织中的微血管生成。将OCT包埋剂包埋的蜡块置于冰冻切片机中，将蜡块切成6um厚度的切片。
1.室温放置30min，随后用预冷的丙酮于4摄氏度固定，室温晾干。
2.PBST浸泡涮洗三次，5min一次(PBST:1XPBS+0.05％Tween20)；
3.免疫组化笔画圈，之后用10％山羊血清(PBST稀释)封闭，每个组织滴加100ul，室温封闭；
4.直接滴加100ul一抗PE-anti-mouse CD31在4℃孵育过夜；
5.第二天用PBST浸泡涮洗三次，5min一次；
6.DAPI染细胞核，每个组织滴加100ul，避光孵育5min；
7.弃去DAPI染色液，PBST浸泡涮洗三次，5min一次；
用抗荧光淬灭封片剂(prolong diamond antifade mountant，Invitrogen)进行封片。随后用全自动定量分析扫描仪进行扫描。结果如图13C所示，IEX04-056治疗后A375肿瘤新生血管显著减少。
实施例15.激光诱导的脉络膜新生血管化药效试验
本实验采用食蟹猴激光诱导的脉络膜新生血管化模型，测定本发明的anti-VEGFA/VEGFC双特异性抗体的抗新生血管化作用。
种属：食蟹猴；等级：普通级；年龄：2.5～5岁；体重：2.45～5.55kg，均数4.02kg；造模时体重3.35～4.35kg。
本试验采用激光围绕恒河猴眼底黄斑中心凹实施光凝，诱导眼底脉络膜血管新生，建立与人类脉络膜新生血管类似的动物模型。光凝前及光凝后20天进行荧光素眼底血管造影，判定造模情况。选择造模成功的16只恒河猴(雌雄各半)分4组，分别为模型对照组、IEX04-056组、IEX04-067组、Eylea+OPT-302组，每组4只猴。光凝后21天，分别按下表6中剂量进行给药，双眼玻璃体注射给予IEX04-056、IEX04-067、或Eylea+OPT-302，模型对照组给与等体积的0.9％氯化钠注射液。各组动物分别于给药后7、14、21、28天进行眼底彩色照相、荧光素眼底血管造影，光学相干断层扫描检查，观察供试品对脉络膜新生血管的抑制情况。于给药后29天实施安乐死后取双眼进行HE染色组织学检查。
表6.实验设计
眼底彩色照相及荧光造影检查
评价指标：
(1)荧光斑评级
造模后荧光造影所摄光斑的分级标准：
1级：光斑没有出现高荧光；
2级：光斑高荧光但没有荧光素渗漏；
3级：光斑高荧光，轻度荧光素渗漏，渗漏不超过光斑边缘；
4级：光斑高荧光，显著荧光素渗漏，渗漏超过光斑边缘。
统计1-4级光斑，每次检查均需记录眼底激光斑等级。
(2)荧光素渗漏面积改善率
荧光素渗漏面积改善率(％)＝(给药前荧光素渗漏面积-给药后荧光素渗漏面积)/给药前荧光素渗漏面积*100％
(3)荧光素渗漏面积减少量
荧光素渗漏面积减少量＝给药前荧光素渗漏面积－给药后荧光素渗漏面积
光学相干断层扫描(OCT)
评价指标：
1)眼底视网膜增厚改善率
眼底视网膜增厚改善率(％)＝给药前视网膜厚度-给药后视网膜厚度100
给药前视网膜厚度-造模前视网膜厚度
(2)眼底视网膜厚度减少量
眼底视网膜厚度减少量＝给药前视网膜厚度-给药后视网膜厚度
眼底彩色照相及荧光造影检查结果如图14-15所示，结果显示，本发明抗体在给药28天后即显示出显著的抗新生血管化作用，证明本发明抗体对激光诱导的眼底新生血管化有明显的抑制效果(P<0.001)，同时具有保护血管完整性功能。OCT结果如图16所示，结果显示本发明抗体在给药后14～28天显著抑制视网膜增厚(P<0.05)，证明本发明抗体具有抑制新生血管化引起的视网膜水肿，和增厚的功能。
组织病理学检查
恒河猴给药29天后根据体重以戊巴比妥钠麻醉(静脉注射约30mg/kg，可根据动物健康状况调整剂量)，腹主动脉或股动脉放血安乐死，进行大体观察，并摘取双侧眼球。
部分动物双眼以改良的Davidson’s固定液固定，石蜡包埋切片，并选取激光造模区域进行常规HE染色等组织病理学检查。
本发明抗体在病理切片中相对于抗VEGFA分子Eylea与抗VEGFC分子OPT-032的联合，能够更好的改善激光损伤部位水肿，增生，纤维化等病理改变，显示了更好的视网膜形态学改善(图17A和图17B)。
序列表
Claims (24)
- 一种与人VEGF C特异性结合的单域抗体(dsAb)多肽，其包含由3个CDR和4个FR组成的下式的VHH结构域，FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4；其中所述VHH结构域包含：(i)包含SEQ ID NO:1所示氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成的CDR1，包含SEQ ID NO:2所示氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成的CDR2，和包含SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成的CDR3；(ii)包含SEQ ID NO:9所示氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成的CDR1，包含SEQ ID NO:10所示氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成的CDR2，和包含SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成的CDR3；(iii)包含SEQ ID NO:17所示氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成的CDR1，包含SEQ ID NO:18所示氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成的CDR2，和包含SEQ ID NO:19所示的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成的CDR3；或(iv)包含SEQ ID NO:21所示氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成的CDR1，包含SEQ ID NO:22所示氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成的CDR2，和包含SEQ ID NO:23所示的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成的CDR3。
- 权利要求1的多肽，其中所述VHH结构域包含：(i)选自SEQ ID NOs:4,8,12,16,20和24的氨基酸序列，优选SEQ ID NO:20的氨基酸序列，更优选SEQ ID NO：24的氨基酸序列；或(ii)与(i)的氨基酸序列具有至少80％,85％,90％,91％,92％,93％,94％,95％,96％,97％,98％,99％或以上的同一性的氨基酸序列；或(iii)相对于(i)的氨基酸序列具有至少1-30个，或1-20个，或1-15个，或1-10个，或1-5个氨基酸改变(例如，替代，缺失和/或插入，优选替代，更优选保守替代)的氨基酸序列。
- 权利要求1的多肽，其中所述VHH结构域为人源化的。
- 权利要求1的多肽，其中所述单域抗体多肽为由所述VHH结构域组成的单链抗体多肽。
- 包含至少一个权利要求1的单域抗体多肽的蛋白，例如融合蛋白或嵌合多肽，优选地，所述蛋白是VHH-Fc抗体。
- 一种双特异性结合蛋白，其包含(i)与人VEGF C特异性结合的第一抗原结合组分；和(ii)与人VEGF A特异性结合的第二抗原结合组分，其中所述第一抗原结合组分包含权利要求1-4任一项的单域抗体多肽；且所述双特异性结合蛋白抑制VEGF A与其VEGF受体结合并抑制VEGF C与其VEGF受体结合。
- 权利要求6的双特异性结合蛋白，其中所述第一抗原结合组分通过接头与第二抗原结合组分连接，优选地，所述接头包含G(G4S)n或(G4S)n氨基酸序列，n＝1,2,3,4,或5的整数，优选n＝2或3或4。
- 权利要求6或7的双特异性结合蛋白，其中所述第二抗原结合组分选自抗VEGF A抗体(例如， 单链Fv抗体、Fab抗体、Fab'抗体、(Fab)2抗体、单域抗体和纳米抗体)、或VEGF-A Trap分子、或包含VEGFA结合结构域的Fc融合蛋白。
- 权利要求8的双特异性结合蛋白，其中所述第二抗原结合组分为包含VEGF-A结合结构域的Fc融合蛋白，优选地其包含与人IgG Fc的N端融合的VEGF-A结合结构域，例如，来自VEGFR1和/或VEGFR2受体的VEGF-A结合结构域，优选地，所述VEGF-A结合结构域包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列或与其至少85％,90％,95％,96％,97％,98％,99％序列同一性的氨基酸序列；更优选地，VEGF-A结合结构域-Fc融合多肽包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列或与其至少85％,90％,95％,96％,97％,98％,99％序列同一性的氨基酸序列。
- 权利要求9的双特异性结合蛋白，其中所述结合VEGF A的单域抗体多肽连接在所述Fc融合多肽的C末端。
- 权利要求10的双特异性结合蛋白，其中所述蛋白包含第一多肽链和第二多肽链，其中：第一多肽链和第二多肽链相同并各自包含选自SEQ ID NOs:40-41和44-47的氨基酸序列或与其具有至少85％,90％,95％,96％,97％,98％,99％序列同一性的氨基酸序列，优选地，第一多肽链和第二多肽链相同并各自包含SEQ ID NO:47所示的氨基酸序列。
- 权利要求6或7的双特异性结合蛋白，其中所述第二抗原结合组分包含由VH-CH1和VL-CL组成的抗VEGF-A Fab抗体，优选地，所述VH包含SEQ ID NOs:34-36的HCDR1-3的氨基酸序列且所述VL包含SEQ ID NOs:37-39的LCDR1-3的氨基酸序列；更优选地，所述VH包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列，且所述VL包含SEQ ID NO:32的氨基酸修理；再优选地，所述Fab片段包含SEQ ID NO:28和SEQ ID NO:31的氨基酸序列。
- 权利要求12的双特异性结合蛋白，其中所述单域抗体多肽连接，优选地通过接头连接，在所述Fab抗体的VH-CH1和/或VL-CL的C末端。
- 权利要求13的双特异性结合蛋白，其中所述蛋白包含第一多肽链和第二多肽链，其中：第一多肽链包含与所述Fab抗体的VH-CH1多肽的C末端融合的所述单域抗体多肽；且第二多肽链包含与所述Fab抗体的VL-CL多肽的C末端融合的所述单域抗体多肽。
