BRPI0914012A2

BRPI0914012A2 - anticorpo humano, composição farmacêutica, molécula de ácido nucléico, célula, clone de célula b imortalizado, polipeptídeo imunogênico isolado ou purificado, método de inibição da infecção pelo vírus da dengue. método de tratamento da infecção pelo vírus da dengue, método de triagem de polipeptídeos, método monitoramento da qualidade das vascinas contra o vírus da dengue, vacina, uso do anticorpo e epítopo

Info

Publication number: BRPI0914012A2
Application number: BRPI0914012-3A
Authority: BR
Inventors: Antonio Lanzavecchia
Original assignee: Institute For Research In Biomedicine
Priority date: 2008-10-13
Filing date: 2009-10-13
Publication date: 2021-02-23
Also published as: CA2739551A1; AU2009305113A1; WO2010043977A2; BRPI0914012B1; CA2739551C; AU2009305113B2; JP2016020334A; CN108610416A; US9073981B2; EP2334700A2; MX2011003588A; US20120020957A1; CN102272155A; JP5814790B2; CN102272155B; WO2010043977A3; JP2012504955A; NZ592054A; EP2334700B1; CN108610416B

Abstract

ANTICORPOS NEUTRALIZANTES DO VÍRUS DA DENGUE E USOS DESTES. A invenção refere-se a anticorpos e fragmentos de ligação a antígeno destes e a coquetéis de anticorpos e fragmentos de ligação a antígeno que neutralizam a infecção pelo vírus da dengue sem contribuir para o aumento da infecção pelo vírus da dengue dependente do anticorpo. A invenção também refere-se a células b imortalizadas que produzem os, e a epítopos que se ligam aos, referidos anticorpos e fragmentos de ligação a antígeno. Além disso, a invenção refere-se ao uso dos anticorpos, fragmentos de ligação a antígeno, e epítopos em métodos de triagem, bem como no diagnóstico e terapia da infecção pelo vírus da dengue .

Description

, 1/58 ANTICORPO HUMANO, COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, MOLÉCULA DE ÁCIDO NUCLÉICO, CÉLULA, CLONE DE CÉLULA B IMORTALIZADO, POLIPEPTÍDEO IMUNOGÊNICO ISOLADO OU PURIFICADO, MÉTODO DE ' INIBIÇÃO DA INFECÇÃO PELO VÍRUS DA DENGUE, MÉTODO DE TRATAMENTO DA INFECÇÃO PELO VÍRUS DA DENGUE, MÉTODO DE ] TRIAGEM DE POLIPEPTÍDEOS , MÉTODO DE MONITORAMENTO DA QUALIDADE DAS VACINAS CONTRA O VÍRUS DA DENGUE, VACINA, USO

DO ANTICORPO E EPÍTOPO Este pedido reivindica prioridade para o Pedido Provisório Norte-amerícano Nº de Série 61/104,911, intitulado “Anticorpos Neutralizantes do Vírus da Dengue e Uso Destes”, depositado em 13 de outubro de 2008, o qual é aqui incorporado por referência na íntegra.

HISTÓRICO Os vírus da dengue (DENV) são patógenos humanos que representam uma ameaça significativa à saúde mundial. Estima- se que esses vírus causem centenas de milhares de casos de dengue, dengue hemorrágica e síndrome do choque da dengue por ano. Há quatro sorotipos intimamente relacionados do vírus da dengue, DENV-1, DENV-2, DENV-3 e DENV-4, do gênero Flavivirus. Os quatro vírus se disseminam entre os humanos por meio da picada do Aedes aegypti, uma espécie de mosquito altamente urbanizado que resistiu com sucesso a todas as tentativas de erradicação e controle. A vacinação é considerada o único método eficaz de controle da dengue. Para tanto, várias vacinas tetravalentes candidatas para combater a dengue estão nos últimos estágios de desenvolvimento. . Uma primeira infecção com um sorotipo do vírus da dengue induz uma imunidade protetora contra o Sorotipo “30 homólogo para O resto da vida. No entanto, não há proteção cruzada contra a infecção por um sorotipo diferente. De fato, a imunidade pré-existente contra um sorotipo está relacionada ao maior risco de infecção por dengue e dengue hemorrágica | causada por um sorotipo diferente devido ao aumento da infecção dependente do anticorpo (ADE). No ADE, os anticorpos formados antes da infecção pela dengue ou passivamente " transferidos da mãe, formam complexos imunes infecciosos que se ligam às células contendo o receptor de Fc na linhagem fagocítica mononuclear, resultando em uma infecção eficiente. Por esse motivo, existe a necessidade de materiais e métodos para a prevenção da infecção pelo vírus da dengue sem aumentar o risco de aumento da infecção dependente do anticorpo.

SUMÁRIO A invenção tem como base, em partes, a descoberta de anticorpos e coquetéis de anticorpos que neutralizam a infecção pelo vírus da dengue sem contribuir para o aumento da infecção pelo vírus da dengue dependente do anticorpo. Assimy em um aspecto da invenção, esta compreende um anticorpo humano, uma variante de anticorpo ou um fragmento de ligação do antígeno do mesmo, que neutralizam um vírus da dengue, onde o anticorpo, à variante de anticorpo ou O fragmento de ligação a antígeno não contribui para o aumento da infecção pelo vírus da dengue dependente do anticorpo. Em uma configuração, a invenção compreende um anticorpo humano, uma variante de anticorpo ou um fragmento de ligação do antígeno do mesmo, que neutralizam um vírus da dengue, onde o anticorpo, a variante de anticorpo ou o fragmento de ligação a antígeno compreende uma mutação na região Fc, e onde a mutação reduz a ligação do anticorpo à um receptor de Fc. 7 Em outra configuração da invenção, esta compreende uma composição farmacêutica compreendendo dois ou mais “30 anticorpos humanos, ou fragmentos de ligação a antígeno destes. Os anticorpos ou os fragmentos de ligação a antígeno neutralizam os sorotipos do vírus da dengue DENV-1, DENV-2, ' DENV-3 e DENV-4 pela ligação de pelo menos dois epítopos | distintos em cada sorotipo do vírus da dengue. Os anticorpos da composição farmacêutica não contribuem para o aumento da infecção pelo vírus da dengue dependente do anticorpo. " Ainda, em outra configuração, a invenção compreende um anticorpo, ou um fragmento de ligação do antígeno do ] mesmo, compreendendo pelo menos uma sequência de região de determinação de complementaridade (CDR) tendo a sequência de qualquer um dos Nº de ID de SEQ: 1-6, 17-22, 33-38, 49-54, 67-72, 83-88, 99, 100, 105-110, 121-123, 124, 125, 135-139, 149, 153-158, 169-174, 185-188, ou 189, onde o anticorpo neutraliza a infecção pelo vírus da dengue.

Ainda, em outra configuração, a invenção compreende um anticorpo, ou um fragmento de ligação do antígeno do mesmo, onde o anticorpo compreende uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácido do ID de SEQ Nº: 13 e uma região variável de cadeia leve compreendendo a seqúiência de aminoácido do ID de SEQ Nº: 14; ou uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácido do ID de SEQ Nº: 29 e uma região variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácido do ID de SEQ Nº: 30; ou uma região variável de cadeia pesada compreendendo à sequência de aminoácido do ID de SEQ Nº: 45 e uma região variável de cadeia leve compreendendo a seqúência de aminoácido do ID de SEQ Nº: 46; ou uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácido do ID de SEQ Nº: 61 e uma região variável de cadeia leve compreendendo a sequência de 7 aminoácido do ID de SEQ Nº: 62; ou uma região variável de cadeia pesada compreendendo. a sequência de aminoácido do ID “30 de SEQ Nº: 65 e uma região variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácido do ID de SEQ Nº: 62; ou uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácido do ID de SEQ Nº: 79 e uma região | variável de cadeia leve compreendendo a seqgúência de aminoácido do ID de SEQ Nº: 80; ou uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácido do ID 7 de SEQ Nº: 95 e uma região variável de cadeia leve compreendendo a seqúência de aminoácido do ID de SEQ Nº: 96; Ú ou uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácido do ID de SEQ Nº: 95 e uma região variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácido do ID de SEQ Nº: 103; Ou uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácido do ID de SEQ Nº: 117 e uma região variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácido do ID de SEQ Nº: 118; ou uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácido do ID de SEQ Nº: 131 e uma região variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácido do ID de SEQ Nº: 132; Ou uma região variável de cadeia pesada compreendendo a seqúência de amincácido do ID de SEQ Nº: 145 e uma região variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácido do ID de SEQ Nº: 146; ou uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácido do ID de SEQ Nº: 151 e uma região variável de cadeia leve compreendento a sequência de aminoácido do ID de SEQ Nº: 146; ou uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de amincácido do ID de SEQ Nº: 165 e uma região variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácido do ID de SEQ Nº: 166; ou uma região variável de cadeia pesada compreendendo a = sequência de aminoácido do ID de SEQ Nº: 181 e uma região variável de cadeia leve compreendendo a sequência de “30 aminoácido do ID de SEQ Nº: 182; Ou uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácido do ID de SEQ Nº: 195 e uma região variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácido do ID de SEQ Nº: 196,

| onde o anticorpo neutraliza a infecção pelo vírus da dengue.

