MX2011003588A

MX2011003588A - Anticuerpos neutralizadores del virus del dengue y uso de los mismos.

Info

Publication number: MX2011003588A
Application number: MX2011003588A
Authority: MX
Inventors: Antonio Lanzavecchia
Original assignee: Inst Research In Biomedicine
Priority date: 2008-10-13
Filing date: 2009-10-13
Publication date: 2011-10-14
Also published as: WO2010043977A2; CA2739551A1; CN102272155B; BRPI0914012B1; CN108610416B; EP2334700B1; NZ592054A; US20120020957A1; AU2009305113B2; WO2010043977A3; US9073981B2; CN108610416A; JP5814790B2; CA2739551C; JP2012504955A; EP2334700A2; JP2016020334A; CN102272155A; AU2009305113A1; BRPI0914012A2

Abstract

La invención se relaciona con anticuerpos y fragmentos de unión a antigeno de los mismos y a cócteles de anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno que neutralizan la infección por el virus del dengue sin contribuir al potenciamiento dependiente de anticuerpos de la infección por el virus del dengue; la invención también se relaciona con linfocitos B inmortalizados que producen, y con epítopos que se unen a, tales anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno; adicionalmente, la invención se relaciona con el uso de los anticuerpos, fragmentos de unión a antígeno y epítopos en métodos de selección, así como en el diagnóstico y terapia de la infección por el virus del dengue.

Description

ANTICUERPOS NEUTRALIZANTES DE VIRUS DE DENGUE Y USOS DE LOS MISMOS SOLICITUD RELACIONADA Esta solicitud reclama prioridad a la solicitud provisional del PCT con No. de serie 61/104,91 1 , titulada "Dengue Virus Neutralizing Antibodies and Use Thereof," presentada el 13 de octubre de 2008, que es incorporada aquí por referencia en su totalidad.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Los virus de dengue (DENV) son patógenos de humanos con una amenaza significativa a la salud mundial. Se estima que, anualmente, estos virus causan varios cientos de miles de casos de fiebre de dengue, fiebre hemorrágica de dengue y síndrome de choque por dengue. Hay cuatro serotipos estrechamente relacionados de virus de dengue, DENV-1 , DENV-2, DENV-3 y DENV-4, del género Flavivirus. Los cuatro virus se diseminan de un humano a otro humano a través de la picadura de Aedes aegyptí, una especie de mosquito altamente urbanizado que ha resistido exitosamente todos los intentos de erradicación y control. Se considera que la vacunación es el único método de control eficiente de dengue. Para este fin, varias vacunas candidatas tetravalentes contra dengue están en las etapas tardías de desarrollo.

Una primera infección con un serotipo de virus de dengue induce una inmunidad protectora de larga vida al serotipo homólogo. Sin embargo, no hay protección cruzada contra infección por un serotipo diferente. De hecho, la inmunidad pre-existente contra un serotipo está asociada con riesgo incrementado para infección por dengue y fiebre hemorrágica por dengue causada por un serotipo diferente debido a incremento de infección dependiente de anticuerpo (ADE). En ADE, anticuerpos producidos por infección de dengue previa o pasivamente transferida por la madre forman complejos inmunológicos infecciosos que se unen a células que portan Fe en el linaje de fagocitos mononucleares dando por resultado infección eficiente.

Por consiguiente, existe la necesidad de materiales y métodos para prevenir infección por virus de dengue sin incrementar el riesgo de incremento de infección dependiente de anticuerpo.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La invención se basa, en parte, en el descubrimiento de anticuerpos y cócteles de anticuerpos que neutralizan la infección por virus de dengue sin contribuir a incremento de infección dependiente de anticuerpo por virus de dengue. Por consiguiente, en un aspecto de la invención, la invención comprende un anticuerpo humano, una variante de anticuerpo, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que neutralizan un virus de dengue, en donde el anticuerpo, variante de anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno no contribuye a incremento de infección dependiente de anticuerpo por virus de dengue. En una modalidad, la invención comprende un anticuerpo humano, una variante de anticuerpo, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que neutraliza un virus de dengue, en donde el anticuerpo, variante de anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno comprende una mutación en la región Fe, y en donde la mutación reduce la unión del anticuerpo a un receptor de Fe.

En otra modalidad de la invención, la invención comprende una composición farmacéutica que comprende dos o más anticuerpos humanos, o fragmentos de unión a antígeno del mismo. Los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno neutralizan los serotipos de virus de dengue DENV-1 , DENV-2, DENV-3 y DENV-4 al unir por lo menos dos epítopes distintos en cada serotipo de virus de dengue. Los anticuerpos de la composición farmacéutica no contribuyen a incremento de infección dependiente de anticuerpo por virus de dengue.

En otra modalidad más, la invención comprende un anticuerpo, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que comprende por lo menos una secuencia de región determinante de complementariedad (CDR) que tiene la secuencia de cualquiera de SEQ ID NOs: 1-6, 17-22, 33-38, 49-54, 67-72, 83-88, 99, 100, 105-110, 121-123, 124, 125, 135-139, 149, 153-158, 169-174, 185-188 ó 189, en donde el anticuerpo neutraliza la infección por virus de dengue.

En otra modalidad más, la invención comprende un anticuerpo, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, en donde el anticuerpo comprende una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 13 y una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 14; o una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 29 y una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 30; o una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 45 y una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 46; o una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 61 y una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 62; o una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 65 y una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 62; o una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 79 y una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 80; o una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 95 y una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 96; o una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 95 y una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 103; o una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 17 y una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 18; o una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 131 y una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 132; o una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 145 y una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 146; o una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 151 y una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 146; o una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 165 y una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 166; o una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 181 y una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 182; o una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 195 y una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 196, en donde el anticuerpo neutraliza infección por virus de dengue.

En una modalidad adicional, la invención comprende un anticuerpo recombinante, variante de anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, que puede neutralizar un virus de dengue. El anticuerpo recombinante, variante de anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno no contribuye a incremento de infección dependiente de anticuerpo por virus de dengue.

En otro aspecto, la invención comprende una molécula de ácido nucleico que comprende un polinucleótido que codifica un anticuerpo o fragmento de anticuerpo de la invención que neutraliza infección por virus de dengue. En otro aspecto más, la invención comprende una célula que expresa un anticuerpo de la invención. En otro aspecto adicional, la invención comprende un polipéptido inmunogénico aislado o purificado que comprende un epítope que se une a un anticuerpo de la invención.

La invención también comprende una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo, una variante de anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno de la invención, un ácido nucleico de la invención, o un polipéptido inmunogénico de la invención y un diluyente o vehículo farmacéuticamente aceptable y, opcionalmente, un agente útil para extender la vida media del anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo.

En otro aspecto de la invención, la invención provee un método de inhibición o prevención de infección por virus de dengue o una enfermedad relacionada con virus de dengue o un método de tratamiento de infección por virus de dengue o una enfermedad relacionada con virus de dengue. El método comprende administrar a un sujeto que necesita el mismo, una cantidad terapéuticamente efectiva de por lo menos un anticuerpo, variante de anticuerpo, fragmento de unión a antígeno, o una composición farmacéutica de la invención.

En otro aspecto más de la invención, la invención comprende un método de determinación selectiva para polipéptidos que pueden inducir o revelar una respuesta inmunológica contra virus de dengue, que comprende determinar selectivamente genotecas de polipéptido usando un anticuerpo, un fragmento o variante de anticuerpo de la invención.

En otro aspecto más de la invención, la invención comprende un método de monitoreo de la calidad de vacunas anti-virus de dengue. El método comprende usar un anticuerpo, una variante de anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo de la invención para verificar que el antígeno de la vacuna contiene el epítope específico en la conformación correcta.

En un aspecto adicional de la invención, la invención comprende una vacuna que comprende un epítope que se une específicamente a un anticuerpo, un fragmento o variante de anticuerpo de la invención.

El uso de un anticuerpo de la invención, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, un ácido nucleico de la invención, un polipéptido inmunogénico de la invención, o una composición farmacéutica de la invención (i) en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de infección por virus de dengue, (ii) en una vacuna, o (iii) en diagnóstico de infección por virus de dengue también se contempla que está dentro del alcance de la invención. Además, el uso de un anticuerpo de la invención, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, para monitorear la calidad de vacunas anti-DENV al verificar que el antígeno de dicha vacuna contiene el epítope específico en la conformación correcta también se contempla que está dentro del alcance de la invención.

En un aspecto adicional, la invención comprende un epítope que se une específicamente a un anticuerpo de cualquiera de la invención, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, para usarse (i) en terapia, (ii) en la fabricación de un medicamento para tratar infección por virus de dengue, (iii) como una vacuna, o (iv) en determinación selectiva para ligandos capaces de neutralizar infección por virus de dengue.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS Figura 1. Se usaron células VERO y células K562 en pruebas de neutralización e incremento de virus con cada serotipo de virus de dengue usando anticuerpos anti-virus de dengue de tipo silvestre. Los anticuerpos para virus de dengue inhiben infección del virus objetivo en células VERO de una manera dependiente de la dosis. En células K562, los anticuerpos conducen a un incremento de infección dependiente de anticuerpo (ADE) dependiente de la dosis.

Figura 2. Anticuerpos anti-virus de dengue que tienen una sustitución de CH2 L4A y L5A (variantes LALA) en la cadena pesada neutralizan infección por virus objetivo sobre células VERO como lo hicieron los anticuerpos no modificados. Sin embargo, las variantes LALA anularon por completo el incremento de infección dependiente de anticuerpo por el virus objetivo sobre células K562.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La invención se basa en el descubrimiento de anticuerpos y cócteles de anticuerpos que neutralizan infección por virus de dengue (DENV) sin contribuir a incremento dependiente de anticuerpo (ADE) de infección por virus de dengue. En un aspecto de la invención, la invención comprende un anticuerpo humano, un anticuerpo de variante, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que neutraliza un virus de dengue sin contribuir a incremento de infección dependiente de anticuerpo por virus de dengue. Los anticuerpos o fragmento de anticuerpos pueden neutralizar más de un serotipo de virus de dengue, por ejemplo, 2, 3 o los 4 serotipos de virus de dengue DENV-1 , DENV-2, DENV-3 y DENV-4.

La invención también comprende una composición farmacéutica que comprende, por ejemplo, un cóctel de anticuerpos que comprende dos o más anticuerpos humanos, variantes de anticuerpo o fragmentos de unión a antígeno del mismo. Las composiciones farmacéuticas de la invención que comprenden un cóctel de anticuerpos humanos, fragmentos de anticuerpo o variantes neutralizan todos los cuatro serotipos de virus de dengue, es decir, DENV-1 , DENV-2, DENV-3 y DENV-4. En una modalidad, el cóctel de anticuerpos, fragmentos de anticuerpo o variantes neutralizan virus de dengue al unirse a por lo menos dos epítopes distintos en cada serotipo de virus de dengue. Cabe notar que los anticuerpos, variantes y fragmentos de la composición farmacéutica no contribuyen a incremento de infección dependiente de anticuerpo por virus de dengue. En una modalidad, el cóctel comprende dos anticuerpos, fragmentos o variantes de los mismos. En otra modalidad, el cóctel comprende tres anticuerpos, fragmentos o variantes de los mismos. En otra modalidad más, el cóctel comprende más de 3 anticuerpos, v.gr., 4, 5, 6, 7 ó 8 anticuerpos.

Como se usa aquí, los términos "fragmento", "fragmento de anticuerpo" y "fragmento de unión a antígeno" se usan indistintamente para referirse a cualquier fragmento de un anticuerpo de la invención que retiene la actividad de unión a antígeno del anticuerpo. Fragmentos ilustrativos de anticuerpo incluyen, pero no se limitan a fragmentos Fab, Fab', F(ab')2> Fv y scFv.

Los términos "mutación" y "sustitución" se usan indistintamente para referirse a un cambio en uno o más residuos de ácido nucleico o aminoácidos.

Como se usa aquí, los términos "variante" y "variante de anticuerpo" se usan indistintamente para referirse a cualquier variante de un anticuerpo de la invención que retiene la actividad de unión a antígeno de los anticuerpos. El término variante incluye anticuerpos que comprenden mutaciones y/o sustituciones. Variantes de anticuerpo ilustrativas incluyen, pero no se limitan a, aquellas que tienen una sustitución L a A en la posición CH2 4, 5, o ambas.

Anticuerpos de la invención La invención provee anticuerpos que neutralizan virus de dengue, pero no contribuyen a ADE de infección por virus de dengue. Un "anticuerpo neutralizante" es uno que puede neutralizar la capacidad de un patógeno para iniciar y/o perpetuar una infección en un hospedero. Los anticuerpos de la invención son capaces de neutralizar uno o más serotipos de virus de dengue DENV-1 , DENV-2, DENV-3 y DENV-4. En una modalidad, el anticuerpo de la invención neutraliza más de un, v.gr., 2, 3, o todos los 4 serotipos de virus de dengue. En otra modalidad, una composición farmacéutica que comprende dos o más anticuerpos, fragmentos de anticuerpo o variantes pueden neutralizar todos los 4 serotipos de virus de dengue. En otra modalidad más, la composición farmacéutica que comprende dos o más anticuerpos, fragmentos de anticuerpo o variantes neutraliza infección por virus de dengue al dirigir dos epítopes distintos en cada serotipo de virus de dengue. Estos anticuerpos, fragmentos de unión a antígeno y vanantes se pueden usar como agentes profilácticos o terapéuticos bajo formulación apropiada, o como una herramienta de diagnóstico, como se describe aquí.

Los anticuerpos de la invención pueden ser monoclonales, por ejemplo, anticuerpos monoclonales humanos, o anticuerpos recombinantes. La invención también provee fragmentos de los anticuerpos de la invención, particularmente fragmentos que retienen la actividad de unión a antígeno de los anticuerpos. Aunque la especificación, incluyendo las reivindicaciones, en algunos lugares, pueden referirse explícitamente a fragmento de anticuerpo(s), variante(s) y/o derivado(s) de anticuerpos, se entiende que el término "anticuerpo" o "anticuerpo de la invención" incluye todas las categorías de anticuerpos, a saber, fragmento de anticuerpo(s), variante(s) y derivado(s) de anticuerpos.

Sin desear estar limitados por la teoría, se cree que el incremento de infección dependiente de anticuerpo por virus de dengue se produce por la unión de la región Fe del anticuerpo, en particular, la región Fe de la cadena pesada de una molécula de IgG, a un receptor de Fe, v.gr., un receptor de Fcy en una célula hospedera. La invención, por otra parte, provee anticuerpos, incluyendo moléculas de IgG, que tienen unión reducida al receptor de Fes (FcR). En una modalidad, el anticuerpo de la invención comprende una o más mutaciones en la región Fe. La mutación(es) puede ser cualquier mutación que reduce la unión del anticuerpo a un receptor de Fe. En una modalidad, la región Fe de un anticuerpo de la invención comprende una sustitución en las posiciones CH2 4, 5, o ambas. En general, el aminoácido en las posiciones 4 y 5 de CH2 de lgG1 y lgG3 de tipo silvestre es una leucina ("L"). En una modalidad, los anticuerpos de la invención comprenden un aminoácido en la posición 4, 5, o ambas, de CH2 que no es una L. En otra modalidad, los anticuerpos de la invención comprenden una alanina ("A") en la posición 4, 5, o ambas, de CH2. Un anticuerpo que comprende una sustitución de L4A y una de L5A de CH2 se refiere aquí como una variante "LALA".

Alternativamente, la invención provee fragmentos de anticuerpo que no comprenden una región Fe y por lo tanto no se unen a una FcR. Fragmentos ilustrativos de anticuerpo incluyen, pero no se limitan a, Fab, Fab', F(ab')2, Fv y scFv.

Las secuencias de las cadenas pesadas y cadenas ligeras de varios anticuerpos ilustrativos de la invención, que comprenden cada uno tres CDRs en la cadena pesada y tres CDRs en la cadena ligera se han determinado. La posición de los aminoácidos de CDR se define de conformidad con el sistema de numeración IMGT [1 , 2, 3]. Las secuencias de las CDRs, cadena pesadas, cadenas ligeras así como las secuencias de las moléculas de ácido nucleico que codifican las CDRs, cadena pesadas, cadenas ligeras de muchos anticuerpos ilustrativos de la invención se describen en el listado de secuencia. El cuadro 1 provee las SEQ ID NOs para las secuencias de aminoácidos de las seis CDRs, la región variable de las cadenas pesadas y ligeras, respectivamente, de anticuerpos ilustrativos de la invención. El cuadro 2 provee las SEQ ID NOs para las secuencias de las moléculas de ácido nucleico que codifican las CDRs, cadenas pesadas y cadenas ligeras de anticuerpos ilustrativos de la invención.

CUADRO 1 SEQ IDs de aminoácidos para CDRs de anticuerpo, cadenas pesadas y ligeras Región variable Región Anticuerpo CDRs de cadena variable de pesada cadena ligera HMB-DV-1 1-6 13 14 HMB-DV-2 17-22 29 30 HMB-DV-3 33-38 45 46 HMB-DV-4 49-54 61 , 65 62 HMB-DV-5 67-72 79 80 HMB-DV-6 83-88 95 96 HMB-DV-7 83-85, 99, 53, 100 95 103 HMB-DV-8 105-1 10 117 1 18 HMB-DV-9 121-123, 70 124, 125 131 132 HMB-DV-10 135-139, 109 145 146 HMB-DV-1 1 149, 136-139, 109 151 146 HMB-DV-12 153-158 165 166 HMB-DV-13 169-174 181 182 HMB-DV- 4 185-188, 37, 189 195 196 CUADRO 2 SEQ IDs de ácido nucleico para CDRs de anticuerpo, cadenas pesadas y ligeras En una modalidad, los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de la invención comprenden una o más CDRs de cadena pesada o ligera de los anticuerpos ilustrativos de la invención. En una modalidad ilustrativa, los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de la invención neutralizan la infección por virus de dengue y comprenden por lo menos una secuencia de CDR que tiene la secuencia de cualquiera de SEQ ID NOs: 1-6, 17-22, 33-38, 49-54, 67-72, 83-88, 99, 100, 105-110, 121-123, 124, 125, 135-139, 149, 153-158, 169-174, 185-188 ó 189.

En otra modalidad, los anticuerpos, variantes de anticuerpo o fragmentos de unión a antígeno de la invención comprenden una cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos de una o más de SEQ ID NOs: 1-3, 17-19, 33-35, 49-51 , 67-69, 83-85, 105-107, 121-123, 135-137, 149, 153-155, 169-171 ó 185-187. En otra modalidad más, los anticuerpos, variantes de anticuerpo o fragmentos de unión a antígeno de la invención comprenden una CDR1 de cadena pesada seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NOs: 1 , 17, 33, 49, 67, 83, 105, 121 , 135, 149, 153, 169 y 185; una CDR2 de cadena pesada seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NOs: 2, 18, 34, 50, 68, 84, 106, 122, 136, 154, 170 y 186; y una CDR3 de cadena pesada seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NOs: 3, 19, 35, 51 , 69, 85, 107, 123, 137, 155, 171 y 187.

Por ejemplo, los anticuerpos de la invención comprenden una cadena pesada que comprende SEQ ID NO: 1 para CDRH1 , SEQ ID NO: 2 para CDRH2, SEQ ID NO: 3 para CDRH3; SEQ ID NO: 17 para CDRH1 , SEQ ID NO: 18 para CDRH2 y SEQ ID NO: 19 para CDRH3; SEQ ID NO: 33 para CDRH1 , SEQ ID NO: 34 para CDRH2 y SEQ ID NO: 35 para CDRH3; SEQ ID NO: 49 para CDRH1 , SEQ ID NO: 50 para CDRH2 y SEQ ID NO: 51 para CDRH3; SEQ ID NO: 67 para CDRH1 , SEQ ID NO: 68 para CDRH2 y SEQ ID NO: 69 para CDRH3; SEQ ID NO: 83 para CDRH1 , SEQ ID NO: 84 para CDRH2 y SEQ ID NO: 85 para CDRH3; SEQ ID NO: 105 para CDRH1 , SEQ ID NO: 106 para CDRH2 y SEQ ID NO: 107 para CDRH3; SEQ ID NO: 121 para CDRH1 , SEQ ID NO: 122 para CDRH2 y SEQ ID NO: 123 para CDRH3; SEQ ID NO: 135 para CDRH1 , SEQ ID NO: 136 para CDRH2 y SEQ ID NO: 137 para CDRH3; SEQ ID NO: 149 para CDRH1 , SEQ ID NO: 136 para CDRH2 y SEQ ID NO: 137 para CDRH3; SEQ ID NO: 153 para CDRH1 , SEQ ID NO: 154 para CDRH2 y SEQ ID NO: 155 para CDRH3; SEQ ID NO: 169 para CDRH1 , SEQ ID NO: 170 para CDRH2 y SEQ ID NO: 171 para CDRH3; y SEQ ID NO: 185 para CDRH1 , SEQ ID NO: 186 para CDRH2 y SEQ ID NO: 187 para CDRH3.

En otra modalidad más, los anticuerpos, variantes de anticuerpo o fragmento de anticuerpos de la invención comprenden una cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos de una o más de SEQ ID NOs: 4-6, 20-22, 36-38, 52-54, 70-72, 86-88, 99, 100, 108-110, 124, 125, 138, 139, 156-158, 172-174, 188 ó 189. En una modalidad adicional, los anticuerpos, variantes de anticuerpo o fragmento de anticuerpos de la invención comprenden una cadena ligera CDR1 seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NOs: 4, 20, 36, 52, 70, 86, 99, 108, 138, 156, 172 y 188; una cadena ligera CDR2 seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NOs: 5, 21 , 37, 53, 71 , 87, 109, 124, 157 y 173; y una cadena ligera CDR3 seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NOs: 6, 22, 38, 54, 72, 88, 100, 110, 125, 139, 158, 174 y 189.

Por ejemplo, los anticuerpos de la invención comprenden una cadena ligera que comprende SEQ ID NO: 4 para CDRL1 , SEQ ID NO: 5 para CDRL2; SEQ ID NO: 6 para CDRL3; SEQ ID NO: 20 para CDRL1 , SEQ ID NO: 21 para CDRL2; SEQ ID NO: 22 para CDRL3; SEQ ID NO: 36 para CDRL1 , SEQ ID NO: 37 para CDRL2; SEQ ID NO: 38 para CDRL3; SEQ ID NO: 52 para CDRL1 , SEQ ID NO: 53 para CDRL2; SEQ ID NO: 54 para CDRL3; SEQ ID NO: 70 para CDRL1 , SEQ ID NO: 71 para CDRL2; SEQ ID NO: 72 para CDRL3; SEQ ID NO: 86 para CDRL1 , SEQ ID NO: 87 para CDRL2; SEQ ID NO: 88 para CDRL3; SEQ ID NO: 99 para CDRL1 , SEQ ID NO: 53 para CDRL2; SEQ ID NO: 100 para CDRL3; SEQ ID NO: 108 para CDRL1 , SEQ ID NO: 109 para CDRL2; SEQ ID NO: 1 10 para CDRL3; SEQ ID NO: 70 para CDRL1 , SEQ ID NO: 124 para CDRL2; SEQ ID NO: 125 para CDRL3; SEQ ID NO: 138 para CDRL1 , SEQ ID NO: 109 para CDRL2; SEQ ID NO: 139 para CDRL3; SEQ ID NO: 156 para CDRL1 , SEQ ID NO: 157 para CDRL2; SEQ ID NO: 158 para CDRL3; SEQ ID NO: 172 para CDRL1 , SEQ ID NO: 173 para CDRL2; SEQ ID NO: 174 para CDRL3; y SEQ ID NO: 188 para CDRL1 , SEQ ID NO: 37 para CDRL2; SEQ ID NO: 189 para CDRL3.

En una modalidad, un anticuerpo de la invención, o fragmento de unión a antígeno del mismo, comprende todas las CDRs de anticuerpo HMB-DV-1 como se lista en el cuadro 1 , y neutraliza infección por virus de dengue en un hospedero humano. En otra modalidad, un anticuerpo de la invención, o fragmento de unión a antígeno del mismo, comprende todas las CDRs de anticuerpo HMB-DV-2 como se lista en el cuadro 1 , y neutraliza infección por virus de dengue en un hospedero humano. En otra modalidad, un anticuerpo de la invención, o fragmento de unión a antígeno del mismo, comprende todas las CDRs de anticuerpo HMB-DV-3 como se lista en el cuadro 1 , y neutraliza infección por virus de dengue en un hospedero humano. En otra modalidad más, un anticuerpo de la invención, o fragmento de unión a antígeno del mismo, comprende todas las CDRs de anticuerpo HMB-DV-4 como se lista en el cuadro 1 , y neutraliza infección por virus de dengue en un hospedero humano. En otra modalidad más, un anticuerpo de la invención, o fragmento de unión a antígeno del mismo, comprende todas las CDRs de anticuerpo HMB-DV-5 como se lista en el cuadro 1 , y neutraliza infección por virus de dengue en un hospedero humano. En otra modalidad más, un anticuerpo de la invención, o fragmento de unión a antígeno del mismo, comprende todas las CDRs de anticuerpo HMB-DV-6 como se lista en el cuadro 1, y neutraliza infección por virus de dengue en un hospedero humano. En otra modalidad más, un anticuerpo de la invención, o fragmento de unión a antígeno del mismo, comprende todas las CDRs de anticuerpo HMB-DV-7 como se lista en el cuadro 1 , y neutraliza infección por virus de dengue en un hospedero humano.

En una modalidad adicional, un anticuerpo de la invención, o fragmento de unión a antígeno del mismo, comprende todas las CDRs de anticuerpo HMB-DV-8 como se lista en el cuadro 1, y neutraliza infección por virus de dengue en un hospedero humano. En otra modalidad, un anticuerpo de la invención, o fragmento de unión a antígeno del mismo, comprende todas las CDRs de anticuerpo HMB-DV-9 como se lista en el cuadro 1 , y neutraliza infección por virus de dengue en un hospedero humano. En otra modalidad más, un anticuerpo de la invención, o fragmento de unión a antígeno del mismo, comprende todas las CDRs de anticuerpo HMB-DV-10 como se lista en el cuadro 1 , y neutraliza infección por virus de dengue en un hospedero humano. En otra modalidad más, un anticuerpo de la invención, o fragmento de unión a antígeno del mismo, comprende todas las CDRs de anticuerpo HMB-DV-11 como se lista en el cuadro 1 , y neutraliza infección por virus de dengue en un hospedero humano. En otra modalidad más, un anticuerpo de la invención, o fragmento de unión a antígeno del mismo, comprende todas las CDRs de anticuerpo HMB-DV-12 como se lista en el cuadro 1 , y neutraliza infección por virus de dengue en un hospedero humano. En otra modalidad más, un anticuerpo de la invención, o fragmento de unión a antígeno del mismo, comprende todas las CDRs de anticuerpo HMB-DV-13 como se lista en el cuadro 1 , y neutraliza infección por virus de dengue en un hospedero humano. En otra modalidad más, un anticuerpo de la invención, o fragmento de unión a antígeno del mismo, comprende todas las CDRs de anticuerpo HMB-DV-14 como se lista en el cuadro 1 , y neutraliza infección por virus de dengue en un hospedero humano.

En otra modalidad más, los anticuerpos de la invención comprenden una cadena pesada con una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 70%, por lo menos 75%, por lo menos 80%, por lo menos 85%, por lo menos 90%, por lo menos 95%, por lo menos 98%, o por lo menos 99% idéntica a las de SEQ ID NOs: 13, 29, 45, 61 , 65, 79, 95, 117, 131 , 145, 151 , 165, 181 ó 195. En otra modalidad más, los anticuerpos de la invención comprenden una cadena ligera con una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 70%, por lo menos 75%, por lo menos 80%, por lo menos 85%, por lo menos 90%, por lo menos 95%, por lo menos 98%, o por lo menos 99% idéntica a las de SEQ ID NOs: 14, 30, 46, 62, 80, 96, 103, 118, 132, 146, 166, 182 ó 196.