- 权利要求14的双特异性结合蛋白，其中第一多肽链和第二多肽链选自：-包含SEQ ID NO:42的氨基酸序列或与其具有至少85％,90％,95％,96％,97％,98％,99％序列同一性的氨基酸序列的第一多肽链，和包含SEQ ID NO:43的氨基酸序列或与其具有至少85％,90％,95％,96％,97％,98％,99％序列同一性的氨基酸序列的第二多肽链；-包含SEQ ID NO:48的氨基酸序列或与其具有至少85％,90％,95％,96％,97％,98％,99％序列同一性的氨基酸序列的第一多肽链，和包含SEQ ID NO:49的氨基酸序列或与其具有至少85％,90％,95％,96％,97％,98％,99％序列同一性的氨基酸序列的第二多肽链；-包含SEQ ID NO:50的氨基酸序列或与其具有至少85％,90％,95％,96％,97％,98％,99％序列同一性的氨基酸序列的第一多肽链，和包含SEQ ID NO:51的氨基酸序列或与其具有至少85％,90％,95％,96％,97％,98％,99％序列同一性的氨基酸序列的第二多肽链，优选地，所述第一多肽链包含SEQ ID NO:48所示氨基酸序列且所述第二多肽链包含SEQ ID NO:49 所示氨基酸序列。
- 编码权利要求1-4的单域抗体多肽、权利要求5的蛋白或权利要求6-15的双特异性结合蛋白的多核苷酸。
- 包含权利要求16的多核苷酸的表达载体。
- 转染了权利要求17的载体的宿主细胞。
- 产生权利要求1-4的单域抗体多肽、权利要求5的蛋白或权利要求6-15的双特异性结合蛋白的方法，包括培养权利要求18的宿主细胞，和回收产生的单域抗体多肽或双特异性结合蛋白。
- 包含权利要求1-4的单域抗体多肽、权利要求5的蛋白或权利要求6-15的双特异性结合蛋白和药学可接受载体的药物组合物。
- 治疗新生血管化相关疾病的方法，包括向受试者施用权利要求1-4的单域抗体多肽、权利要求5的蛋白或权利要求6-15的双特异性结合蛋白或其药物组合物。
- 权利要求21的方法，其中所述疾病为实体瘤，优选黑素瘤，其中所述双特异性结合蛋白的施用抑制肿瘤内的新生血管形成和/或肿瘤的生长。
- 权利要求21的方法，其中所述疾病为眼部疾病，优选老年黄斑变性，糖尿病性视网膜病变，视网膜血管阻塞和角膜新生血管化。
- 权利要求1-4的单域抗体多肽、权利要求5的蛋白或权利要求6-15的双特异性结合蛋白在制备在受试者中治疗和/或预防疾病的药物和/或用于制备诊断疾病的诊断工具的用途，其中所述疾病优选为新生血管化相关疾病，例如实体瘤和眼部疾病。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202110932078 | 2021-08-13 | ||
| CN2021109320787 | 2021-08-13 | ||
| PCT/CN2022/111717 WO2023016516A1 (zh) | 2021-08-13 | 2022-08-11 | 抗vegf a和vegf c双特异性抗体及其用途 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN118043350A true CN118043350A (zh) | 2024-05-14 |
Family
ID=85200580
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202280055810.XA Pending CN118043350A (zh) | 2021-08-13 | 2022-08-11 | 抗vegf a和vegf c双特异性抗体及其用途 |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN118043350A (zh) |
| AU (1) | AU2022327397A1 (zh) |
| CA (1) | CA3229250A1 (zh) |
| WO (1) | WO2023016516A1 (zh) |
Family Cites Families (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6403088B1 (en) * | 1995-08-01 | 2002-06-11 | Helsinki University Licensing, Ltd. | Antibodies reactive with VEGF-C, a ligand for the Flt4 receptor tyrosine kinase (VEGFR-3) |
| DE69829891T2 (de) | 1997-04-07 | 2005-10-06 | Genentech, Inc., South San Francisco | Anti-VEGF Antikörper |
| EP2509626B1 (en) * | 2009-12-11 | 2016-02-10 | F.Hoffmann-La Roche Ag | Anti-vegf-c antibodies and methods using same |
| US20120207671A1 (en) * | 2010-04-15 | 2012-08-16 | Vegenics Pty Limited | Combination treatment with vegf-c antagonists |
| US20120225081A1 (en) * | 2010-09-03 | 2012-09-06 | Boehringer Ingelheim International Gmbh | Vegf-binding molecules |
