RU2744274C1 - Моноклональное антитело к RBD фрагменту в составе S белка вируса SARS-CoV-2 - Google Patents
Моноклональное антитело к RBD фрагменту в составе S белка вируса SARS-CoV-2 Download PDFInfo
- Publication number
- RU2744274C1 RU2744274C1 RU2020138183A RU2020138183A RU2744274C1 RU 2744274 C1 RU2744274 C1 RU 2744274C1 RU 2020138183 A RU2020138183 A RU 2020138183A RU 2020138183 A RU2020138183 A RU 2020138183A RU 2744274 C1 RU2744274 C1 RU 2744274C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- protein
- sars
- cov
- rbd
- antibody
- Prior art date
Links
- 239000012634 fragment Substances 0.000 title claims abstract description 48
- 101000629318 Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 Spike glycoprotein Proteins 0.000 title abstract description 7
- 239000000203 mixture Substances 0.000 title description 2
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims abstract description 15
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims abstract description 15
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims abstract description 15
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims abstract description 9
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims abstract description 9
- 241001678559 COVID-19 virus Species 0.000 claims description 46
- 102100031673 Corneodesmosin Human genes 0.000 claims description 42
- 101710139375 Corneodesmosin Proteins 0.000 claims description 40
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 claims description 11
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims description 8
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims description 5
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims 4
- 238000000034 method Methods 0.000 abstract description 19
- 238000003556 assay Methods 0.000 abstract description 4
- 238000003119 immunoblot Methods 0.000 abstract description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 3
- 238000011532 immunohistochemical staining Methods 0.000 abstract description 3
- 238000012760 immunocytochemical staining Methods 0.000 abstract description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 31
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 20
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 19
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 17
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 17
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 14
- 208000025721 COVID-19 Diseases 0.000 description 13
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 13
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 11
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 11
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 11
- 108010047041 Complementarity Determining Regions Proteins 0.000 description 10
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 9
- 108091005634 SARS-CoV-2 receptor-binding domains Proteins 0.000 description 8
- 201000003176 Severe Acute Respiratory Syndrome Diseases 0.000 description 8
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 8
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 7
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 7
- 206010003445 Ascites Diseases 0.000 description 6
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 6
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 6
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 6
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 6
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 6
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 5
- 239000006180 TBST buffer Substances 0.000 description 5
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 5
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 5
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 5
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 5
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 5
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 5
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 5
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 5
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 5
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 4
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 4
- 241000699660 Mus musculus Species 0.000 description 4
- 101100378849 Mus musculus Alg3 gene Proteins 0.000 description 4
- 101100460719 Mus musculus Noto gene Proteins 0.000 description 4
- 229940096437 Protein S Drugs 0.000 description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 4
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 4
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 4
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 3
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 3
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 3
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 3
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 3
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 3
- 102000000447 Peptide-N4-(N-acetyl-beta-glucosaminyl) Asparagine Amidase Human genes 0.000 description 3
- 108010055817 Peptide-N4-(N-acetyl-beta-glucosaminyl) Asparagine Amidase Proteins 0.000 description 3
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 3
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 3
- 108700005078 Synthetic Genes Proteins 0.000 description 3
- 241000711975 Vesicular stomatitis virus Species 0.000 description 3
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 3
- 239000012568 clinical material Substances 0.000 description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 description 3
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 3
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 3
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 3
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 3
- RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N imidazole Natural products C1=CNC=N1 RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 3
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 3
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 3
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 3
- NFGXHKASABOEEW-UHFFFAOYSA-N 1-methylethyl 11-methoxy-3,7,11-trimethyl-2,4-dodecadienoate Chemical compound COC(C)(C)CCCC(C)CC=CC(C)=CC(=O)OC(C)C NFGXHKASABOEEW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IGAZHQIYONOHQN-UHFFFAOYSA-N Alexa Fluor 555 Chemical compound C=12C=CC(=N)C(S(O)(=O)=O)=C2OC2=C(S(O)(=O)=O)C(N)=CC=C2C=1C1=CC=C(C(O)=O)C=C1C(O)=O IGAZHQIYONOHQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 2
- 241000711573 Coronaviridae Species 0.000 description 2
- 101710154606 Hemagglutinin Proteins 0.000 description 2
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 2
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 2
- 101710093908 Outer capsid protein VP4 Proteins 0.000 description 2
- 101710135467 Outer capsid protein sigma-1 Proteins 0.000 description 2
- 101800001494 Protease 2A Proteins 0.000 description 2
- 101800001066 Protein 2A Proteins 0.000 description 2
- 101710176177 Protein A56 Proteins 0.000 description 2
- 102000029301 Protein S Human genes 0.000 description 2
- 241000711798 Rabies lyssavirus Species 0.000 description 2
- 241000315672 SARS coronavirus Species 0.000 description 2
- 108010046722 Thrombospondin 1 Proteins 0.000 description 2
- 102100036034 Thrombospondin-1 Human genes 0.000 description 2
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 description 2
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 2
- 108010031318 Vitronectin Proteins 0.000 description 2
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 2
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 238000007622 bioinformatic analysis Methods 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 2
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 2
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 2
- 230000000120 cytopathologic effect Effects 0.000 description 2
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 2
- 230000022811 deglycosylation Effects 0.000 description 2
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 2
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 2
- 239000000185 hemagglutinin Substances 0.000 description 2
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 2
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 2
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 2
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 2
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 229940126619 mouse monoclonal antibody Drugs 0.000 description 2
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 2
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 2
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 2
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 2
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 2
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 2
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 2
- NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 2,3-bis(butanoylsulfanyl)propyl butanoate Chemical compound CCCC(=O)OCC(SC(=O)CCC)CSC(=O)CCC NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 4',6-Diamino-2-phenylindol Chemical compound C1=CC(C(=N)N)=CC=C1C1=CC2=CC=C(C(N)=N)C=C2N1 FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QFVHZQCOUORWEI-UHFFFAOYSA-N 4-[(4-anilino-5-sulfonaphthalen-1-yl)diazenyl]-5-hydroxynaphthalene-2,7-disulfonic acid Chemical compound C=12C(O)=CC(S(O)(=O)=O)=CC2=CC(S(O)(=O)=O)=CC=1N=NC(C1=CC=CC(=C11)S(O)(=O)=O)=CC=C1NC1=CC=CC=C1 QFVHZQCOUORWEI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HJCMDXDYPOUFDY-WHFBIAKZSA-N Ala-Gln Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(N)=O HJCMDXDYPOUFDY-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 229940022962 COVID-19 vaccine Drugs 0.000 description 1
- 241000699802 Cricetulus griseus Species 0.000 description 1
- GRRNUXAQVGOGFE-UHFFFAOYSA-N Hygromycin-B Natural products OC1C(NC)CC(N)C(O)C1OC1C2OC3(C(C(O)C(O)C(C(N)CO)O3)O)OC2C(O)C(CO)O1 GRRNUXAQVGOGFE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000712431 Influenza A virus Species 0.000 description 1
- 108091029795 Intergenic region Proteins 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- 229930182816 L-glutamine Natural products 0.000 description 1
- 235000006679 Mentha X verticillata Nutrition 0.000 description 1
- 235000002899 Mentha suaveolens Nutrition 0.000 description 1
- 235000001636 Mentha x rotundifolia Nutrition 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 241000276498 Pollachius virens Species 0.000 description 1
- 108010076039 Polyproteins Proteins 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 1
- 206010037742 Rabies Diseases 0.000 description 1
- 208000034712 Rickettsia Infections Diseases 0.000 description 1
- 208000037847 SARS-CoV-2-infection Diseases 0.000 description 1
- 101710167605 Spike glycoprotein Proteins 0.000 description 1
- 101710198474 Spike protein Proteins 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000010530 Virus Neutralization Effects 0.000 description 1
- 241000907316 Zika virus Species 0.000 description 1
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 238000001574 biopsy Methods 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 1
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 238000011097 chromatography purification Methods 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000003113 dilution method Methods 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 210000004754 hybrid cell Anatomy 0.000 description 1
- GRRNUXAQVGOGFE-NZSRVPFOSA-N hygromycin B Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](NC)C[C@@H](N)[C@H](O)[C@H]1O[C@H]1[C@H]2O[C@@]3([C@@H]([C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](C(N)CO)O3)O)O[C@H]2[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 GRRNUXAQVGOGFE-NZSRVPFOSA-N 0.000 description 1
- 229940097277 hygromycin b Drugs 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 230000000984 immunochemical effect Effects 0.000 description 1
- 238000010820 immunofluorescence microscopy Methods 0.000 description 1
- 238000003125 immunofluorescent labeling Methods 0.000 description 1
- 230000002998 immunogenetic effect Effects 0.000 description 1
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 1
- 238000002991 immunohistochemical analysis Methods 0.000 description 1
- 239000003547 immunosorbent Substances 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 1
- 238000001638 lipofection Methods 0.000 description 1
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 1
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 235000019799 monosodium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 210000001989 nasopharynx Anatomy 0.000 description 1
- 238000010397 one-hybrid screening Methods 0.000 description 1
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 1
- 210000003300 oropharynx Anatomy 0.000 description 1
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 1
- 239000012188 paraffin wax Substances 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- KNVAYBMMCPLDOZ-UHFFFAOYSA-N propan-2-yl 12-hydroxyoctadecanoate Chemical compound CCCCCCC(O)CCCCCCCCCCC(=O)OC(C)C KNVAYBMMCPLDOZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 1
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 1
- 239000002356 single layer Substances 0.000 description 1
- AJPJDKMHJJGVTQ-UHFFFAOYSA-M sodium dihydrogen phosphate Chemical compound [Na+].OP(O)([O-])=O AJPJDKMHJJGVTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000004989 spleen cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000004988 splenocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 238000012916 structural analysis Methods 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- 230000014621 translational initiation Effects 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
- C07K14/08—RNA viruses
- C07K14/165—Coronaviridae, e.g. avian infectious bronchitis virus
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/08—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses
- C07K16/10—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses from RNA viruses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Virology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biophysics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
Изобретение относится к области биотехнологии и биохимии, а именно моноклональному антителу, селективно взаимодействующему с RBD фрагментом в составе S белка вируса SARS-CoV-2, и изолированному фрагменту ДНК, кодирующему участки легкой и тяжелой цепи указанного антитела, и антигенсвязывающему фрагменту указанного моноклонального антитела. Специфичность моноклонального антитела к RBD фрагменту в составе S белка вируса SARS-CoV-2 подтверждена методами иммуноферментного анализа, иммуноблоттинга, иммуноцитохимического и иммуногистохимического окрашивания. Установлена нуклеотидная последовательность вариабельных доменов моноклонального антитела. Изобретение позволяет получить новые моноклональные антитела, селективно связывающие RBD фрагмент в составе S белка вируса SARS-CoV-2. 4 н.п. ф-лы, 8 ил.
Description
Изобретение относится к области биотехнологии и биохимии, а именно моноклональному антителу, селективно взаимодействующему с RBD фрагментом в составе S белка вируса SARS-CoV-2 и изолированному фрагменту ДНК, кодирующему участки легкой и тяжелой цепи указанного антитела, и антиген-связывающему фрагменту указанного моноклонального антитела. Специфичность моноклонального антитела к RBD фрагменту в составе S белка вируса SARS-CoV-2 подтверждена методами иммуноферментного анализа, иммуноблоттинга, иммуноцитохимического и иммуногистохимического окрашивания. Установлена нуклеотидная последовательность вариабельных доменов моноклонального антитела. Изобретение позволяет получить новые моноклональные антитела, селективно связывающие RBD фрагмент в составе S белка вируса SARS-CoV-2. 8 фиг.
Область техники
Изобретение относится к биотехнологии и биохимии, а именно моноклональному антителу, связывающемуся RBD фрагментом в составе S белка вируса SARS-CoV-2
Уровень техники
Известны различные моноклональные анти-RBD антитела, которые связываются с различными эпитопами RBD домена в составе S белка вируса SARS-CoV-2. Многие, представленные на мировом рынке антитела не открыты по нуклеотидным последовательностям. Как пример можно рассмотреть мышиное моноклональное Компания GeneTex, Inc., клон [1A9] (GTX 632604 https://www.genetex.com/Product/Detail/SARS-CoV-SARS-CoV-2-COVID-19-spike-antibody-1A9/GTX632604) - распознает шиповидные белки SARS-CoV и SARS-CoV-2, но не используется для иммуногистохимического анализа и не охарактеризовано по нейтрализующему потенциалу.
Известна разработка японские исследователей, связанная с получением мышиных моноклональных антител, при этом их последовательности использованных антител неизвестны [https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2020.10.01.323220v1.full.pdf]. Недостатком данных моноклональных антител является отсутствие доступа к их вариабельным доменам.
Известна генетическая конструкция для экспрессии рекомбинантного белка RBD вируса SARS-CoV-2, штамм клеток яичника китайского хомячка CHO-S-RBD, продуцирующего рекомбинантный белок - рецептор-связывающий домен (RBD) вируса SARS-CoV-2, который может быть использован для диагностических целей [Патент РФ №2723008, C07K 14/165, опубл. 08.06.2020]. Описан так же способ получения штамма клеток яичника китайского хомячка CHO-S-RBD продуцента рекомбинантного белка RBD вируса SARS-CoV-2, содержащий определенную генетическую конструкцию, введение указанной генетической конструкции в клетки путем липофекции; селекцию клеток на антибиотике Hygromycin B. Раскрыта информация о штамме клеток яичника китайского хомячка CHO-S-RBD, продуценте рекомбинантного белка RBD вируса SARS-CoV-2. Описаны способы получения рекомбинантного белка RBD вируса SARS-CoV-2 включающие: культивирование штамма клеток яичника китайского хомячка CHO-S-RBD; хроматографическую очистку рекомбинантного белка RBD вируса SARS-CoV-2 из культуральной среды штамма клеток яичника китайского хомячка CHO-S-RBD; подтверждение получения рекомбинантного белка RBD вируса SARS-CoV-2. Создан рекомбинантный белок RBD вируса SARS-CoV-2 для выявления антител к SARS-CoV-2. Создана тест-система для иммуноферментного анализа сыворотки или плазмы крови человека. Разработан способ для анализа сыворотки или плазмы крови реконвалесцентов COVID-19 для отбора образцов наиболее перспективных для терапии пациентов, инфицированных SARS-CoV-2. Разработан способ анализа сыворотки или плазмы крови человека для определения титра антител к вирусу SARS-CoV-2. Изобретение предоставляет быструю и эффективную тест-систему для определения наиболее перспективных образцов сыворотки или плазмы крови реконвалесцентов COVID-19 для терапии пациентов, инфицированных SARS-CoV-2. Изобретение позволяет сократить время и упростить процедуру анализа сыворотки или плазмы крови реконвалесцентов COVID-19 для отбора образцов наиболее перспективных для терапии пациентов, инфицированных SARS-CoV-2. Данные технические решения не относятся к моноклональным антителам.
Известен искусственный ген, используемый для создания вакцины против коронавируса SARS-CoV-2, кодирующий искусственный белок-иммуноген, представляющий собой бицистронную структуру, состоящую из последовательностей рецептор-связывающего домена (RBD) гликопротеина S коронавируса SARS-CoV-2, гетерологического сигнального пептида гемагглютинина (HA) вируса гриппа А, линкера, P2A-пептида для расщепления полипротеина во время трансляции и гликопротеина G с мутацией M(1)>P(1), предотвращающей альтернативную инициацию трансляции, длиной 2355 п.н. Описан штамм rVSV-Stbl_RBD_SC2 рекомбинантного вируса везикулярного стоматита, полученный с использованием рекомбинантной плазмиды pStem-rVSV-Stbl_RBD_SC2, обеспечивающий независимый синтез коронавирусного антигена (рецептор-связывающий домен гликопротеина S SARS-CoV-2) и белка G вируса везикулярного стоматита, используемого для создания вакцины против коронавируса SARS-CoV-2 и депонированного в Государственной коллекции возбудителей вирусных инфекций, риккетсиозов ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора под номером V-984. Техническим результатом является улучшение фолдинга и повышение инфекционного титра рекомбинантного вируса, стабильности целевого трансгена и иммуногенных/антигенных свойств заявляемого рекомбинантного вируса. [Патент РФ №2733834, МПК A61K 39/215 (2006.01), опубл 2020.10.07].
Указанное решение относится к искусственному гену, кодирующему бицистронную структуру, образованную последовательностями рецептор-связывающего домена (RBD) гликопротеина S коронавируса SARS-CoV-2, P2A-пептидом и гликопротеином G вируса везикулярного стоматита, рекомбинантной плазмиде, обеспечивающей экспрессию указанного искусственного гена и рекомбинантному штамму вируса везикулярного стоматита, экспрессирующему антигены коронавируса SARS-CoV-2, индуцирующему специфический иммунный ответ к SARS-CoV-2 и используемому для создания вакцины против коронавируса SARS-CoV-2 и может быть использовано в биотехнологии, молекулярной биологии, генетической инженерии и медицине, но не касается разработки моноклональных антител.
Известно решение по заявке (US, 20190062785 A1, МПК A61K 39/215, A61K 39/205; C12N 15/86, опубл. 28.02.2019 г.), представляющее собой вакцину на основе рекомбинантного вируса бешенства, которая обеспечивает защиту против бешенства и тяжелого острого респираторного синдрома (SARS-CoV). Транскрипционная кассета локализована в межгенном регионе N и P, что гарантирует высокий уровень экспрессии трансгена за счет особенностей организации генома рабдовирусов. В патенте раскрыты основные существующие подходы дизайна целевых коронавирусных иммуногенов/антигенов, такие как полноразмерный гликопротеин S, вариант с усеченным цитоплазматическим доменом (Δ19), а также рецептор-связывающий домен RBD с трансмембранным регионом и цитоплазматическим доменом вируса бешенства. Патент не включает в себя создание моноклональных антител. Патентный поиск нейтрализующих антител показывает ряд патентов - CN 111333722 A (https://patents.google.com/patent/CN111333722A/en), CN 111423508 A (https://patents.google.com/patent/CN111423508A/en), CN 111592595 A (https://patentimages.storage.googleapis.com/ca/4f/d6/8b54080db2f1e3/CN111592595A.pdf), CN 111732655 A (https://patents.google.com/patent/CN111732655A/en), CN 111690059 A (https://patents.google.com/patent/CN111690059A/en), CN 111718411 A (https://patents.google.com/patent/CN111718411A/en), CN 111732654 A (https://patents.google.com/patent/CN111732654A/en). Среди представленных разработок нет мышиных моноклональных антител одновременно обладающих вируснейтрализующей активностью и пригодных для идентификации вируса SARS-CoV-2 всеми методами иммуноанализа.
Сегодня специфические мышиные или кроличьи mAb против S-белка коммерчески доступны во многих странах компании (Abcam- https://www.abcam.com/sars-spike-glycoprotein-antibody-3a2-coronavirus-ab272420.html, GeneTex- https://www.genetex.com/Product/Detail/SARS-CoV-SARS-CoV-2-COVID-19-spike-antibody-1A9/GTX632604, Sino Biological и др.). Их применимость для разных методов описана, но ни одна из этих компаний не предоставляет последовательность антител, хотя эта информация может быть критичной для некоторых экспериментов. Так же для них не описана вируснейтрализующая активность.
Проведенный биоинформатический анализ всех представленных последовательностей по следующим базам данных моноклональных антител к SARS-CoV-2 не выявил совпадающих антител по последовательностям легкой и тяжелой цепи:: по легкой цепи
по тяжелой цепи
В базе данных http://opig.stats.ox.ac.uk/webapps/covabdab/ представлено 407 моноклональных антитела с вируснейтрализующей активностью. Анализ научных публикаций : Wafaa Alsoussi et al., 2020 (https://www.jimmunol.org/content/early/2020/06/23/jimmunol.2000583);
Xiangyang Chi et al., 2020 (https://science.sciencemag.org/content/early/2020/06/19/science.abc6952/tab-pdf); Xiangyu Chen et al., 2020 (https://www.nature.com/articles/s41423-020-0426-7);
Jinkai Wan et al., 2020 (https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2211124720308998);
Xiaojian Han et al., 2020 https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2020.08.19.253369v2.full.pdf+html; Shuo Du et al., 2020 (https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2020.07.09.195263v1);
Yunlong Cao et al., 2020 (https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0092867420306206) Davide Robbiani et al., 2020 (https://www.nature.com/articles/s41586-020-2456-9);
Sarah Clark et al., 2020 (https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2020.11.13.381533v1)) показывает отсутствие среди них мышиных моноклональных антител охарактеризованных для исследования клинического материала.
Техническое приемлемой, решаемой настоящим изобретением, является получение моноклонального антитела, способного к связыванию RBD фрагмента в составе S белка вируса SARS-CoV-2 и отличающегося по аминокислотной последовательности вариабельных доменов легкой и тяжелой цепей от известных моноклональных антител к RBD фрагменту в составе S белка вируса SARS-CoV-2, пригодного для исследования клинического материала и обладающего вируснейтрализующей активностью, а также получение изолированных фрагментов ДНК, кодирующих участки легкой и тяжелой цепей указанного антитела и антигенсвязывающего фрагмента указанного моноклонального антитела.
Раскрытие изобретения
Техническим результатом является получение нового моноклонального антитела мыши IgM-изотипа, обладающего вируснейтрализующей активностью и детектирующего до 1 нг рекомбинантного RBD фрагмент S белка вируса SARS-CoV-2 с помощью метода иммуноферментного анализа.
Также техническим результатом является расширение арсенала средств аналогичного назначения, а именно получение нового моноклонального антитела к RBD фрагменту в составе S белка вируса SARS-CoV-2.
Поставленная техническая проблема решается получением моноклонального антитела, селективно
связывающего RBD фрагмент в составе S белка вируса SARS-CoV-2 человека, включающего вариабельный участок тяжелой цепи (VH) указанного антитела, содержащего последовательность аминокислот, SEQ ID NO: 1; а вариабельный участок легкой цепи(VL) указанного антитела содержит последовательность аминокислот, SEQ ID NO: 2. Поставленная техническая проблема решается также тем, что установлен изолированный фрагмент ДНК, кодирующий VH указанного антитела с нуклеотидной последовательностью SEQ IDNO: 3.
Поставленная техническая проблема решается также тем, что получен изолированный фрагмент ДНК, кодирующий VL указанного антитела с нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 4.
Поставленная техническая проблема решается также тем, что получен антигенсвязывающий фрагмент указанного моноклонального антитела, содержащий вариабельный участок тяжелой цепи (VH) указанного антитела с последовательностью аминокислот SEQ ID NO: 1, и вариабельный участок легкой цепи (VL) указанного антитела с последовательностью аминокислот, SEQ ID NO: 2.
Моноклональное антитело, селективно связывающее RBD фрагмент в составе S белка вируса SARS-CoV-2,человека, настоящего изобретения характеризуется тем, что вариабельный участок тяжелой цепи (VH) указанного антитела содержит:
(i) CDR1 с последовательностью аминокислот QSIVHSNGNTY из SEQ ID NO: 1;
(ii) CDR2 с последовательностью аминокислот KVS из SEQ ID NO: 1;
(iii) CDR3 с последовательностью аминокислот FQGSHVPLT из SEQ ID NO: 1.
При этом вариабельный участок легкой цепи (VL) указанного антитела содержит
(i) CDR1 с последовательностью аминокислот QSLLYSRTRKNY из SEQ ID NO: 2;
(ii) CDR2 с последовательностью аминокислот WAS из SEQ ID NO: 2;
(iii) CDR3 с последовательностью аминокислот KQSYTLYT из SEQ ID NO: 2. Моноклональное антитело получено путем иммунизации мышей Balb/C человеческим рекомбинантным RBD фрагментом S белка вируса SARS-CoV-2, экспрессированным в E.coli (E.coli-RBD) и полноразмерным S белком вируса SARS-CoV-2 в составе клеток линии HEK293, получения и селекции линий гибридом, продуцирующих моноклональные антитела к рекомбинантному RBD фрагменту в составе S белка вируса SARS-CoV-2, анализа аффинности и специфичности отобранного МАт, определения нуклеотидной последовательности его вариабельных доменов. Антитела обычно состоят из двух тяжелых цепей, связанных между собой дисульфидными связями, и легких цепей, ассоциированных с N-концом каждой из тяжелых цепей. Каждая тяжелая цепь содержит на N-конце вариабельный домен с константным доменом на другом конце. Каждая легкая цепь содержит на N-конце вариабельный домен с константным доменом на другом конце. Вариабельные домены каждой пары легкой и тяжелой цепей образуют антигенсвязывающий участок. Вариабельные домены легкой и тяжелой цепей обладают похожей общей структурой, и каждый домен включает каркас из четырех участков, последовательности которых являются относительно консервативными, связанных посредством трех участков, определяющих комплементарность (complementarity determining regions, CDRs). Четыре каркасных участка формируют конформацию типа бета-складчатого слоя. Участки CDRs расположены в близком соседстве друг с другом благодаря каркасным участкам и вносят вклад в образование антигенсвязывающего участка. Участки CDRs и каркасные участки антител могут быть определены путем ссылки на нумерационную систему Кабата (Kabat numbering system, Kabat et al., 1987 "Sequences of Proteins of Immunological Interest", US Dept. of Health and Human Services, US Government Printing Office) в сочетании с данными рентгеноструктурного анализа. Участки CDRs и каркасные участки антител могут также быть определены по номенклатуре Международной информационной системы по иммуногенетике (International Immunogenetics Information System, www.imgt.org). Для получения антитела, которое может связываться с каким-либо специфическим антигеном, обычно используют методику Kohler и Milstein (Kohler et al., (1976) Nature 256: 495-497). Моноклональные антитела получают путем слияния клеток селезенки из иммунизированного животного и клеток миеломы с получением гибридомы. Гибридомы могут быть проверены на способность к продукции нужного антитела, затем гибридомы могут быть выращены, из них могут быть выделены указанные антитела. Термин «выращенные клетки», использованный здесь, означает гибридомы или другие линии клеток, которые производят антитела. Методы получения и проверки таких выращенных клеток описаны Harlow и др. (Antibodies, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Labs Press, 1988). Получение материала, использующегося в качестве антигена для инъекции животных, включают в себя методики, хорошо известные из уровня техники, например использование полноразмерного белка, использование пептида, выбранного из иммуногенных участков белка, а также любыми другими методами, известными из уровня техники (Harlow и др. Antibodies, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Labs Press, 1988).
Подходящий способ для выделения антител, эффективных для использования в рамках настоящего изобретения, включает (а) назначение животному эффективного количества белка или пептида с целью получения антител, (b) выделение указанных антител, (с) определение последовательности антител.
Мышей BALB / С в возрасте 5 недель иммунизировали по стандартному протоколу [Methods Mol Biol. 2014; 1131: 33-45. doi: 10.1007/978-1-62703-992-5_3] с несколькими модификациями.
Затем полученные лимфоциты гибридизуют с клетками миеломы X63.
Тестирование супернатантов гибридом проводят методом непрямого иммуноферментного анализа (ИФА) с использованием RBD фрагмента S белка. Все первичные культуры, показавшие активность в ИФА, клонируют методом предельных разведений. Отбирают группы клонов - потомков одной первичной культуры. Клетки каждого из субклонов нарабатывают в культуре в количестве, достаточном для получения асцитных жидкостей.
Моноклональные антитела, выделенные из асцитной жидкости, сравнивают методом непрямого ИФА, по результатам которого было отобрано антитело 11/9.
Затем определили субизотип полученного антитела, оценили специфичность и
иммунореактивность полученного антитела методом непрямого ИФА с сорбированным на планшеты RBD фрагментом S белка с использованием коммерческих типирующих сывороток. Полученные антитела 11/9 определены как IgM.
Мы показали возможность использования МАт 11/9 для анализа клинических образцов, полученных от пациентов с COVID19 и контрольных пациентов без заболевания. В клинической практике чаще всего образцы готовятся в виде парафиновых блоков для облегчения длительного хранения материалов. Однако, длительная фиксация, парафинизация и депарафинизация крайне негативно влияют на структуру и доступность антигена. Таким образом, часто большинство антител способны обнаруживать антиген в экспериментах WB или ELISA, только некоторые из них хорошо работают на клинических образцах.
Например, из более чем 50 антител, доступных на Abcam, GeneTex и Sino Biological только один (Abcam ab275759) был утвержден для работы с клиническими образцами, и это антитело было кроличьим поликлональным.
Ни одно антитело, из перечисленных в Abcam, GeneTex, Sino Biological, не показывает свою эффективность во всех этих методиках одновременно.
Краткое описание чертежей и таблиц, иллюстрирующих изобретение
На Фиг. 1 показаны аминокислотные (SEQ ID NO: 1 и 2) и нуклеотидные (SEQ ID NO: 3 и 4) последовательности МАт 11/9.
На Фиг. 2 показана гель-электрофореграмма рекомбинантного RBD, очищенный из E. Coli используемого для иммунизации
На Фиг. 3 показан иммуноцитохимический анализ клеток, котрансфицированных плазмидами, кодирующими GFP (зеленый) и полноразмерный S белок
окрашенных сывороткой, полученной от мышей (красный). ** р <0,01
окрашенных сывороткой, полученной от мышей (красный). ** р <0,01
На Фиг. 4 показан вестерн-блот анализ лизатов клеток, трансфицированных плазмидой, кодирующей GFP (G) или полноразмерный S-белок (S). Для окрашивания мембран использовали культуральную среду из разных субклонов.
На Фиг. 5 показан вестерн-блот анализ лизата клеток трансфицированных плазмидой, кодирующей полноразмерный S-белок. Лизат инкубировали в присутствии или в отсутствие PNGase F. Мембрану окрашивали МАт 11/9
На Фиг. 6 Иммуногистохимическое окрашивание образцов биопсии легкого, залитых парафином, от контрольных пациентов и пациентов с COVID19. Асцитная жидкость, образованная моноклоном №11 / 9, использовалась в разведениях -а- 1: 1000 и б - 1: 100000. Масштабная линейка 100 мкм.
На Фиг. 7 показаны результаты иммуноферментного анализа с последовательным разведением МАт 11/9 в составе асцитной жидкости, против RBD (красный) или контрольный белок (синий), очищенный от E. coli. А так же результаты иммуноферментного анализа показывающие чувствительность МАт 11/9 в составе асцитной жидкости. Разведение 1:10 000 против различных количеств RBD, очищенного от E. coli и иммобилизованного в лунках планшета.
На Фиг. 8 показаны результаты исследования нейтрализующей активности МАт 11/9 в отношении SARS-CoV-2
Осуществление изобретения
Последующие примеры приведены для целей объяснения и не ограничивают каким-либо образом рамки настоящего изобретения.
Получение мышиного моноклонального антитела против RBD фрагмента в составе S белка вируса SARS-CoV-2.
Первую иммунизацию проводили внутрибрюшинно с помощью 200 мкг рекомбинантного очищенного RBD фрагмента, ресуспендированного в 150 мкл PBS и смешанного с 150 мкл либо полного адъюванта Фрейнда (FCA), либо неполного адъюванта Фрейнда (FIA) (Thermo Fisher). Две недели спустя мышам внутрибрюшинно вводили 200 мкг рекомбинантного очищенного RBD фрагмента, ресуспендированного в 150 мкл PBS, и смешивали с 150 мкл FIA. Через 6 дней кровь из хвостовой вены была собрана для проведения ELISA и IF окрашивания.
Экспрессия рекомбинантного белка и очистка от E.coli
Кодон BL21 (DE3) + RIL Клетки E.coli (Agilent) трансформировали плазмидой pET28-S. Бактерии инкубировали при 37°C на качалке до достижения OD600 0,7. Затем добавляли IPTG до конечной концентрации 1 мМ, и бактерии инкубировали еще 4 часа при 37°C. 200 мл среды с бактериями центрифугировали 15 мин, 5000 g при 4°C и осадок ресуспендировали в 12 мл лизирующего буфера B (200 мМ NaCl, 100 мМ NaH2PO4, 10 мМ Трис-HCl pH 8,0, 8 М мочевина, 0,5 мМ DTT) и инкубировали 1,5 часа при комнатной температуре. Затем раствор центрифугировали в течение 15 мин, 20000 g при 4°C и супернатант инкубировали с 2 мл смолы Ni-NTA в течение 1 часа при постоянном перемешивании. Суспензию переносили в колонку и промывали 20 мл буфера B и 10 мл буфера C (то же, что и буфер B, но с рН 6,3). Связанные белки элюировали буфером D (буфер C с 250 мМ имидазола) и диализовали в течение ночи против PBS с 1 мМ DTT. Чистоту полученного белка оценивали с помощью электрофореза и последующего окрашивания кумасси синим.
На 28, 29 и 30 дни после первой иммунизации мышам подкожно инъецировали 2×106 клеток HEK293, трансфицированных плазмидой pTwist-EF1a-nCoV-2019-S-2xStrep.
Культура клеток
Клетки HEK293 и HT1080 выращивали в среде Игла, модифицированной Дульбекко (DMEM), с добавлением 10% (об. / Об.) Фетальной телячьей сыворотки (FBS), 2 мМ L-глутамина, 1 мМ Na-пирувата и смеси пенициллин-стрептомицин (100 мкг / мл). Трансфекцию проводили реагентом Lipofectamine LTX (Thermo Fisher) в соответствии с протоколом производителя. Трансфицированные клетки окрашивали или вводили мышам через 48 часов после трансфекции. Клетки миеломы и гибридомы X63 выращивали в среде DMEM / F12 с добавлением 15% (об. / Об.) FBS, GlutaMAX (Thermo Fisher), 1 мМ Na-пирувата и смеси пенициллин-стрептомицин (100 мкг / мл). Добавки HAT или HT (Sigma) добавляли в разные моменты времени после слияния, как описано ранее [Methods Mol Biol. 2014;1131:33-45. doi: 10.1007/978-1-62703-992-5_3]. Затем полученные лимфоциты гибридизуют с клетками миеломы SP2/0. Тестирование супернатантов гибридом проводят методом непрямого иммуноферментного анализа (ИФА). Иммуноферментный анализ
Иммуноферментный анализ (ELISA) проводили, как описано ранее [BMC Biotechnol. 2016 Nov 22; 16(1): 83. doi: 10.1186/s12896-016-0314-5]. Вкратце, 0,5 мкг RBD, выделенного из E.coli, RBD, выделенного из клеток или клеток HEK293, или 0,5 мкг контрольного белка, выделенного из E.coli, иммобилизовали в лунках 96-луночного планшета EIA (Corning). После блокирования 1% BSA в TBST (20 мМ Tris pH 7,6, 150 мМ NaCl, 0,1% Tween20) лунки инкубировали с культуральной средой из клеток гибридомы, разведенной 1: 1 в TBST, или с сывороткой мыши, разведенной 1: 500 в TBST. После промывания TBST лунки инкубировали с HRP-конъюгированными вторичными антителами против мыши (Thermo Fisher) (разведение 1: 10000 в TBST) и проявляли с помощью раствора субстрата 1-Step Ultra TMB-ELISA (Thermo Fisher) в соответствии с протоколом производителя.
Мы получили, выделили и очистили рекомбинантный RBD фрагмент S белка из E.coli в денатурирующих условиях (Фиг. 2). Первая иммунизация проводилась белком, смешанным 1:1 с Freund's incomplete adjuvant (FIA). Интересно, что именно использование FIA позволило получить значительно более высокий титр целевых антител у животных. Этот результат говорит в пользу того, что нерастворимый S белок обладает достаточно высокой иммуногенностью для индукции иммунного ответа и не требует дополнительных стимулирующих добавок. Такие данные хорошо согласуются с результатами, полученные ранее, при иммунизации животных поверхностным белком вируса Зика [Biochimie. 2017 Nov; 142: 179-182. doi: 10.1016/j.biochi.2017.09.011]. Иммунофлуоресцентное окрашивание с использованием сыворотки имуннизированных животных показало, что антитела, вырабатываемые в ответ на нерастворимый RBD фрагмент S белка, были способны распознавать нативный S белок, экспрессированный на поверхности человеческих клеток (Фиг. 3). Таким образом, нерастворимый RBD и полноразмерный S белок имеют общие эпитопы и значит могут быть использованы для индукции и селекции антител к SARS-CoV2.
Отбор гибридом, секретируеющих антитела к S белку SARS-CoV2. После иммунизации мыши использовались для выделения спленоцитов, которые сливали с линией миеломы X63. Сразу после слияния полученные клетки были рассеяны на 20 96-луночных планшетов. Через 2 недели было получено 120 моноклонов гибридомных клеток. Антитела, производимые этими гибридомами, проверяли с помощью ELISA на RBD фрагмент S белка, выделенный из клеток HEK293. Использование для первичного скрининга белка, выделенного из другого источника дает возможность отсеять клоны, вырабатывающие антитела на разнообразные примеси, которые неизбежно содержатся в выделенном белке. Кроме того, так как белок из клеток HEK293 предположительно имеет гликозилирование и фолдинг сходные с таковыми у полноразмерного S белка, то антитела, взаимодействующие с RBD из HEK293, со значительной вероятностью, будут взаимодействовать и с нативным S белком.
14 гибридом, показавших наиболее сильную иммунореактивность к RBD, были использованы для дальнейшего анализа. Методом иммуноблотинга мы протестировали взаимодействие соответствующих антител с лизатами человеческих клеток, оверэкспрессирующих полноразмерный S белок или GFP в качестве контроля.
Получение моноклонов, продуцирующих антитела к S белку SARS-CoV2. Ранее многими авторами было показано, что в первые пассажи после слияния клетки гибридомы характеризуются высокой генетической нестабильностью, и поэтому даже потомки одной гибридной клетки, вероятнее всего, будут производить различные антитела [Dev Biol Stand. 1994; 83: 55-64]. По этой причине, гибридома #11, секретирующая наиболее специфичные антитела к RBD по результатам предыдущего анализа, была расклонирована для получения истинных моноклонов. Антитела, продуцируемые 17 субклонами гибридомы #11, были протестированы с помощью ELISA на взаимодействие с RBD, выделенным и E.coli; RBD, выделенным и HEK293; и контрольным белком, выделенным из E.coli. Результаты этого эксперимента позволили выбрать три моноклона для последующего анализа. Иммуноблотинг показал, что все полученные моноклоны обладают значительно большей специфичностью, чем исходная гибридома #11 (Фиг. 4).
Характеризация моноклональных антител к S белку SARS-CoV2.
По результатам предыдущего анализа, наиболее специфичными оказались антитела, производимые моноклоном #11/9. Иммунохцитохимическое окрашивание показывает, что антитела #11/9 окрашивают человеческие клетки, оверэкспрессирующие S белок, и почти не окрашивают соседние не транфицированные клетки. Таким образом, антитела #11/9 взаимодействуют с RBD фрагментом в условиях ELISA; с полноразмерным денатурированным S белком в условиях WB; и с полноразмерным нативным S белком на поверхности клеток.
Ранее было показано, что RBD, как и большинство поверхностных белков, подвергается значительному гликозилированию в клетках [Emerg Microbes Infect. 2020 Mar 17; 9(1): 601-604. doi: 10.1080/22221751.2020.1739565]. Лизат клеток оверэкспрессирующих S белок был обработан дегликозилирующим ферментом PNGase F. Из Фиг. 5 видно, что дегликозилирование уменьшает молекулярную массу S белка как минимум на 30 кДа, однако не оказывает влияние на интенсивность окрашивания антителами #11/9, таким образом, можно утверждать, что участок связывание антител с S белком не экранируется гликозидными группами. Дегликозилирование S-белка из лизата клеток HEK293, трансфицированных плазмидой pTwist-EF1a-nCoV-2019-S-2xStrep, проводили, как описано ранее [Methods Enzymol. 1994; 230: 44-57. doi: 10.1016/0076-6879(94)30006-2], с использованием PNGase F (New England Biolabs).
Иммунофлуоресцентная микроскопия
Клетки HT1080 высевали в лунки камеры Lab-Tek II и котрансфицировали плазмидами pTwist-EF1a-nCoV-2019-S-2xStrep и pTagGFP2-C (Evrogen). Через два дня после трансфекции клетки промывали забуференным фосфатом физиологическим раствором (PBS) и фиксировали 4% PFA в PBS в течение 15 минут при комнатной температуре. Клетки промывали 2 раза PBS и инкубировали с культуральной средой из клеток гибридомы, разведенной 1: 1 в PBS, или с сывороткой мыши, разведенной 1: 500 в PBS. После 5 промываний PBS клетки инкубировали с конъюгированными с AlexaFluor555 вторичными антителами против мыши (Thermo Fisher) (разведение 1: 500 в PBS) и затем окрашивали DAPI. Изображения получали с помощью флуоресцентного микроскопа DIAPHOT 300 (Nikon).
Секвенирование антител
Секвенирование мРНК, кодирующих тяжелую и легкую цепи антител, проводили с использованием метода 5'-SMART RACE, как описано ранее [PLoS One. 2019; 14(6): e0218717] с небольшими модификациями. Первую цепь кДНК синтезировали с использованием набора Mint (Evrogen) с праймерами для k-цепи (TTG TCG TTC ACT GCC ATC AAT C), λ-цепи (GGG GTA CCA TCT ACC TTC CAG) и тяжелой цепи (X) в соответствии с протоколу производителя. Затем кДНК, кодирующая IgG, была амплифицирована с помощью стандартной ПЦР с использованием прямого праймера M1 (AAG CAG TGG TAT CAA CGC AGA GT) и обратных праймеров, специфичных для k-цепи (ACA TTG ATG TCT TTG GGG TAG AAG), λ-цепи (ATC GTA CAC ACC AGT GTG GC) и тяжелой цепи (X). Полученную ДНК очищали и клонировали в вектор pKAN-T (Евроген), который впоследствии секвенировали. Секвенировали по крайней мере 3 разных клона для каждой цепи антител. В частности, антителом согласно настоящему изобретению является моноклональное антитело, обладающее способностью к связыванию RBD фрагмента в составе S белка вируса SARS-CoV-2. Использование праймеров специфическихк цепям k или λ мы продемонстрировали, что Мат 11 / 9 содержит только легкую цепь k. Последовательность действий продуктов ПЦР выявила нуклеотидную и аминокислотную последовательность вариабельных доменов Мат 11 / 9 (Фиг. 1). Биоинформатический анализ показал, что и легкие, и тяжелые цепи не содержат стоп-кодоны. Мы проанализировали сходство Мат 11 / 9 с антителами против SARS-CoV2, которые появляется естественным образом у пациентов с COVID19. С этой целью мы сравнили аминокислотные последовательности определяющая комплементарность область 3 (CDR3) Мат 11 / 9 к ранее опубликованным последовательностям антител, экспрессируемых RBD-связывающими В-клетками, выделенными от 60 пациентов с COVID19 [doi:10.1148/radiol.2020200463]. Важно отметить, что последовательности CDR3, как было показано, играют главную роль в связывании антигена и поэтому В-клетки, которые имеют идентичный CDR3 как для тяжелой, так и для легкой цепей, могут быть отнесены к этому же клонотипу [doi:10.1148/radiol.2020200463]. Сравнение последовательностей Мат 11 / 9 с последовательностями 91 различных клонотипов RBD-связывающего IgG выявили значительное сходство как тяжелых, так и легких цепей Мат 11 / 9 к нейтрализующим антителам, которые появляются у пациентов с COVID19 после заражения. Этот результат указывает на то, что, несмотря на иммунизацию искусственно синтезированным S-белком, мы смогли получить антитела, которые имеют аналогичную последовательность и, скорее всего, связываются с теми же участками белка S, что и естественного происхождения нейтрализующие антитела SARS-CoV2.
Мы использовали МАт 11/9 для окрашивания клинического материала и показали, что они позволяют легко различать контрольные образцы и образцы от пациентов с COVID19 (Фиг. 6). Таким образом, мы продемонстрировали, что МАт 11/9 может идентифицировать S белок с использованием всех иммунохимических методов (WB, ELISA, IHC-P, IF, эксперимент по нейтрализации).
Полученное Мат 11/9 способно выявлять методом иммуноферментного анализа рекомбинантный RBD в концентрации 1 нг (Фиг. 7). В культуральная среда от клеток гибридомы содержит 19,3±0,7 мкг / мл антител.
Мы выполнили анализ нейтрализации вируса с использованием hCoV-19 / Россия / Moscow_PMVL-4 штамм SARS-CoV-2, выделенный из носоглотки / ротоглотки мазок пациента с COVID-19. Вирус пассировали и титровали на клетках Vero E6. Серию пятикратных разведений асцита, образованного моноклоном 11/9, инкубировали с 100 TCID50 SARS-CoV-2 1 час при 37°C. Комплексы антитело-вирус добавляли к монослою культуры клеток Vero E6 в 96-луночные планшеты. Планшеты инкубировали в CO2-инкубаторе при 37°С в течение 72 ч, после чего цитопатический эффект (ЦПЭ) наблюдали микроскопически. Титры нейтрализации определяли как разведения антител, необходимого для 50% нейтрализации вирусной инфекции. Наши данные демонстрируют способность моноклональных антител 11 / 9 эффективно блокировать инфекцию SARS-CoV-2 (Фиг. 8).
Название проекта: Моноклональное антитело к RBD фрагменту в составе S белка вируса SARS-CoV-2
Статус: invalid
Дата создания: 2020-11-19
Общая информация
Текущая заявка
Номер заявки: before
Название изобретения
| Язык | Имя изобретателя |
| ru | Моноклональное антитело к RBD фрагменту в составе S белка вируса SARS-CoV-2 |
Заявитель и изобретатель:
Имя заявителя: Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук
Язык: ru
Название или имя и фамилия латиницей: Shemyakin-Ovchinnikov Institute of Bioorganic Chemistry RAS
Адрес места жительства: 117997, Российская Федеpация, Москва, ГСП-7, улица Миклухо-Маклая, дом 16/10
Адрес для переписки: 117997, Российская Федеpация, Москва, ГСП-7, улица Миклухо-Маклая, дом 16/10
Последовательности
Последовательность 1: " вариабельный участок тяжелой цепи (VH) SEQ ID NO:1"
| Длина | Тип молекулы | Организм | Содержит фрагменты ДНК и РНК | Пропущенная последовательность |
| 140 | AA | Mus musculus | Нет | Нет |
Характеристики
| Ключ характеристики | Местоположение характеристики | Квалификаторы |
| SOURCE | 1..140 | MOL_TYPE = protein ORGANISM = Mus musculus |
Последовательность
--->
MRWSCIILFL VATATGVNSQ VQLQQPGAEL VMPGASVKMS CKASGYTFTD YWMHWVKQRP 60
GQGLEWIGAI DTSDSYTSYN QKFKGKATLT VDESSSTAYM QLSSLTSEDS AVYYCARRGY 120
GSSYTWFAYW GQGTLVTVSA 140
<---
Последовательность 2: "вариабельный участок легкой цепи (VL)SEQ ID NO: 2"
| Длина | Тип молекулы | Организм | Содержит фрагменты ДНК и РНК | Пропущенная последовательность |
| 131 | AA | Mus musculus | Нет | Нет |
Характеристики
| Ключ характеристики | Местоположение характеристики | Квалификаторы |
| SOURCE | 1..131 | MOL_TYPE = protein ORGANISM = Mus musculus |
Последовательность
--->
MKLPVRLLVL MFWIPASSSD VLMTQTPLSL PVSLGDQASI SCRSSQSIVH SNGNTYLEWY 60
LQKPGQSPKL LIYKVSNRFS GVPDRFSGSG SGTDFTLKIS RVEAEDLGVY YCFQGSHVPL 120
TFGAGTKLEL K 131
<---
Последовательность 3: "Изолированный фрагмент ДНК, кодирующий VH антитела SEQ ID NO: 3"
| Длина | Тип молекулы | Организм | Содержит фрагменты ДНК и РНК | Пропущенная последовательность |
| 420 | DNA | Mus musculus | Нет | Нет |
Характеристики
| Ключ характеристики | Местоположение характеристики | Квалификаторы |
| source | 1..420 | mol_type = other DNA organism = Mus musculus |
Последовательность
--->
atgagatgga gctgtatcat cctcttcttg gtagcaacag ctacaggtgt caactcccag 60
gtccaactgc agcagcctgg ggctgagctt gtgatgcctg gggcttcagt gaagatgtcc 120
tgcaaggctt ctggctacac attcactgac tactggatgc actgggtgaa gcagaggcct 180
ggacaaggcc ttgagtggat cggagcgatt gatacttctg atagttatac tagctacaat 240
caaaagttca agggcaaggc cacattgact gtagacgaat cctccagcac agcctacatg 300
cagctcagca gcctgacatc tgaggactct gcggtctatt actgtgcaag aaggggctac 360
ggtagtagct acacctggtt tgcttactgg ggccaaggga ctctggtcac tgtctctgca 420
<---
Последовательность 4: "Изолированный фрагмент ДНК, кодирующий VL антитела SEQ ID NO: 4"
| Длина | Тип молекулы | Организм | Содержит фрагменты ДНК и РНК | Пропущенная последовательность |
| 393 | DNA | Mus musculus | Нет | Нет |
Характеристики
| Ключ характеристики | Местоположение характеристики | Квалификаторы |
| source | 1..393 | mol_type = other DNA organism = Mus musculus |
Последовательность
--->
atgaagttgc ctgttaggct gttggtgctg atgttctgga ttcctgcttc cagcagtgat 60
gttttgatga cccaaactcc actctccctg cctgtcagtc ttggagatca agcctccatc 120
tcttgcagat ctagtcagag cattgtacat agtaatggaa acacctattt agaatggtac 180
ctgcagaaac caggccagtc tccaaagctc ctgatctaca aagtttccaa ccgattttct 240
ggggtcccag acaggttcag tggcagtgga tcagggacag atttcacact caagatcagc 300
agagtggagg ctgaggatct gggagtttat tactgctttc aaggttcaca tgttccgctc 360
acgttcggtg ctgggaccaa gctggagctg aaa 393
<---
Claims (4)
1. Моноклональное антитело, селективно связывающее RBD фрагмент в составе S белка вируса SARS-CoV-2, обладающее вируснейтрализующей активностью, включающее вариабельный участок тяжелой цепи (VH) указанного антитела, содержащий последовательность аминокислот SEQ ID NO: 1, а вариабельный участок легкой цепи (VL) указанного антитела содержит последовательность аминокислот SEQ ID NO: 2.
2. Изолированный фрагмент ДНК, кодирующий VH антитела по п. 1, с нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 3.
3. Изолированный фрагмент ДНК, кодирующий VL антитела по п. 1, с нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 4.
4. Антигенсвязывающий фрагмент моноклонального антитела по п. 1, селективно связывающий RBD фрагмент в составе S белка вируса SARS-CoV-2, содержащий вариабельный участок тяжелой цепи (VH) указанного антитела с последовательностью аминокислот SEQ ID NO: 1, и вариабельный участок легкой цепи (VL) указанного антитела с последовательностью аминокислот SEQ ID NO: 2.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2020138183A RU2744274C1 (ru) | 2020-11-20 | 2020-11-20 | Моноклональное антитело к RBD фрагменту в составе S белка вируса SARS-CoV-2 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2020138183A RU2744274C1 (ru) | 2020-11-20 | 2020-11-20 | Моноклональное антитело к RBD фрагменту в составе S белка вируса SARS-CoV-2 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2744274C1 true RU2744274C1 (ru) | 2021-03-04 |
Family
ID=74857542
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2020138183A RU2744274C1 (ru) | 2020-11-20 | 2020-11-20 | Моноклональное антитело к RBD фрагменту в составе S белка вируса SARS-CoV-2 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2744274C1 (ru) |
Cited By (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN113150136A (zh) * | 2021-04-30 | 2021-07-23 | 杭州贤至生物科技有限公司 | 新型冠状病毒n蛋白单克隆抗体的制备 |
| RU2754340C1 (ru) * | 2021-02-11 | 2021-09-01 | Общество с ограниченной ответственностью "Научно-производственное объединение "Диагностические системы" | Тест-система и способ дифференцированного выявления антител к SARS-CoV-2 |
| RU2763001C1 (ru) * | 2021-07-29 | 2021-12-24 | федеральное государственное бюджетное учреждение «Национальный исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф. Гамалеи» Министерства здравоохранения Российской Федерации | Однодоменное антитело и его модификации, специфически связывающиеся с RBD S белка вируса SARS-CoV-2, и способ их применения для терапии и экстренной профилактики заболеваний, вызываемых вирусом SARS-CoV-2 |
| RU2765731C1 (ru) * | 2021-12-22 | 2022-02-02 | федеральное государственное бюджетное учреждение "Национальный исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф. Гамалеи" Министерства здравоохранения Российской Федерации | Гуманизированное моноклональное антитело, специфически связывающиеся с RBD S белка вируса SARS-CoV-2, средство и способ для терапии и экстренной профилактики заболеваний, вызываемых вирусом SARS-CoV-2 |
| RU2769223C1 (ru) * | 2021-12-22 | 2022-03-29 | федеральное государственное бюджетное учреждение "Национальный исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф. Гамалеи" Министерства здравоохранения Российской Федерации | Средство и способ терапии и экстренной профилактики заболеваний, вызываемых вирусом SARS-CoV-2 на основе рекомбинантного антитела и гуманизированного моноклонального антитела |
| RU2773397C1 (ru) * | 2021-11-18 | 2022-06-03 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Ивановский государственный химико-технологический университет" (ИГХТУ) | 5-[4-(1,3-БЕНЗОТИАЗОЛ-2-ИЛ)ФЕНИЛ]-10,15,20-ТРИС(1-МЕТИЛПИРИДИНИЙ-3-ИЛ)ПОРФИРИН ТРИИОДИД, ПРОЯВЛЯЮЩИЙ СВОЙСТВО СВЯЗЫВАНИЯ СПАЙКОВОГО БЕЛКА ВИРУСА SARS-CoV-2 |
| WO2022237924A1 (en) * | 2021-05-14 | 2022-11-17 | Ustav Organicke Chemie A Biochemie Av Cr, V. V. I. | Antibody binding to rbd of the spike protein of sars-cov-2 and a method for quantifying protective antibodies against sars-cov-2 |
| US11732030B2 (en) | 2020-04-02 | 2023-08-22 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Anti-SARS-CoV-2-spike glycoprotein antibodies and antigen-binding fragments |
| US11999777B2 (en) | 2020-06-03 | 2024-06-04 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Methods for treating or preventing SARS-CoV-2 infections and COVID-19 with anti-SARS-CoV-2 spike glycoprotein antibodies |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN111423508A (zh) * | 2020-03-31 | 2020-07-17 | 江苏省疾病预防控制中心(江苏省公共卫生研究院) | 一种分离的抗病毒感染的SARS-CoV-2蛋白结合分子 |
| CN111620946A (zh) * | 2020-05-09 | 2020-09-04 | 江苏省疾病预防控制中心(江苏省公共卫生研究院) | 分离的新型冠状病毒单克隆抗体或其抗原结合部分 |
| RU2733834C1 (ru) * | 2020-07-28 | 2020-10-07 | Федеральное бюджетное учреждение науки Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии "Вектор" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (ФБУН ГНЦ ВБ "Вектор" Роспотребнадзора) | Искусственный ген EctoS_SC2, кодирующий эктодомен гликопротеина S коронавируса SARS-CoV-2 с C-концевым тримеризующим доменом, рекомбинантная плазмида pStem-rVSV-EctoS_SC2, обеспечивающая экспрессию искусственного гена, и рекомбинантный штамм вируса везикулярного стоматита rVSV-EctoS_SC2, используемый для создания вакцины против коронавируса SARS-CoV-2 |
-
2020
- 2020-11-20 RU RU2020138183A patent/RU2744274C1/ru active
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN111423508A (zh) * | 2020-03-31 | 2020-07-17 | 江苏省疾病预防控制中心(江苏省公共卫生研究院) | 一种分离的抗病毒感染的SARS-CoV-2蛋白结合分子 |
| CN111620946A (zh) * | 2020-05-09 | 2020-09-04 | 江苏省疾病预防控制中心(江苏省公共卫生研究院) | 分离的新型冠状病毒单克隆抗体或其抗原结合部分 |
| RU2733834C1 (ru) * | 2020-07-28 | 2020-10-07 | Федеральное бюджетное учреждение науки Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии "Вектор" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (ФБУН ГНЦ ВБ "Вектор" Роспотребнадзора) | Искусственный ген EctoS_SC2, кодирующий эктодомен гликопротеина S коронавируса SARS-CoV-2 с C-концевым тримеризующим доменом, рекомбинантная плазмида pStem-rVSV-EctoS_SC2, обеспечивающая экспрессию искусственного гена, и рекомбинантный штамм вируса везикулярного стоматита rVSV-EctoS_SC2, используемый для создания вакцины против коронавируса SARS-CoV-2 |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| HUSSAIN A. et al., Targeting SARS-CoV2 Spike Protein Receptor Binding Domain by Therapeutic Antibodies, Biomed Pharmacother., 2020, Volume 130, p. 110559. * |
| TIAN X. et al., Potent binding of 2019 novel coronavirus spike protein by a SARS coronavirus-specific human monoclonal antibody, Emerg Microbes Infect., 2020, Volume 9, Issue 1, pp. 382-385. * |
| TIAN X. et al., Potent binding of 2019 novel coronavirus spike protein by a SARS coronavirus-specific human monoclonal antibody, Emerg Microbes Infect., 2020, Volume 9, Issue 1, pp. 382-385. HUSSAIN A. et al., Targeting SARS-CoV2 Spike Protein Receptor Binding Domain by Therapeutic Antibodies, Biomed Pharmacother., 2020, Volume 130, p. 110559. * |
Cited By (18)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US11732030B2 (en) | 2020-04-02 | 2023-08-22 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Anti-SARS-CoV-2-spike glycoprotein antibodies and antigen-binding fragments |
| US11999777B2 (en) | 2020-06-03 | 2024-06-04 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Methods for treating or preventing SARS-CoV-2 infections and COVID-19 with anti-SARS-CoV-2 spike glycoprotein antibodies |
| RU2754340C1 (ru) * | 2021-02-11 | 2021-09-01 | Общество с ограниченной ответственностью "Научно-производственное объединение "Диагностические системы" | Тест-система и способ дифференцированного выявления антител к SARS-CoV-2 |
| CN113150136A (zh) * | 2021-04-30 | 2021-07-23 | 杭州贤至生物科技有限公司 | 新型冠状病毒n蛋白单克隆抗体的制备 |
| CN113150136B (zh) * | 2021-04-30 | 2022-04-01 | 杭州贤至生物科技有限公司 | 新型冠状病毒n蛋白单克隆抗体的制备 |
| WO2022237924A1 (en) * | 2021-05-14 | 2022-11-17 | Ustav Organicke Chemie A Biochemie Av Cr, V. V. I. | Antibody binding to rbd of the spike protein of sars-cov-2 and a method for quantifying protective antibodies against sars-cov-2 |
| RU2794141C2 (ru) * | 2021-06-11 | 2023-04-11 | Степан Петрович Чумаков | Однодоменные наноантитела против шиповидного белка вируса SARS-CoV-2 |
| RU2763001C1 (ru) * | 2021-07-29 | 2021-12-24 | федеральное государственное бюджетное учреждение «Национальный исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф. Гамалеи» Министерства здравоохранения Российской Федерации | Однодоменное антитело и его модификации, специфически связывающиеся с RBD S белка вируса SARS-CoV-2, и способ их применения для терапии и экстренной профилактики заболеваний, вызываемых вирусом SARS-CoV-2 |
| RU2773397C1 (ru) * | 2021-11-18 | 2022-06-03 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Ивановский государственный химико-технологический университет" (ИГХТУ) | 5-[4-(1,3-БЕНЗОТИАЗОЛ-2-ИЛ)ФЕНИЛ]-10,15,20-ТРИС(1-МЕТИЛПИРИДИНИЙ-3-ИЛ)ПОРФИРИН ТРИИОДИД, ПРОЯВЛЯЮЩИЙ СВОЙСТВО СВЯЗЫВАНИЯ СПАЙКОВОГО БЕЛКА ВИРУСА SARS-CoV-2 |
| RU2769223C1 (ru) * | 2021-12-22 | 2022-03-29 | федеральное государственное бюджетное учреждение "Национальный исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф. Гамалеи" Министерства здравоохранения Российской Федерации | Средство и способ терапии и экстренной профилактики заболеваний, вызываемых вирусом SARS-CoV-2 на основе рекомбинантного антитела и гуманизированного моноклонального антитела |
| WO2023121507A1 (ru) * | 2021-12-22 | 2023-06-29 | федеральное государственное бюджетное учреждение "Национальный исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф. Гамалеи" Министерства здравоохранения Российской Федерации | Антитело к sars-cov-2, средство и способ для терапии заболеваний, вызываемых sars-cov-2 |
| WO2023121506A1 (ru) * | 2021-12-22 | 2023-06-29 | федеральное государственное бюджетное учреждение "Национальный исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф. Гамалеи" Министерства здравоохранения Российской Федерации | Средство и способ терапии заболеваний, вызываемых вирусом sars-cov-2 |
| RU2765731C1 (ru) * | 2021-12-22 | 2022-02-02 | федеральное государственное бюджетное учреждение "Национальный исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф. Гамалеи" Министерства здравоохранения Российской Федерации | Гуманизированное моноклональное антитело, специфически связывающиеся с RBD S белка вируса SARS-CoV-2, средство и способ для терапии и экстренной профилактики заболеваний, вызываемых вирусом SARS-CoV-2 |
| RU2800649C2 (ru) * | 2021-12-29 | 2023-07-25 | Общество с ограниченной ответственностью "Имген+" | Моноклональные антитела против рецептор-связывающего домена spike-белка вируса sars-cov-2 и их антигенсвязывающие фрагменты, кодирующие их нуклеиновые кислоты, а также способы применения |
| RU2791749C1 (ru) * | 2022-06-17 | 2023-03-13 | Александр Сергеевич Малоголовкин | Биспецифическое моноклональное антитело против sars-cov-2 |
| RU2810476C1 (ru) * | 2022-12-29 | 2023-12-27 | Федеральное государственное бюджетное учреждение науки институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук (ИБХ РАН) | Широко нейтрализующее антитело против SARS-CoV-2 |
| RU2817696C1 (ru) * | 2023-11-22 | 2024-04-18 | Общество с ограниченной ответственностью "ИМГЕН+" (ООО "ИМГЕН+") | Моноклональное антитело iC1 и его антигенсвязывающий фрагмент, селективно связывающие рецептор-связывающий домен Spike-белка вируса SARS-CoV-2, обладающие вируснейтрализующей активностью |
| RU2817697C1 (ru) * | 2023-12-08 | 2024-04-18 | Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт молекулярной и клеточной биологии Сибирского отделения Российской академии наук (ИМКБ СО РАН) | Моноклональное антитело iC2 и его антигенсвязывающий фрагмент, селективно связывающие рецептор-связывающий домен Spike-белка вируса SARS-CoV-2, обладающие вируснейтрализующей активностью |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| RU2744274C1 (ru) | Моноклональное антитело к RBD фрагменту в составе S белка вируса SARS-CoV-2 | |
| KR101732056B1 (ko) | 중화 항-인플루엔자 ａ 바이러스 항체 및 이의 용도 | |
| WO2019091449A1 (zh) | Cd96抗体、其抗原结合片段及医药用途 | |
| JP2023503180A (ja) | 抗ヒトクローディン１８．２抗体及びその適用 | |
| WO2016173558A1 (zh) | 抗诺如病毒gii.4型鼠源单克隆抗体的制备和应用 | |
| US9567404B2 (en) | Anti-vasa antibodies, and methods of production and use thereof | |
| CN113416245A (zh) | 一种可结合SARS-CoV-2病毒RBD蛋白的中和抗体及其应用 | |
| EP1167389B1 (en) | Antibodies against the protein SEMP1, methods for their production and uses thereof | |
| KR20190044006A (ko) | 중동호흡기증후군 코로나바이러스에 대한 항체 및 이를 이용한 항체역가 측정방법 | |
| CN112480250B (zh) | 一种抗人骨桥蛋白的抗体及其应用 | |
| CN115386006A (zh) | 抗gprc5d抗体、其制备方法与用途 | |
| WO2022267936A1 (zh) | 特异性结合糖基化ceacam5的抗体 | |
| KR20190054779A (ko) | 치쿤구니아 바이러스 감염 진단용 단일클론항체, 이를 생산하는 하이브리도마 및 이를 이용한 치쿤구니아 바이러스 감염 진단 방법 | |
| CN110702913B (zh) | 一种用于定量检测贝氏柯克斯体i相株的单抗组合物 | |
| CN109593134B (zh) | 抗cd20的人源化单克隆抗体及其制剂 | |
| CN115838424A (zh) | 靶向tigit的单克隆抗体 | |
| EP1167387A1 (en) | Antibodies against SEMP1, methods for their production and uses thereof | |
| CN114174515A (zh) | tau中的构象特异性表位、其抗体和其相关方法 | |
| JP7498747B2 (ja) | 抗ｇｍ２ａｐ抗体及びその応用 | |
| CN117126269B (zh) | 一种1型人博卡病毒型别特异性抗体及其应用 | |
| JP7392200B2 (ja) | グリコシル化ｃｅａｃａｍ５に特異的に結合した抗体 | |
| CN117126270B (zh) | 一种2型人博卡病毒型别特异性抗体及其应用 | |
| CN114805570B (zh) | 一种抗人ace2单克隆抗体及其应用 | |
| WO2024131846A1 (en) | Antibody, antigen-binding fragment thereof, and pharmaceutical use thereof | |
| CN117129675B (zh) | 用于人博卡病毒型别特异性检测或诊断的试剂或试剂盒 |