Em uma outra configuração, a invenção compreende um anticorpo recombinante, uma variante de anticorpo ou um ' fragmento de ligação do antígeno do mesmo, que podem neutralizar um vírus da dengue.

O anticorpo recombinante, uma : variante de anticorpo ou um fragmento de ligação a antígeno não contribuem para o aumento da infecção pelo vírus da dengue dependente do anticorpo.

Em outro aspecto, a invenção compreende uma molécula de ácido nucléico compreendendo um polinucleotídeo que codifica um anticorpo ou fragmento de anticorpo da invenção que neutraliza a infecção pelo vírus da dengue.

Ainda, em outro aspecto, a invenção compreende uma célula que expressa um anticorpo da invenção.

Ainda, em outro aspecto, a invenção compreende um polipeptídeo imunogênico isolado ou purificado compreendendo um epítopo que se liga a um anticorpo da invenção. ' A invenção também compreende uma composição i farmacêutica compreendendo um anticorpo, uma variante de anticorpo ou um fragmento de ligação a antígeno da invenção, um ácido nucléico da invenção, ou um polipeptídeo imunogênico da invenção e um diluente ou veículo farmaceuticamente aceitável e, opcionalmente, um agente útil para aumentar a meia-vida do anticorpo ou fragmento de ligação do antígeno do mesmo.

Em outro aspecto da invenção, esta provê um método de inibição ou prevenção de infecção pelo vírus da dengue ou ] de uma doença relacionada ao vírus da dengue ou um método de tratamento de infecção pelo vírus da dengue ou de uma doença “30 relacionada ao vírus da dengue.

O método compreende administrar, a um indivíduo em necessidade, uma quantidade terapeuticamente eficaz de pelo menos um anticorpo, uma variante de anticorpo, um fragmento de ligação a antígeno, ou | uma composição farmacêutica da invenção. Ainda, em outro aspecto da invenção, esta compreende um método de triagem de polipeptídeos que podem 7 induzir ou revelar uma resposta imune contra o vírus da dengue, compreendendo a triagem de bibliotecas de ] polipeptídeos utilizando um anticorpo, um fragmento de anticorpo ou uma variante da invenção.

Ainda, em outro aspecto da invenção, esta compreende um método de monitoramento da qualidade das vacinas contra o vírus da dengue. O método compreende o uso de um anticorpo, uma variante de anticorpo ou um fragmento de ligação do antígeno do mesmo de acordo com a invenção para verificar se o antígeno da vacina contém o epítopo específico na conformação correta.

Em um outro aspecto, a invenção compreende uma vacina compreendendo um epítopo que se liga especificamente a um anticorpo, um fragmento de anticorpo ou uma variante da invenção.

O uso de um anticorpo da invenção, ou um fragmento de ligação do antígeno do mesmo, um ácido nucléico da invenção, um polipeptídeo imunogênico da invenção, ou uma composição farmacêutica da invenção (i) na produção de um medicamento para o tratamento de infecção pelo vírus da dengue, (ii) em uma vacina, ou (iii) no diagnóstico de infecção pelo vírus da dengue, também é considerado como parte do escopo da invenção. Além disso, Oo uso de um anticorpo da invenção, ou um fragmento de ligação do antígeno " do mesmo, para o monitoramento da qualidade das vacinas anti- DENV verificando-se se o antígeno da referida vacina contém O epítopo específico na conformação correta, também é considerado como parte do escopo da invenção. Em um outro aspecto, a invenção compreende um epítopo que se liga especificamente a um anticorpo de | qualquer anticorpo da invenção, ou um fragmento de ligação do antígeno do mesmo, para uso (i) em terapia, (ii) na produção de um medicamento para o tratamento de infecção pelo vírus da : dengue, (iii) como uma vacina, ou (iv) na triagem de ligantes capazes de neutralizar a infecção pelo vírus da dengue.

' BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS Figura 1. células VERO e células K562 foram utilizadas em ensaios de neutralização e aumento viral com cada sorotipo do vírus da dengue utilizando anticorpos do tipo selvagem contra o vírus da dengue. Os anticorpos contra o vírus da dengue inibem a infecção do vírus-alvo em células VERO de uma forma dependente da dose. Em células K562, os anticorpos levam a um aumento da infecção dependente do anticorpo (ADE) e dependente da dose.

Figura 2. Anticorpos contra o vírus da dengue que possuem uma substituição CH2 L4A e L5A (variantes LALA) na cadeia pesada neutralizam a infecção pelo vírus-alvo em cêlulas VERO assim como os anticorpos não modificados. No entanto, as variantes LALA eliminam completamente o aumento da infecção dependente do anticorpo pelo vírus-alvo em células K562,

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO A invenção tem como base a descoberta de anticorpos e coquetéis de anticorpos que neutralizam a infecção pelo vírus da dengue (DENV) sem contribuir para o aumento da infecção pelo vírus da dengue dependente do anticorpo (ADE). Em um aspecto da invenção, esta compreende um anticorpo ' humano, uma variante de anticorpo ou um fragmento de ligação do antígeno do mesmo, que neutraliza um vírus da dengue sem “30 contribuir para o aumento da infecção pelo vírus da dengue dependente do anticorpo. Os anticorpos Ou fragmentos de anticorpos podem neutralizar mais que um sorotipo do vírus da dengue, por exemplo, 2, 3 ou todos os 4 sorotipos do vírus da |

' dengue DENV-1, DENV-2, DENV-3 e DENV-4,. A invenção também compreende uma composição farmacêutica compreendendo, por exemplo, um coquetel de : anticorpos que compreende dois ou mais anticorpos humanos, variantes de anticorpos ou fragmentos de ligação a antígeno ' destes.

As composições farmacêuticas da invenção compreendendo um coquetel de anticorpos humanos, fragmentos de anticorpos ou variantes neutralizam todos os quatro sorotipos do vírus da dengue, a saber, DENV-1, DENV-2, DENV-3 e DENV-4. Em uma configuração, o coquetel de anticorpos, os fragmentos de anticorpos ou variantes neutralizam o vírus da dengue pela ligação de pelo menos dois epítopos distintos em cada sorotipo do vírus da dengue.

Observa-se que oS anticorpos, as variantes e os fragmentos da composição farmacêutica não contribuem para o aumento da infecção pelo vírus da dengue dependente do anticorpo.

Em uma configuração, o coquetel compreende dois anticorpos, fragmentos Ou variantes destes.

Em outra configuração, o coquetel compreende três anticorpos, fragmentos ou variantes destes, Ainda, em outra configuração, o coquetel compreende mais que 3 anticorpos, por exemplo, 4, 5, 6, 7 ou 8 anticorpos.

Conforme aqui utilizados, os termos “fragmento”, “fragmento de anticorpo” e “fragmento de ligação a antígeno” são utilizados de forma intercambiável para se referir a qualquer fragmento de um anticorpo da invenção que mantenha a atividade de ligação a antígeno do anticorpo.

Exemplos de fragmentos de anticorpos incluem, entre outros, fragmentos " Fab, Fab', F(ab'),, Fv e scFv.

Os termos “mutação” e “substituição” são utilizados “30 de forma intercambiável para se referir a uma alteração em um ou mais resíduos de ácido nucléico ou aminoácido.

Conforme aqui utilizados, os termos “variante” e “variante de anticorpo” são utilizados de forma | intercambiável para se referir a qualquer variante de um anticorpo da invenção que mantenha a atividade de ligação a antígeno dos anticorpos. O termo variante inclui anticorpos ' que compreendem mutações e/ou substituições. Exemplos de variantes de anticorpos incluem, entre outros, aqueles que ' possuem uma substituição L a A na posição CH2 4, 5, ou em ambas.

Anticorpos da invenção A invenção provê anticorpos que neutralizam o vírus da dengue, porém que não contribuem para a ADE de infecção pelo vírus da dengue. Um “anticorpo neutralizante” é aquele que pode neutralizar a capacidade de um patógeno de iniciar e/ou perpetuar uma infecção em um hospedeiro. Os anticorpos da invenção são capazes de neutralizar um ou mais sorotipos do vírus da dengue DENV-1, DENV-2, DENV-3 e DENV-4. Em uma configuração, o anticorpo da invenção neutraliza mais que um, por exemplo, 2, 3, ou todos os 4 sorotipos do vírus da dengue. Em outra configuração, a composição farmacêutica compreendendo dois ou mais anticorpos, fragmentos —de anticorpos ou variantes podem neutralizar todos os 4 sorotipos do vírus da dengue. Ainda, em outra configuração, a composição farmacêutica compreendendo dois ou mais anticorpos, fragmentos de anticorpos ou variantes, neutraliza a infecção pelo vírus da dengue ao visar dois epítopos distintos em cada sorotipo do vírus da dengue. Esses anticorpos, fragmentos de ligação a antígeno e variantes, podem ser utilizados como agentes profiláticos ou 7 terapêuticos quando em uma formulação adequada, ou como uma ferramenta de diagnóstico, conforme aqui descrito.

Os anticorpos da invenção podem ser monoclonais, por exemplo, anticorpos monoclonais humanos, ou anticorpos recombinantes. A invenção também provê fragmentos dos anticorpos da invenção, particularmente fragmentos que mantêm | a atividade de ligação a antígeno dos anticorpos.

Embora a especificação, incluindo as reivindicações, possa, em alguns locais, se referir explicitamente ao(s) fragmento(s), 7 variante(s) e/ou derivados(s) de anticorpo(s), fica entendido que o termo “anticorpo” ou “anticorpo da invenção" inclui ' todas as categorias de anticorpos, a saber, fragmento(s) de anticorpo(s), variante(s) e derivados(s) de anticorpos.

Sem ficar preso a qualquer teoria, acredita-se que o aumento da infecção pelo vírus da dengue dependente do anticorpo é causado pela ligação da região Fc do anticorpo, em particular, a região Fc da cadeia pesada de uma molécula de IgG, a um receptor de Fc, por exemplo, um receptor Fcy em uma célula hospedeira.

A invenção, por outro lado, provê anticorpos, incluindo moléculas de IgG, que possuem ligação reduzida aos receptores de Fc (FcR). Em uma configuração, o anticorpo da invenção compreende uma Ou mais mutações na região Fc, A mutação (ou mutações) pode ser qualquer mutação que reduza a ligação do anticorpo a um receptor de Fc.

Em uma configuração, a região Fc de um anticorpo da invenção compreende uma substituição nas posições CH2 4, 5, ou em ambas.

De modo geral, o aminoácido na posições 4 e 5 de CH2 do IgG1 e IgG3 do tipo selvagem é uma leucina (“L”). Em uma configuração, os anticorpos da invenção compreendem um aminoácido na posição CH2 4, 5, ou em ambas, que não seja uma L.

Em outra configuração, os anticorpos da invenção compreendem uma alanina (“A”) na posição CH2 4, ou 5, ou em ambas.

Um anticorpo compreendendo uma substituição CH2 L4A e

7 uma L5A é aqui denominado variante “LALA”. Alternativamente, a invenção provê fragmentos de “30 anticorpos que não compreendem uma região Fc e, assim, não se ligam a um FCR.

Exemplos de fragmentos de anticorpos incluem, entre outros, Fab, Fab', F(ab'),», Fv e scFv.

As sequências das cadeias pesadas e das cadeias | leves de vários exemplos de anticorpos da invenção, cada um compreendendo três CDRs na cadeia pesada e três CDRs na cadeia leve, foram determinadas.

A posição dos aminoácidos " CDR é definida de acordo com o sistema de numeração IMGT [1, 2, 3). As sequências das CDRs, das cadeias pesadas, das cadeias leves, bem como as sequências das moléculas de ácido nucléico que codificam as CDRs, as cadeias pesadas, as cadeias leves de vários exemplos de anticorpos da invenção são reveladas na listagem de sequências.

A Tabela 1 mostra os IDs de SEQ Nº da seqúência de aminoácidos das seis CDRs, da região variável das cadeias pesadas e leves, respectivamente, de exemplos de anticorpos da invenção.

A Tabela 2 mostra os IDs de SEQ Nº das sequências das moléculas de ácido nucléico que codificam as CDRs, as cadeias pesadas e as cadeias leves de exemplos de anticorpos da invenção.

Tabela 1. IDs de SEQ de Aminoácidos para CDRs de Anticorpo, Cadeias Pesada e Leve Região Região Anticorpo CDRs | variável de | variável de cadeia pesada cadeia leve mMB-DV-2 [17-22 a ao |EMB-DV-3 [33-38 as fas [EMB-DV-4 [49-54 ===> 61, 65 62 | EMB-DV-5 | 67r7a ra | [AMB-DV-6 [eae 5 [Be 83-85, 99, 1205-110 121-123, 70 : 135-139, 109 AMB-DV-11|/249: 1236-139, 157 146 109 - 153-158 169-174 185-188, 37. Tabela 2. IDs de SEQ de Ácido Nucléico para CDRs de |

Anticorpo, Cadeias Pesada e Leve Região Região Anticorpo | CDRs variável de | variável de cadeia pesada |cadeia leve ' HMB-DV-1 EMB-DV-2 [23-28 [BR [32 : EMB-DV-3 [39-44 [47 [48 AMB-DV-4 |55-60 ——>>—JS63, 66 la | HMB-DV-5. [73-78 Bo BB HMB-DV-6 | 89-94 Br BE 89-91, 101, AMB-DV-6 [1112-116 1126-128, HMB-DV-9 76, 129, | 133 134 130 140-143, 150, 141- HMB-DV-11 | 143, 115, | 152 148 144 HMB-DV-12 |159-164 HMB-DV-13 | 175-180 [Bar gg 190-193, Em uma configuração, os anticorpos ou fragmentos de ligação a antígeno da invenção compreendem uma ou mais CDRs de cadeias pesada ou leve dos exemplos de anticorpos da invenção. EM um exemplo de configuração, os anticorpos ou fragmentos de ligação a antígeno da invenção neutralizam a infecção pelo vírus da dengue e compreendem pelo menos uma sequência de CDR tendo a sequência de qualquer um dos Nº de ID de SEQ: 1-6, 17-22, 33-38, 49-54, 67-72, 83-88, 99, 100, 105-110, 121-123, 124, 125, 135-139, 149, 153-158, 169-174, 185-188, ou 189.

] Em outra configuração, os anticorpos, variantes de . anticorpos ou fragmentos de ligação a antígeno da invenção compreendem uma cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácido de um ou mais dos IDs de SEQ Nº: 1-3, 17-19, 33- 35, 49-51, 67-69, 83-85, 1105-107, 121-123, 135-137, 149, 153- |

155, 169-171, ou 185-187, Ainda, em outra configuração, os anticorpos, variantes de anticorpos ou fragmentos de ligação a antígeno da invenção compreendem uma CDR1 de cadeia pesada í selecionada do grupo consistindo nos IDs de SEQ Nº: 1, 17, 33, 49, 67, 83, 105, 121, 135, 149, 153, 169, e 185; uma CDR2 ' de cadeia pesada selecionada do grupo consistindo nos IDs de SEQ Nº: 2, 18, 34, 50, 68, 84, 106, 122, 136, 154, 170, e 186; e uma CDR3 de cadeia pesada selecionada do grupo consistindo nos IDs de SEQ Nº: 3, 19, 35, 51, 69, 85, 107, 123, 137, 155, 171, e 187.

Por exemplo, os anticorpos da invenção compreendem uma cadeia pesada compreendendo o ID de SEQ Nº: 1 para CDRHI1, ID de SEQ Nº: 2 para CDRH2, ID de SEQ Nº: 3 para CDRH3; ID de SEQ Nº: 17 para CDRH1, ID de SEQ Nº: 18 para CDRH2 e ID de SEQ Nº: 19 para CDRH3; ID de SEQ Nº: 33 para CDRH1, ID de SEQ Nº: 34 para CDRH2 e ID de SEQ Nº: 35 para CDRH3; ID de SEQ Nº: 49 para CDRH1, ID de SEQ Nº: 50 para CDRH2 e ID de SEQ Nº: 51 para CDRH3; ID de SEQ Nº: 67 para CDRH1, ID de SEQ Nº: 68 para CDRH2 e ID de SEQ Nº: 69 para CDRH3; ID de SEQ Nº: 83 para CDRHI, ID de SEQ Nº: 84 para CDRH2 e ID de SEQ Nº: 85 para CDRH3; ID de SEQ Nº: 105 para CDRH1, ID de SEQ Nº: 106 para CDRH2 e ID de SEQ Nº: 107 para CDRH3; ID de SEQ Nº: 121 para CDRH1, ID de SEQ Nº: 122 para CDRH2 e ID de SEQ Nº: 123 para CDRH3; ID de SEQ Nº: 135 para CDRH1, ID de SEQ Nº: 136 para CDRH2 e ID de SEQ Nº: 137 para CDRH3; ID de SEQ Nº: 149 para CDRH1, ID de SEQ Nº: 136 para CDRH2 e ID de SEQ Nº: 137 para CDRH3; ID de SEQ Nº: 153 para CDRH1, ID de SEQ Nº: 154 ' para CDRH2 e ID de SEQ Nº: 155 para CDRH3; ID de SEQ Nº: 169 para CDRH1, ID de SEQ Nº: 170 para CDRH2 e ID de SEQ Nº: 171 “30 para CDRH3; e ID de SEQ Nº: 185 para CDRH1, ID de SEQ Nº: 186 para CDRH2 e ID de SEQ Nº: 187 para CDRH3. Ainda, em outra configuração, os anticorpos, variantes de anticorpos ou fragmentos de anticorpos da | invenção —“compreendem uma cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácido de um ou mais dos IDs de SEQ Nº: 4-

6, 20-22, 36-38, 52-54, 70-72, 86-88, 99, 100, 108-110, 124,

í 125, 138, 139, 156-158, 172-174, 188, ou 189. Em uma outra configuração, os anticorpos, variantes de anticorpos ou

] fragmentos de anticorpos da invenção compreendem uma CDR1 de cadeia leve selecionada do grupo consistindo nos IDs de SEQ

Nº: 4, 20, 36, 52, 70, 86, 99, 108, 138, 156, 172, e 188;

uma CDR2 de cadeia leve selecionada do grupo consistindo nos

IDs de SEQ Nº: 5, 21, 37, 53, 71, 87, 109, 124, 157, e 173;

e uma CDR3 de cadeia leve selecionada do grupo consistindo nos IDs de SEQ Nº: 6, 22, 38, 54, 72, 88, 100, 110, 125,

139, 158, 174, e 189,

Por exemplo, os anticorpos da invenção compreendem uma cadeia leve compreendendo o ID de SEQ Nº: 4 para CDRL1,

ID de SEQ Nº: 5 para CDRL2; ID de SEQ Nº; 6 para CDRL3; ID de

SEQ Nº: 20 para CDRL1, ID de SEQ Nº: 21 para CDRL2; ID de SEQ

Nº: 22 para CDRL3; ID de SEQ Nº: 36 para CDRL1, ID de SEQ Nº:

37 para CDRL2; ID de SEQ Nº: 38 para CDRL3; ID de SEQ Nº: 52 para CDRLI, ID de SEQ Nº: 53 para CDRL2; ID de SEQ Nº: 54 para CDRL3; ID de SEQ Nº: 70 para CDRL1, ID de SEQ Nº: 71

.para CDRL2; ID de SEQ Nº: 72 para CDRL3; ID de SEQ Nº: 86 para CDRL1, ID de SEQ Nº: 87 para CDRL2; ID de SEQ Nº: 88 para CDRL3; ID de SEQ Nº: 99 para CDRL1, ID de SEQ Nº: 53 para CDRL2; ID de SEQ Nº: 100 para CDRL3; ID de SEQ Nº: 108 para CDRL1, ID de SEQ Nº: 109 para CDRL2; ID de SEQ Nº: 110 para CDRL3; ID de SEQ Nº: 70 para CDRL1, ID de SEQ Nº: 124 para CDRLS;7 ID de EE No dagomo Mn tono para CURI; dO UE SEM NO L6 > para CDRLI2; ID de SEQ Nº: 139 para CDRL1, ID de SEQ Nº: 10! ; para CDRL1, ID de SEQ Nº: 157 “30 para CDRL3; ID de SEQ Nº: 15 3 para CDRI3; ID de SEQ Nº: 172 para CDRL2; ID de SEQ Nº: 15! ; para CDRI2; ID de SEQ Nº; 174 para CDRL1, ID de SEQ Nº: 17: 88 para CDRL1, ID de SEQ Nº: 37 para CDRL3; e ID de SEQ Nº: 1

1 para CDRL2; ID de SEQ Nº: 189 para CDRL3, Em uma configuração, um anticorpo da invenção, ou fragmento de ligação do antígeno do mesmo, compreende todas Í as CDRs do anticorpo HMB-DV-1, conforme mostrado na Tabela 1, e neutraliza a infecção pelo vírus da dengue em um hospedeiro ] humano.

Em outra configuração, um anticorpo da invenção, ou fragmento de ligação do antígeno do mesmo, compreende todas as CDRs do anticorpo HMB-DV-2, conforme mostrado na Tabela 1, e neutraliza a infecção pelo vírus da dengue em um hospedeiro humano.

Em outra configuração, um anticorpo da invenção, ou fragmento de ligação do antígeno do mesmo, compreende todas as CDRs do anticorpo HMB-DV-3, conforme mostrado na Tabela 1, e neutraliza a infecção pelo vírus da dengue em um hospedeiro humano.

Ainda, em outra configuração, um anticorpo da invenção, ou fragmento de ligação do antígeno do mesmo, compreende todas as CDRs do anticorpo HMB-DV-4, conforme mostrado na Tabela 1, e neutraliza a infecção pelo vírus da dengue em um hospedeiro humano.

Ainda, em outra configuração, um anticorpo da invenção, ou fragmento de ligação do antígeno do mesmo, compreende todas as CDRs do anticorpo HMB-DV-S5, conforme mostrado na Tabela 1, e neutraliza a infecção pelo vírus da dengue em um hospedeiro humano.

Ainda, em outra configuração, um anticorpo da invenção, ou fragmento de ligação do antígeno do mesmo, compreende todas as CDRs do anticorpo HMB-DV-6, conforme mostrado na Tabela 1, e neutraliza a infecção pelo vírus da dengue em um hospedeiro humano.

Ainda, em outra configuração, um anticorpo da . invenção, ou fragmento de ligação do antígeno do mesmo, compreende todas as CDRs do anticorpo HMB-DV-7, conforme “30 mostrado na Tabela 1, e neutraliza a infecção pelo vírus da dengue em um hospedeiro humano.

Em uma outra configuração, um anticorpo da invenção, ou fragmento de ligação do antígeno do mesmo, | compreende todas as CDRs do anticorpo HMB-DV-8, conforme mostrado na Tabela 1, e neutraliza a infecção pelo vírus da dengue em um hospedeiro humano. Em outra configuração, um ' anticorpo da invenção, ou fragmento de ligação do antígeno do mesmo, compreende todas as CDRs do anticorpo HMB-DV-9, ' conforme mostrado na Tabela 1, e neutraliza a infecção pelo vírus da dengue em um hospedeiro humano. Ainda, em outra configuração, um anticorpo da invenção, ou fragmento de ligação do antígeno do mesmo, compreende todas as CDRs do anticorpo HMB-DV-l10, conforme mostrado na Tabela 1, e neutraliza a infecção pelo vírus da dengue em um hospedeiro humano. Ainda, em outra configuração, um anticorpo da invenção, ou fragmento de ligação do antígeno do mesmo, compreende todas as CDRs do anticorpo HMB-DV-11, conforme mostrado na Tabela 1, e neutraliza a infecção pelo vírus da dengue em um hospedeiro humano. Ainda, em outra configuração, um anticorpo da invenção, ou fragmento de ligação do antígeno do mesmo, compreende todas as CDRs do anticorpo HMB-DV-12, conforme mostrado na Tabela 1, e neutraliza a infecção pelo vírus da dengue em um hospedeiro humano. Ainda, em outra configuração, um anticorpo da invenção, ou fragmento de ligação do antígeno do mesmo, compreende todas as CDRs do anticorpo HMB-DV-13, conforme mostrado na Tabela 1, e neutraliza a infecção pelo vírus da dengue em um hospedeiro humano. Ainda, em outra configuração, um anticorpo da invenção, ou fragmento de ligação do antígeno do mesmo, compreende todas as CDRs do anticorpo HMB-DV-l14, conforme . mostrado na Tabela 1, e neutraliza a infecção pelo vírus da dengue em um hospedeiro humano.

Ainda, em outra configuração, os anticorpos da invenção compreendem a cadeia pesada com uma sequência de aminoácido que é pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo | menos 98%, ou pelo menos 99% idêntica àquelas dos IDs de SEQ Nº: 13, 29, 45, 61, 65, 79, 95, 117, 131, 145, 151, 165, 181, ou 195, Ainda, em outra configuração, os anticorpos da o invenção compreendem a cadeia leve com uma sequência de aminoácido que é pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos ' 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, ou pelo menos 99% idêntica àquelas dos IDs de SEQ Nº: 14, 30, 46, 62, 80, 96, 103, 118, 132, 146, 166, 182, ou

196.

Em uma outra configuração, os anticorpos, variantes de anticorpos ou fragmentos de anticorpos da invenção compreendem uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácido de qualquer um dos IDs de SEQ Nº: 13, 29, 45, 61, 65, 79, 95, 117, 131, 145, 151, 165, 181, ou 195, e uma região variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácido de qualquer um dos IDs de SEQ Nº; 14, 30, 46, 62, 80, 96, 103, 118, 132, 146, 166, 182, ou 196.

Ainda, em outra configuração, os anticorpos, variantes de anticorpos ou fragmentos de anticorpos da invenção neutralizam a infecção pelo vírus da dengue e compreendem uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácido do ID de SEQ Nº: 13 e uma região variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácido do ID de SEQ Nº: 14; Ou uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácido do ID de SEQ Nº: 29 e uma região variável de cadeia leve ] compreendendo a sequência de aminoácido do ID de SEQ Nº: 30; ou uma região variável de cadeia pesada compreendendo a “30 seqúência de aminoácido do ID de SEQ Nº: 45 e uma região variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácido do ID de SEQ Nº: 46; ou uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácido do ID | de SEQ Nº: 61 e uma região variável de cadeia leve compreendendo a seqúência de aminoácido do ID de SEQ Nº: 62;

ou uma região variável de cadeia pesada compreendendo a

- sequência de aminoácido do ID de SEQ Nº: 65 e uma região variável de cadeia leve compreendendo a sequência de

' aminoácido do ID de SEQ Nº: 62; Ou uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácido do ID de SEQ Nº: 79 e uma região variável de cadeia leve compreendendo a seqúência de aminoácido do ID de SEQ Nº: 80;

ou uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácido do ID de SEQ Nº: 95 e uma região variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácido do ID de SEQ Nº: 96; ou uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácido do ID de SEQ Nº: 95 e uma região variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácido do ID de SEQ Nº: 103;

ou uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácido do ID de SEQ Nº: 117 e uma região variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácido do ID de SEQ Nº: 118; ou uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácido do ID de SEQ Nº: 131 e uma região variável de cadeia leve compreendendo a sequência de amincácido do ID de SEQ Nº: 132;

ou uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácido do ID de SEQ Nº: 145 e uma região variável de cadeia leve compreendendo a seqúência de aminoácido do ID de SEQ Nº: 146; Ou uma região variável de

- cadeia pesada compreendendo a sequiência de aminoácido do ID de SEQ Nº: 151 e uma região variável de cadeia leve “30 compreendendo a sequência de aminoácido do ID de SEQ Nº: 146; ou uma região variável de cadeia pesada compreendendo a seqiência de aminoácido do ID de SEQ Nº: 165 e uma região variável de cadeia leve compreendendo a sequência de

| aminoácido do ID de SEQ Nº: 166; ou uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácido do ID de SEQ Nº: 181 e uma região variável de cadeia leve " compreendendo a sequência de aminoácido do ID de SEQ Nº: 182; ou uma região variável de cadeia pesada compreendendo a ' sequência de âmincácido do ID de SEQ Nº: 195 e uma região variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácido do ID de SEQ Nº: 196.

Métodos de substituição de cadeia e para enxerto de CDR são bem conhecidos na técnica. Originalmente, esses métodos foram desenvolvidos para humanizar anticorpos não- humanos "(geralmente anticorpos de camundongos) Ou para selecionar contrapartes de anticorpo humano tendo bioatividade equivalente aos anticorpos não-humanos. Esses métodos incluem técnicas de substituição onde somente uma das CDRs, por exemplo, as CDR3s, do anticorpo não-humano são mantidas e o restante da região V, incluindo a estrutura e as outras duas CDRsS, por exemplo, as CDRS 1 e 2, é individualmente substituído em etapas realizadas sequencialmente (por exemplo, Pedido de Patente . Norte- Americana Nº 20030166871; Rader, et al., Proc Natl Acad Sci USA 95:8910-15, 1998; Steinberg, et al., J Biol Chem 275:36073-78, 2000; Rader, et al., J Biol Chem 275;:13668-76, 2000).

Além disso, métodos de criação de anticorpos com as especificidades de ligação de um anticorpo de referência para um antígeno-alvo são descritos no Pedido de Patente Nº " WOO5/069,970. Os métodos incluem a transferência, do anticorpo de referência para um anticorpo receptor Ou fragmento de anticorpo, a mínima especificidade de ligação essencial do anticorpo de referência. Exemplos de regiões que podem ser transferidas incluem, entre outros, a transferência de um único segmento de CDR, por exemplo, um segmento de |

CDR3, a partir da cadeia pesada e/ou da cadeia leve, ou um segmento D, Ou um segmento CDR3-FR4, ou qualquer segmento CDR3-FR4 que compreenda o determinante de mínima ? especificidade de ligação essencial. Os anticorpos criados utilizando esses métodos mantêm a especificidade de ligação, ' e geralmente a afinidade, do anticorpo de referência. os anticorpos, variantes de anticorpos ou fragmentos de anticorpos da invenção incluem anticorpos que compreendem, entre outras coisas, uma ou mais CDRs, uma cadeia pesada ou uma cadeia leve de um exemplos de anticorpo da invenção e mantêm sua especificidade e capacidade de neutralizar a infecção pelo vírus da dengue. Exemplos de anticorpos da invenção incluem, entre outros, HMB-DV1, HMB-DV2, HMB-DV3, HMB-DV4, HMB-DV5, HMB-DVG6, HMB-DV7, HMB-DV8, HMB-DV9, HMB-DV10, HMB-DV11, HMB-DV12, HMB- DV13 e HMB-DVl4. Variantes do HMB-DV4 consistem em variantes de cadeia pesada tendo a sequência de aminoácido mencionada na ID de SEQ Nº: 61 e na ID de SEQ Nº: 65, e uma cadeia leve tendo a segqiúência de aminoácido mencionada na ID de SEQ Nº:

62. As sequências de ácido nucléico que codifica as variantes de cadeia pesada são mencionadas na ID de SEQ Nº: 63 e ID de SEQ Nº: 66. O ácido nucléico que codifica a cadeia leve é mencionado na ID de SEQ Nº: 64. Assim, os anticorpos compreendendo as cadeias pesadas (IDs de SEQ Nº: 61, 65) ea cadeia leve (ID de SEQ Nº: 62) da variante HMB-DV4 são incluídos no escopo da invenção. - Conforme aqui utilizado, Oo termo. “HMB-DV4" é utilizado para se referir a todas e/ou quaisquer variantes de “30 HMB-DV4, por exemplo, aquelas com cadeias pesadas correspondentes às IDs de SEQ Nº: 61 e 65 e à cadeia leve correspondente à ID de SEQ Nº: 62. Em uma configuração, um coquetel de anticorpos da | invenção compreende dois ou mais anticorpos selecionados do grupo consistindo em HMB-DV1, HMB-DV2, HMB-DV3, HMB-DV4, HMB- DV5, HMB-DV6, HMB-DV7, HMB-DV8, HMB-DV9, HMB-DV10, HMB-DV11, 7 HMB-DV12, HMB-DV13 e HMB-DVl4. Em outra configuração, um coquetel da invenção compreende três anticorpos selecionados ' do grupo consistindo em HMB-DV1l, HMB-DV2, HMB-DV3, HMB-DV4, HMB-DVS5, HMB-DV6, HMB-DV7, HMB-DV8, HMB-DV9, HMB-DV10, HMB- DV11, HMB-DV12, HMB-DV13 e HMB-DVlI4. Ainda, em outra configuração, um coquetel de anticorpos da invenção compreende mais que três, por exemplo, 4, 5, 6, 7 ou 8 anticorpos selecionados do grupo consistindo em HMB-DV1, HMB- DV2, HMB-DV3, HMB-DV4, HMB-DV5, HMB-DV6, HMB-DV7, HMB-DV8, HMB-DV9, HMB-DV10, HMB-DV11, HMB-DV12, HMB-DV13 e HMB-DV14. Em um exemplo de configuração, um coquetel da invenção compreende HMB-DV5, HMB-DV6 e HMB-DV8.

A invenção compreende ainda um anticorpo, OU fragmento deste, que se liga a um epítopo capaz de se ligar a um anticorpo da invenção. A invenção também compreende um anticorpo ou um fragmento de anticorpo que compete com um anticorpo da invenção.

Em outro aspecto, a invenção também inclui sequências de ácido nucléico que codifica parte ou todas as cadeias leves e pesadas e as CDRs dos anticorpos da presente invenção. Em uma configuração, as sequências de ácido nucléico de acordo com a invenção incluem sequências de ácido nucléico sendo pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo - menos 98%, ou pelo menos 99% idênticas ao ácido nucléico que codifica a cadeia pesada ou leve de um anticorpo da invenção.

“ 30 Em outra configuração, uma seqúência de ácido nucléico da invenção tem a sequência de um ácido nucléico que codifica a CDR da cadeia pesada ou leve de um anticorpo da invenção, Por exemplo, uma sequência de ácido nucléico de acordo com a | invenção compreende a segúência que é pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, ou pelo menos 99% idêntica às - sequências de ácido nucléico dos IDs de SEQ Nº: 7-12, 23-28, 39-44, 55-60, 73-78, 89-94, 101, 102, 111-116, 126-128, 129, ' 130, 140-144, 150, 159-164, 175-180 e 190-194.

Devido à redundância do código genético, existirão variantes dessas sequências que codificam a mesma sequência de aminoácidos. Essas variantes estão incluídas no escopo da invenção, As variantes de anticorpos também estão incluídas no escopo da invenção. Assim, as variantes das sequências mencionadas no pedido também estão incluídas no escopo da invenção. Essas variantes incluem variantes naturais geradas por mutação somática in vivo durante a resposta imune ou in vitro mediante a cultura de clones de célula B imortalizados. Alternativamente, as variantes podem surgir devido à degeneração do código genético, conforme acima mencionado, ou podem ser geradas devido a erros na transcrição ou tradução.

As variantes também podem ser introduzidas para modificar a função efetora do anticorpo, por exemplo, na região Fc para reduzir a ligação do anticorpo a um receptor de Fc.

Outras variantes das sequências do anticorpo tendo afinidade e/ou potência aperfeiçoada podem ser obtidas utilizando métodos conhecidos na técnica e estão incluídas no escopo da invenção. Por exemplo, substituições de aminoácido podem ser utilizadas para obtenção de anticorpos com - afinidade ainda mais aperfeiçoada. Alternativamente, a otimização de códon da seqúência de nucleotídeo pode ser “ 30 utilizada para melhorar a eficiência da tradução em sistemas de expressão para a produção do anticorpo. Além disso, polinucleotídeos compreendendo uma sequência otimizada para especificidade de anticorpo ou atividade neutralizante pela | aplicação de um método de evolução direcionado a qualquer uma das sequências de ácido nucléico da invenção também são no escopo da invenção. sn Em uma configuração, as sequências de anticorpo variante podem compartilhar 70% ou mais (por exemplo, 75%, ' 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% ou mais) da identidade da sequência de aminoácido com as sequências mencionadas. no pedido.

Em algumas configurações, essa identidade de sequência é calculada em relação a todo o comprimento da sequência de referência (ou seja, a sequência mencionada no pedido). Em algumas outras configurações, o percentual de identidade, conforme aqui denominado, é conforme determinado utilizando BLAST versão 2.1.3 empregando os parâmetros padrão (default) especificados pelo NCBI (National Center for Biotechnology Information; http: //www.ncbi.nlm.nih.gov/) [Blosum 62 matrix; gap open penalty=11 and gap extension penalty=1]. Vetores estão ainda incluídos no escopo da invenção, por exemplo, vetores de expressão, compreendendo uma sequência de ácido nucléico de acordo com a invenção.

AS células “transformadas com esses vetores também estão incluídas no escopo da invenção.

Exemplos dessas células incluem, entre outros, células eucarióticas, por exemplo, células de levedura, células animais ou células vegetais.

Em uma configuração, as células são de mamíferos, por exemplo, células humanas, CHO, HEK293T, PER.C6, NSO, mieloma Ou hibridoma. - A invenção também refere-se a anticorpos monoclonais que se ligam à um epítopo capaz de se ligar a um * 30 anticorpo da invenção.

Em uma configuração, a invenção inclui um anticorpo monoclonal que se liga a um epítopo capaz de se ligar a um anticorpo monoclonal selecionado do grupo consistindo em HMB-DVl, HMB-DV2, HMB-DV3, HMB-DV4, HMB-DV5, |

HMB-DV6, HMB-DV7, HMB-DV8, HMB-DV9, HMB-DV10, HMB-DV11, HMB- DV12, HMB-DV13 e HMB-DV14. Anticorpos monoclonais e recombinantes são - particularmente úteis na identificação e purificação dos polipeptídeos individuais ou outros antígenos contra os quais 7 são direcionados.

Os anticorpos da invenção ainda são úteis pelo fato de que podem ser empregados como reagentes em imunoensaios, radioimunoensaios (RIA) ou ensaios imunoabsorventes ligados à enzima (ELISA). Nessas aplicações, Os anticorpos — podem ser marcados com um reagente analiticamente detectável, por exemplo, um radioisótopo, uma molécula fluorescente ou uma enzima, Os anticorpos também podem ser utilizados para a identificação molecular e caracterização (mapeamento de epítopo) de antígenos. os anticorpos da invenção serão geralmente glicosilados.

Glicanos ligados à N e ligados ao domínio Cx2 de uma cadeia pesada, por exemplo, podem influenciar a ligação Cliq e FcR, com anticorpos não glicosilados tendo menor afinidade por esses receptores, A estrutura do glicano também pode afetar a atividade, ou seja, diferenças na morte celular mediadas por complemento podem ser observadas dependendo do número de açucares de galactose (0, 1 ou 2) na terminação de uma cadeia biantenária do glicano.

Os glicanos de um anticorpo preferencialmente não levam a uma resposta imunogênica humana após a administração.

Os anticorpos da invenção podem ser ligados a uma droga para distribuição a um local de tratamento ou ligados a e um marcador detectável para facilitar a geração de imagem de um local compreendendo as células de interesse, por exemplo, * 30 células infectadas com o vírus da dengue.

Os métodos de ligação de anticorpos a drogas e os marcadores detectáveis também são bem conhecidos na têcnica, pois são métodos de geração de imagem utilizando marcadores detectáveis.

Os | anticorpos marcados podem ser empregados em uma ampla variedade de ensaios, empregando uma ampla variedade de marcadores.

A detecção da formação de um complexo anticorpo- Ç antígeno entre um anticorpo da invenção e um epítopo de interesse (um epítopo DENV) pode ser facilitada pela ligação . de uma substância detectável ao anticorpo.

Os meios adequados de detecção incluem o uso de marcadores, tais como radionuclídeos, enzimas, coenzimas, agentes fluorescentes, agentes quimioluminescentes, cromogênios, substratos enzimáticos ou co-fatores, inibidores enzimáticos, complexos de grupo protético, radicais livres, partículas, pigmentos e similares.

Exemplos de enzimas adequadas incluem peroxidase de raiz-forte, fosfatase alcalina, B-galactosidase, ou acetilcolinesterase; exemplos de complexos de grupo protético adequado incluem estreptavidina/biotina e avidina/biotina; exemplos de materiais fluorescentes adequados incluem umbelliferone, Eluoresceína, isotiocianato de fluoresceína, rodamina, diclorotriazinilamina fluoresceína, cloreto de dansila ou ficoeritrina; um exemplo de um material luminescente é o luminol; exemplos de materiais bioluminescentes incluem luciferase, luciferina, e aequorina; e exemplos de materiais radioativos adequados incluem **I, "PT, *S, ou *H.

Esses reagentes marcados podem ser utilizados em diversos ensaios bem conhecidos, tais como radioimunoensaios, imunoensaios enzimáticos, por exemplo,

ELISA, imunoensaios fluorescentes, e similares.

Um «anticorpo de acordo com a invenção pode ser - conjugado com uma parcela terapêutica, por exemplo, uma - citotoxina, um agente terapêutico ou um íon metálico “30 radioativo ou radioisótopo.

Exemplos de radioisótopos incluem, entre outros, I-131, I-123, I-125, Y-90, Re-188, Re- 186, At-211, Cu-67, Bi-212, Bi-213, Pd-109, Tc-99, In-111, e similares.

Esses conjugados de anticorpo podem ser utilizados

| para modificação de uma determinada resposta biológica; a parcela de droga não deve ficar limitada aos agentes terapêuticos químicos clássicos. Por exemplo, a parcela de ” droga pode ser uma proteína ou polipeptídeo tendo uma - 5 atividade biológica desejada. Essas proteínas podem incluir, . por exemplo, uma toxina, por exemplo, abrina, ricina A, exotoxina pseudomonas, toxina bacteriana da caliqueamicina, ou toxina da difteria.

As técnicas para conjugação dessa parcela terapêutica em anticorpos são bem conhecidas. Vide, por exemplo, Arnon et al. (1985) “Monoclonal Antibodies for Immunotargeting of Drugs in Cancer Therapy," in Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, ed. Reisfeld et al. (Alan R. Liss, Inc.), pp. 243-256; ed. Hellstron et al. (1987) “Antibodies for Drug Delivery,” in Controlled Drug Delivery, ed. Robinson et al. (2d ed; Marcel Dekker, Inc.), pp. 623- 653; Thorpe (1985) “Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents in Cancer Therapy: A Review," in Monoclonal Antibodies '84: Biological and Clinical Applications, ed. Pinchera et al. pp. 475-506 (Editrice Kurtis, Milano, Italy, 1985); “Analysis, Results, and Future Prospective of the Therapeutic Use of Radiolabeled aAntibody in Cancer Therapy,” in Monoclonal Antibodies for Cancer Detection and Therapy, ed. Baldwin et al. (Academic Press, New York, 1985), pp. 303-316; e Thorpe et al. (1982) Immunol. Rev. 62:119-158. Alternativamente, um anticorpo pode ser conjugado em um segundo anticorpo para formar um heteroconjugado de an anticorpo conforme descrito na referência 4. Além disso, + ligantes podem ser utilizados entre os marcadores e oS * 30 anticorpos da invenção [5]. Anticorpos, ou fragmentos de ligação a antígeno destes, podem ser diretamente marcados com iodo radioativo, índio, ítrio ou outra partícula radioativa conhecida na técnica [6]. O tratamento pode consistir em uma | combinação de tratamento com anticorpos conjugados e não- conjugados administrados simultaneamente ou subsequentemente [7, 81. E Os anticorpos da invenção também podem ser ligados & 5 aum suporte sólido.

7 Além disso, os anticorpos da invenção, OU fragmentos “funcionais de anticorpos destes, podem ser quimicamente modificados por conjugação covalente em um polímero para, por exemplo, aumentar «sua meia-vida circulante. Exemplos de polímeros e métodos para liga-los a peptídeos, são mostrados nas referências 9 a 12. Em algumas configurações, os polímeros podem ser selecionados de polióis polioxietilados e de polietilenoglicol (PEG). O PEG é solúvel em água em temperatura ambiente e tem a fórmula general: R(O- -CH;y--CH;)n O-R, onde R pode ser hidrogênio, ou um grupo protetor, por exemplo, um grupo alquila ou alcanol. Em uma configuração, o grupo protetor pode ter entre 1 e 8 carbonos. Em uma outra configuração, o grupo protetor é metila. O símbolo n é um número inteiro positivo. Em uma configuração, n varia entre 1 e 1.000. Em outra configuração, n varia entre 2 e 500. Em uma configuração, o PEG tem um peso molecular médio entre 1.000 e 40.000. Em uma outra configuração, o PEG tem um peso molecular entre 2.000 e 20.000. Ainda, em outra configuração, o PEG tem um peso molecular entre 3.000 e

12.000. Em uma configuração, o PEG tem pelo menos um grupo hidroxi. Em outra configuração, o PEG tem um grupo hidroxi terminal. Ainda, em outra configuração, é o grupo hidroxi a terminal que é ativado para reagir com um grupo amino livre + no inibidor. No entanto, ficará entendido que o tipo e r 30 quantidade dos grupos reativos pode ser ajustado de modo a se obter um PEG/anticorpo covalentemente conjugado da presente invenção. Os anticorpos da invenção podem ser modificados | pela introdução de mutações de aminoácido aleatórias em uma região em particular do domínio CH2 ou CH3 da cadeia pesada para alterar sua afinidade de ligação com FcRn e/ou sua meia- vida sérica em comparação aos anticorpos não-modificados. Exemplos dessas modificações incluem, entre outros, substituições de pelo menos um aminoácido da região constante de cadeia pesada selecionado do grupo consistindo nos resíduos de aminoácido 250, 314 e 428. Polióis polioxietilados solúveis em água também são úteis na presente invenção. Estes incluem —sorbitol polioxietilado, glicose polioxietilada, glicerol polioxietilado (POG), e similares. Em uma configuração, POG é utilizado. Sem ficar preso à teoria, uma vez que à backbone de glicerol do glicerol polioxietilado é a mesma backbone que ocorre naturalmente em, por exemplo, animais e humanos em mono-, di-, triglicerídeos, essa ramificação não seria necessariamente vista como um agente estranho no organismo. Em algumas configurações, o POG tem um peso molecular na : mesma faixa do PEG. A estrutura do POG é mostrada na referência 13 e uma discussão dos conjugados de POG/IL-2 é encontrada na referência 9. Outro sistema de administração de droga que pode ser utilizado para aumentar a meia-vida circulatória é oO lipossomo. Métodos de preparação de sistemas de administração de lipossonmo são discutidos nas referências 14, 15 e 16, Outros sistemas de administração de droga são conhecidos na técnica e são descritos, por exemplo, nas referências 17 e

18. Os anticorpos da invenção podem ser providos na forma purificada. Tipicamente, O anticorpo estará presente em uma composição que é substancialmente livre de outros polipeptídeos, por exemplo, onde menos que 90% (em peso), geralmente menos que 60% e mais usualmente menos que 50% da | composição é composta por outros polipeptídeos.

Os anticorpos da invenção podem ser imunogênicos em hospedeiros não-humanos (ou heterólogos), por exemplo, em camundongos. Em particular, os anticorpos podem ter um idiótopo que é imunogênico em hospedeiros não-humanos, porém não em um hospedeiro humano. Os anticorpos da invenção para uso humano incluem aqueles que não podem ser facilmente isolados de hospedeiros, por exemplo, camundongos, cabras, coelhos, ratos, mamíferos não-primatas, etc. e geralmente não podem ser obtidos por humanização ou de xeno-camundongos.

Os anticorpos da invenção podem ser de qualquer isotipo (por exemplo, IgA, IgG, IgM, por exemplo, uma cadeia pesada a, y ou p), porém serão geralmente IgG. Dentro do isotipo IgG, os anticorpos podem ser da subclasse IgGl, IgG2, Ige3 ou IgG. Em uma configuração, o anticorpo é IgG1l. Os anticorpos da invenção podem ter uma cadeia leve K ou a À.

Fazem parte do escopo da invenção as moléculas de anticorpo biespecíficas recombinantes ou modificadas neutralizantes de DENV ou fragmentos de ligação a antígeno destas. Esses anticorpos e fragmentos podem compreender um primeiro sítio de ligação a um epítopo em um primeiro sorotipo do vírus da dengue e um segundo sítio de ligação a um segundo epítopo no mesmo sorotipo do vírus da dengue ou em um sorotipo do vírus da dengue diferente, por exemplo, um segundo, terceiro ou quarto. Os domínios variáveis dos respectivos sítios de ligação podem ser formados como isotipos de imunoglobulina. da invenção ou como Fab, Fab', F(ab'),, ScFv heterodiméricos ou diacorpos que podem ser unidos por meio de um ou mais ligantes peptídicos.

Produção de anticorpos Os anticorpos monoclonais de acordo com à invenção podem ser obtidos por qualquer método conhecido na técnica. A metodologia geral para produção de anticorpos monoclonais | utilizando a tecnologia de hibridoma é bem conhecida [19, 20). Preferencialmente, é utilizado o método alternativo de imortalização EBV descrito na referência 21, Utilizando o método descrito na referência 21, as células B que produzem o anticorpo da invenção podem ser transformadas com EBV na presença de um ativador de célula B policlonal. A transformação com EBV é uma técnica padrão e pode ser facilmente adaptadas para incluir ativadores de célula B policlonal.

Outros estimulantes de crescimento e diferenciação celular podem ser opcionalmente acrescentados durante a etapa de transformação para melhorar ainda mais a eficiência. Esses estimulantes podem ser citocinas, tais como IL-2 e IL-15. Em um aspecto, a TIL-2 é adicionada durante a etapa de imortalização para melhorar ainda mais a eficiência da imortalização, porém não é essencial.

As células B imortalizadas produzidas utilizando-se esses métodos podem ser então cultivadas utilizando-se métodos conhecidos na técnica e anticorpos isolados a partir destas.

Os anticorpos da invenção também podem ser obtidos cultivando-se células plasmáticas únicas em placas de cultura de micropoço utilizando o método descrito no Pedido de Patente do Reino Unido 0819376.5. Além disso, a partir de culturas de células plasmáticas únicas, o RNA pode ser extraído e a PCR de célula única pode ser realizada utilizando métodos conhecidos na técnica. As regiões VH e VL dos anticorpos podem ser amplificadas por RT-PCR, sequenciadas e clonadas em um vetor de expressão que é então transfectado em células HEK293T ou em outras células hospedeiras. A clonagem do ácido nucléico em vetores de expressão, a transfecção de células hospedeiras, a cultura de células hospedeiras transfectadas e o isolamento do anticorpo | produzido podem ser realizadas utilizando-se quaisquer métodos conhecidos pelos técnicos no assunto.

os anticorpos monoclonais podem ser ainda purificados, se desejado, utilizando-se filtração, centrifugação e vários métodos cromatográficos, tais como HPLC ou cromatografia por afinidade. As técnicas de purificação de anticorpos monoclonais, inclusive as técnicas para produção de anticorpos de grau farmacêutico, são bem conhecidos na área.

os fragmentos dos anticorpos monoclonais da invenção podem ser obtidos dos anticorpos monoclonais por métodos que incluem a digestão com enzimas, tais como pepsina ou papaína, e/ou por clivagem de ligações bissulfeto por redução — química. Alternativamente, os fragmentos — dos anticorpos monoclonais podem ser obtidos por clonagem e expressão de parte das sequências das cadeias pesadas ou leves. Os “fragmentos” de anticorpo podem incluir fragmentos Fab, Fab', F(ab');, e Fv. A invenção também abrange fragmentos Fv de cadeia simples (scFv) derivados de cadeias pesadas e leves de um anticorpo monoclonal da invenção, por exemplo, a invenção inclui um scFv compreendendo as CDRs de um anticorpo da invenção. São também incluídos os monômeros e dímeros de cadeias pesadas ou leves, bem como os anticorpos de cadeia simples, por exemplo, Fv de cadeia simples nos quais os domínios variáveis de cadeia pesada e leve são unidos por um ligante peptídico.

Técnicas padrão de biologia molecular podem ser utilizadas para preparar a codificação de sequências de DNA para os anticorpos ou fragmentos ou variantes dos anticorpos da presente invenção. As seqúências de DNA desejadas podem ser completamente sintetizadas ou parcialmente utilizando técnicas de síntese de oligonucleotídeo.

Técnicas de reação de cadeia de polimerase (PCR) e | mutagênese direcionada ao sítio podem ser utilizadas conforme necessário.

Qualquer sistema adequado de célula hospedeira/vetor pode ser utilizado para expressão das sequências de DNA que codificam as moléculas de anticorpo da presente invenção ou fragmentos destas.

Sistemas bacterianos, por exemplo, E. coli, e outros sistemas microbianos podem ser utilizados, na técnicas, para expressão de fragmentos de anticorpos, tais como fragmentos Fab e F(ab')>, e, especialmente fragmentos Fv e fragmentos de anticorpo de cadeia simples, por exemplo, Fvs.

Eucariótico de cadeia simples, por exemplo, mamíferos, sistemas de expressão de célula hospedeira podem ser utilizados para a produção de moléculas de anticorpo maiores, incluindo moléculas de anticorpo completas.

As células hospedeiras de mamíferos adequadas incluem CHO, HEK293T, PER.C6, NS0, mieloma Ou células de hibridoma.

A presente invenção também provê um processo para a produção de um anticorpo da invenção compreendendo a cultura de uma célula hospedeira compreendendo um vetor da presente invenção sob condições adequadas para levar à expressão de proteína do DNA que codifica o anticorpo da presente invenção, e isolamento da molécula do anticorpo.

A molécula do anticorpo pode compreender somente um polipeptídeo de cadeia pesada ou leve, caso este em que somente um polipeptídeo de cadeia pesada ou cadeia leve que codifica a seqúência precisa ser utilizado para transfectar as células hospedeiras.

Para a obtenção de produtos compreendendo ambas as cadeias pesadas e leves, a linhagem celular pode ser transfectada com dois vetores, um primeiro vetor que codifica um polipeptídeo de cadeia leve e um segundo vetor que codifica um polipeptídeo de cadeia pesada.

Alternativamente, um único vetor pode ser utilizado, O | referido vetor incluindo seqúências que codificam polipeptídeos de cadeia leve e de cadeia pesada. Alternativamente, os anticorpos de acordo com a invenção podem ser produzidos por i) expressão de uma seqgúência de ácido nucléico de acordo com a invenção em uma célula, e ii) isolamento do produto de anticorpo expresso. Além disso, o método pode incluir iii) purificação do anticorpo.

Triagem e isolamento de células B As células B transformadas podem ser triadas em cêlulas produtoras de anticorpos com a especificidade desejada do antígeno, e clones individuais de célula B podem ser então produzidos a partir de células positivas.

A etapa de triagem pode ser realizada por ELISA, por coloração de tecidos ou células (incluindo células infectadas ou transfectadas), um ensaio de neutralização ou um dos vários outros métodos conhecidos na técnica para identificação da especificidade de antígeno desejada. O ensaio pode ser escolhido com base no reconhecimento de antígeno simples, ou pode ser selecionado ainda com base em uma função desejada, por exemplo, para selecionar neutralizantes de anticorpo em vez de apenas anticorpos de ligações a antígeno, para selecionar anticorpos que podem alterar as características das células desejadas, por exemplo, suas cascatas de sinalização, seu formato, sua velocidade de crescimento, sua capacidade de influenciar outras células, sua resposta à influência por outras células ou por outros reagentes ou por uma alteração nas condições, seu estado de diferenciação, etc.