| US9527925B2 (en) * | 2011-04-01 | 2016-12-27 | Boehringer Ingelheim International Gmbh | Bispecific binding molecules binding to VEGF and ANG2 |
| KR101632620B1 (ko) * | 2011-07-27 | 2016-06-23 | 글락소 그룹 리미티드 | Ｆｃ 도메인에 융합된 항ｖｅｇｆ 단일 가변 도메인 |
| KR102131370B1 (ko) * | 2013-10-18 | 2020-07-08 | 삼성전자주식회사 | Vegf-c에 특이적으로 결합하는 폴리펩타이드 및 그의 용도 |
| CN108640994A (zh) * | 2018-06-28 | 2018-10-12 | 浙江众意生物科技有限公司 | 一种vegf-c单克隆抗体及试剂盒 |
-
2022
- 2022-08-11 AU AU2022327397A patent/AU2022327397A1/en active Pending
- 2022-08-11 WO PCT/CN2022/111717 patent/WO2023016516A1/zh active Application Filing
- 2022-08-11 CA CA3229250A patent/CA3229250A1/en active Pending
- 2022-08-11 CN CN202280055810.XA patent/CN118043350A/zh active Pending
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CA3229250A1 (en) | 2023-02-16 |
| WO2023016516A1 (zh) | 2023-02-16 |
| AU2022327397A1 (en) | 2024-03-14 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| TW201718657A (zh) | Ｐｄ－ｌ１抗體、其抗原結合片段及其醫藥用途 | |
| US20220235123A1 (en) | Synthetic antibodies against vegf and their uses | |
| US20220185875A1 (en) | Bispecific antibody specifically bound to vegf and ang2 | |
| KR20140019375A (ko) | 인간 조직 인자 항체 및 이의 용도 | |
| US20230071422A1 (en) | ANTI-CD3 and ANTI-CD123 Bispecific Antibody and Use Thereof | |
| WO2021170082A1 (zh) | 抗cd47/抗pd-l1抗体及其应用 | |
| WO2022117040A1 (zh) | 抗人b7-h3抗体及其应用 | |
| CN114907479A (zh) | 抗cd112r抗体及其用途 | |
| KR20240004860A (ko) | 디엘엘3에 대한 결합 분자 및 이의 용도 | |
| WO2023016516A1 (zh) | 抗vegf a和vegf c双特异性抗体及其用途 | |
| EP4349861A1 (en) | Bispecific binding molecule binding vegf and ang2 and use thereof | |
| WO2024002145A1 (zh) | 结合il-17a和il-17f的抗体分子及其应用 | |
| WO2023030511A1 (en) | Bi-functional fusion protein and uses thereof | |
| WO2024094017A1 (zh) | 一种针对磷脂酰肌醇蛋白聚糖3的双特异性抗体及其应用 | |
| WO2024114746A1 (zh) | 包含结合VEGF和Ang2的双特异性结合分子的制剂以及其用途 | |
| WO2024078558A1 (zh) | 抗cd100抗体及其用途 | |
| US20220026445A1 (en) | Antibodies that bind to natively folded myocilin | |
| TW202302641A (zh) | 針對IL-13Rα2的抗體及其應用 | |
| AU2022220965A1 (en) | Anti-vegf antibody and use thereof | |
| KR20240046557A (ko) | 항-b7-h4 항체 및 이의 제조 방법과 용도 | |
| TW202317631A (zh) | 抗crtam抗體及其應用 | |
| IL311153A (en) | Bispecific antibody and its use | |
| CN118119645A (zh) | 双功能融合蛋白及其用途 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination |