WO2023121507A1 - Антитело к sars-cov-2, средство и способ для терапии заболеваний, вызываемых sars-cov-2 - Google Patents

Антитело к sars-cov-2, средство и способ для терапии заболеваний, вызываемых sars-cov-2 Download PDF

Info

Publication number
WO2023121507A1
WO2023121507A1 PCT/RU2022/000190 RU2022000190W WO2023121507A1 WO 2023121507 A1 WO2023121507 A1 WO 2023121507A1 RU 2022000190 W RU2022000190 W RU 2022000190W WO 2023121507 A1 WO2023121507 A1 WO 2023121507A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
cov
virus
sars
monoclonal antibody
xrh19
Prior art date
Application number
PCT/RU2022/000190
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Ильяс Булатович Есмагамбетов
Дмитрий Викторович ЩЕБЛЯКОВ
Юрий Степанович ЛЕБЕДИН
Ирина Алексеевна ФАВОРСКАЯ
Инна Вадимовна ДОЛЖИКОВА
Артем Алексеевич ДЕРКАЕВ
Екатерина Игоревна РЯБОВА
Владимир Владимирович ПРОКОФЬЕВ
Ирина Александровна АЛЕКСЕЕВА
Дарья Владимировна ВОРОНИНА
Илья Дмитриевич ЗОРКОВ
Анна Витальевна КОВЫРШИНА
Анна Алексеевна ИЛЮХИНА
Андрей Геннадьевич Ботиков
Андрей Павлович КАРПОВ
Надежда Леонидовна ЛУБЕНЕЦ
Ольга Вадимовна ЗУБКОВА
Александр Сергеевич Семихин
Борис Савельевич НАРОДИЦКИЙ
Денис Юрьевич ЛОГУНОВ
Александр Леонидович ГИНЦБУРГ
Original Assignee
федеральное государственное бюджетное учреждение "Национальный исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф. Гамалеи" Министерства здравоохранения Российской Федерации
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by федеральное государственное бюджетное учреждение "Национальный исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф. Гамалеи" Министерства здравоохранения Российской Федерации filed Critical федеральное государственное бюджетное учреждение "Национальный исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф. Гамалеи" Министерства здравоохранения Российской Федерации
Publication of WO2023121507A1 publication Critical patent/WO2023121507A1/ru