En una modalidad adicional, los anticuerpos, variantes de anticuerpo o fragmento de anticuerpos de la invención comprenden una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de cualquiera de SEQ ID NOs: 13, 29, 45, 61 , 65, 79, 95, 117, 131 , 145, 151 , 165, 181 ó 195, y una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de cualquiera de SEQ ID NOs: 14, 30, 46, 62, 80, 96, 103, 118, 132, 146, 166, 182 ó 196.

En otra modalidad más, los anticuerpos, variantes de anticuerpo o fragmento de anticuerpos de la invención neutralizan infección por virus de dengue y comprenden una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 13 y una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 14; o una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 29 y una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 30; o una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 45 y una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 46; o una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 61 y una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 62; o una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 65 y una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 62; o una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 79 y una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 80; o una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 95 y una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 96; o una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 95 y una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 103; o una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 117 y una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 118; o una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 131 y una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 132; o una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 145 y una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 146; o una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 151 y una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 146; o una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 165 y una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 166; o una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 181 y una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 182; o una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 195 y una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 196.

Métodos para reemplazo de cadena y para injerto de CDR son bien conocidos en la técnica. Originalmente, estos métodos se desarrollaron para humanizar anticuerpos no humanos (generalmente anticuerpos de ratón) o para seleccionar contrapartes de anticuerpo humano que tienen bioactividad equivalente a los anticuerpos no humanos. Estos métodos incluyen técnicas de reemplazo en donde sólo una de las CDRs, por ejemplo, las CDR3s, del anticuerpo no humano son retenidas y el resto de la región V, incluyendo el marco de lectura y las otras dos CDRs, por ejemplo, las CDRs 1 y 2, son individualmente reemplazadas en los pasos realizados secuencialmente (v.,gr. solicitud de patente de E.U.A. No. 20030166871 ; Rader, et al., Proc Nati Acad Sci USA 95:8910-15, 1998; Steinberg, et al., J Biol Chem 275:36073-78, 2000; Rader, et al., J Biol Chem 275:13668-76, 2000).

Además, métodos para crear anticuerpos con las especificidades de unión de un anticuerpo de referencia para un antígeno objetivo se describen en la solicitud de patente No. WO05/069,970. Los métodos incluyen transferir, del anticuerpo de referencia a un anticuerpo o fragmento de anticuerpo del receptor, la especificidad de unión esencial mínima del anticuerpo de referencia. Ejemplos de regiones que pueden ser transferidas incluyen, pero no se limitan a, la transferencia de un solo segmento de CDR, por ejemplo un segmento de CDR3, de la cadena pesada y/o de la cadena ligera, o un segmento D, o un segmento CDR3-FR4, o cualquier segmento CDR3-FR4 que comprende el determinante de especificidad de unión esencial mínima. Los anticuerpos creados usando estos métodos retienen la especificidad de unión, y a menudo afinidad, del anticuerpo de referencia.

Los anticuerpos, variantes de anticuerpo o fragmentos de anticuerpo de la invención incluyen anticuerpos que comprenden, ínter alia, una o más CDRs, una cadena pesada o una cadena ligera de un anticuerpo ilustrativo de la invención y retienen su especificidad y capacidad para neutralizar infección por virus de dengue.

Anticuerpos ilustrativos de la invención incluyen, pero no se limitan a, HMB-DV1 , HMB-DV2, HMB-DV3, HMB-DV4, H B-DV5, HMB-DV6, HMB-DV7, HMB-DV8, HMB-DV9, HMB-DV10, HMB-DV1 1 , HMB-DV12, HMB-DV 3 y HMB-DV14.

Variantes de HMB-DV4 consisten de una variante de cadena pesada que tiene secuencias de aminoácidos mencionadas en SEQ ID NO: 61 y SEQ ID NO: 65, y una cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos mencionada en SEQ ID NO: 62. Las secuencias de ácido nucleico que codifican las variantes de cadena pesada se mencionan en SEQ ID NO: 63 y SEQ ID NO: 66. El ácido nucleico que codifica la cadena ligera se menciona en SEQ ID NO: 64. Por lo tanto, los anticuerpos que comprenden las variantes de cadena pesada HMB-DV4 (SEQ ID NOs: 61 , 65) y cadena ligera (SEQ ID NO: 62) se incluyen dentro del alcance de la invención.

Como se usa aquí, el término "HMB-DV4" se usa para referirse a cualquiera y/o todas las variantes de HMB-DV4, por ejemplo, aquellas con cadenas pesadas correspondientes a SEQ ID NOs: 61 y 65 y cadena ligera correspondiente a SEQ ID NO: 62.

En una modalidad, un cóctel de anticuerpos de la invención comprende dos o más anticuerpos seleccionados del grupo que consiste de HMB-DV1 , HMB-DV2, HMB-DV3, HMB-DV4, HMB-DV5, HMB-DV6, HMB-DV7, HMB-DV8, HMB-DV9, HMB-DV10, HMB-DV11 , HMB-DV12, HMB-DV13, y HMB-DV14. En otra modalidad, un cóctel de la invención comprende tres anticuerpos seleccionados del grupo que consiste de HMB-DV1 , HMB-DV2, HMB-DV3, HMB-DV4, HMB-DV5, HMB-DV6, HMB-DV7, HMB-DV8, HMB-DV9, HMB-DV10, HMB-DV1 1 , HMB-DV12, HMB-DV13 y HMB-DV14. En otra modalidad más, un cóctel de anticuerpos de la invención comprende más de tres, por ejemplo, 4, 5, 6, 7 ó 8 anticuerpos seleccionados del grupo que consiste de HMB-DV1 , HMB-DV2, HMB-DV3, HMB-DV4, HMB-DV5, HMB-DV6, HMB-DV7, HMB-DV8, HMB-DV9, HMB-DV10, HMB-DV11 , HMB-DV12, HMB-DV13 y HMB-DV14. En una modalidad ilustrativa, un cóctel de la invención comprende HMB-DV5, HMB-DV6 y HMB-DV8.

La invención además comprende un anticuerpo, o fragmento del mismo, que se une a un epítope capaz de unirse a un anticuerpo de la invención. La invención también comprende un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo que compite con un anticuerpo de la invención.

En otro aspecto, la invención también incluye secuencias de ácido nucleico que codifican parte o todas las cadenas ligeras y pesadas y CDRs de los anticuerpos de la presente invención. En una modalidad, secuencias de ácido nucleico de conformidad con la invención incluyen secuencias de ácido nucleico que tienen por lo menos 70%, por lo menos 75%, por lo menos 80%, por lo menos 85%, por lo menos 90%, por lo menos 95%, por lo menos 98%, o por lo menos 99% de identidad al ácido nucleico que codifica una cadena pesada o ligera de un anticuerpo de la invención. En otra modalidad, una secuencia de ácido nucleico de la invención tiene la secuencia de un ácido nucleico que codifica una CDR de cadena pesada o ligera de un anticuerpo de la invención. Por ejemplo, una secuencia de ácido nucleico de conformidad con la invención comprende una secuencia que es por lo menos 70%, por lo menos 75%, por lo menos 80%, por lo menos 85%, por lo menos 90%, por lo menos 95%, por lo menos 98%, o por lo menos 99% idéntica a las secuencias de ácido nucleico de SEQ ID NOs: 7-12, 23-28, 39-44, 55-60, 73-78, 89-94, 101 , 102, 111-116, 126-128, 129, 130, 140-144, 150, 159-164, 175-180 y 190-194.

Debido a la redundancia del código genético, existirán variantes de estas secuencias que codifican las mismas secuencias de aminoácidos. Estas variantes se incluyen dentro del alcance de la invención.

Los anticuerpos de variante también se incluyen dentro del alcance de la invención. Por lo tanto, variantes de las secuencias mencionadas en la solicitud también se incluyen dentro del alcance de la invención. Dichas variantes incluyen variantes naturales generadas por mutación somática in vivo durante la respuesta inmunológica o in vitro bajo cultivo de clones de células B inmortalizadas. Alternativamente, las variantes pueden producirse debido a la degeneración del código genético, como se mencionó antes o puede ser producido debido a errores en transcripción o traducción. Las variantes también se pueden introducir para modificar la función efectora del anticuerpo, por ejemplo en la región Fe para reducir la unión del anticuerpo a un receptor de Fe.

Variantes adicionales de las secuencias de anticuerpo que tienen afinidad y/o potencia mejoradas se pueden obtener usando métodos conocidos en la técnica y se incluyen dentro del alcance de la invención. Por ejemplo, se pueden usar sustituciones de aminoácidos para obtener anticuerpos con afinidad mejorada adicional. Alternativamente, la optimización por codón de la secuencia de nucleótidos se puede usar para mejorar la eficiencia de traducción en sistemas de expresión para la producción del anticuerpo. Además, los polinucleótidos que comprenden una secuencia optimizada para especificidad o actividad neutralizante de anticuerpo mediante la aplicación de un método de evolución dirigido a cualquiera de las secuencias de ácido nucleico de la invención también están dentro del alcance de la invención.

En una modalidad, secuencias de anticuerpo variantes pueden compartir 70% o más (es decir, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% o más) de identidad de secuencia de aminoácidos con las secuencias mencionadas en la solicitud. En algunas modalidades, dicha identidad de secuencia se calcula con respecto a la longitud completa de la secuencia de referencia (es decir, la secuencia mencionada en la solicitud). En algunas modalidades, el porcentaje de identidad, como se refiere aquí, es como se determina usando BLAST versión 2.1.3 mediante el uso de los parámetros por omisión especificados por el NCBI (the National Center for Biotechnology Information (Centro Nacional para Información de Biotecnología); http://www.ncbi.nlm.nih.gov ) [Blosum 62 matriz; gap open penalty=11 and gap extensión penalty=1 (Matriz de Blosum 62; sanción por espacio abierto=11 y sanción por extensión de espacio =1)].

Además, dentro del alcance de la invención se incluyen vectores, por ejemplo, vectores de expresión, que comprenden una secuencia de ácido nucleico de conformidad con la invención. Las células transformadas con dichos vectores también se incluyen dentro del alcance de la invención. Ejemplos de dichas células incluyen pero no se limitan a, células eucarióticas, v.gr., células de levadura, células animales o células vegetales. En una modalidad, las células son células de mamífero, v.,gr. humanas, CHO, HEK293T, PER.C6, NS0, mieloma o hibridoma.

La invención también se refiere a anticuerpos monoclonales que se unen a un epítope capaz de unirse a un anticuerpo de la invención. En una modalidad, la invención incluye un anticuerpo monoclonal que se une a un epítope capaz de unirse a un anticuerpo monoclonal seleccionado del grupo que consiste de HMB-DV1 , HMB-DV2, HMB-DV3, HMB-DV4, HMB-DV5, HMB-DV6, HMB-DV7, HMB-DV8, HMB-DV9, HMB-DV10, HMB-DV11 , HMB-DV12, HMB-DV13, y HMB-DV14.

Anticuerpos monoclonales y recombinantes son particularmente útiles en la identificación y purificación de los polipéptidos individuales u otros antígenos contra los cuales son dirigidos. Los anticuerpos de la invención tienen utilidad adicional ya que se pueden utilizar como reactivos en inmunoensayos, radioinmunoensayos (RIA) o pruebas inmunoabsorbentes ligadas a enzima (ELISA). En estas aplicaciones, los anticuerpos se pueden mercar con un reactivo analíticamente detectable tal como un radioisótopo, una molécula fluorescente o una enzima. Los anticuerpos también se pueden usar para la identificación y caracterización moleculares (mapeo de epítope) de antígenos.

Los anticuerpos de la invención típicamente serán glicosilados. Los glicanos N-enlazados unidos al dominio CH2 de una cadena pesada, por ejemplo, pueden influir en la unión de C1q y FcR, con anticuerpos aglicosilados que tienen afinidad más baja para estos receptores. La estructura de glicano también puede afectar la actividad v.gr., diferencias en muerte celular mediada por complemento se pueden ver dependiendo del número de azúcares de galactosa (0, 1 ó 2) en el término de una cadena biantenaria del glicano. Un glicano del anticuerpo preferiblemente no conduce a una respuesta inmunogénica humana después de la administración.

Los anticuerpos de la invención pueden ser acoplados a un fármaco para suministrarse a un sitio de tratamiento o acoplados a un marcador detectable para facilitar la formación de imagen de un sitio que comprende células de interés, tal como células infectadas con virus de dengue. Los métodos para acoplar anticuerpos a fármacos y marcadores detectables son bien conocidos en la técnica, como lo son los métodos para formación de imagen que usan marcadores detectables. Los anticuerpos marcados se pueden utilizar en una amplia variedad de pruebas, utilizando una amplia variedad de marcadores. La detección de la formación de un complejo anticuerpo-antígeno entre un anticuerpo de la invención y un epítope de interés (un epítope de DENV) puede ser facilitado al unir una sustancia detectable al anticuerpo. Los medios de detección adecuados incluyen el uso de marcadores tales como radionúclidos, enzimas, coenzimas, fluorescentes, quimioluminiscentes, cromógenos, sustratos de enzima o co-factores, inhibidores de enzima, complejos de grupo prostético, radicales libres, partículas, colorantes y similares. Ejemplos de enzimas adecuadas incluyen peroxidasa de rábano picante, fosfatasa alcalina, ß-galactosidasa o acetilcolinesterasa; ejemplos de complejos de grupo prostético adecuados incluyen estreptavidina/biotina y avidina/biotina; ejemplos de materiales fluorescentes adecuados incluyen umbeliferona, fluoresceína, isotiocianato de fluoresceína, rodamina, diclorotriazinilamina-fluoresceína, cloruro de dansilo o ficoeritrina; un ejemplo de un material luminiscente es luminol; ejemplos de materiales bioluminiscentes incluyen luciferasa, luciferina y aecuorina; y ejemplos de material radioactivo adecuado incluyen 125l, 13 1, 35S o 3H. Dichos reactivos marcados se pueden usar en una variedad de pruebas bien conocidas, tales como radioinmunoensayos, inmunoensayos de enzima, v.gr., ELISA, inmunoensayos fluorescentes, y similares.

Un anticuerpo de conformidad con la invención puede ser conjugado a una porción terapéutica tal como una citotoxina, un agente terapéutico, o un ion de metal radioactivo o radioisótopo. Ejemplos de radioisótopos incluyen, pero no se limitan a, 1-131 , 1-123, 1-125, Y-90, Re-188, Re-186, At-21 1 , Cu-67, Bi-212, Bi-213, Pd-109, Tc-99, ln-111 , y similares. Dichos conjugados de anticuerpo se pueden usar para modificar una respuesta biológica dada; la porción de fármaco no debe considerarse como limitada a agentes terapéuticos químicos clásicos. Por ejemplo, la porción de fármaco puede ser una proteína o polipéptido que posee una actividad biológica deseada. Dichas proteínas pueden incluir, por ejemplo, una toxina tal como abrin, ricino A, endotoxina de Pseudomonas, toxina bacteriana de caliqueamicina, o toxina de difteria.

Las técnicas para conjugar dicha porción terapéutica a anticuerpos son bien conocidas. Véase, por ejemplo, Arnon et al. (1985) "Monoclonal Antibodies for Immunotargeting of Drugs in Cáncer Therapy," en Monoclonal Antibodies and Cáncer Therapy, ed. Reisfeld et al. (Alan R. Liss, Inc.), pp. 243-256; ed. Hellstrom et al. (1987) "Antibodies for Drug Delivery," in Controlled Drug Delivery, ed. Robinson et al. (2d ed; Marcel Dekker, Inc.), pp. 623-653; Thorpe (1985) "Antibody Carriers of Cytotoxic Agents in Cáncer Therapy: A Review," in Monoclonal Antibodies '84: Biological and Clinical Applicaciones, ed. Pinchera et al. pp. 475-506 (Editrice Kurtis, Milano, Italia, 1985); "Analysis, Results, and Future Prospective of the Therapeutic Use de Radiolabeled Antibody in Cáncer Therapy," en Monoclonal Antibodies for Cáncer Detección and Therapy, ed. Baldwin et al. (Academic Press, New York, 1985), pp. 303-316; y Thorpe er a/. (1982) Immunol. Rev. 62:1 19-158.

Alternativamente, un anticuerpo puede ser conjugado a un segundo anticuerpo para formar un heteroconjugado de anticuerpo como se describe en la referencia 4. Además, los enlazadores se pueden usar entre los marcadores y los anticuerpos de la invención [5]. Los anticuerpos o, fragmentos de unión a antígeno de los mismos pueden ser directamente marcados con yodo, indio, itrio radioactivo, u otra partícula radioactiva conocida en la técnica [6]. El tratamiento puede consistir de una combinación de tratamiento con anticuerpos conjugados y no conjugados administrados simultáneamente o subsecuentemente [7, 8].

Los anticuerpos de la invención también se pueden unir a un soporte sólido.

Además, los anticuerpos de la invención, o fragmentos de anticuerpo funcionales de los mismos, pueden ser químicamente modificados por conjugación covalente a un polímero para, por ejemplo, incrementar, por ejemplo, su vida media circulante. Ejemplos de polímeros, y métodos para unirlos a péptidos, se muestran en las referencias 9-12. En algunas modalidades, los polímeros se pueden seleccionar de polioles polioxietilados y polietilenglicol (PEG). El PEG es soluble en agua a temperatura ambiente y tiene la fórmula general: R(0-CH2 --CH2)n 0--R, en donde R puede ser hidrógeno, o un grupo protector tal como un grupo alquilo o alcanol. En una modalidad, el grupo protector puede tener entre 1 y 8 carbonos. En una modalidad adicional, el grupo protector es metilo. El símbolo n es un entero positivo. En una modalidad, n es entre 1 y 1 ,000. En otra modalidad, n es entre 2 y 500. En una modalidad, el PEG tiene un peso molecular promedio entre 1,000 y 40,000. En una modalidad adicional, el PEG tiene un peso molecular entre 2,000 y 20,000. En una modalidad adicional, el PEG tiene un peso molecular de entre 3,000 y 12,000. En una modalidad, PEG tiene por lo menos un grupo hidroxi. En otra modalidad, el PEG tiene un grupo hidroxi terminal. En otra modalidad más, es el grupo hidroxi terminal el que es activado para reaccionar con un grupo libre sobre el inhibidor. Sin embargo, se entenderá que el tipo y cantidad de los grupos reactivos se puede variar para lograr un PEG/anticuerpo covalentemente conjugado de la presente invención.

Los anticuerpos de la invención pueden ser modificados al introducir mutaciones de aminoácido aleatorias en una región particular del dominio CH2 o CH3 de la cadena pesada para alterar su afinidad de unión para FcRn y/o su vida media en el suero en comparación con los anticuerpos no modificados. Ejemplos de dichas modificaciones incluyen, pero no se limitan a, sustituciones de por lo menos un aminoácido de la región constante de cadena pesada seleccionado del grupo que consiste de los residuos de aminoácido 250, 314 y 428.

Polioles polioxietilados solubles en agua también son útiles en la presente invención. Estos incluyen sorbitol polioxietilado, glucosa polioxietilada, glicerol polioxietilado (POG), y similares. En una modalidad, se usa POG. Sin estar limitado por alguna teoría, debido a que la estructura de base de glicerol del glicerol polioxietilado es la misma estructura de base que ocurre naturalmente en, por ejemplo, animales y humanos en mono-, di-, triglicéridos, esta ramificación no se vería necesariamente como un agente extraño en el cuerpo. En algunas modalidades, POG tiene un peso molecular en el mismo intervalo que PEG. La estructura para POG se muestra en la referencia 13, y una discusión de conjugados POG/IL-2 se encuentra en la referencia 9.

Otro sistema de suministro de fármaco que se puede usar para incrementar la vida media circulatoria es el liposoma. Los métodos de preparación de sistemas de suministro de liposoma se describen en las referencias 14, 15 y 16. Otros sistemas de suministro de fármaco son conocidos en la técnica y se describen, por ejemplo, en las referencias 17 y 18.

Los anticuerpos de la invención se pueden proveer en forma purificada. Típicamente, el anticuerpo estará presente en una composición que es sustancialmente libre de otros polipéptidos, v.,gr. en donde menos de 90% (en peso), usualmente menos de 60% y muy usualmente menos de 50% de la composición está constituida por otros polipéptidos.

Los anticuerpos de la invención pueden ser inmunogénicos en hospederos no humanos (o heterólogos), v.gr., en ratones. En particular los anticuerpos pueden tener un ideotipo que es inmunogénico en hospederos no humanos, pero no en un hospedero humano. Los anticuerpos de la invención para uso humano incluyen aquellos que no pueden ser fácilmente aislados de hospederos tales como ratones, cabras, conejos, ratas, mamíferos no primates, etc., y generalmente no pueden obtenerse por humanización o a partir de xeno-ratones.

Los anticuerpos de la invención pueden ser de cualquier isotipo (v.gr., IgA, IgG, IgM, es decir, una cadena pesada a, ? o µ), pero generalmente serán IgG. Dentro del isotipo IgG, los anticuerpos pueden ser de la subclase lgG1 , lgG2, lgG3 o lgG4. En una modalidad, el anticuerpo es lgG1. Los anticuerpos de la invención pueden tener una cadena ligera ? o ?.

Incluidos dentro del alcance de la invención están las moléculas de anticuerpo bi-especificas recombinantes o genéticamente manipuladas DENV-neutralizantes o fragmentos de unión a antígeno de los mismos. Dichos anticuerpos y fragmentos pueden comprender un primer sitio de unión para un epítope sobre un primer serotipo de virus de dengue y un segundo sitio de unión para un segundo epítope en el mismo serotipo de virus de dengue o en uno diferente, por ejemplo, un segundo, tercer o cuarto serotipo de virus de dengue. Los dominios variables de los sitios de unión respectivos se pueden formar como isotipos de inmunoglobulina de la invención o como Fab, Fab', F(ab')2, ScFv heterodiméricos o diacuerpos que pueden ser enlazados entre si por uno o más enlazadores de péptido.

Producción de anticuerpos Los anticuerpos monoclonales de conformidad con la invención se pueden hacer por cualquier método conocido en la técnica. La metodología general para hacer anticuerpos monoclonales usando tecnología de hibridoma es bien conocida [19, 20]. Preferiblemente, se usa el método de inmortalización de EBV alternativo descrito en la referencia 21.

Usando el método descrito en la referencia 21 , células B que producen el anticuerpo de la invención pueden ser transformadas con EBV en presencia de un activador de células B poiiclonal. La transformación con EBV es una técnica estándar y puede ser fácilmente adaptada para incluir activadores de células B policlonales.

Estimulantes adicionales de crecimiento y diferenciación celulares se pueden añadir opcionalmente durante el paso de transformación para incrementar adicionalmente la eficiencia. Estos estimulantes pueden ser citocinas tales como IL-2 y IL-15. En un aspecto, IL-2 se añade durante el paso de inmortalización para mejorar adicionalmente la eficiencia de inmortalización, pero su uso no es esencial.

Las células B inmortalizadas producidas usando estos métodos pueden ser cultivadas usando métodos conocidos en la técnica y anticuerpos aislados de los mismos.

Los anticuerpos de la invención también se pueden hacer cultivando células plasmáticas individuales en placas de cultivo de micropozos mediante el uso del medio descrito en la solicitud de patente del Reino Unido 0819376.5. Además, a partir de los cultivos de células plasmáticas, el ARN se puede extraer y se puede realizar PCR de células individuales usando métodos conocidos en la técnica. Las regiones VH y VL de los anticuerpos pueden ser amplificadas por RT-PCR, secuenciadas y clonadas en un vector de expresión que después es transfectado en células HEK293T y otras células hospederas. La clonación de ácido nucleico en vectores de expresión, la transfección de células hospederas, el cultivo de las células hospederas transfectadas y el aislamiento del anticuerpo producido se pueden hacer usando cualesquiera métodos conocidos por los expertos en la técnica.

Los anticuerpos monoclonales pueden ser además purificados, si se desea, usando filtración, centrifugación y varios métodos cromatográficos tales como CLAR o cromatografía de afinidad. Las técnicas para purificación de anticuerpos monoclonales, incluyendo técnicas para producir anticuerpos de grado farmacéutico, son bien conocidas en la técnica.

Los fragmentos de los anticuerpos monoclonales de la invención se pueden obtener a partir de los anticuerpos monoclonales por métodos que incluyen digestión con enzimas, tales como pepsina o papaína, y/o por digestión de enlaces de bisulfuro por reducción química. Alternativamente, fragmentos de anticuerpos monoclonales se pueden obtener por clonación y expresión de una parte de las secuencias de las cadenas pesada y ligera. Los "fragmentos" de anticuerpo pueden incluir fragmentos Fab, Fab', F(ab')2 y Fv. La invención también abarca fragmentos Fv de una sola cadena (scFv) derivados de las cadenas pesada y ligera de un anticuerpo monoclonal de la invención, v.gr., la invención incluye un scFv que comprende las CDRs de un anticuerpo de la invención. También se incluyen monómeros y dímeros de cadena pesada o ligera así como anticuerpos de una sola cadena, v.gr., Fv de una sola cadena en el cual los dominios variables de cadena pesada y ligera son unidos por un enlazador de péptido.

Técnicas estándares de biología molecular se pueden usar para preparar secuencias de ADN que codifican para los anticuerpos o fragmentos o variantes de los anticuerpos de la presente invención. Las secuencias de ADN deseadas pueden ser sintetizadas completamente o en parte usando técnicas de síntesis de oligonucleótidos. Las técnicas de mutagénesis dirigida al sitio y reacción en cadena de polimerasa (PCR) se pueden usar según sea apropiado.

Cualquier sistema de célula/vector de hospedero adecuado se puede usar para la expresión de secuencias de ADN que codifican las moléculas de anticuerpo de la presente invención o fragmentos de las mismas. Sistemas bacterianos, por ejemplo E. coli, y otros sistemas microbianos se pueden usar, en parte, para expresión de fragmentos de anticuerpo tales como fragmentos Fab y F(ab')2, y especialmente fragmentos Fv y fragmentos de anticuerpo de una sola cadena, por ejemplo, Fvs, de una sola cadena. Sistemas de expresión de células hospederas eucarióticas, v.gr., de mamífero, se pueden usar para la producción de moléculas de anticuerpo más grandes, incluyendo moléculas de anticuerpo completas. Las células hospederas de mamífero adecuadas incluyen CHO, HEK293T, PER.C6, NSO, células de mieloma o hibridoma.

La presente invención también provee un procedimiento para la producción de un anticuerpo de la invención que comprende cultivar una célula hospedera que comprende un vector de la presente invención bajo condiciones adecuadas para conducir a la expresión de proteína a partir del ADN que codifica el anticuerpo de la presente invención, y aislar la molécula de anticuerpo.

La molécula de anticuerpo puede comprender solo un polipéptido de cadena pesada o ligera, en cuyo caso solo una secuencia codificante de polipéptido de cadena pesada o cadena ligera se necesita usar para transfectar las células hospederas. Para la producción de productos que comprenden tanto cadenas pesada como ligera, la línea celular puede ser transfectada con dos vectores, un primer vector que codifica un polipéptido de cadena ligera y un segundo vector que codifica un polipéptido de cadena pesada. Alternativamente, se puede usar un solo vector, el vector incluyendo secuencias que codifican polipéptidos de cadena ligera y cadena pesada. Alternativamente, los anticuerpos de conformidad con la invención pueden ser producidos por i) expresión de una secuencia de ácido nucleico de conformidad con la invención en una célula y ii) aislar el producto de anticuerpo expresado. Además el método puede incluir iii) purificar el anticuerpo.

Determinación selectiva y aislamiento de células B Las células B transformadas pueden ser determinadas selectivamente para aquellas que producen anticuerpos de la especificidad de antígeno deseado y clones de células B individuales también pueden ser producidos a partir de las células positivas.

El paso de determinación selectiva se puede llevar a cabo por ELISA, por tinción de tejidos o células (incluyendo células infectadas o transfectada), una prueba de neutralización o uno de un número de métodos conocidos en la técnica para identificar la especificidad de antígeno deseado. Está prueba se puede seleccionar sobre la base de reconocimiento de antígeno simple, o se puede seleccionar sobre la base adicional de una función deseada, v.gr., para seleccionar anticuerpos neutralizantes en vez de solo anticuerpos de unión a antígeno, para seleccionar anticuerpos que pueden cambiar características de células objetivo, tales como sus cascadas de señalización, su forma, su tasa de crecimiento, su capacidad de influir en otras células, su respuesta a la influencia por otras células o por otros reactivos o por un cambio en las condiciones, su estado de diferenciación, etc.

El paso de clonación para separar clones individuales de la mezcla de células positivas se puede llevar a cabo usando dilución limitante, micro manipulación, deposición de células individuales por distribución de células o cualquier otro método conocido en la técnica.

Los clones de células B inmortalizadas de la invención se pueden usar de varias maneras, v.gr., como una fuente de anticuerpos monoclonales, como una fuente de ácido nucleico (ADN o ARNm) que codifican un anticuerpo monoclonal de interés, para investigación, etc.

La invención provee una composición que comprende células de memoria B inmortalizadas, en donde las células producen anticuerpos que neutralizan uno o más serotipos de virus de dengue, y en donde los anticuerpos son producidos a >5pg por célula por día. La invención también provee una composición que comprende clones de una célula de memoria B inmortalizada, en donde los clones producen un anticuerpo monoclonal que neutraliza uno o más serotipos de virus de dengue, y en donde el anticuerpo es producido a >5 por célula por día.

Un clon de célula B inmortalizado ilustrativo de conformidad con la invención incluye, pero no se limita a HMB-DV1 , HMB-DV2, HMB-DV3, HMB-DV4, HMB-DV5, HMB-DV6, HMB-DV7, HMB-DV8, HMB-DV9, HMB-DV10, HMB-DV11 , HMB-DV12, HMB-DV 3, y HMB-DV14.

Epítopes Como se mencionó antes, los anticuerpos de la invención se pueden usar para mapear los epítopes a los cuales se unen. Los epítopes reconocidos por los anticuerpos de la invención pueden tener un número de usos. El epítope y mimotopos del mismo en forma purificada o sintética se pueden usar para producir respuestas inmunológicas (es decir, una vacuna, o para la producción de anticuerpos para otros usos) o para determinar selectivamente suero del paciente para anticuerpos que reaccionan inmunológicamente con el epítope o mimotopos del mismo. En una modalidad tal como un epítope o mimotopo, o antígeno que comprende dicho epítope o mimotopo se puede usar como una vacuna para producir una respuesta inmunológica. Los anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno de la invención también se pueden usar en un método de monitoreo de la calidad de vacunas. En particular, los anticuerpos se puede usar para verificar que el antígeno en una vacuna contenga el epítope específico en la conformación correcta.

El epítope también puede ser útil en la determinación selectiva de ligandos que se unen a ese epítope. Dichos ligandos, incluyen pero no se limitan a anticuerpos, incluyendo aquellos de camellos, tiburones y otras especies, fragmentos de anticuerpos, péptidos, productos de tecnología de desplegué de fagos, aptámeros, adnectinas, compuestos sintéticos o fragmentos de otras proteínas virales o celulares, que pueden bloquear el epítope y así prevenir la infección. Dichos ligandos son abarcados dentro del alcance de la invención.

Expresión recombinante Las células de memoria B inmortalizadas de la invención también se pueden usar como una fuente de ácidos nucleicos para la clonación de genes de anticuerpo para la expresión recombinante subsecuente. La expresión de fuentes recombinantes es más común para propósitos farmacéuticos que la expresión de células B o hibridomas, v.gr., por razones de estabilidad, capacidad de reproducción, facilidad de cultivo, etc.

Por lo tanto, la invención provee un método para preparar una célula recombinate, que comprende los pasos de: (i) obtener uno o más ácidos nucleicos (v.gr., genes de cadena pesada y/o ligera) del clon de células B que codifica el anticuerpo de interés; y (ii) insertar el ácido nucleico en un hospedero de expresión a fin de permitir la expresión del anticuerpo de interés en un hospedero.

De manera similar, la invención provee un método para preparar una célula recombinante, que comprende los pasos de: (ii) secuenciar ácido(s) nucleico(s) del clon de células B que codifica el anticuerpo de interés; y (ii) usar la información de secuencia del paso (i) para preparar ácido(s) nucleico(s) para inserción en un hospedero de expresión a fin de permitir la expresión del anticuerpo de interés en ese hospedero. El ácido nucleico puede, pero no necesita, ser manipulado entre los pasos (i) y (ii) para introducir sitios de restricción, para cambiar el uso de codón, para optimizar las secuencias reguladoras de transcripción y/o traducción, y/o para modificar la función efectora.

La invención también provee un método de preparación de una célula recombinante, que comprende el paso de transformar una célula hospedera con uno o más ácidos nucleicos que codifican un anticuerpo monoclonal de interés, en donde los ácidos nucleicos son ácidos nucleicos que fueron derivados de un clon de células B inmortalizadas de la invención. Por lo tanto, los procedimientos para preparar primero el ácido(s) nucleico(s) y después usarlo para transformar una célula hospedera se puede realizar en diferentes tiempos por diferentes personas en diferentes lugares (v.gr., diferentes países).

Estas células recombinantes de la invención se pueden usar para propósitos de expresión y cultivo. Son particularmente útiles para la expresión de anticuerpos para producción farmacéutica a gran escala. También se pueden usar como el ingrediente activo de una composición farmacéutica. Cualesquiera técnicas de cultivo adecuadas se pueden usar, incluyendo pero sin limitarse a cultivo estático, cultivo en botellas rodantes, fluido de ascitos, cartucho de biorreactor de tipo de fibra hueca, minifermentador modular, tanque agitado, cultivo en microportadores, perfusión de núcleo de cerámica, etc.

Los métodos para obtener y secuenciar genes de inmunoglobulina a partir de células B son bien conocidos en la técnica (v.gr., véase referencia 22).

El hospedero de expresión es preferiblemente una célula eucariótica, incluyendo células de levadura y animales, particularmente células de mamífero (v.gr., células CHO, células ÑSO, células humanas tales como células PER.C6 [Crucell; referencia 23] o HKB-11 [Bayer; referencias 24 y 25], células de mieloma [26 y 27], etc.), así como células vegetales. Los hospederos de expresión preferidos pueden glicosilar el anticuerpo de la invención, particularmente con estructuras de carbohidratos que como tales no son inmunogénicas en humanos. En una modalidad, el hospedero de expresión puede ser capaz de crecer en medio libre de suero. En una modalidad adicional, el hospedero de expresión puede ser capaz de crecer en cultivo sin la presencia de productos derivados de animales.

El hospedero de expresión puede ser cultivado para dar una línea de células.

La invención provee un método para preparar una o más moléculas de ácido nucleico (v.gr., genes de cadena pesada y ligera) que codifican un anticuerpo de interés, que comprende los pasos de: (i) preparar un clon de células B inmortalizado de conformidad con la invención; (ii) obtener del clon de células B ácido nucleico que codifica el anticuerpo de interés. La invención también provee un método para obtener una secuencia de ácido nucleico que codifica un anticuerpo de interés, que comprende los pasos de: (i) preparar un clon de células B inmortalizado de conformidad con la invención; (ii) secuenciar ácido nucleico del clon de células B que codifica el anticuerpo de interés.

La invención también provee un método de preparación de molécula(s) de ácido nucleico que codifica un anticuerpo de interés, que comprende el paso de obtener el ácido nucleico de un clon de células B que se obtuvo de una célula B transformada de la invención. Por lo tanto, los procedimientos para obtener primero el clon de células B y después preparar el ácido(s) nucleico(s) del mismo se puede realizar en tiempos muy diferentes por diferentes personas en lugares diferentes (v.gr., diferentes países).

La invención provee un método para preparar un anticuerpo (v.gr., para uso farmacéutico), que comprende los pasos de: (i) obtener y/o secuenciar uno o más ácidos nucleicos (v.gr., genes de cadena pesada y ligera); (ii) usar la información de secuencia del paso (i) para preparar ácido(s) nucleico(s) para inserción en un hospedero de inserción a fin de permitir la expresión del anticuerpo de interés en ese hospedero; (iii) cultivar o sub-cultivar el hospedero de expresión bajo condiciones en donde el anticuerpo de interés es expresado; y opcionalmente (iv) purificar el anticuerpo de interés. El ácido nucleico puede, pero no necesita, ser obtenido y/o secuenciado de un clon de células B que expresa el anticuerpo de interés. En una modalidad, el ácido nucleico del paso (i) puede ser opcionalmente modificado para introducir sustituciones deseadas en la secuencia de aminoácidos del anticuerpo.

La invención también provee un método de preparación de un anticuerpo que comprende los pasos de: cultivar o sub-cultivar una población de células hospederas de expresión bajo condiciones en donde el anticuerpo de interés es expresado; y opcionalmente purificar el anticuerpo de interés, en donde dicha población de células hospederas de expresión ha sido preparada al (i) proveer ácido(s) nucleico(s) que codifica un anticuerpo de interés; (ii) insertar el ácido(s) nucleico(s) en un hospedero de expresión que puede expresar el anticuerpo de interés, y (iii) cultivar o sub-cultivar los hospederos de expresión que comprenden dichos ácidos nucleicos insertados para producir dicha población de células hospederas de expresión.

Composiciones farmacéuticas La invención provee una composición farmacéutica que contiene los anticuerpos y/o fragmentos de anticuerpo de la invención y/o ácido nucleico que codifica dichos anticuerpos y/o células B inmortalizadas que expresan dichos anticuerpos y/o los epítopes reconocidos por los anticuerpos de la invención. Una composición farmacéutica también puede contener un vehículo farmacéuticamente aceptable para permitir la administración. El vehículo no debe inducir la producción de anticuerpos nocivos para el individuo que recibe la composición y debe ser no tóxico. Vehículos adecuados pueden ser grandes, macromoléculas metabolizadas tales como proteínas, polipéptidos, liposomas, polisacáridos, ácidos polilácticos, ácidos poliglicólicos, aminoácidos poliméricos, copolímeros de aminoácido y partículas de virus inactivas.

Se pueden usar sales farmacéuticamente aceptables, por ejemplo sales de ácido mineral, tales como clorhidratos, bromhidratos, fosfatos y sulfatos, o sales de ácidos orgánicos, tales como acetatos, propionatos, malonatos y benzoatos.

Vehículos farmacéuticamente aceptables en composiciones terapéuticas pueden contener además líquidos tales como agua, solución salina, glicerol y etanol. Además, sustancias auxiliares tales como agentes humectantes o emulsionantes o sustancias reguladoras de pH, pueden estar presentes en dichas composiciones. Los vehículos permiten que las composiciones farmacéuticas sean formuladas como tabletas, pildoras, grageas, cápsulas, líquidos, geles, jarabes, pastas acuosas y suspensiones, para ser ingeridas por el paciente.

Dentro del alcance de la invención, las formas de administración pueden incluir aquellas formas adecuadas para administración parenteral v.gr., por inyección o infusión, por ejemplo, por inyección de bolo o infusión continua. En donde el producto es para inyección o infusión, puede adoptar la forma de una suspensión, solución o emulsión en un vehículo oleoso o acuoso y puede contener agentes de formulación, tales como agentes de suspensión, conservadores, estabilizadores y/o de dispersión. Alternativamente, la molécula de anticuerpo puede estar en forma seca, para reconstitución antes de usarse con un líquido estéril apropiado.

Una vez formuladas, las composiciones de la invención se pueden administrar directamente al sujeto. En una modalidad, las composiciones están adaptadas para administrarse a sujetos humanos.

Las composiciones farmacéuticas de esta invención se pueden administrar por cualquier número de vías incluyendo, pero sin limitarse a vías oral, intravenosa, intramuscular, intra-arterial, ¡ntramedular, intraperitoneal, intratecal, intraventricular, transdérmica, transcutánea, tópica, subcutánea, intranasal, enteral, sublingual, intravaginal o rectal. Las hipoaspersiones también se pueden usar para administrar las composiciones farmacéuticas de la Invención. Típicamente, las composiciones terapéuticas se pueden preparar como soluciones o suspensiones inyectables, ya sea soluciones o suspensiones líquidas. También se pueden preparar formas sólidas adecuadas para solución en, o suspensión en, vehículos líquidos antes de la inyección.

El suministro directo de las composiciones generalmente se logrará por inyección, subcutánea, intraperitoneal, intravenosa o intramuscular, o se suministrará el espacio intersticial de un tejido. El tratamiento de dosis puede ser un programa de una sola dosis o un programa de dosis múltiples. Los agentes farmacéuticos a base de anticuerpo conocidos proveen una guía relacionada con la frecuencia de administración, v.g., ya sea que un agente farmacéutico se administre diariamente, semanalmente, mensualmente, etc. La frecuencia y dosis también pueden depender de la severidad de los síntomas.

Las composiciones de la invención se pueden preparar de varias formas. Por ejemplo, las composiciones se pueden preparar como soluciones o suspensiones inyectables, ya sea como soluciones o suspensiones líquidas. Las formas sólidas adecuadas para solución o suspensión en vehículos líquidos antes de la inyección también se pueden preparar (v.gr., una composición liofilizada, como Synagis™ y Herceptin™, para reconstitución con agua estéril que contiene un conservador). La composición se puede preparar para administración tópica, v.gr., como una pomada, crema o polvo. La composición se puede preparar para una administración oral, v.gr., como una tableta o cápsula, como una aspersión, o como un jarabe (opcionalmente saborizado). La composición se puede preparar para administración pulmonar, v.gr., como un inhalador, usando un polvo fino o una aspersión. La composición se puede preparar como un supositorio o pesario. La composición se puede preparar para administración nasal, aural u ocular v.gr., como gotas. La composición puede estar en forma de kit, diseñado de tal manera que una composición combinada sea reconstituida inmediatamente antes de administrarse a un paciente. Por ejemplo, un anticuerpo liofilizado se puede proveer en forma de kit con agua estéril o un regulador de pH estéril.

Se apreciará que el ingrediente activo en la composición será una molécula de anticuerpo, un fragmento de anticuerpo o variantes y derivados del mismo. Como tal, será susceptible a degradación en el tracto gastrointestinal. Por lo tanto, si la composición ha de ser administrada por una vía que usa el tracto gastrointestinal, la composición necesitará contener agentes que protejan al anticuerpo contra degradación pero que libere el anticuerpo una vez que ha sido absorbido en el tracto gastrointestinal.

Una discusión completa de vehículos farmacéuticamente aceptables está disponible en Gennaro (2000) Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20a. edición, ISBN: 0683306472.

Las composiciones farmacéuticas de la invención generalmente tiene un pH entre 5.5 y 8.5, en algunas modalidades este puede ser entre 6 y 8, y en modalidades adicionales de aproximadamente 7. El pH se puede mantener mediante el uso de un regulador de pH. La composición puede ser estéril y/o libre de pirógenos. La composición puede ser isotónica con respecto a los humanos. En una modalidad, las composiciones farmacéuticas de la invención se suministran en contenedores herméticamente sellados.

Las composiciones farmacéuticas incluirán una cantidad terapéuticamente efectiva de uno o más anticuerpos de la invención y/o un péptido que comprende un epítope que se une a un anticuerpo de la invención, es decir, una cantidad que es suficiente para tratar, mitigar o prevenir una enfermedad o condición deseada, o para presentar un efecto terapéutico detectable. Los efectos terapéuticos también incluyen reducción en síntomas físicos. La cantidad efectiva precisa para cualquier sujeto particular dependerá del tamaño y salud, la naturaleza y grado de la condición, y los agentes terapéuticos o combinación de agentes terapéuticos seleccionados para administración. La cantidad efectiva para una situación dada se determina por experimentación de rutina y está dentro del juicio de un médico clínico. Para los propósitos de la presente invención, una dosis efectiva generalmente será de aproximadamente 0.01 mg/kg a aproximadamente 50 mg/kg, o aproximadamente 0.05 mg/kg a aproximadamente 10 mg/kg de las composiciones de la presente invención en el individuo al cual se administra. Los agentes farmacéuticos a base de anticuerpo conocidos proveen una guía a este respecto v.gr., Herceptin™ se administra por infusión intravenosa de una solución de 21 mg/ml, con una dosis de carga inicial de 4 mg/kg de peso corporal y una dosis de mantenimiento semanal de 2 mg/kg de peso corporal; Rituxan™ se administra semanalmente a 375 mg/m2; etc.

En una modalidad, las composiciones farmacéuticas pueden incluir más de un (v.gr., 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, etc.) anticuerpo de la invención. En otra modalidad, la composición comprende dos o más (v.gr., 2, 3, 4, 5, etc.) anticuerpos, en donde el primer anticuerpo es específico para un primer epítope DENV, y el segundo anticuerpo es específico para un segundo epítope DENV. En otra modalidad, la composición farmacéutica comprende tres anticuerpos de la invención. En otra modalidad, la composición comprende dos o más (v.gr., 2, 3, 4, 5, etc.) anticuerpos, que juntos neutralizan más de un serotipo de virus de dengue. En otra modalidad más, los dos o más anticuerpos de la invención juntos neutralizan todos los serotipos de virus de dengue, DENV-1 , DENV-2, DENV-3 y DENV-4. En una modalidad adicional, dos o más anticuerpos de la invención juntos neutralizan todos los serotipos de virus de dengue al unirse a por lo menos dos epítopes distintos en cada serotipo de virus de dengue.

Los anticuerpos ilustrativos de la invención para usarse en una composición farmacéutica que neutraliza un virus de dengue sin contribuir al incremento dependiente de anticuerpo de infección por virus de dengue incluyen pero no se limitan a, HMB-DV1 , HMB-DV2, HMB-DV3, HMB-DV4, H B-DV5, HMB-DV6, H B-DV7, HMB-DV8, HMB-DV9, HMB-DV10, HMB-DV11 , HMB-DV12, HMB-DV13, y HMB-DV14.

En una modalidad, una composición farmacéutica incluye dos anticuerpos ilustrativos de la invención, por ejemplo HMB-DV3 y HMB-DV7; HMB-DV3 y HMB-DV9; HMB-DV3 y HMB-DV12; HMB-DV3 y HMB-DV14; HMB-DV6 y HMB-DV7; HMB-DV6 y HMB-DV8. En otra modalidad, una composición farmacéutica incluye tres anticuerpos ilustrativos de la invención, por ejemplo, HMB-DV2, HMB-DV3 y H B-DV6; HMB-DV2, HMB-DV6 y HMB-DV8; HMB-DV2, HMB-DV8 y HMB-DV9; HMB-DV2, HMB-DV8 y HMB-DV12; HMB-DV2, HMB-DV8 y HMB-DV14; HMB-DV5, HMB-DV6 y HMB-DV8. Con base en las enseñanzas de la presente, un experto en la técnica puede determinar otras combinaciones de anticuerpos para usarse en una composición farmacéutica.

En una modalidad, la invención provee una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo HMB-DV1 o un fragmento de unión a antígeno del mismo, y un diluyente o vehículo farmacéuticamente aceptable. En otra modalidad, la invención provee una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo HMB-DV2 o un fragmento de unión a antígeno del mismo, y un diluyente o vehículo farmacéuticamente aceptable. En otra modalidad, la invención provee una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo HMB-DV3 o un fragmento de unión a antígeno del mismo, y un diluyente o vehículo farmacéuticamente aceptable. En otra modalidad, la invención provee una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo HMB-DV4 o un fragmento de unión a antígeno del mismo, y un diluyente o vehículo farmacéuticamente aceptable. En otra modalidad más, la invención provee una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo HMB-DV5 o un fragmento de unión a antígeno del mismo, y un diluyente o vehículo farmacéuticamente aceptable. En otra modalidad, la invención provee una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo HMB-DV6 o un fragmento de unión a antígeno del mismo, y un diluyente o vehículo farmacéuticamente aceptable. En otra modalidad, la invención provee una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo HMB-DV7 o un fragmento de unión a antígeno del mismo, y un diluyente o vehículo farmacéuticamente aceptable.

En otra modalidad más, la invención provee una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo HMB-DV8 o un fragmento de unión a antígeno del mismo, y un diluyente o vehículo farmacéuticamente aceptable. En otra modalidad, la invención provee una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo HMB-DV9 o un fragmento de unión a antígeno del mismo, y un diluyente o vehículo farmacéuticamente aceptable. En otra modalidad, la invención provee una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo HMB-DV10 o un fragmento de unión a antígeno del mismo, y un diluyente o vehículo farmecéuticamente aceptable. En otra modalidad más, la invención provee una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo HMB-DV11 o un fragmento de unión a antígeno del mismo, y un diluyente o vehículo farmecéuticamente aceptable. En otra modalidad, la invención provee una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo HMB-DV12 o un fragmento de unión a antígeno del mismo, y un diluyente o vehículo farmecéuticamente aceptable. En otra modalidad, la invención provee una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo HMB- DV13 o un fragmento de unión a antígeno del mismo, y un diluyente o vehículo farmecéuticamente aceptable. En otra modalidad más, la invención provee una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo HMB-DV14 o un fragmento de unión a antígeno del mismo, y un diluyente o vehículo farmecéuticamente aceptable.

Los anticuerpos de la invención se puede administrar (ya sea combinados o por separado) con otros agentes terapéuticos v.gr., con compuestos quimioterapéuticos, con radioterapia, etc. Los compuestos terapéuticos preferidos incluyen compuestos anti-virales. Dicha terapia de combinación provee un aditivo o mejora sinergística en eficacia terapéutica en relación con los agentes terapéuticos individuales cuando se administra solo. El término "sinergia" se usa para describir un efecto combinado de dos o más agentes activos que es mayor que la suma de los efectos individuales de cada agente activo respectivo. Por lo tanto, en donde el efecto combinado de dos o más agentes da por resultado "inhibición sinergística" de una actividad o proceso, se pretende que la inhibición de la actividad o proceso sea mayor que la suma de los efectos individuales de cada agente activo respectivo. El término "efecto terapéutico sinergístico" se refiere a un efecto terapéutico observado con una combinación de dos o más terapias en donde el efecto terapéutico (como se mide por cualquiera de un número de parámetros) es mayor que la suma de los efectos terapéuticos individuales observados con la terapia individual respectiva.

En composiciones de la invención que incluyen anticuerpos de la invención, los anticuerpos pueden constituir por lo menos 50% en peso (v.gr., 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% o más) del total de proteína en la composición. Los anticuerpos por lo tanto están en forma purificada.

La invención provee un método de preparación de un agente farmacéutico, que comprende los pasos de (i) preparar un anticuerpo de la invención; y (i¡) mezclar el anticuerpo purificado con uno o más vehículos farmacéuticamente aceptable.

La invención también provee un método de preparación de un agente farmacéutico, que comprende el paso de mezclar un anticuerpo con uno o más vehículos farmacéuticamente aceptable, en donde el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal que se obtuvo de una célula B transformada de la invención. Por lo tanto, los procedimientos para obtener primero el anticuerpo monoclonal y después preparar el agente farmacéutico se pueden realizar en tiempos muy diferentes por diferentes personas en lugares diferentes (v.gr., en países diferentes).

Como una alternativa a suministrar anticuerpos para propósitos terapéuticos, es posible suministrar ácido nucleico (típicamente ADN) que codifica el anticuerpo monoclonal (o fragmento activo del mismo) de interés a un sujeto, de tal manera que el ácido nucleico se pueda expresar en el sujeto in situ para proveer un efecto terapéutico deseado. La terapia de gen adecuada y los vectores de suministro de ácido nucleico son conocidos en la técnica.

Las composiciones de la invención pueden ser composiciones inmunogénicas, y en algunas modalidades pueden ser composiciones de vacuna que comprenden un antígeno que comprende un epítope de DENV. Vacunas de conformidad con la invención pueden ser ya sea profilácticas (es decir, para prevenir infección) o terapéuticas (es decir, para tratar infección).

Las composiciones pueden incluir un antimicrobiano, particularmente si se empacan en un formato de dosis múltiples. Las composiciones pueden comprender detergente v.gr., un Tween (polisorbato), tal como un Tween 80. Los detergentes están presentes generalmente a niveles bajos v.gr., <0.01%. Las composiciones pueden incluir sales de sodio (v.gr., cloruro de sodio) para dar tonicidad. Una concentración de 10+2 mg/ml de NaCI es típica.

Las composiciones pueden comprender un alcohol de azúcar (v.gr., manitol) o un disacárico (v.gr., sacarosa o trehalosa) v.gr., a alrededor de 15-30 mg/ml (v.gr., 25 mg/ml), particularmente si han de ser liofilizados o si incluye material que ha de ser reconstituido a partir de material liofilizado. El pH de una composición para liofilización se puede ajustar a alrededor de 6.1 antes de la liofilización.

Las composiciones de la invención también pueden comprender uno o más agentes inmunorreguladores. En una modalidad, uno o más agentes inmunorreguladores incluyen un adyuvante.

Tratamientos médicos y usos Los anticuerpos, fragmentos de unión a antígeno, derivados y variantes de los mismos, o el cóctel y composiciones farmacéuticas de la invención se pueden usar para el tratamiento de infección por DENV, para la prevención de infección por DENV o para el diagnóstico de infección por DENV.

Los métodos de diagnóstico pueden incluir poner en contacto un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo con una muestra. Dicha muestra puede ser muestras de tejido tomadas de, por ejemplo, glándulas salivales, pulmón, hígado, páncreas, riñon, oído ojos, placenta, tracto alimentario, corazón, ovarios, pituitaria, glándulas suprarrenales, tiroides, cerebro o piel. Los métodos de diagnóstico también pueden incluir la detección de un complejo de antígeno/anticuerpo.

La invención por lo tanto provee (i) un anticuerpo, un fragmento de anticuerpo o variantes de derivados de los mismos de conformidad con la invención, (ii) un clon de células B inmortalizadas de conformidad con la invención, (iii) un epítope capaz de unirse a un anticuerpo de la invención o (iv) un ligando, preferiblemente un anticuerpo, capaz de unir un epítope que se une a un anticuerpo de la invención para uso en terapia.

También se provee un método de tratamiento de un sujeto que comprende administrar a ese sujeto (i) un anticuerpo, un fragmento de anticuerpo, variantes y derivados de los mismos, o una composición farmacéutica de conformidad con la invención, o un ligando, preferiblemente un anticuerpo, capaz de unirse a un epítope que se une a un anticuerpo de la invención.

La invención también provee el uso de (i) un anticuerpo, un fragmento de anticuerpo o variantes y derivados de los mismos de conformidad con la invención, (ii) un clon de células B inmortalizadas de conformidad con la invención, (iii) un epítope capaz de unirse a un anticuerpo de la invención o (iv) un ligando, preferiblemente un anticuerpo, que se une a un epítope capaz de unirse a un anticuerpo de la invención, en la fabricación de un medicamento para la prevención o tratamiento de infección por DENV.

La invención provee una composición farmacéutica para usarse como un medicamento para la prevención o tratamiento de infección por DENV. También se provee el uso de un anticuerpo de la invención y/o una proteína que comprende un epítope al cual dicho anticuerpo se une en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de un paciente y/o diagnóstico en un paciente. También provee un método para tratar a un sujeto, v.gr., un sujeto humano. El método comprende el paso de administrar al sujeto una dosis terapéuticamente efectiva de una composición de la invención. Una manera de verificar de la eficacia del tratamiento terapéutico implica monitorear síntomas de enfermedad después de la administración de la composición de la invención. El tratamiento puede ser un programa de una sola dosis o un programa de dosis múltiples.

En una modalidad, un anticuerpo, fragmento de anticuerpo, variante de anticuerpo, epítope o composición farmacéutica de conformidad con la invención se administra a un sujeto que necesita dicho tratamiento. El sujeto incluye, pero no se limitan a, uno que está particularmente en riesgo de o que es susceptible de infección por DENV.

Los anticuerpos de la invención se pueden usar en inmunización pasiva. Los anticuerpos y fragmentos o variantes de los mismos, o un ácido nucleico que codifica un anticuerpo, o un fragmento o variante de anticuerpo como se describe en la presente invención, también se puede usar en un kit para el diagnóstico de infección por virus de dengue.

Epítopes capaces de unirse a un anticuerpo de la invención, v.gr., los anticuerpos monoclonales HMB-DV1 , HMB-DV2, HMB-DV3, HMB-DV4, HMB-DV5, HMB-DV6, H B-DV7, HMB-DV8, HMB-DV9, HMB-DV10, HMB-DV11 , HMB-DV12, HMB-DV13, y HMB-DV14, también se pueden usar en un kit para monitorear la eficacia de procedimientos de vacunación al detectar la presencia de anticuerpos anti-DENV protectores.

Anticuerpos, fragmentos de anticuerpo o variantes y derivados de los mismos, como se describe en la presente invención también se pueden usar en un kit para monitorear la fabricación de vacunas con la inmunogenicidad deseada.

La invención también provee un método para preparar una composición farmacéutica que comprende el paso de mezclar un anticuerpo monoclonal con uno o más vehículos farmacéuticamente aceptables, en donde el anticuerpo monoclonal es un anticuerpo monoclonal que se obtuvo de un hospedero de expresión de la invención. Por lo tanto, los procedimientos para obtener primero el anticuerpo monoclonal (v.gr., expresarlo y/o purificarlo) y después mezclarlo con el vehículo(s) farmacéutico se puede realizar en tiempos muy diferentes por diferentes personas en diferentes lugares (v.gr., en diferentes países).

Empezando con una célula B trasformada de la invención, varios pasos de cultivo, sub-cultivo, clonación, sub-clonación, secuenciación, reparación de ácido nucleico, etc., se pueden realizar a fin de perpetuar el anticuerpo expresado por la célula B transformada, con optimización opcional e cada paso. En una modalidad preferida, los métodos anteriores además comprenden técnicas para optimización (v.gr., maduración u optimización de afinidad) aplicadas a los ácidos nucleicos que codifican el anticuerpo. La invención abarca todas las células, ácidos nucleicos, vectores, secuencias, anticuerpos, etc., usados y preparados durante dichos pasos.

En todos estos métodos, el ácido nucleico usado en el hospedero de expresión puede ser manipulado para insertar, deletar o enmendar ciertas secuencias de ácido nucleico. Los cambios de dicha manipulación incluyen, pero no se limitan a, cambios para introducir sitios de restricción, para enmendar uso de codón, para añadir u optimizar secuencias reguladoras de transcripción y/o traducción, etc. También es posible cambiar los ácidos nucleicos para alterar los aminoácidos codificados. Por ejemplo, puede ser útil introducir una o más (v.gr., 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, etc.) sustituciones, deleciones o inserciones de aminoácidos en la secuencia de aminoácidos del anticuerpo. Dichas mutaciones puntuales pueden modificar las funciones efectuadas, afinidad de unión a antígeno, modificaciones post-traduccionales, inmunogenicidad, etc., pueden introducir aminoácidos para la unión de grupos covalentes (v.gr., marcadores) o pueden introducir etiquetas (v.gr., para propósitos de purificación). Las mutaciones también pueden ser introducidas en sitios específicos o pueden ser introducidas en forma aleatoria, seguido por selección (v.gr., evolución molecular). Por ejemplo, uno o más ácidos nucleicos que codifican cualquiera de las regiones CDR, regiones variables de cadena pesada o regiones variables de cadena ligera de anticuerpos de la invención pueden ser aleatoriamente o direccionalmente mutados para introducir diferentes propiedades en los aminoácidos codificados. Dichos cambios pueden ser el resultado de un proceso iterativo en donde los cambios iniciales son retenidos y nuevos cambios en otras posiciones de nucleótido son introducidas. Más aún, cambios logrados en pasos independientes pueden ser combinados. Diferentes propiedades introducidas en los aminoácidos codificados pueden incluir, pero no se limitan a. afinidad incrementada.

Aspectos generales El término "que comprende" abarca "que incluye" así como "que consiste de" v.gr., una composición "que comprende" X puede consistir exclusivamente de X o puede incluir algo adicional, v.gr., X + Y.

La palabra "sustancialmente" no excluye "completamente" v.gr., una composición que es "sustancialmente libre" de Y puede ser completamente libre de Y. En donde es necesario, la palabra "sustancialmente" puede ser omitida de la definición de la invención.

El término "aproximadamente" en relación con un valor numérico x significa, por ejemplo, x ± 10%.

El término "enfermedad", como se usa aquí, pretende ser generalmente sinónimo, y se usa indistintamente con los términos "trastorno" y "condición" (como en condición médica), ya que todo refleja una condición anormal del cuerpo humano o animal o de una de sus partes que altera el funcionamiento normal es típicamente manifestada por signos y síntomas distintivos, y hace que el humano o animal tenga una duración o calidad de vida reducida.

Como se usa aquí, la referencia a "tratamiento" de un paciente pretende incluir prevención y profilaxis así como terapia. El término "paciente" significa todos los mamíferos incluyendo humanos. Generalmente, el paciente es un humano.

EJEMPLOS Modalidades ilustrativas de la presente invención se proveen en los siguientes ejemplos.

Los siguientes ejemplos se presentan únicamente a manera de ilustración y para ayudar a un experto en la técnica a usar la invención. Los ejemplos no pretenden de ninguna manera limitar el alcance de la invención.

EJEMPLO 1 Clonación de células B y determinación selectiva para identificación de Abs específico de virus de dengue Células B de memoria se aislaron de la sangre de donadores inmunes a DENV y se inmortalizaron usando EBV y CpG como se describe en la referencia. En resumen, las células B de memoria lgG+ se aislaron usando esferas CD22, seguido por remoción de células B de lgM+, lgD+ lgA+ mediante el uso de anticuerpos específicos y distribución de células. Las células distribuidas (lgG+) fueron inmortalizadas con EBV en presencia de CpG 2006 y células mononucleares alogeneicas irradiadas. Los cultivos replicados que contenían cada uno 30-50 células B de memoria se colocaron en varias placas de 96 pozos con fondo en U. después de dos semanas los sobrenadantes de cultivo se colectaron y se probaron para su capacidad para teñir células C6/36 infectadas con DENV de serotipos 1 ,2,3 o 4 por análisis de inmunofluorescencia y/o para unirse a proteínas DENV1-4 E2 recombinantes por ELISA. Los sobrenadantes se probaron para su capacidad para neutralizar infección por DENV de células VERO o células Raji transfectadas con DC-SING y para incrementar la infección de células K562. Clones de células B se aislaron de cultivos policlonales positivos como se describió anteriormente [28]. Concentraciones de IgG en los sobrenadantes de clones seleccionados se determinan usando ELISA especifica de IgG.

EJEMPLO 2 mAbs humano de células B inmortalizadas reconocen proteínas de virus de dengue y neutralizan la infección Para la neutralización viral y prueba de incremento viral, cantidades tituladas de DENV atenuado de serotipos 1 , 2, 3 o 4 se mezclaron con un volumen igual de sobrenadantes de cultivo. Los virus y la multiplicidad de infección (MOI) usados fueron: rDEN1A30 (03JB186-1A+V2) MOI 0.04; rDEN2/4A30 (04JBV351-1A-V2) MOI 0.04; rDEN3/4A30 (DEN3#107C) MOI 0.02; rDEN4A30 (06JBV591-V3+1A1+v2) MOI 0.04. Después de una hora de incubación a temperatura ambiente, la mezcla se añadió a células objetivo (v.gr., células de VERO, células DC-SIGN-Raji o células K562) en placas de fondo plano de 96 pozos y se incubaron a 37°C durante 72-96 horas. Las células después se tiñeron con un anticuerpo monoclonal de ratón para proteínas 1-4 E de virus de dengue (clon 4G2), seguido por una Ig anti-ratón de cabra marcada con fluoresceína y analizada por FACS. El titulo neutralizante se indica como una concentración de anticuerpo (pg/ml) que da un 50% de reducción de infección por DENV.

Para la identificación de los antígenos objetivo reconocidos por anticuerpos monoclonales, levaduras que desplegaban dominios III o dominio l-ll de proteína de virus de dengue se tiñeron con los anticuerpos monoclonales seguido por anticuerpos IgG anti-humanos de cabra marcados con Cy5 y analizados por FACS. Se realizaron experimentos de Western blotting usando lisados de células infectadas por DENV.

El cuadro 3 muestra que tres diferentes tipos de anticuerpos han sido identificados. Estos incluyen aquellos que son específicos para el dominio III (DI 11) de la proteína E, aquellos que son específicos para los dominios l-ll (Dl-ll) de proteína E y aquellos específicos para prM. Los anticuerpos muestran diferentes grados de reactividad cruzada con los cuatro serotipos de DENV diferentes y neutralizan aquellos serotipos a los cuales se unen.

CUADRO 3 Especificidad de antígeno objetivo de anticuerpos anti-virus de dengue neutralizantes Serotipos de virus Anticuerpo Antígeno objetivo de dengue neutralizados HMB-DV-1 E, DIN 1 ,2,3 HMB-DV-2 E, Dlll 1 ,3 HMB-DV-3 prM 1 ,2,3,4 HMB-DV-4 E, Dl-ll 1 ,2,3,4 HMB-DV-5 E, Dl-ll 1 ,2,3,4 HMB-DV-6 E, Dlll 1 ,2,3 HMB-DV-7 E, Dlll 1 ,2,3 HMB-DV- 8 E 4 HMB-DV- 9 E, Dlll 2 HMB-DV-10 E, Dlll 1 ,2,3,4 HMB-DV-11 E, Dlll 1 ,2,3,4 HMB-DV-12 E, DI-DII 2 HMB-DV-13 E, Dlll 1 ,2,3,4 HMB-DV-14 E, Dlll 2 El cuadro 4 muestra los resultados de pruebas de neutralización virus sobre células VERO y células Raji transfectadas con DC-SING.

CUADRO 4 Neutralización de virus de dengue (serotipos DENV1-DENV4) por anticuerpos EJEMPLO 3 Anticuerpos anti-virus de dengue recombinantes neutralizantes con mutaciones en la región Fe no causan incremento de infección por virus sobre células K562 El incremento dependiente de anticuerpo (ADE) de infección por virus de dengue se ha descrito en la literatura. Esta propiedad podría limitar la efectividad terapéutica de anticuerpos anti-virus de dengue para uso en situaciones clínicas. Por lo tanto, ARNm de las líneas de células B inmortalizadas que expresan anticuerpos HMB-DV-5, HMB-DV-6 y HMB-DV-8 fueron aislados, ADNc fue sintetizado usando iniciadores específicos oligo-dT, regiones variables de cadena pesada y ligera fueron secuenciadas y clonadas en un vector de expresión usando iniciadores específicos. Los vectores fueron transfectados en células hospederas para expresión recombinante. Además de la producción recombinante de los anticuerpos lgG1 de tipo silvestre, cada una de las cadenas pesadas fue mutada en los aminoácidos 4 y 5 del dominio CH2 utilizando una alanina en lugar de la leucina natural usando mutagénesis dirigida al sitio creando así la variante LALA de cada anticuerpo. Tanto los anticuerpos recombinantes de tipo silvestre como mutados fueron cosechados de las líneas de células de expresión y purificados. Tanto el anticuerpo antivirus de dengue lgG1 de tipo silvestre como la variante LALA se unieron a la proteína objetivo de una manera comparable (no se muestran datos).

La neutralización e incremento del virus se determinó como antes sobre células VERO y células K562. Cada uno de los tres anticuerpos tiene un objetivo molecular definido así como objetivo de serotipo (véase cuadro3). La figura 1 muestra que los anticuerpos recombinantes no modificados neutralizan infección por virus objetivo de células VERO de una manera dependiente de la dosis (líneas punteadas). Sobre células K562, una línea de células que no es eficientemente infectada por virus de dengue, los anticuerpos no modificados muestran un incremento de infección viral a concentraciones que son generalmente más altas que aquellas requeridas para neutralización (líneas sólidas). El experimento se repitió usando variantes LALA de cada anticuerpo. La figura 2 muestra que cada una de las variantes LALA de los anticuerpos anti-virus de dengue recombinantes también neutralizaron el virus objetivo sobre células VERO (líneas punteadas) de una manera dependiente de la dosis. Sin embargo, cada uno de los anticuerpos LALA no mostró evidencia de incremento dependiente de anticuerpo de infección sobre células K562 (líneas sólidas). Cabe notar que la respuesta a la dosis es plana sobre las células K562 a las concentraciones de anticuerpos usadas en este experimento y la línea parece ser muy cercana al eje x.

Todas las patentes y publicaciones referidas aquí son incorporadas expresamente por referencia en su totalidad.

Cabe notar que hay formas alternativas de implementar la presente invención y que varias modificaciones se pueden hacer sin apartarse del alcance y esencia de la invención. Por consiguiente, las presentes modalidades se considera que son ilustrativas y no restrictivas, y la invención no está limitada a los detalles dados aquí, sino que pueden ser modificados dentro del alcance y equivalentes de las reivindicaciones anexas.

Referencias (los contenidos de las cuales son incorporados aquí por referencia) [I] Lefranc er a/. (2003) Dev Comp Immunol. 27(1):55-77. [2] Lefranc er a/. (1997) Immunology Today, 18:509. [3] Lefranc (1999) The Immunologist, 7:132-136. [4] US 4,676,980 [5] US 4,831 ,175 [6] US 5,595,721 [7] WO00/52031 [8] WO00/52473 [9] US 4,766,106 [10] US 4,179,337 [I I] US 4,495,285 [12] US 4,609,546 [13] Knauf et al. (1988) J. Bio. Chem. 263:15064-15070 [14] Gabizon et al. (1982) Cáncer Research 42:4734 [15] Cafiso (1981 ) Biochem Biophys Acta 649:129 [16] Szoka (1980) Ann. Rev. Biophys. Eng. 9:467 [17] Poznansky et al. (1980) Drug Delivery Systems (R.L. Juliano, ed., Oxford, N.Y.) pp. 253-315 [18] Poznansky (1984) Pharm Revs 36:277 [19] Kohler, G. and Milstein, C,. 1975, Nature 256:495-497. [20] Kozbar et al. 1983, Immunology Today 4:72. [21] WO2004/076677 [22] Capítulo 4 de Kuby Immunology (4a edición, 2000; ASIN: 07167333 5 [23] Jones et al. Biotechnol Prog 2003, 19(1 ): 163-8 [24] Cho et al. Cytotechnology 2001 ,37:23-30 [25] Cho et al. Biotechnol Prog 2003,19:229-32 [26] US 5,807,715 [27] US 6,300,104 [28] Traggiai et al. (2004) Nat Med 10(8):871-875

Claims

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES

1.- Un anticuerpo humano, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que neutraliza un virus de dengue, en donde el anticuerpo no contribuye a incremento dependiente de anticuerpo de infección por virus de dengue.

2. - El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 1 , o un fragmento de unión a antígeno del mismo, caracterizado además porque neutraliza un virus de dengue, en donde el anticuerpo comprende una mutación en la región Fe, y en donde la mutación reduce la unión del anticuerpo a un receptor de Fe.

3. - El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 1 ó 2, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, caracterizado además porque la región Fe del anticuerpo comprende una mutación CH2 L4A, una mutación CH2 L5A, o ambas.

4. - El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 1 ó 2, caracterizado además porque el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal o un anticuerpo recombinante.

5. - El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 1 ó 2, caracterizado además porque el anticuerpo neutraliza más de un virus de dengue de dos, tres o cuatro diferentes serotipos de virus de dengue.

6. - El anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-5, o un fragmento de unión a antigeno del mismo, caracterizado además porque comprende por lo menos una secuencia de región determinante de complementariedad (CDR) que tiene la secuencia de cualquiera de SEQ ID NOs: 1-6, 17-22, 33-38, 49-54, 67-72, 83-88, 99, 100, 105-110, 121-123, 124, 125, 135-139, 149, 153-158, 169-174, 185-188 O 189.

7. - El anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-6, o un fragmento de unión a antigeno del mismo, caracterizado además porque comprende: (i) una CDR1 de cadena pesada seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NOs: 1 , 17, 33, 49, 67, 83, 105, 121 , 135, 149, 153, 169 y 185; una CDR2 de cadena pesada seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NOs: 2, 18, 34, 50, 68, 84, 106, 122, 136, 154, 170 y 186; y una CDR3 de cadena pesada seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NOs: 3, 19, 35, 51 , 69, 85, 107, 123, 137, 155, 171 , y 187; o (ii) una CDR1 de cadena ligera seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NOs: 4, 20, 36, 52, 70, 86, 99, 108, 138, 156, 172 y 188; una CDR2 de cadena ligera seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NOs: 5, 21 , 37, 53, 71 , 87, 109, 124, 157 y 173; y una CDR3 de cadena ligera seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NOs: 6, 22, 38, 54, 72, 88, 100, 110, 125, 139, 158, 174 y 189.

8. - El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 7, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, caracterizado además porque comprende: (i) una cadena pesada que comprende SEQ ID NO: 1 para CDRH1 , SEQ ID NO: 2 para CDRH2, SEQ ID NO: 3 para CDRH3; SEQ ID NO: 17 para CDRH1 , SEQ ID NO: 18 para CDRH2 y SEQ ID NO: 19 para CDRH3; SEQ ID NO: 33 para CDRH1 , SEQ ID NO: 34 para CDRH2 y SEQ ID NO: 35 para CDRH3; SEQ ID NO: 49 para CDRH1 , SEQ ID NO: 50 para CDRH2 y SEQ ID NO: 51 para CDRH3; SEQ ID NO: 67 para CDRH1 , SEQ ID NO: 68 para CDRH2 y SEQ ID NO: 69 para CDRH3; SEQ ID NO: 83 para CDRH1 , SEQ ID NO: 84 para CDRH2 y SEQ ID NO: 85 para CDRH3; SEQ ID NO: 105 para CDRH1 , SEQ ID NO: 106 para CDRH2 y SEQ ID NO: 107 para CDRH3; SEQ ID NO: 121 para CDRH1 , SEQ ID NO: 122 para CDRH2 y SEQ ID NO: 123 para CDRH3; SEQ ID NO: 135 para CDRH1 , SEQ ID NO: 136 para CDRH2 y SEQ ID NO: 137 para CDRH3; SEQ ID NO: 149 para CDRH1 , SEQ ID NO: 136 para CDRH2 y SEQ ID NO: 137 para CDRH3; SEQ ID NO: 153 para CDRH1 , SEQ ID NO: 154 para CDRH2 y SEQ ID NO: 155 para CDRH3; SEQ ID NO: 169 para CDRH1 , SEQ ID NO: 170 para CDRH2 y SEQ ID NO: 171 para CDRH3; y SEQ ID NO: 185 para CDRH1 , SEQ ID NO: 186 para CDRH2 y SEQ ID NO: 187 para CDRH3; y/o (¡i) una cadena ligera que comprende SEQ ID NO: 4 para CDRL1 , SEQ ID NO: 5 para CDRL2; SEQ ID NO: 6 para CDRL3; SEQ ID NO: 20 para CDRL1 , SEQ ID NO: 21 para CDRL2; SEQ ID NO: 22 para CDRL3; SEQ ID NO: 36 para CDRL1 , SEQ ID NO: 37 para CDRL2; SEQ ID NO: 38 para CDRL3; SEQ ID NO: 52 para CDRL1 , SEQ ID NO: 53 para CDRL2; SEQ ID NO: 54 para CDRL3; SEQ ID NO: 70 para CDRL1 , SEQ ID NO: 71 para CDRL2; SEQ ID NO: 72 para CDRL3; SEQ ID NO: 86 para CDRL1 , SEQ ID NO: 87 para CDRL2; SEQ ID NO: 88 para CDRL3; SEQ ID NO: 99 para CDRL1 , SEQ ID NO: 53 para CDRL2; SEQ ID NO: 100 para CDRL3; SEQ ID NO: 108 para CDRL1 , SEQ ID NO: 109 para CDRL2; SEQ ID NO: 110 para CDRL3; SEQ ID NO: 70 para CDRL1 , SEQ ID NO: 124 para CDRL2; SEQ ID NO: 125 para CDRL3; SEQ ID NO: 138 para CDRL1 , SEQ ID NO: 109 para CDRL2; SEQ ID NO: 139 para CDRL3; SEQ ID NO: 156 para CDRL1 , SEQ ID NO: 157 para CDRL2; SEQ ID NO: 158 para CDRL3; SEQ ID NO: 172 para CDRL1 , SEQ ID NO: 173 para CDRL2; SEQ ID NO: 174 para CDRL3; y SEQ ID NO: 188 para CDRL1 , SEQ ID NO: 37 para CDRL2; SEQ ID NO: 189 para CDRL3.

9.- El anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, caracterizado además porque comprende: (i) una región variable de cadena pesada que tiene por lo menos 70% de identidad de secuencia a cualquiera de SEQ ID NOs: 13, 29, 45, 61, 65, 79, 95, 117, 131 , 145, 151 , 165, 181 o 195; y/o (ii) una región variable de cadena ligera que tiene por lo menos 70% de identidad de secuencia a cualquiera de SEQ ID NOs: 14, 30, 46, 62, 80, 96, 103, 118, 132, 146, 166, 182 ó 196.

10.- El anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, caracterizado además porque el anticuerpo comprende una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de cualquiera de SEQ ID NOs: 13, 29, 45, 61 , 65, 79, 95, 117, 131 , 145, 151 , 165, 181 ó 195, y en donde el anticuerpo comprende una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de cualquiera de SEQ ID NOs: 14, 30, 46, 62, 80, 96, 103, 118, 132, 146, 166, 182 ó 196.

11.- El anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, caracterizado además porque el anticuerpo comprende una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 13 y una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 14; o una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 29 y una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 30; o una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 45 y una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 46; o una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 61 y una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 62; o una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 65 y una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 62; o una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 79 y una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 80; o una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 95 y una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 96; o una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 95 y una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 103; o una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 117 y una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 118; o una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 131 y una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 132; o una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 145 y una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 146; o una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 151 y una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 146; o una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 165 y una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 166; o una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 181 y una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 182; o una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 195 y una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 196.

12. - El anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, o un fragmento de unión a antígeno del mismo caracterizado además porque el anticuerpo o anticuerpos se seleccionan del grupo que consiste de HMB-DV1 , H B-DV2, HMB-DV3, HMB-DV4, HMB-DV5, HMB-DV6, HMB-DV7, HMB-DV8, HMB-DV9, HMB-DV10, HMB-DV11 , HMB-DV12, HMB-DV13 y HMB-DV14.

13. - El anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, caracterizado además porque el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo de cadena sencilla, Fab, Fab', F(ab')2, Fv o scFv.

14. - Un anticuerpo aislado, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que se une al mismo epítope que el anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo neutraliza la infección por virus de dengue.

15. - Un anticuerpo aislado, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que compite en forma cruzada con el anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo neutraliza la infección por virus de dengue.

16. - Una molécula de ácido nucleico que comprende un polinucleótido que codifica el anticuerpo, o fragmentos de unión a antígeno del mismo, de cualquiera de las reivindicaciones anteriores.

17. - La molécula de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 16, caracterizada además porque la secuencia de polinucleótido es por lo menos 70% idéntica a las secuencias de ácido nucleico de SEQ ID NOs: 7-12, 15, 16, 23-28, 31 , 32, 39-44, 47, 48, 55-60, 63, 64, 66, 73-78, 81 , 82, 89-94, 97, 98, 101 , 102, 104, 111-116, 119, 120, 126-128, 129, 130, 133, 134, 140-143, 144, 147, 148, 150, 152 159-164, 167, 168, 175-180, 183, 184, 190-193, 194, 197 y 198.

18. - Una célula que expresa el anticuerpo, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, de cualquiera de las reivindicaciones 1-15.

19.- Un clon de células B inmortalizadas que expresa el anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1-15.

20.- Un polipéptido inmunogénico aislado o purificado que comprende un epítope que se une al anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1-15.

21.- Una composición farmacéutica que comprende dos o más anticuerpos de cualquiera de las reivindicaciones 1-15, o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, en don de dichos anticuerpos, o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, colectivamente neutralizan serotipos de virus de dengue DENV-1, DENV-2, DENV-3 y DENV-4 al unirse a por lo menos dos epítiopes distintos en cada serotipo de virus de dengue, y en donde los anticuerpos no contribuyen a incremento dependiente de anticuerpo de infección por virus de dengue.

22.- Una composición farmacéutica que comprende por lo menos un anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1-15, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, el ácido nucleico de la reivindicación 16 o reivindicación 17, o el polipéptido inmunogénico de la reivindicación 20, y un diluyente o vehículo farmacéuticamente aceptable y, opcionalmente, un agente útil para extender la vida media del anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo.

23 - La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 21 , caracterizada además porque comprende un diluyente o vehículo farmacéuticamente aceptable y, opcionalmente, un agente útil para extender la vida media del anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo.

24. - La composición farmacéutica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 21-23, caracterizada además porque comprende un primer anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo, específico para un primer epítope, y un segundo anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo, específico para un segundo epítope.

25. - El uso de por lo menos un anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, como se reclama en cualquiera de las reivindicaciones 1-15, o la composición de cualquiera de las reivindicaciones 21-24 en la preparación de un medicamento para inhibir la infección por virus de dengue o una enfermedad relacionada con virus de dengue en un sujeto que necesita el mismo.

26. - El uso como se reclama en la reivindicación 25, en donde dicho medicamento está adaptado para ser administrable con un segundo agente terapéutico.

27. - El uso como se reclama en la reivindicación 26, en donde dicho segundo agente terapéutico es un agente anti-viral.

28. - El uso de: un primer anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, como se reclama en cualquiera de las reivindicaciones 1-15, específico para un primer epítope, y un segundo anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, específico para un segundo epítope diferente, en la preparación de un medicamento para inhibir la infección por virus de dengue o una enfermedad relacionada con virus de dengue en un sujeto que necesita el mismo.

29. - El uso de un anticuerpo monoclonal, purificado, neutralizante, humano, o fragmento de anticuerpo del mismo, como se reclama en cualquiera de las reivindicaciones 1-15, o la composición farmacéutica de cualquiera de las reivindicaciones 21-24, en la preparación de un medicamento para el tratamiento de infección por virus de dengue o una enfermedad relacionada con virus de dengue en un sujeto.

30. - El uso como se reclama en la reivindicación 29, en donde dicho medicamento está adaptado para ser administrable con dos o más de los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos.

31. - Un método de determinación selectiva para polipéptidos que puede inducir una respuesta inmunológica contra virus de dengue, que comprende determinar selectivamente genotecas de polipéptido usando el anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, de cualquiera de las reivindicaciones 1-15.

32. - Un método de monitoreo de la calidad de vacunas de virus anti-dengue, que comprende el uso del anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, de cualquiera de las reivindicaciones 1-15 para verificar que el antígeno de dicha vacuna contenga el epítope específico en la conformación correcta.

33. - Una vacuna que comprende un epítope que se une específicamente al anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, de cualquiera de las reivindicaciones 1-15.

34. - El uso del anticuerpo como se reclama en cualquiera de las reivindicaciones 1-15, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, el ácido nucleico de la reivindicación 16 o reivindicación 17, el polipéptido inmunogénico de la reivindicación 20, o la composición farmacéutica de cualquiera de las reivindicación 21-24 en una vacuna.

35. - El uso del anticuerpo como se reclama en cualquiera de las reivindicaciones 1-15, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, para monitorear la calidad de vacunas de virus anti-dengue al verificar que el antígeno de dicha vacuna contenga el epítope específico en la conformación correcta.

36.- Un epítope que se une específicamente al anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1-15, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, para su uso (i) en la fabricación de un medicamento para tratar infección por virus de dengue, (ii) como una vacuna, o (iii) en la determinación selectiva para ligandos capaces de neutralizar la infección por virus de dengue.