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies

Definitions

  • the group of inventions relates to the field of biotechnology, immunology and virology.
  • a humanized monoclonal antibody has been created that specifically binds to the RBD S protein of the SARS-CoV-2 virus and has virus-neutralizing activity; a means and method for the treatment and emergency prevention of diseases caused by the SARS-CoV-2 virus have also been proposed.
  • the causative agent of the disease was a single-stranded RNA-containing virus SARS-CoV-2, belonging to the Coronaviridae family, to the Beta-CoV B line.
  • Coronavirus SARS-CoV-2 can be transmitted by airborne, airborne, contact, fecal-oral methods, as well as through contaminated objects and surfaces (fomites), through blood, from mother to child and from animals to humans (Mechanisms of transmission of the SARS-CoV virus -2 and their implications for prevention choices, Research Summary, 9 July 2020 WHO). In a few months, the virus spread around the world, and in January 2020, WHO declared the epidemic associated with SARS-CoV-2 an international health emergency, and in March 2020 described the spread of the disease as a pandemic.
  • COVID-19 The disease that SARS-CoV-2 causes has been given its own name, COVID-19. This is a potentially severe acute respiratory infection that can be mild or severe, and is accompanied by complications such as pneumonia, acute respiratory distress syndrome, acute respiratory failure, acute heart failure, acute renal failure, septic shock, cardiomyopathies. , etc. Currently, the number of cases of COVID-19 is more than 185 million people, and more than 4 million people have died, and these numbers continue to grow. It is clear that there is an urgent need worldwide for the development of safe and effective means of prevention and treatment.
  • REGEN-COV consists of two monoclonal antibodies, casirivimab (REGN10933) and imdevimab (REGN10987), that bind to non-overlapping epitopes of the SARS-CoV-2 S protein.
  • the results of clinical studies of this drug showed that it is able to reduce the viral load, with a large effect in patients in whom the immune response has not yet been initiated or who initially had a high viral load (Weinreich DM, Sivapalasingam S, Norton T, Ali S, Gao H, Bhore R, Musser BJ, Soo Y, Rofail D, Im J, Perry C, Pan C, Hosain R, Mahmood A, Davis JD, Turner KS, Hooper AT, Hamilton JD, Baum A, Kyratsous CA, Kim Y, Cook A, Kampman W, Kohli A, Sachdeva Y, Graber X, Kowal B, DiCioccio T, Stahl N, Lipsich L, Braunstein N
  • bamlanivimab Another monoclonal antibody drug, bamlanivimab (LY-CoV555, developer: Eli Lilly), has received emergency FDA clearance for the treatment of mild to moderate COVID-19 in non-hospitalized adults and children. However, the results of clinical studies are mixed. Among hospitalized patients with COVID-19, co-administration of bamlanivimab with remdesivir was not effective.
  • bamlanivimab and etsevimab.
  • bamlanivimab and etsevimab.
  • etsevimab The best effect was observed with combination therapy with two monoclonal antibodies: bamlanivimab and etsevimab.
  • Gottling RL Nirula A, Chen P, Boscia J, Heller B, Morris J, Huhn G, Cardona J, Mocherla B, Stosor V, Shawa I, Kumar P, Adams AC, Van Naarden J, Custer KL, Durante M, Oakley G, Schade AE, Holzer TR, Ebert PJ, Higgs RE, Kallewaard NL, Sabo J, Patel DR, Klekotka P, Shen L, Skovronsky DM Effect of Bamlanivimab as Monotherapy or in Combination With Etesevimab on Viral Load in Patients With Mild to Moderate COVID-19:
  • nanoantibodies single-domain antibodies
  • Single domain antibodies Due to their relatively small size, single domain antibodies have favorable biophysical properties and are cheaper to produce than standard monoclonal antibodies. They can be produced using prokaryotic or eukaryotic expression systems. Their small size, as well as long complementarity-determining regions of the heavy chain, allow them to target concave epitopes.
  • nanoantibodies can be sprayed and delivered directly into the lungs of a Covid-19 patient using an inhaler, which is a better alternative to classical antibodies administered intravenously (Ram Sasisekharan. Preparing for the Future — Nanobodies for Covid-19? April 22, 2021 N Engl J Med 2021;384:1568-1571 DOI: 10.1056/NEJMcibr2101205)
  • a solution is known (CN112500480A, pub. 03/16/2021), in which variants of a single-domain antibody against the SARS-CoV-2 virus, the corresponding expression vector, as well as a cell line capable of expressing the above variants of a single-domain antibody, and a method for obtaining variants of this antibody are developed.
  • a solution is known (CN111825762A, pub. 10/27/2020), in which several variants of nanoantibodies to the RBD S domain of the SARS-COV-2 virus protein were developed, as well as a method for using nanoantibody variants for the preparation of drugs for inhibiting the SARS-COV-2 viral infection and preparation of reagents or kits for testing the SARS-COV-2 virus.
  • the patent (CN112094342A, published 12/18/2020) presents a biepitope specific antibody derived from alpaca, or an antigen-binding fragment thereof, that binds to the RBD domain of SARS-CoV-2 with high affinity, which can be used for prevention, treatment and / or diagnosis SARS-CoV-2 infections.
  • a solution is known (CN112062839A, pub. 12/11/2020), which describes the creation of a nanoantibody to the SARS-CoV-2 S protein, as well as a method for using it to prepare a reagent for the treatment and / or diagnosis of an infection caused by the SARS-CoV-2 coronavirus.
  • a solution is also known (CN112062840A, published on 12/11/2020), which provides for the development of a nanoantibody to the S protein of SARS-CoV-2, as well as a method for using it for preparation of a reagent for the treatment and / or diagnosis of an infection caused by the SARS-CoV-2 coronavirus.
  • the patent (CN111303279A, published September 19, 2020) describes the creation of a humanized single-domain antibody against the SARS-CoV-2 coronavirus, a nucleic acid molecule encoding a single-domain antibody, as well as the creation of an expression cassette, a recombinant vector, a recombinant bacterium or a transgenic cell line containing the above described nucleic acid molecule.
  • a method has been developed for using a single-domain antibody or engineered nucleic acid molecule or engineered expression cassette, recombinant vector, recombinant bacterium, or transgenic cell line in the manufacture of a product that can be used to prevent and/or treat diseases caused by infection with the novel coronavirus SARS-CoV- 2; as well as to suppress infection with the novel coronavirus SARS-CoV-2.
  • the product may: communicate with the new coronavirus SARS-CoV-2; detect binding of the novel coronavirus SARS-CoV-2; bind to the S protein of the novel coronavirus SARS-CoV-2; detect the S protein of the new SARS-CoV-2 coronavirus.
  • a pharmaceutical composition has also been developed containing the created single-domain antibody and a pharmaceutically acceptable excipient, diluent or carrier.
  • the disadvantage of the prototype is the lack of data on the possibility of using the obtained antibodies for the treatment of a disease caused by the SARS-CoV-2 virus of other variants (for example, the Delta variant), in addition, single-domain antibodies are rapidly excreted from the body due to the low molecular weight and, thus require multiple injections.
  • the technical objective of the claimed group of inventions is to expand the arsenal of agents for therapy and emergency prevention of diseases caused by the SARS-CoV-2 virus.
  • the technical result consists in creating a humanized monoclonal antibody with virus-neutralizing activity and protective activity against various strains of the SARS-CoV-2 virus.
  • a also, the technical result consists in creating an effective method for the treatment or emergency prevention of diseases caused by the SARS-CoV-2 virus, which consists in the introduction of an effective agent, including the developed humanized monoclonal antibody.
  • a humanized monoclonal antibody has been created for the treatment and emergency prevention of diseases caused by the SARS-CoV-2 virus, and has the amino acid sequence of the heavy chain SEQ ID N0:1 and the amino acid sequence of the light chain SEQ ID N0:2.
  • an agent for the treatment and emergency prevention of diseases caused by the SARS-CoV-2 virus has been created, containing the developed humanized monoclonal antibody in an effective amount, as well as a pharmaceutically acceptable carrier and/or diluent.
  • a method for the treatment or emergency prevention of diseases caused by the SARS-CoV-2 virus which consists in introducing a humanized monoclonal antibody in an effective amount into the body of mammals.
  • FIG. 1 shows an electrophoregram of the analysis of a humanized XRH19 monoclonal antibody.
  • FIG. 1 shows a sample of a humanized XRH19 monoclonal antibody under denatured conditions
  • FIG. 3 shows a sample of a humanized XRH19 monoclonal antibody under undenatured conditions
  • FIG. 2 is a schematic representation of a humanized XRH19 monoclonal antibody.
  • FIG. 3 shows the results of the analysis of the specific activity of the humanized monoclonal antibody XRH19 in indirect ELISA.
  • Abscissa axis - XRH19 antibody concentration ⁇ g/ml
  • FIG. 4 shows the HPLC chromatogram of the XRH19 humanized monoclonal antibody sample in buffer #2.
  • FIG. Figure 5 shows the results of the survival of animals that were injected with the humanized monoclonal antibody XRH19 and animals from the placebo group for 15 days after infection with the SARS-CoV-2 virus of the hCoV-19/ Russia/Moscow_PMVL-1/2020 strain.
  • the abscissa axis is the time after infection of animals with the SARS-CoV-2 virus, days
  • mice treated with phosphate-buffered saline (PBS) 1 hour after infection with the virus;
  • PBS phosphate-buffered saline
  • FIG. 6 shows the results of the analysis of the change in weight of animals that were injected with humanized monoclonal antibody XRH19 and animals from the placebo group within 15 days after infection with the SARS-CoV-2 variant Delta virus. At each time point for each group of animals, the weight is presented as an arithmetic mean.
  • the y-axis is the change in the weight of animals from the initial one, % Abscissa axis - time after infection of animals with the SARS-CoV-2 virus, days - mice that received humanized monoclonal antibody XRH19 10 mg/kg 1 hour after infection with the virus;
  • mice receiving humanized monoclonal antibody XRH19 10 mg/kg 6 hours after infection with the virus
  • MLNHI who received the humanized monoclonal antibody XRH19 20 mg/kg 6 hours after infection with the virus; mice treated with phosphate buffered saline (PBS) 1 hour after virus infection;
  • PBS phosphate buffered saline
  • mice treated with phosphate buffered saline (PBS) 6 hours after infection with the virus;
  • PBS phosphate buffered saline
  • FIG. 7 shows the survival results of animals treated with the humanized monoclonal antibody XRH19 and animals in the placebo group for 15 days after infection with the SARS-CoV-2 variant Delta virus.
  • the abscissa axis is the time after infection of animals with the SARS-CoV-2 virus, days
  • mice that received humanized monoclonal antibody XRH19 20 mg/kg 1 hour after infection with the virus;
  • mice P0L in CHIVS receiving the humanized monoclonal antibody XRH19 20 mg/kg 6 hours after infection with the virus; mice treated with phosphate-buffered saline (PBS) 1 hour after infection with the virus; - mice treated with phosphate buffered saline (PBS) 6 hours after infection with the virus;
  • PBS phosphate-buffered saline
  • the technical task of the claimed group of inventions is the creation of a humanized monoclonal antibody for the treatment and emergency prevention of diseases caused by the SARS-CoV-2 virus.
  • Monoclonal antibodies with high specificity for the RBD S-protein of the SARS-CoV-2 virus and virus-neutralizing activity are considered as promising agents for the treatment and emergency prevention of COVID 19.
  • a humanized monoclonal antibody (XRH19) was developed that specifically binds to the RBD domain S of the SARS-CoV-2 virus protein, has virus-neutralizing and protective activity against various strains of the SARS-CoV-2 virus, and has the amino acid sequence of the heavy chain SEQ ID N0: 1 and the light chain amino acid sequence of SEQ ID N0:2.
  • a humanized monoclonal antibody can be used for the treatment and emergency prevention of COVID 19.
  • mice were immunized with recombinant RBD of the SARS-CoV-2 virus obtained in the CHO cell line and purified by metal affinity and size exclusion chromatography. The effectiveness of immunization was confirmed by assessing the titer of antibodies specific to RBD in the blood serum of mice.
  • splenocytes were isolated from mice, which were then fused with the mouse myeloma line Sp2/0-Ag-14, thus obtaining hybridomas.
  • Hybridoma selection was performed on RPMI-1640 nutrient medium (Sigma, USA) supplemented with HAT Media Supplement (Hybri-Max®, Sigma, USA). The selection of clones producing antibodies specific to RBD was carried out by the method of solid-phase ELISA.
  • a hybridoma clone was selected that produces the mouse monoclonal antibody XR19, which is specific to RBD and has a pronounced virus-neutralizing and protective activity against the SARS-CoV-2 virus, including the Delta variant.
  • sections of the genome of the selected hybridoma clone encoding the antigen-binding regions (CDR domains) of the XR19 antibody were sequenced and used to create a humanized monoclonal antibody GamXRH19.
  • the nucleotide sequences encoding the humanized monoclonal antibody GamXRH19 (SEQ ID N0:1 heavy chain and SEQ ID N0:2 light chain) were obtained.
  • sequences of monoclonal antibodies specific to the RBD of the SARS-CoV-2 virus may contain amino acid substitutions that do not affect the secondary and tertiary structure of the monoclonal antibodies and do not affect their ability to bind and neutralize the RBD of the SARS-CoV-2 virus.
  • CDR domains antigen-binding regions
  • sequences of CDR domains may contain substitutions/deletions/insertions of amino acids, which, when paired with amino acid sequences, provide homology of at least 70% and do not qualitatively affect the ability to bind to the antigen.
  • all immunoglobulins or their analogues containing sequences of CDR domains, the homology of which is not less than 70% with the proposed sequences can be used for the implementation of this invention.
  • the humanized monoclonal antibody XRH19 (human IgGl isotype), which specifically binds to the RBD domain S of the SARS-CoV-2 virus protein and has virus-neutralizing and protective activity, was obtained by expressing the nucleotide sequence of the heavy and light chains in CHO-producing cells.
  • nucleotide sequences of the heavy and light chains of the humanized monoclonal antibody XRH19 were genetically engineered based on the nucleotide sequence of human immunoglobulin G1 and nucleotide sequences of the antigen-binding sites of the XR19 antibody.
  • nucleotide sequence encoding a humanized monoclonal antibody may differ based on the principle of degeneracy of the genetic code.
  • all nucleotide sequences encoding the amino acid sequence of the humanized monoclonal antibody XRH19 can be used to practice the present invention.
  • a producer cell containing nucleic acids was obtained with the nucleotide sequences of the humanized XRH19 monoclonal antibody (SEQ ID N0:3 heavy chain and SEQ ID N0:4 light chain) and expressing the humanized XRH19 monoclonal antibody (SEQ ID N0: 1 heavy chain and SEQ ID N0:2 light chain).
  • SEQ ID N0: 3 heavy chain and SEQ ID N0:4 light chain the nucleotide sequences of the humanized XRH19 monoclonal antibody
  • SEQ ID N0: 1 heavy chain and SEQ ID N0:2 light chain expressing the humanized XRH19 monoclonal antibody
  • the authors of the patent have developed a method for the treatment and emergency prevention of diseases caused by the SARS-CoV-2 virus (including the Delta variant), which consists in systemically administering an effective amount of humanized XRH19 monoclonal antibody into the body of mammals.
  • Example 1 Obtaining an immunogen - receptor-binding domain (RBD) S protein of the SARS-CoV-2 virus.
  • an immunogen was obtained - the receptor-binding domain (RBD) S protein of the SARS-CoV-2 virus.
  • RBD receptor-binding domain
  • the amino acid sequence of the receptor-binding domain (RBD) of the surface Spike protein of the SARS-CoV-2 virus was modified from the N-terminus with the signal peptide of alkaline phosphatase SEAP (MLLLLLLGLRLRLQLSLGI ) and from the C-terminus with a glycine-serine linker and histidine tag sequence (GSHHHHHHHHH).
  • a nucleotide sequence was obtained, which was synthesized by Evrogen CJSC. After that, the nucleotide sequence of the resulting polypeptide was cloned into a plasmid for transient expression in mammalian cells. Next, cell culture CHO was charged with the obtained plasmid using the CHO Gro kit (Minis Bio, USA) according to the manufacturer's protocol. The cells were then cultured in Erlenmeyer flasks for 10 days. After this period, the culture liquid was clarified by centrifugation at 5000g.
  • Example 2 Obtaining monoclonal antibody XR19.
  • mice (10 females, 5-6 weeks old, weighing 15-20 g) were immunized with the preparation of the recombinant RBD of the SARS-CoV-2 virus obtained in example 1.
  • the immunization schedule included 4 subcutaneous injections of the antigen with an injection interval of 21 days.
  • the dose of the drug was 50 mcg per injection.
  • blood was taken from the paraorbital sinus and the titer of specific antibodies was determined using enzyme-linked immunosorbent assay. For this, the plates were sensitized with antigen in 50 mM carbonate-bicarbonate buffer pH 9.6.
  • Mouse blood samples were diluted by 10-fold titration in ELISA buffer (0.1 M phosphate-buffered saline supplemented with 1% bovine serum albumin (Serva, Germany) and 0.1% Tween 20 (Serva, Germany) and incubated in the plate wells for 30 minutes at 37 ° C.
  • the wells were washed with three additions of 0.9% sodium chloride with the addition of 0.1% Tween 20 (washing buffer) and antibodies against mouse immunoglobulins labeled with horseradish peroxidase (Cat. No. AS302-HRP, Khema, Russia) were added. ) in working dilution for 30 minutes at 37° C. After washing 5 times with washing buffer, a chromogen-substrate mixture (Cat.
  • the animals with the highest level of antibody production 20 days after immunization were given an intra-abdominal injection (booster dose) of the antigen in the amount of 50 mcg.
  • booster dose intra-abdominal injection
  • the spleen was aseptically removed, splenocytes were obtained by perfusion with RPMI1640 medium (Sigma-Aldrich, USA).
  • Cloning of cultures of hybrid cells was carried out by the method of limiting dilutions at the calculated seed concentration of one cell per well.
  • the production activity of individual clones was determined, starting from the 10th day, twice with an interval of three days by enzyme immunoassay according to the scheme described above. After the isolation of positive clones, their cells were expanded in sufficient quantity, the samples were frozen in RPMI growth medium containing 20% fetal calf serum and 8% dimethyl sulfoxide (Serva, Germany) and stored in a container with liquid nitrogen.
  • the reaction was manifested using chromogen-substrate mixture and photometry at 450 nm.
  • the culture medium was placed in the control well instead of the culture fluid sample. Selected cultures that gave the maximum inhibition of the interaction of ACE2 and RBD-peroxidase (not less than 90%).
  • the secondary screening procedure was repeated for selected clones at all stages of obtaining monoclonal antibodies in order to obtain antibodies, as a result, the monoclonal antibody XR19 was chosen, which gives the maximum specific activity of inhibition.
  • RNA isolation 5 ⁇ g was used for cDNA synthesis using the SuperScript IV TM first-strand synthesis system kit (Invitrogen).
  • the heavy and light chain variable domain sequences were amplified by PCR using a panel of primers specifically annealing at the beginning and end of mouse variable domain sequences.
  • the obtained PCR products were sequenced according to Sanger on the Genetic Analyzer 3500 Applied Biosystems.
  • variable domains of the heavy and light chains of the XR19 antibody were obtained, presented in Table 1.
  • a mouse monoclonal antibody XR19 was obtained, which specifically binds to the RBD S protein of the SARS-CoV-2 virus.
  • Example 4 Obtaining, nucleic acids, producer cells and humanized monoclonal antibody XRH19.
  • amino acid sequence design of the full-length heavy and light chains of the humanized XRH19 antibody was developed.
  • the amino acid sequence of the humanized heavy is shown by SEQ ID N0:1
  • the amino acid sequence of the humanized light is shown by SEQ ID N0:2.
  • the nucleotide sequences of the XRH19 antibody were obtained, which were synthesized at ZAO Evrogen.
  • the resulting nucleotide sequences were cloned into a vector for expression in eukaryotic cells.
  • CHO cells were transfected with the obtained expression vectors using the CHO Gro system (Minis Bio, USA) in accordance with the manufacturer's protocol. Cells were cultured in Erlenmeyer flasks for 10 days. After that, the culture liquid was clarified by centrifugation at 5000g.
  • the antibody was purified by affinity chromatography on an AKTA start system (Cytiva, Sweden) using MAbSelect SuRe 1 ml columns (Cytiva, Sweden) according to the manufacturer's protocol. Additional purification and buffer replacement were carried out on an XK 26/100 column (Cytiva, Sweden) packed with a Superdex 200 pg sorbent (Cytiva, Sweden). The purity of the resulting humanized XRH19 monoclonal antibody preparation was determined by vertical polyacrylamide gel electrophoresis under non-denaturing conditions and denaturing conditions (FIG. 1). A schematic representation of the humanized XRH19 monoclonal antibody is shown in FIG. 2.
  • nucleic acids were obtained that have nucleotide sequences encoding the heavy and light chains of the humanized XRH19 monoclonal antibody (SEQ ID N0:3 and SEQ ID N0:4), the cell producing the humanized XRH19 monoclonal antibody, and the humanized XRH19 monoclonal antibody having the final amino acid sequence of the heavy and light chains of SEQ ID N0:1 and SEQ ID N0:2.
  • Example 5 Study of the specific activity of the humanized monoclonal antibody XRH19 in indirect ELISA.
  • an indirect ELISA method For this, the recombinant RBD S protein of the SARS-CoV-2 virus was immobilized in the well of an immunological plate in 50.0 mm carbonate-bicarbonate buffer overnight. Unbound protein was removed and the well was blocked with 5% milk powder in phosphate buffer for 1 hour at room temperature. The wells were then washed with 0.1% Tween-20 detergent solution in phosphate buffer and a solution of 5% milk powder in phosphate buffer containing various dilutions of the humanized XRH19 monoclonal antibody was added. Each dilution was made in 3 repetitions, incubated for 1 hour at 37°C with gentle stirring.
  • a 3-fold washing was carried out with a 0.1% solution of Tween-20 detergent in phosphate buffer.
  • a solution of the conjugate labeled with peroxidase was added and incubated for 1 hour at 37°C with gentle stirring.
  • a 5-fold wash was carried out with a 0.1% solution of Tween-20 detergent in phosphate buffer.
  • a TMB substrate solution was added and incubated for 10 min at room temperature without stirring, after which the reaction was stopped by adding a sulfuric acid solution and measurements were taken on a spectrophotometer.
  • the results of the study are presented in Fig. 3.
  • the XRH19 antibody has been shown to have specific activity at a concentration of at least 3.3 ng/mL.
  • the interaction constants (KD) of the humanized monoclonal antibody XRH19 were determined by detecting changes in surface plasmon resonance parameters on a Biacore3000 instrument (General Electric, Sweden).
  • the recombinant RBD of the S protein of the SARS-CoV-2 virus was covalently immobilized on the surface of the dextran matrix of the CM5 chip (General Electric, Sweden), and then various concentrations of the resulting XRH19 antibody were passed over the chip surface.
  • Data processing and calculation of constants were carried out automatically using the Bioevaluation program (General Electric, Sweden).
  • the equilibrium dissociation constant of XRH19 was 4*10' 9 M, which demonstrates the high affinity of the antibody for recombinant RBD.
  • the high affinity of the XRH19 antibody for the recombinant RBD of the S protein of the SARS-CoV-2 virus was demonstrated.
  • Example 7 Determination of the virus neutralizing activity of the humanized monoclonal antibody XRH19 against various strains of the SARS-CoV-2 virus.
  • the purpose of this experiment was to evaluate the ability of the developed humanized XRH19 monoclonal antibody to neutralize the SARS-CoV-2 virus of various strains.
  • XRH19 antibody samples were prepared in DMEM culture medium with 2% inactivated fetal bovine serum. Then, the obtained antibody samples were mixed with 100 PFU of the SARS-CoV-2 virus of various strains, incubated for 1 hour at 37°C, and added to Vero E6 cells. Cells were incubated at 37°C in 5% CO2. After 96 hours, the development of the cytopathic effect of the virus on the cell culture was recorded visually by assessing the violation of the cell monolayer. The virus-neutralizing antibody titer was taken as the highest dilution at which the cytopathic effect is suppressed in 2 out of 3 wells. As a result, the following working virus-neutralizing concentrations were determined, presented in table 3.
  • this example demonstrated a pronounced virus-neutralizing activity of the humanized XRH19 monoclonal antibody against the SARS-CoV-2 virus, including the Delta variant.
  • Example 8 Preparation of an agent containing a humanized XRH19 monoclonal antibody.
  • An agent for the treatment and emergency prevention of COVID-19 disease based on the humanized monoclonal antibody GamXRH19 was obtained by selecting a formulating buffer.
  • various physiological buffer systems were used, presented in Table 4.
  • the humanized monoclonal antibody GamXRH19 was transferred to each buffer system using size exclusion chromatography on a Superdex 200 pg sorbent and compressed to a concentration of 20 mg/ml. Next, the samples were incubated at 37°C for a week and then analyzed for their stability and purity using HPLC. The results of the analysis are shown in Table 5. Examples of HPLC analysis chromatograms are shown in FIG. 4.
  • Example 9 A method for the treatment and emergency prevention of COVID-19 disease using a humanized monoclonal antibody XR19.
  • the therapeutic and emergency prophylactic efficacy of the humanized monoclonal antibody XRH19 was evaluated in an ACE2 transgenic mouse model of SARS-CoV-2 virus infection. These animals were chosen because they are highly susceptible to SARS-CoV-2 infection. The lethality of animals after infection with the SARS-CoV-2 virus is 100%.
  • FIG. Figure 5 shows the survival data of animals after infection with the SARS-CoV-2 virus of the hCoV-19/USD/Moscow_PMVL- 1/2020 strain.
  • a single systemic administration based on a humanized monoclonal antibody XRH19 at a dose of 10 and 20 mg/kg to animals one hour after infection allows protecting animals from infection caused by the SARS-CoV-2 virus of the hCoV-19/USD/Moscow_PMVL strain. - 1/2020.
  • the humanized monoclonal antibody XRH19 can be used for therapy and emergency prevention of the disease caused by the SARS-CoV-2 virus.
  • Example 10 A method for the treatment and emergency prevention of COVID-19 disease caused by the SARS-CoV-2 variant Delta virus using a humanized XR19 monoclonal antibody.
  • SARS-CoV-2 virus variant Delta B.1.617.2 T19R G142D E156G F157del R158del L452R T478K D614G P681R D950N
  • the infectious titer of the virus was 10 7 TSGO50/ml and 3.5x10 7 PFU/ml.
  • Animals were infected with the SARS-CoV-2 virus intranasally at a dose of 10 5 TCID50 per animal, followed by a monoclonal antibody preparation or placebo, according to Table 7.
  • FIG. Figure 6 shows the data on the dynamics of the weight of animals after infection with the SARS-CoV-2 Delta variant virus.
  • FIG. 7 shows the survival data of animals after infection with the SARS-CoV-2 variant Delta virus.
  • the resulting humanized XRH19 monoclonal antibody can be used for therapy and emergency prevention of a disease caused by the SARS-CoV-2 virus, including the Delta variant.
  • this antibody can be used for the treatment and emergency prevention of diseases caused by the SARS-CoV-2 virus in various ways.
  • the antibody can be administered subcutaneously, intramuscularly, intravenously, intraperitoneally and intranasally.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

Группа изобретений относится к области биотехнологии, иммунологии и вирусологии. Создано гуманизированное моноклональное антитело, которое специфически связывается с RBD S белка вируса SARS-CoV-2 и обладает вируснейтрализующей активностью, а также создано средство и способ терапии и экстренной профилактики заболеваний, вызываемых вирусом SARS-CoV-2. Гуманизированное моноклональное антитело имеет аминокислотную последовательность тяжелой цепи SEQ ID NO:1 и аминокислотную последовательность легкой цепи SEQ ID NO:2. Группа изобретений обеспечивает создание гуманизированного моноклонального антитела, обладающего вируснейтрализующей активностью и протективной активностью в отношении различных штаммов вируса SARS-CoV-2.

Description

АНТИТЕЛО К SARS-COV-2, СРЕДСТВО И СПОСОБ ДЛЯ ТЕРАПИИ ЗАБОЛЕВАНИЙ, ВЫЗЫВАЕМЫХ SARS-COV-2
Область техники
Группа изобретений относится к области биотехнологии, иммунологии и вирусологии. Создано гуманизированное моноклональное антитело, специфически связывающееся с RBD S белка вируса SARS-CoV-2 и обладающие вируснейтрализующей активностью, также предложено средство и способ терапии и экстренной профилактики заболеваний, вызываемых вирусом SARS-CoV-2.
Предшествующий уровень техники.
31 декабря 2019 года во Всемирную организацию здравоохранения (ВОЗ) поступила информация о вспышке пневмонии неизвестной этиологии в городе Ухань (Китайская Народная Республика). Возбудителем заболевания оказался одноцепочечный РНК- содержащий вирус SARS-CoV-2, относящийся к семейству Coronaviridae, к линии Beta- CoV В.
Коронавирус SARS-CoV-2 может передаваться воздушно-капельным, воздушнопылевым, контактным, фекально-оральным способами, а также через контаминированные предметы и поверхности (фомиты), через кровь, от матери ребенку и от животных к человеку (Механизмы передачи вируса SARS-CoV-2 и их значение для выбора мер профилактики, Резюме научных исследований, 9 июля 2020 г. ВОЗ). За несколько месяцев вирус распространился по всему миру, и в январе 2020 года ВОЗ объявила эпидемию, связанную с SARS-CoV-2, чрезвычайной ситуацией в области здравоохранения международного значения, а в марте 2020 года охарактеризовала распространение болезни как пандемию.
Заболевание, которое вызывает SARS-CoV-2 получило собственное название COVID-19. Это потенциально тяжёлая острая респираторная инфекция, которая может протекать как в легкой, так и в тяжелой форме, и сопровождаться такими осложнениями, как пневмония, острый респираторный дистресс-синдром, острая дыхательная недостаточность, острая сердечная недостаточность, острая почечная недостаточность, септический шок, кардиомиопатии, и др. В настоящее время число заболевших COVID-19 более 185 млн человек, а погибших- более 4 млн человек и эти числа продолжают расти. Очевидно, что во всем мире в настоящее время есть острая необходимость в разработке безопасных и эффективных средств профилактики и лечения. Кроме того, с конца 2020 года начали появляться новые варианты вируса SARS- CoV-2, содержащие точечные аминокислотные замены, позволяющие приобретать частичную или полную резистентность к иммунному ответу, выработанному на исходный вариант вируса. Один из таких новых вариантов В.1. 617.2 Delta, впервые изолированный в Индии, способен индуцировать образование клеточного синцития, что дополнительно помогает уходит от вирус-нейтрализующих антител.
Одним из перспективных подходов к терапии коронавирусной инфекции является применение антител против определенных антигенных детерминант вируса. Это обусловлено двумя основными причинами: высокой специфичностью антител и технологичностью их промышленного производства. (В. С. Смирнов, Арег А. Тотолян. Некоторые возможности иммунотерапии при коронавирусной инфекции. Инфекция и иммунитет 2020, Т. 10, № 3, с. 446-458).
В настоящее время в мире проводится более 50 клинических исследований, связанных с моноклональными антителами (Deb Р, Molla ММА, Saif-Ur-Rahman КМ. Ап update to monoclonal antibody as therapeutic option against COVID-19. Biosaf Health. 2021 Apr;3(2):87-91. doi: 10.1016/j.bsheal.2021.02.001. Epub 2021 Feb 10. PMID: 33585808; PMCID: PMC7872849).
(https://www.sciencedirect.eom/science/article/pii/S2590053621000197#s0005).
В настоящий момент разрешено к экстренному использованию два препарата на основе моноклональных антител. 21 ноября 2020 года Управление по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов США (FDA) выдало разрешение на экстренное использование (EUA) препарата REGEN-COV (Regeneron Pharmaceuticals), для лечения COVID-19 от легкой до умеренной степени у людей в возрасте от двенадцати лет и старше с массой тела не менее 40 кг (88 фунтов) с положительными результатами прямого тестирования на вирус SARS-CoV-2 и которые имеют высокий риск развития тяжелой формы COVID-19. Сюда входят лица в возрасте 65 лет и старше или лица, страдающие определенными хроническими заболеваниями. REGEN-COV состоит из двух моноклональных антител: казиривимаба (REGN10933) и имдевимаба (REGN10987), которые связываются с неперекрывающимися эпитопами S белка SARS-CoV-2. Результаты клинических исследований данного препарата показали, что он способен снижать вирусную нагрузку, с большим эффектом у пациентов, у которых иммунный ответ еще не был инициирован или у которых исходно была высокая вирусная нагрузка (Weinreich DM, Sivapalasingam S, Norton T, Ali S, Gao H, Bhore R, Musser BJ, Soo Y, Rofail D, Im J, Perry C, Pan C, Hosain R, Mahmood A, Davis JD, Turner КС, Hooper AT, Hamilton JD, Baum A, Kyratsous CA, Kim Y, Cook A, Kampman W, Kohli A, Sachdeva Y, Graber X, Kowal B, DiCioccio T, Stahl N, Lipsich L, Braunstein N, Herman G, Yancopoulos GD; Trial Investigators. REGN-COV2, a Neutralizing Antibody Cocktail, in Outpatients with Covid-19. N Engl J Med. 2021 Jan 21 ;384(3):238-251. doi: 10.1056/NEJMoa2035002. Epub 2020 Dec 17. PMID: 33332778; PMCID: PMC7781102).
Другой препарат на основе моноклонального антитела - бамланивимаб (LY-CoV555, разработчик: Eli Lilly) получил разрешение FDA на экстренное применение для лечения COVID-19 от легкой до умеренной степени тяжести у не госпитализированных взрослых и детей. Однако результаты клинических исследований неоднозначны. Среди госпитализированных пациентов с COVID-19 одновременное применение бамланивимаба с ремдесивиром не было эффективно. (ACTIV-3/TICO LY-CoV555 Study Group, Lundgren JD, Grund B, Barkauskas CE, Holland TL, Gottlieb RL, Sandkovsky U, Brown SM, Knowlton KU, Self WH, Files DC, Jain MK, Benfield T, Bowdish ME, Leshnower BG, Baker JV, Jensen JU, Gardner EM, Ginde AA, Harris ES, Johansen IS, Markowitz N, Matthay MA, Ostergaard L, Chang CC, Davey VJ, Goodman A, Higgs ES, Murray DD, Murray TA, Paredes R, Parmar MKB, Phillips AN, Reilly C, Sharma S, Dewar RL, Teitelbaum M, Wentworth D, Cao H, Klekotka P, Babiker AG, Gelijns AC, Kan VL, Polizzotto MN, Thompson ВТ, Lane HC, Neaton JD. A Neutralizing Monoclonal Antibody for Hospitalized Patients with Covid- 19. N Engl J Med. 2021 Mar 11;384(10):905-914. doi: 10.1056/NEJMoa2033130. Epub 2020 Dec 22. PMID: 33356051; PMCID: PMC7781100). Клинические исследования на амбулаторных пациентах показали, что только одна из трех доз исследуемого препарата (2800 мг LY-CoV555) достоверно ускоряла естественное снижение вирусной нагрузки. (Chen Р, Nirula A, Heller В, Gottlieb RL, Boscia J, Morris J, Huhn G, Cardona J, Mocherla B, Stosor V, Shawa I, Adams AC, Van Naarden J, Custer KL, Shen L, Durante M, Oakley G, Schade AE, Sabo J, Patel DR, Klekotka P, Sko vronsky DM; BLAZE- 1 Investigators. SARS-CoV-2 Neutralizing Antibody LY- CoV555 in Outpatients with Covid-19. N Engl J Med. 2021 Jan 21;384(3):229-237. doi:10.1056/NEJMoa2029849. Epub 2020 Oct 28. PMID: 33113295; PMCID: PMC7646625).
Наилучший эффект наблюдался при комбинированной терапии двумя моноклональными антителами: бамланивимаб и этесевимаб. (Gottlieb RL, Nirula A, Chen Р, Boscia J, Heller В, Morris J, Huhn G, Cardona J, Mocherla B, Stosor V, Shawa I, Kumar P, Adams AC, Van Naarden J, Custer KL, Durante M, Oakley G, Schade AE, Holzer TR, Ebert PJ, Higgs RE, Kallewaard NL, Sabo J, Patel DR, Klekotka P, Shen L, Skovronsky DM. Effect of Bamlanivimab as Monotherapy or in Combination With Etesevimab on Viral Load in Patients With Mild to Moderate COVID-19: A Randomized Clinical Trial. JAMA. 2021 Feb 16;325(7):632-644. doi: 10.1001/jama.2021.0202. PMID: 33475701; PMCID: PMC7821080). Кроме того, перспективным направлением для терапии и экстренной профилактики инфекционных заболеваний является использование однодоменных антител (наноантител), которые в природе можно найти у представителей семейства верблюдовые. Благодаря относительно небольшому размеру однодоменные антитела обладают благоприятными биофизическими свойствами и дешевле в производстве, чем стандартные моноклональные антитела. Они могут быть получены с использованием прокариотических или эукариотических систем экспрессии. Их небольшой размер, а также длинные, определяющие комплементарность участки тяжелой цепи позволяют им нацеливаться на вогнутые эпитопы. Кроме того, наноантитела можно распылять и доставлять прямо в легкие пациента с Covid- 19 с помощью ингалятора, что представляет собой лучшую альтернативу внутривенно вводимым классическим антителам (Ram Sasisekharan. Preparing for the Future — Nanobodies for Covid- 19? April 22, 2021 N Engl J Med 2021; 384:1568-1571 DOI: 10.1056/NEJMcibr2101205)
В настоящее время нет препаратов на основе однодоменных антител, разрешенных к применению для лечения COVID-19.
Известно решение (CN112500480А, опуб. 16.03.2021), в котором разработаны варианты однодоменного антитела против вируса SARS-CoV-2, соответствующий вектор экспрессии, а также линия клеток, способная экспрессировать вышеуказанные варианты однодоменного антитела, и способ получения вариантов данного антитела.
Известно решение (CN111825762А, опуб. 27.10.2020), в котором разработано несколько вариантов наноантитела к домену RBD S белка вируса SARS-COV-2, а также способ применения вариантов наноантитела для приготовления лекарственных средств для ингибирования вирусной инфекции SARS-COV-2 и приготовлении реагентов или наборов для тестирования вируса SARS-COV-2.
В патенте (CN112094342А, опуб. 18.12.2020) представлено биэпитопное специфическое антитело, происходящее из альпака, или его антигенсвязывающий фрагмент, который связывается с доменом RBD SARS-CoV-2 с высоким сродством, что может использоваться для профилактики, лечения и / или диагностики инфекции SARS- CoV-2.
Известно решение (CN112062839А, опуб. 11.12.2020), в котором описано создание наноантитела к S белку SARS-CoV-2, а также способ его использования для приготовления реагента для лечения и / или диагностики инфекции, вызванной коронавирусом SARS-CoV-2.
Также известно решение (CN112062840А, опуб. 11.12.2020), предусматривающее разработку наноантитела к S белку SARS-CoV-2, а также способ его использования для приготовления реагента для лечения и / или диагностики инфекции, вызванной коронавирусом SARS-CoV-2.
В патенте (CN111303279А, опуб.19.09.2020) описано создание гуманизированного однодоменного антитела против коронавируса SARS-CoV-2, молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей однодоменное антитело, а также создание кассеты экспрессии, рекомбинантного вектора, рекомбинантной бактерии или линии трансгенных клеток, содержащей вышеописанную молекулу нуклеиновой кислоты. Кроме того, разработан способ применения однодоменного антитела или созданной молекулы нуклеиновой кислоты или созданной экспрессионной кассеты, рекомбинантного вектора, рекомбинантной бактерии или линии трансгенных клеток при производстве продукта, который может применяться для предотвращения и / или лечение заболеваний, вызванных инфицированием новым коронавирусом SARS-CoV-2; а также для подавления заражения новым коронавирусом SARS-CoV-2. При этом продукт может: связываться с новым коронавирусом SARS-CoV-2; обнаруживать связывание нового коронавируса SARS-CoV- 2; связываться с белком S нового коронавируса SARS-CoV-2; обнаруживать белок S нового коронавируса SARS-CoV-2. Также разработана фармацевтическая композиция, содержащая созданное однодоменное антитело и фармацевтически приемлемый наполнитель, разбавитель или носитель.
Данное решение, как наиболее близкое к заявляемому, было выбрано авторами патента за прототип. Однако, недостатком прототипа является отсутствие данных по возможности применения полученных антител для терапии заболевания, вызванного вирусом SARS-CoV-2 других вариантов (например, вариант Delta), кроме того, однодоменные антитела быстро выводятся из организма в следствии низкой молекулярной массы и, таким образом, требуют многократного введения.
Таким образом, в уровне техники существует потребность в создании препарата для терапии и экстренной профилактики заболевания, вызываемого вирусом тяжелого острого респираторного синдрома SARS-CoV-2, лишенного указанного недостатка.
Раскрытие сущности изобретения
Технической задачей заявленной группы изобретений является расширение арсенала средств для терапии и экстренной профилактики заболеваний, вызываемых вирусом SARS-CoV-2.
Технический результат заключается в создании гуманизированного моноклонального антитела, обладающего вируснейтрализующей активностью и протективной активностью в отношении различных штаммов вируса SARS-CoV-2. А также технический результат заключается в создании эффективного способа терапии или экстренной профилактики заболеваний, вызываемых вирусом SARS-CoV-2, заключающийся во введении эффективного средства, включающего разработанное гуманизированное моноклональное антитело.
Указанная технический задача решается тем, что создано гуманизированное моноклональное антитело для терапии и экстренной профилактики заболеваний, вызываемых вирусом SARS-CoV-2, и имеет аминокислотную последовательность тяжелой цепи SEQ ID N0:1 и аминокислотную последовательность легкой цепи SEQ ID N0:2.
Кроме того, создано средство для терапии и экстренной профилактики заболеваний, вызываемых вирусом SARS-CoV-2, содержащее разработанное гуманизированное моноклональное антитело в эффективном количестве, а также фармацевтически приемлемый носитель и/или разбавитель.
А также разработан способ терапии или экстренной профилактики заболеваний, вызываемых вирусом SARS-CoV-2, заключающийся во введении в организм млекопитающих в эффективном количестве гуманизированного моноклонального антитела.
Краткое описание чертежей
На фиг. 1 представлена электрофореграмма анализа гуманизированного моноклонального антитела XRH19.
1 - образец гуманизированного моноклонального антитела XRH19 в денатурированных условиях;
2 - маркер молекулярного веса;
3 - образец гуманизированного моноклонального антитела XRH19 в неденатурированных условиях;
На фиг. 2 представлено схематическое изображение гуманизированного моноклонального антитела XRH19.
На фиг. 3 представлены результаты анализа специфической активности гуманизированного моноклонального антитела XRH19 в непрямом ИФА. Ось ординат - оптические единицы, ОД450нм
Ось абсцисс - концентрация антитела XRH19, мкг/мл
Figure imgf000009_0001
> урОвень СИГнала антитела XRH19 на бычий сывороточный альбумин (отрицательный контроль);
— •— RBD
- уровень сигнала антитела XRH19 на RBD;
На фиг. 4 представлена хроматограмма ВЭЖХ пробы гуманизированного моноклонального антитела XRH19 в буфере №2.
Ось ординат - единицы оптической плотности 280нм, mAu
Ось абсцисс - время удерживания пиков, мин
На фиг. 5 представлены результаты выживаемости животных, которым вводили гуманизированное моноклональное антитело XRH19 и животных из группы плацебо в течение 15 суток после заражения вирусом SARS-CoV-2 штамма hCoV- 19/Russia/Moscow_PMVL- 1 /2020.
Ось ординат - выживаемость, %
Ось абсцисс - время после заражения животных вирусом SARS-CoV-2, дни
. мыши, получившие гуманизированное моноклональное антитело XRH19 (10 мг/кг) спустя 1 час после заражения вирусом;
***** > мыши, получившие гуманизированное моноклональное антитело XRH19 (20 мг/кг) спустя 1 час после заражения вирусом;
- мыши, получившие фосфатно-солевой буфер (PBS) спустя 1 час после заражения вирусом;
На фиг. 6 представлены результаты анализа изменения веса животных, которым вводили гуманизированное моноклональное антитело XRH19 и животных из группы плацебо в течение 15 суток после заражения вирусом SARS-CoV-2 вариант Delta. В каждой временной точке для каждой группы животных вес представлен в виде арифметического среднего.
Ось ординат - изменение веса животных от начального, % Ось абсцисс - время после заражения животных вирусом SARS-CoV-2, дни - мыши, получившие гуманизированное моноклональное антитело XRH19 10 мг/кг спустя 1 час после заражения вирусом;
. мыши, получившие гуманизированное моноклональное антитело XRH19 10 мг/кг спустя 6 часов после заражения вирусом;
. мыши, получившие гуманизированное моноклональное антитело XRH19 20 мг/кг спустя 1 час после заражения вирусом;
МЬ1ШИ, получившие гуманизированное моноклональное антитело XRH19 20 мг/кг спустя 6 часов после заражения вирусом; мыши, получившие фосфатно-солевой буфер (PBS) спустя 1 часов после заражения вирусом;
- мыши, получившие фосфатно-солевой буфер (PBS) спустя 6 часов после заражения вирусом;
На фиг. 7 представлены результаты выживаемости животных, которым вводили гуманизированное моноклональное антитело XRH19, и животных из группы плацебо в течение 15 суток после заражения вирусом SARS-CoV-2 вариант Delta.
Ось ординат - выживаемость, %
Ось абсцисс - время после заражения животных вирусом SARS-CoV-2, дни
- мыши, получившие гуманизированное моноклональное антитело XRH19 10 мг/кг спустя 1 час после заражения вирусом;
*’*** - мыши, получившие гуманизированное моноклональное антитело XRH19 10 мг/кг спустя 6 часов после заражения вирусом;
—л— - мыши, получившие гуманизированное моноклональное антитело XRH19 20 мг/кг спустя 1 час после заражения вирусом;
’ * * " > мыши, П0ЛуЧИВШие гуманизированное моноклональное антитело XRH19 20 мг/кг спустя 6 часов после заражения вирусом; - мыши, получившие фосфатно-солевой буфер (PBS) спустя 1 часов после заражения вирусом; - мыши, получившие фосфатно-солевой буфер (PBS) спустя 6 часов после заражения вирусом;
Осуществление изобретения.
Технической задачей заявленной группы изобретений является создание гуманизированного моноклонального антитела для терапии и экстренной профилактики заболеваний, вызываемых вирусом SARS-CoV-2. Моноклональные антитела, обладающие высокой специфичностью к RBD S-белка вируса SARS-CoV-2 и обладающие вирус- нейтрализующей активностью, рассматриваются в качестве перспективных средств для терапии и экстренной профилактики COVID 19.
Для этого было разработано гуманизированное моноклональное антитело (XRH19), специфически связывающихся с RBD доменом S белка вируса SARS-CoV-2, обладающее вируснейтрализующей и протективной активностью в отношении различных штаммов вируса SARS-CoV-2, имеющее аминокислотную последовательность тяжелой цепи SEQ ID N0:1 и аминокислотную последовательность легкой цепи SEQ ID N0:2. Гуманизированное моноклональное антитело может применятся для терапии и экстренной профилактики заболевания COVID 19.
Для получения гуманизированного моноклонального антитела XRH19 осуществляли иммунизацию мышей линии Balb/c рекомбинантным RBD вируса SARS- CoV-2, полученным в клеточной линии СНО и очищенным металл-аффинной и эксклюзионной хроматографией. Эффективность иммунизации подтверждали оценкой титра специфических к RBD антител в сыворотке крови мышей. Далее у мышей выделяли спленоциты, которые затем сливали с линией мышиной миеломы Sp2/0-Ag-14, получая таким образом, гибридомы. Селекцию гибридом проводили на питательной среде RPMI- 1640 («Sigma», США) с добавлением HAT Media Supplement (Hybri-Max®, «Sigma», США). Отбор клонов, продуцирующих антитела специфичные к RBD, осуществляли методом твердофазного ИФА.
Специалистам в данной области известно, что в целях осуществления настоящего изобретения, возможно использование не только спленоцитов, а также цельной крови, лимфатических узлов клеток и органов иммунизированного животного, экспрессирующих моноклональные антитела. Также специалистам в данной области известно, что в целях осуществления настоящего изобретения возможно использование синтетических библиотек последовательностей моноклональных антител.
В результате селекции и отбора клонов, был отобран клон гибридомы, продуцирующий мышиное моноклональное антитело XR19, специфичное к RBD и обладающее выраженной вирус-нейтрализующей и протективной активностью в отношении вируса SARS-CoV-2, в том числе варианта Delta. Далее участки генома отобранного клона гибридомы, кодирующие антиген-связывающие участки (CDR домены) антитела XR19 были сиквенированы и использованы для создания гуманизированного моноклонального антитела GamXRH19. Таким образом, были получены нуклеотидные последовательности кодирующие гуманизированное моноклональное антитело GamXRH19 (SEQ ID N0:1 тяжелая цепь и SEQ ID N0:2 легкая цепь).
Специалистам в данной области известно, что в целях осуществления настоящего изобретения последовательности моноклональных антител, специфических к RBD вируса SARS-CoV-2, могут содержать в себе аминокислотные замены, которые не сказываются на вторичной и третичной структуре моноклональных антител и не влияют на их способность связывать и нейтрализовать RBD вируса SARS-CoV-2. Более того, поскольку в связывании с антигеном участвуют только антигенсвязывающие участки (CDR домены) то, как известно специалистам в данной области, любой иммуноглобулин или его аналог, содержащий такие же аминокислотные последовательности CDR доменов могут быть использованы в целях осуществления данного изобретения. Более того, последовательности CDR доменов могут содержать замены/делеции/вставки аминокислот, которые при парном выравнивании аминокислотных последовательностей обеспечивают гомологичность не менее 70% и не оказывают качественного влияния на способность связываться с антигеном. Таким образом, все иммуноглобулины или их аналоги, содержащие последовательности CDR доменов, гомология которых составляет не менее 70% с предлагаемыми последовательностями могут быть использованы в целях осуществления данного изобретения.
Гуманизированное моноклональное антитело XRH19 (изотип IgGl человека), специфически связывающееся с RBD доменом S белка вируса SARS-CoV-2, обладающее вируснейтрализующей и протективной активностью, было получено путем экспрессии нуклеотидной последовательности тяжелой и легкой цепи в клетках-продуцентах СНО.
Нуклеотидные последовательности тяжелой и легкой цепи гуманизированного моноклонального антитела XRH19 были созданы генно-инженерным путем на основе нуклеотидной последовательности иммуноглобулина G1 человека и нуклеотидных последовательностей антиген-связывающих участков антитела XR19. Специалистам в данной области известно, что в целях осуществления настоящего изобретения нуклеотидная последовательность, кодирующая гуманизированное моноклональное антитело, может отличаться, основываясь на принципе вырожденности генетического кода. Таким образом, все последовательности нуклеотидов, кодирующие аминокислотную последовательность гуманизированного моноклонального антитела XRH19 (SEQ ID N0:1 тяжелая цепь и SEQ ID N0:2 легкая цепь), могут быть использованы в целях осуществления настоящего изобретения.
С помощью методов генной инженерии была получена клетка-продуцент, содержащая нуклеиновые кислоты, с нуклеотидными последовательностями гуманизированного моноклонального антитела XRH19 (SEQ ID N0:3 тяжелая цепь и SEQ ID N0:4 легкая цепь) и экспрессирующая гуманизированное моноклональное антитело XRH19 (SEQ ID N0:1 тяжелая цепь и SEQ ID N0:2 легкая цепь). Таким образом, была получена: клетка-продуцент на основе клеточной линии СНО, экспрессирующая гуманизированное моноклональное антитело XRH19. Специалистам в данной области известно, что в целях осуществления настоящего изобретения в качестве продуцента можно использовать другие эукариотические системы экспрессии.
Кроме того, авторами патента разработан способ терапии и экстренной профилактики заболеваний, вызываемых вирусом SARS-CoV-2 (в том числе варианта Delta), заключающийся в системном введении в организм млекопитающих в эффективном количестве гуманизированного моноклонального антитела XRH19.
Осуществление изобретения подтверждается следующими примерами.
Пример 1. Получение иммуногена - рецептор-связывающего домена (RBD) S белка вируса SARS-CoV-2.
На первом этапе работы был получен иммуноген - рецептор-связывающий домен (RBD) S белка вируса SARS-CoV-2. Для этого аминокислотную последовательность рецептор-связывающего домена (RBD) поверхностного Spike-белка вируса SARS-CoV-2 (а.о. 319 - 541, UniProtKB: locus SPIKE_SARS2, accession P0DTC2) модифицировали c N- конца сигнальным пептидом щелочной фосфатазы SEAP (MLLLLLLLGLRLQLSLGI) и с С-конца последовательностью глицин-серинового линкера и гистидиновой метки (GSHHHHHHHHH). На основе аминокислотной последовательности получили нуклеотидную последовательность, которая была синтезирована ЗАО «Евроген». После этого нуклеотидную последовательность полученного полипептида клонировали в плазмиду для транзиентной экспрессии в клетках млекопитающих. Далее, культуру клеток CHO тарифицировали полученной плазмидой с помощью набора СНО Gro (Minis Bio, США) в соответствии с протоколом производителя. Затем клетки культивировали в колбах Эрленмейера в течение 10 дней. По истечении этого срока культуральную жидкость осветляли центрифугированием при 5000g. Рецептор-связывающий домен (RBD) очищали металл-аффинной хроматографией на системе АКТА start («GE Healthcare Life Sciences», США), используя колонки HisTrap FF 5 мл («GE Healthcare Life Sciences», США) в соответствии с протоколом производителя. Дополнительную очистку и замену буфера на 20 мМ фосфат натрия, 500 мМ натрия хлорид (рН=7,2) проводили на колонке ХК 26/100 («GE Healthcare Life Sciences», США), упакованной сорбентом Superdex 200 pg («GE Healthcare Life Sciences», США). Таким образом, в результате проведенной работы был получен очищенный рекомбинантный RBD S белка вируса SARS-CoV-2.
Пример 2. Получение моноклонального антитела XR19.
Мышей линии BALB/c (10 самок 5-6-недельного возраста массой 15-20 г) иммунизировали препаратом рекомбинантного RBD вируса SARS-CoV-2, полученного в примере 1. Схема иммунизации включала 4 подкожные инъекции антигена с интервалом введения 21 день. Доза препарата составила 50 мкг на инъекцию. Через 18 дней после последней инъекции осуществляли взятие крови из параорбитального синуса и определяли титр специфических антител с помощью твердофазного иммуноферментного анализа. Для этого планшеты сенсибилизировали антигеном, в 50 мМ карбонат- бикарбонатном буфере с pH 9,6. Образцы крови мышей разбавляли 10-кратным титрованием в буфере для ИФА (0.1М фосфатно-солевой буфер с добавлением 1% бычьего сывороточного альбумина (Serva, Германия) и 0,1% Твин 20 (Serva, Германия) и инкубировали в лунках планшет в течение 30 минут при 37 °C. Лунки отмывали трехкратным внесением 0,9% натрия хлорида с добавлением 0,1% Твин 20 (отмывочного буфера) и добавляли антитела против иммуноглобулинов мыши, меченые пероксидазой хрена (кат. № AS302-HRP, Хема, Россия) в рабочем разведении на 30 минут при 37°С. После 5-кратной отмывки отмывочным буфером в лунки добавляли хромоген- субстратную смесь (кат. № R055, Хема, Россия) на 15 минут, останавливали реакцию 5% раствором серной кислоты и считывали оптическую плотность при 450 нм на планшетном ридере НуРо (Biosan, Латвия). Удовлетворительным считали титр антител не менее 1:100 000.
Далее животным с наибольшим уровнем продукции антител через 20 дней после иммунизации делали внутрибрюшную инъекцию (бустер-доза) антигена в количестве 50 мкг. На четвертые сутки с момента бустерной инъекции селезенку асептически извлекали, спленоциты получали путем перфузии средой RPMI1640 (Sigma- Aldrich, США).
Процедуру слияния иммунных спленоцитов и клеток миеломы SP2/0-A l4 проводили по методике, предложенной G. Kohler и C.Milstein в модификации De St.Fazekas, S. Groth и D.Scheidegger. В качестве индуктора слияния клеток использовали 50% раствор полиэтиленгликоля с молекулярной массой 1450 (Sigma-Aldrich, США). Гибридные клетки культивировали in vitro в СО2-инкубаторе при температуре 37 °C и содержании диоксида углерода равном 5%. Для культивирования использовали ростовую среду RPMI-1640, содержащую 2 мМ L-глютамина, с добавлением 20% фетальной телячьей сыворотки (Thermo Scientific, США) и 80 мг/л гентамицина (Россия). С целью проведения селекции гибридных клеток в ростовую среду добавляли HAT (Sigma- Aldrich, США), содержащий гипоксантин (Н), аминоптерин (А) и тимидин (т) в рабочем разведении.
Первичный скрининг гибридных культур проводили, начиная с 10-х суток после гибридизации. Специфическую активность антителопродукции гибридных культур определяли в культуральной жидкости без разведения методом ИФА аналогично описанному в разделе «Контроль иммунного ответа» трижды с интервалом 2-3 дня по мере интенсивности роста клеток. Пробы считали положительными, если оптическая плотность в лунках с исследуемыми образцами превышала на 0,5 значение оптической плотности в контрольных лунках со средой культивирования.
Клонирование культур гибридных клеток проводили методом лимитирующих разведений при расчетной посевной концентрации одна клетка на лунку. Продуцирующую активность отдельных клонов определяли, начиная с 10-х суток, дважды с интервалом три дня методом иммуноферментного анализа по схеме, описанной выше. После выделения положительных клонов их клетки размножали в достаточном количестве, образцы замораживали в ростовой среде RPMI, содержащей 20% фетальной телячьей сыворотки и 8% диметилсульфоксида (Serva, Германия), и помещали на хранение в контейнер с жидким азотом.
Культуральные и секреторные свойства полученных клонов изучали в процессе культивирования in vitro в 24-луночных планшетах (Flow Laboratories, Великобритания) в течение десяти пассажей.
После клонирования образцы культуральной жидкости от моноклональных культур изучали методом конкурентного ИФА. Рекомбинантный белок - рецептор АСЕ2 (Vaxine, Австралия) сорбировали в лунках планшет в концентрации 0,5 мкг/мл в 0,1М фосфатном буфере, pH 7,2 в течение 12-16 часов при температуре +4 С. После однократной отмывки отмывочным буфером (см Контроль иммунного ответа) планшет в лунки вносили 50 мкл образцов культуральной жидкости и 50 мкл разведения белка RBD, меченого пероксидазой хрена (Faizyme, ЮАР) и инкубировали 30 минут при 37 С. После 5х кратной отмывки отмывочным буфером реакцию проявляли с помощью хромоген-субстратной смеси и фотометрии при 450 нм. В контрольной лунке вместо образца культуральной жидкости помещали среду культивирования. Отбирали культуры, которые давали максимальное ингибирование взаимодействия АСЕ2 и RBD-пероксидаза (не менее 90%). Методику вторичного скрининга повторяли у выбранных клонов на всех этапах получения моноклональных антител с целью получения антител, в итоге выбрали моноклональное антитело XR19, дающее максимальную удельную активность ингибиции.
Далее, проводили сиквенирование отобранного клона гибридомы, для определения нуклеотидных последовательностей кодирующих. Для этого, клетки гибридомы линии XR19 лизировали с помощью 1 мл TRIzol reagent (Thermofisher scientific) с последующим выделением тотальной РНК. 5 мкг тотальной РНК использовали для синтеза кДНК с помощью набора SuperScript IV ТМ first-strand synthesis system (Invitrogen). Последовательности вариабельных доменов тяжелой и легкой цепи амплифицировали методом ПЦР с использованием панели праймеров, специфично отжигающихся в начале и конце последовательностей вариабельных доменов мыши. Полученные ПЦР-продукты секвенировали по Сэнгеру на приборе Genetic Analyzer 3500 Applied Biosystems.
Таким образом, были получены последовательности вариабельных доменов тяжелой и легкой цепей антитела XR19, представленные в таблице 1.
Таблица. 1. Нуклеотидные и аминокислотные последовательности вариабельных доменов тяжелой и легкой цепи антитела XR19.
Figure imgf000016_0001
Figure imgf000017_0001
Таким образом в данном примере было получено мышиное моноклональное антитело XR19, специфически связывающееся с RBD S белка вируса SARS-CoV-2.
Пример 3. Гуманизация мышиного моноклонального антитела XR19.
Далее аминокислотные последовательности вариабельных доменов тяжелой и легкой цепей антитела XR19 были гуманизированы при помощи биоинформатического ресурса Abisys database (http://www.abysis.org/abysis/). Полученные аминокислотные последовательности гуманизированного моноклонального антитела XR19 (GamXRH19), представлены в таблице 2.
Таблица 2. Гуманизированные нуклеотидные и аминокислотные последовательности вариабельных доменов тяжелой и легкой цепи антитела GamXRH19.
Figure imgf000017_0002
Таким образом, в данном примере была проведена гуманизация мышиного моноклонального антитела и были получены аминокислотные последовательности тяжелой и легкой цепи гуманизированного моноклонального антитела XRH19.
Пример 4. Получение, нуклеиновых кислот, клетки-продуцента и гуманизированного моноклонального антитела XRH19.
Далее, был разработан дизайн аминокислотной последовательности полноразмерных тяжелых и легких цепей гуманизированного антитела XRH19. Аминокислотная последовательность гуманизированной тяжелой представлена SEQ ID N0:1 и аминокислотная последовательность гуманизированной легкой представлена SEQ ID N0:2.
На основе аминокислотных последовательностей были получены нуклеотидные последовательности антитела XRH19, которые были синтезированы в компании ЗАО «Евроген». Полученные нуклеотидные последовательности клонировали в вектор для экспрессии в эукариотических клетках. Далее проводили трансфекцию клеток линии СНО полученными экспрессионными векторами с использованием системы СНО Gro (Minis Bio, США) в соответствии с протоколом производителя. Клетки культивировали в колбах Эрленмейера в течение 10 дней. После чего культуральную жидкость осветляли центрифугированием при 5000g. Антитело очищали аффинной хроматографией на системе АКТА start (Cytiva, Швеция), используя колонки MAbSelect SuRe 1 мл (Cytiva, Швеция) в соответствии с протоколом производителя. Дополнительную очистку и замену буфера проводили на колонке ХК 26/100 (Cytiva, Швеция), упакованной сорбентом Superdex 200 pg (Cytiva, Швеция). Чистоту полученного препарата гуманизированного моноклонального антитела XRH19, определяли методом вертикального электрофореза в полиакриламидном геле в неденатурирующих условиях и денатурирующих условиях (фиг. 1). Схематичное изображение гуманизированного моноклонального антитела XRH19 представлено на фиг. 2.
Таким образом, в результате проведенной работы были получены нуклеиновые кислоты, имеющие нуклеотидные последовательности, кодирующие тяжелую и легкую цепи гуманизированного моноклонального антитела XRH19 (SEQ ID N0:3 и SEQ ID N0:4), клетка продуцент гуманизированного моноклонального антитела XRH19 и гуманизированное моноклональное антитело XRH19, имеющее конечную аминокислотную последовательность тяжелых и легких цепей SEQ ID N0:1 и SEQ ID N0:2. Пример 5. Изучение специфической активности гуманизированного моноклонального антитела XRH19 в непрямом ИФА.
Для определения специфической активности антитела XRH19 метод непрямого ИФА. Для этого рекомбинантный RBD S белка вируса SARS-CoV-2 иммобилизовали в лунке иммунологического планшета в 50,0 мМ карбонатно-бикарбонатном буфере в течение ночи. Не связавшийся белок удаляли, а лунку блокировали 5% раствором сухого молока в фосфатном буфере в течение 1 часа при комнатной температуре. Затем лунки промывали 0,1% раствором детергента Твин-20 в фосфатном буфере и добавляли раствор 5% раствором сухого молока в фосфатном буфере, содержащим различные разведения гуманизированного моноклонального антитела XRH19. Каждое разведение вносили в 3-х повторах, инкубировали 1 час при 37°С при слабом перемешивании. Затем проводили 3-х кратную отмывку 0,1% раствором детергента Твин-20 в фосфатном буфере. После отмывки вносили раствор конъюгата, меченного перексидазой и инкубировали 1 час при 37°С при слабом перемешивании. Далее проводили 5-х кратную отмывку 0,1% раствором детергента Твин-20 в фосфатном буфере. Далее вносили раствор субстрата ТМБ и инкубировали 10 мин при комнатной температуре без перемешивания, после чего реакцию останавливали добавлением раствора серной кислоты и проводили измерение на спектрофотометре. Результаты исследования представлены на фиг. 3. Было продемонстрировано, что антитело XRH19 обладает специфической активность в концентрации как минимум 3,3 нг/мл.
Таким образом, в данном примере была изучена специфическая активность антитела XRH19 в непрямом ИФА и определена его минимальная рабочая концентрация.
Пример 6. Определение константы аффинности гуманизированного моноклонального антитела XRH19.
Константы взаимодействия (KD) гуманизированного моноклонального антитела XRH19 определяли путем детекции изменения показателей поверхностного плазмонного резонанса на приборе Biacore3000 (General Electric, Швеция). Для этого рекомбинантный RBD S-белка вирусма SARS-CoV-2 ковалентно иммобилизировали на поверхности декстранового матрикса чипа СМ5 (General Electric, Швеция), а затем пропускали над поверхностью чипа различные концентрации полученного антитела XRH19. Обработку данных и вычисление констант проводили в автоматическом режиме при помощи программы Bioevaluation (General Electric, Швеция). В результате константа равновесной диссоциации XRH19 составила 4*10‘9М, что демонстрирует высокую аффинность антитела к рекомбинантному RBD. Таким образом, в данном примере была продемонстрирована высокая аффинность антитела XRH19 к рекомбинантный RBD S-белка вируса SARS-CoV-2.
Пример 7. Определение вируснейтрализуюгцей активности гуманизированного моноклонального антитела XRH19, в отношении различных штаммов вируса SARS-CoV- 2.
Целью данного эксперимента являлась оценка способности разработанного гуманизированного моноклонального антитела XRH19 нейтрализовать вирус SARS-CoV-2 различных штаммов. На первом этапе работы подготовили образцы антитела XRH19 в культуральной среде ДМЕМ с 2% инактивированной фетальной бычьей сывороткой. Затем полученные образцы антител смешивали со 100 БОЕ вируса SARS-CoV-2 различных штаммов, инкубировали 1 час при 37°С и добавляли к клеткам Vero Е6. Клетки инкубировали при 37°С в 5% СО2. Через 96 часов производили учет развития цитопатического действия вируса на культуру клеток визуально по оценке нарушения монослоя клеток. За вируснейтрализующий титр антитела принимали высшее их разведение, при котором происходит подавление цитопатического действия в 2-х лунках из 3-х. В результате были определены следующие рабочие вируснейтрализующие концентрации, представленные в таблице 3.
Таблица. 3. Вирус-нейтрализующие титры гуманизированного моноклонального антитела RH19 в отношении вируса SARS-CoV-2 различных штаммов.
Figure imgf000020_0001
Таким образом, в данном примере продемонстрирована выраженная вирус- нейтрализующая активность гуманизированного моноклонального антитела XRH19 в отношении вируса SARS-CoV-2, в том числе варианта Delta.
Пример 8. Получение средства, содержащего гуманизированное моноклональное антитело XRH19. Средство для терапии и экстренной профилактики заболевания COVID-19 на основе гуманизированного моноклонального антитела GamXRH19 получали путем подбора формулирующего буфера. Для сравнения использовали различные физиологические буферные системы, представленные в таблице 4.
Таблица 4. Состав буферных систем для разработки средства.
Figure imgf000021_0001
Гуманизированное моноклональное антитело GamXRH19 переводили в каждую буферную систему при помощи эксклюзионной хроматографии на сорбенте Superdex 200 pg и ужимали до концентрации 20 мг/мл. Далее образцы инкубировали при 37°С в течении недели и далее анализировали их стабильность и чистоту при помощи ВЭЖХ. Результаты анализа представлены в таблице 5. Примеры хроматограмм ВЭЖХ анализа представлены на фиг. 4.
Таблица. 5. Процентное содержание целевых и примесных пиков гуманизированного моноклонального антитела XRH19 в различных буферных растворах.
Figure imgf000021_0002
В результате было продемонстрировано что наибольшая стабильность антитела XRH19 наблюдается в буфере №2: Фосфат натрия 20мМ, Хлорид натрия 150 мМ, полисорбат 80 0,05%, pH 7,2. Таким образом, в данном примере было получено средство на основе гуманизированного моноклонального антитела XRH19 и подобран оптимальный буферный.
Пример 9. Способ терапии и экстренной профилактики заболевания COVID-19 при помощи гуманизированного моноклонального антитела XR19.
Терапевтическую эффективность и эффективность при экстренной профилактике, гуманизированного моноклонального антитела XRH19 оценивали на модели инфекции, вызванной вирусом SARS-CoV-2, у АСЕ2-трансгенных мышей. Данные животные были выбраны, так как они высоко чувствительны к инфекции SARS-CoV-2. Летальность животных после заражения вирусом SARS-CoV-2 составляет 100%.
В работе использовали вирус SARS-CoV-2 штамма hCoV-19/Russia Moscow_PMVL- 1/2020, изолированный в 2020 году в ФГБУ «НИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России, хранящийся в Государственной коллекции вирусов. Инфекционный титр вируса 107 ТСШ50/мл и 3,5x107 БОЕ/мл. Животных заражали вирусом SARS-CoV-2 интраназально в дозе 105 TCID50 на животное, далее вводили средство, содержащее гуманизированное моноклональное антитело XRH19 или плацебо, согласно таблице 6.
Таблица 6. Дизайн экспериментального изучения эффективности гуманизированного моноклонального антитела XRH19.
Figure imgf000022_0001
В течение 30 суток после заражения оценивали выживаемость животных.
На фиг. 5 представлены данные выживаемости животных после заражения вирусом SARS-CoV-2 штамма hCoV-19/Russia/Moscow_PMVL- 1/2020. В результате исследования было показано, что однократное системное введение на основе гуманизированного моноклонального антитела XRH19 в дозе 10 и 20 мг/кг животным через час после заражения позволяет защитить животных от инфекции, вызванной вирусом SARS-CoV-2 штамма hCoV- 19/Russia/Moscow_PMVL- 1/2020. Таким образом, можно сделать вывод, что гуманизированное моноклональное антитело XRH19 может быть использовано для терапии и экстренной профилактики заболевания, вызванного вирусом SARS-CoV-2.
Пример 10. Способ терапии и экстренной профилактики заболевания COVID-19, вызванного вирусом SARS-CoV-2 варианта Delta при помощи гуманизированного моноклонального антитела XR19.
В работе использовали вирус SARS-CoV-2 варианта Delta В.1.617.2 (T19R G142D E156G F157del R158del L452R Т478К D614G P681R D950N), изолированный в 2021 году в ФГБУ «НИЦЭМ им. Н.Ф.Гамалеи» Минздрава России, хранящийся в Государственной коллекции вирусов. Инфекционный титр вируса 107 ТСГО50/мл и 3,5x107 БОЕ/мл. Животных заражали вирусом SARS-CoV-2 интраназально в дозе 105 TCID50 на животное, далее вводйли препарат моноклональных антител или плацебо, согласно таблице 7.
Таблица 7. Дизайн экспериментального изучения эффективности гуманизированного моноклонального антитела XRH19 против вируса SARS-CoV-2 варианта Delta.
Figure imgf000023_0001
В течение 30 суток после заражения оценивали вес и выживаемость животных.
На фиг. 6 представлены данные динамики веса животных после заражения вирусом SARS-CoV-2 варианта Delta. На фиг. 7 представлены данные выживаемости животных после заражения вирусом SARS-CoV-2 варианта Delta. В результате исследования было показано, что однократное системное введение средства на основе гуманизированного моноклонального антитела XRH19 в дозе 10 и 20 мг/кг животным через час и через 6 часов после заражения позволяет защитить животных от инфекции, вызванной вирусом SARS-CoV-2 варианта Delta, при этом, падения веса животных более чем на 10% не наблюдалось. В контрольной группе животных после заражения получивших плацебо наблюдалось снижение массы тела. К 10 суткам все животные из группы контроля погибли.
Таким образом, можно сделать вывод, что полученное гуманизированное моноклональное антитело XRH19 может быть использовано для терапии и экстренной профилактики заболевания, вызванного вирусом SARS-CoV-2 в том числе варианта Delta.
Специалисту очевидно, что данное антитело может быть использовано для терапии и экстренной профилактики заболеваний, вызываемых вирусом SARS-CoV-2, различных вариантов. При этом антитело может вводиться подкожно, внутримышечно, внутривенно, внутрибрюшинно и интраназально.
Экспериментальные данные показывают, антитела могут вводиться человеку в концентрации от 1 до 100 мг/мл.
Промышленная применимость
Все приведенные примеры подтверждают эффективность созданного гуманизированного моноклонального антитела, обладающего вируснейтрализующей активностью, и обладающего терапевтическими и протективными свойствами против вируса SARS-CoV-2 различных вариантов и их промышленную применимость.

Claims

Формула изобретения
1. Гуманизированное моноклональное антитело специфически связывающееся с RBD S белка вируса SARS-CoV-2, обладающее вируснейтрализующей и протективной активностью в отношении вируса SARS-CoV-2, имеющее аминокислотную последовательность тяжелой цепи SEQ ID N0:1 и аминокислотную последовательность легкой цепи SEQ ID N0:2.
2. Средство для терапии и экстренной профилактики заболеваний, вызываемых вирусом SARS-CoV-2, содержащее гуманизированное моноклональное антитело по п.1 в эффективном количестве, а также фармацевтически приемлемый носитель и/или разбавитель.
3. Способ терапии и экстренной профилактики заболеваний, вызываемых вирусом SARS-CoV-2, заключающийся в системном введении эффективного количества средства по п.2.
23
PCT/RU2022/000190 2021-12-22 2022-06-10 Антитело к sars-cov-2, средство и способ для терапии заболеваний, вызываемых sars-cov-2 WO2023121507A1 (ru)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2021138328A RU2765731C1 (ru) 2021-12-22 2021-12-22 Гуманизированное моноклональное антитело, специфически связывающиеся с RBD S белка вируса SARS-CoV-2, средство и способ для терапии и экстренной профилактики заболеваний, вызываемых вирусом SARS-CoV-2
RU2021138328 2021-12-22

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2023121507A1 true WO2023121507A1 (ru) 2023-06-29

Family

ID=80214719

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/RU2022/000190 WO2023121507A1 (ru) 2021-12-22 2022-06-10 Антитело к sars-cov-2, средство и способ для терапии заболеваний, вызываемых sars-cov-2

Country Status (2)

Country Link
RU (1) RU2765731C1 (ru)
WO (1) WO2023121507A1 (ru)

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2744274C1 (ru) * 2020-11-20 2021-03-04 Федеральное государственное бюджетное учреждение науки институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук (ИБХ РАН) Моноклональное антитело к RBD фрагменту в составе S белка вируса SARS-CoV-2
WO2021183456A1 (en) * 2020-03-08 2021-09-16 Humanigen, Inc. Methods for treating coronavirus infection and resulting inflammation-induced lung injury
WO2021203034A2 (en) * 2020-04-03 2021-10-07 Firebreak, Inc. Alimentary and systemic antiviral therapeutics
WO2021207948A1 (en) * 2020-04-14 2021-10-21 Tsb Therapeutics (Beijing) Co., Ltd. Anti-sars-cov-2 antibodies and uses thereof

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2021183456A1 (en) * 2020-03-08 2021-09-16 Humanigen, Inc. Methods for treating coronavirus infection and resulting inflammation-induced lung injury
WO2021203034A2 (en) * 2020-04-03 2021-10-07 Firebreak, Inc. Alimentary and systemic antiviral therapeutics
WO2021207948A1 (en) * 2020-04-14 2021-10-21 Tsb Therapeutics (Beijing) Co., Ltd. Anti-sars-cov-2 antibodies and uses thereof
RU2744274C1 (ru) * 2020-11-20 2021-03-04 Федеральное государственное бюджетное учреждение науки институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук (ИБХ РАН) Моноклональное антитело к RBD фрагменту в составе S белка вируса SARS-CoV-2

Also Published As

Publication number Publication date
RU2765731C1 (ru) 2022-02-02

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US10723786B2 (en) RSV-specific binding molecule
CN108026166B (zh) 多瘤病毒中和抗体
EA027069B1 (ru) Моноклональные антитела, способные взаимодействовать с множеством подтипов вируса гриппа а
US11723977B2 (en) Broadly neutralizing antibodies directed against the rabies virus glycoprotein and uses thereof
CN115710311A (zh) 冠状病毒的抗体或其抗原结合片段
EP2313112A2 (en) Neutralizing anti-influenza a virus antibodies and uses thereof
MX2011003588A (es) Anticuerpos neutralizadores del virus del dengue y uso de los mismos.
RU2764740C1 (ru) Биспецифическое антитело против вируса бешенства и его применение
WO2023009028A1 (ru) Однодоменное антитело и его модификации, специфически связывающиеся с rbd s белка вируса sars-cov-2
CN114106164B (zh) 抗新型冠状病毒s蛋白的单克隆抗体及其应用
CN111153988B (zh) 广谱抗肠道病毒d68型的中和性单克隆抗体
CN113817052A (zh) 抗SARS-CoV-2核衣壳蛋白单克隆抗体及其制备方法和用途
WO2022216223A1 (en) Vaccine and/or antibody for viral infection
JP2014526886A (ja) マクロファージ遊走阻止因子（ｍｉｆ）とｄ−ドーパクロームトートメラーゼ（ｄ−ｄｔ）に交差反応性がある抗体
RU2765731C1 (ru) Гуманизированное моноклональное антитело, специфически связывающиеся с RBD S белка вируса SARS-CoV-2, средство и способ для терапии и экстренной профилактики заболеваний, вызываемых вирусом SARS-CoV-2
CN114805579B (zh) 一种抗人ace2蛋白单克隆抗体、核酸分子及应用
CN114231497B (zh) 一株表达SARS-CoV-2 S1蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞系及中和活性抗体
RU2769223C1 (ru) Средство и способ терапии и экстренной профилактики заболеваний, вызываемых вирусом SARS-CoV-2 на основе рекомбинантного антитела и гуманизированного моноклонального антитела
WO2022079359A1 (en) Sars-cov-2 coronavirus-neutralizing antibody
CN114805570B (zh) 一种抗人ace2单克隆抗体及其应用
EP0370090B1 (en) Immunogens and biologically active peptides derived from shared sequences from antigens and anti-idiotypic antibodies or antibodies specific for cellular receptors of the antigens
EP2552958B1 (en) Monoclonal antibody directed against the p17 protein of hiv, capable of neutralising the binding of p17 to the p17 receptor (p17r)
RU2793967C1 (ru) Однодоменное антитело ламы Н5 и его производное H5-Fc, специфически связывающие RBD-домен S-белка вируса SARS-CoV-2, обладающие вируснейтрализующей активностью
Marghani COVID-19 immunotherapy: novel humanized 47D11 monoclonal antibody
CN116425871B (zh) 抗新冠病毒s蛋白人源化抗体及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 22912082

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1