A etapa de clonagem para separação de clones individuais da mistura de células positivas pode ser realizada utilizando diluição limitativa, micromanipulação, deposição de célula simples por classificação celular ou | outro método conhecido na técnica.

Os. clones de célula B imortalizados da invenção podem ser utilizados de várias formas, por exemplo, como uma fonte de anticorpos monoclonais, como uma fonte de ácido nucléico (DNA ou mMRNA) que codifica um anticorpo monoclonal de interesse, para pesquisa, etc.

A invenção provê uma composição compreendendo células B de memória imortalizadas, onde as células produzem anticorpos que neutralizam um ou mais sorotipos do vírus da dengue, e onde os anticorpos são produzidos a >5pg por célula por dia. A invenção também provê uma composição compreendendo clones de uma célula B de memória imortalizados, onde os clones produzem um anticorpo monoclonal que neutraliza um ou mais sorotipos do vírus da dengue, e onde o anticorpo é produzido a >5pg por célula por dia.

Exemplos de clone de célula B imortalizado de acordo com a invenção incluem, entre outros, HMB-DV1, HMB- DV2, HMB-DV3, HMB-DV4, HMB-DV5, HMB-DV6, HMB-DV7, HMB-DV8, HMB-DV9, HMB-DV10, HMB-DV11, HMB-DV12, HMB-DV13 e HMB-DV14, Epítopos Conforme mencionado acima, os anticorpos da invenção podem ser utilizados para mapear os epítopos aos quais se ligam. Os epítopos reconhecidos pelos anticorpos da presente invenção podem ter diversos usos. O epítopo e os mimótopos deste na forma purificada ou sintética podem ser utilizados para aumentar as respostas imunes (por exemplo, como uma vacina, ou para à produção de anticorpos para outros usos) ou para a triagem do soro do paciente para anticorpos que reagem imunologicamente com o epítopo ou mimótopos deste.

Em uma configuração, esse epítopo ou mimótopo, ou antígeno compreendendo este epítopo ou mimótopo, pode ser utilizado como uma vacina para aumentar uma resposta imune, OS anticorpos e fragmentos de ligação a antígeno da invenção |

, . também podem ser utilizados em um método de monitoramento da qualidade de vacinas. Em particular, os anticorpos podem ser utilizados para verificar se o antígeno em uma vacina contém o epítopo específico na conformação correta.

O epítopo também pode ser útil na triagem de ligantes que se ligam ao referido epítopo. Esses ligantes incluem, entre outros, anticorpos, inclusive aqueles de camelos, tubarões e outras espécies, fragmentos —* de i anticorpos, peptídeos, produtos de tecnologia de exibição de fago, aptâmeros, adnectinas, compostos — sintéticos, ou fragmentos de outras proteínas virais ou celulares, que podem bloquear o epítopo e assim impedir infecções. Esses ligantes são abrangidos no escopo da invenção.

Expressão recombinante As células B de memória imortalizadas da invenção também podem ser utilizadas como uma fonte de ácido nucléico para a clonagen de genes de anticorpo para Subsequente expressão recombinante. A expressão a partir de fontes recombinantes é mais comum para fins farmacêuticos que a expressão a partir de células B ou hibridomas, por exemplo, por motivos de estabilidade, reprodutibilidade, facilidade de cultura, etc.

Assim, a invenção provê um método de preparação de uma célula recombinante, compreendendo as etapas de; (1i) obtenção de um ou mais ácidos nucléicos (por exemplo, genes de cadeia pesada e/ou leve) a partir do clone de célula B que codifica o anticorpo de interesse; e (ii) inserção do ácido nucléico em um hospedeiro de expressão para permitir a expressão do anticorpo de interesse no referido hospedeiro.

Similarmente, a invenção provê um método de preparação de uma célula recombinante, compreendendo as etapas de: (i) sequenciamento de ácido(s) nucléico(s) a partir do clone de célula B que codifica o anticorpo de | interesse; e (ii) uso das informações de sequência da etapa (i) para preparar ácido(s) nucléico(s) para inserção em um hospedeiro de expressão para permitir a expressão do anticorpo de interesse no referido hospedeiro. O ácido nucléico pode, porém não necessariamente, ser manipulado entre as etapas (i) e (ii) para introduzir sítios de restrição, para alterar o uso de códon, para otimizar seqúências reguladoras de transcrição e/ou tradução, e/ou para modificar a função efetora.

A invenção também provê um método de preparação de uma célula recombinante, compreendendo a etapa de transformação de uma célula hospedeira com um ou mais ácidos nucléicos que codificam um anticorpo monoclonal de interesse, onde os ácidos nucléicos são ácidos nucléicos que foram derivados de um clone de célula B imortalizado da invenção. Assim, os procedimentos para primeiramente preparar (os) ácido(s) nucléico(s) e então utilizá-lo para transformar uma t célula hospedeira, podem ser realizados em diferentes Í horários, por diferentes pessoas e em diferentes locais (por ; exemplo, em diferentes países).

Essas células recombinantes da invenção podem ser então utilizadas para fins de expressão e cultura, Elas são particularmente úteis para expressão de anticorpos para a produção farmacêutica em larga escala. Também podem ser utilizadas como o princípio ativo de uma composição farmacêutica. Quaisquer técnicas adequadas de cultura podem ser utilizadas, incluíndo, entre outras, cultura estática, cultura em frasco giratório, fluido de ascite, cartucho de biorreator do tipo de fibra oca, minifermentador modular, tanque com agitação, cultura em micro-veículo, perfusão em núcleo de cerâmica, etc.

Os métodos de obtenção e sequenciamento de genes de imunoglobulina a partir de células B são bem conhecidos na | técnica (vide, por exemplo, a referência 22).

O hospedeiro de expressão é preferencialmente uma célula eucariótica, incluindo células de levedura e animais, particularmente células de mamíferos (por exemplo, células de CHO, células de NSO0O, células humanas, tais como PER.C6 [Crucell; referência 23) ou células HKB-11 [Bayer; referências 24 e 25), células de mieloma [26 e 27], etc.), bem como células vegetais. Os hospedeiros de expressão preferidos podem glicosilar o anticorpo da invenção, particularmente com estruturas de carboidratos que não são imunogênicos em humanos. Em uma configuração, o hospedeiro de expressão pode ser capaz de crescer em um meio sem soro. Em uma outra configuração, o hospedeiro de expressão pode ser capaz de crescer em cultura sem a presença de produtos de origem animal.

O hospedeiro de expressão pode ser cultivado para dar origem a uma linhagem celular. j A invenção provê um método de preparação de uma ou ' mais moléculas de ácido nucléico (por exemplo, genes de cadeia pesada e leve) que codificam um anticorpo de interesse, compreendendo as etapas de: (i) preparação de um clone de célula B imortalizado de acordo com à invenção; (ii) obtenção, a partir do clone de célula B, do ácido nucléico que codifica o anticorpo de interesse. A invenção também provê um método para obtenção de uma sequência de ácido nucléico que codifica um anticorpo de interesse, compreendendo as etapas de: (i) preparação de um clone de célula B imortalizado de acordo com a invenção; (ii) sequenciamento do ácido nucléico a partir do clone de célula B que codifica o anticorpo de interesse.

A invenção também provê um método de preparação de molécula(s) de ácido nucléico que codificam um anticorpo de interesse, compreendendo a etapa de obtenção do ácido | nucléico a partir de um clone de célula B que foi obtido a partir de uma célula B transformada da invenção. Assim, os procedimentos para primeiramente obter o clone de célula B e então preparar o(s) ácido(s) nucléico(s) a partir deste, podem ser realizados em horários muito diferentes, por pessoas diferentes e em diferentes locais (por exemplo, em diferentes países).

A invenção provê um método de preparação de um anticorpo (por exemplo, para uso farmacêutico), compreendendo as etapas de: (i) obtenção e/ou sequenciamento de um ou mais ácidos nucléicos (por exemplo, genes de cadeia pesada e leve); (ii) uso das informações de sequência da etapa (1) para preparar ácido(s) nucléico(s) para inserção em um hospedeiro de expressão para permitir a expressão do anticorpo de interesse no referido hospedeiro; (iii) cultura ou sub-cultura do hospedeiro de expressão sob condições onde o anticorpo de interesse é expresso; e, opcionalmente, (iv) purificação do anticorpo de interesse. O ácido nucléico pode, porém não necessariamente, ser obtido e/ou sequenciado a partir de um clone de célula B que expressa O anticorpo de interesse. Em uma configuração, o ácido nucléico da etapa (1) pode, opcionalmente, ser modificado de modo a introduzir as substituições desejadas na segqúência de aminoácido do anticorpo.

A invenção também provê um método de preparação de um anticorpo compreendendo as etapas de: cultura ou sub- cultura de uma população de célula de hospedeiro de expressão sob condições onde o anticorpo de interesse é expresso e, opcionalmente, a purificação do anticorpo de interesse, onde a referida população de célula de hospedeiro de expressão foi preparada por (i) provendo ácido(s) nucléico(s) que codifica(m) um anticorpo de interesse; (ii) inserção do(s) ácido(s) nucléico(s) em um hospedeiro de expressão que pode | expressar o anticorpo de interesse, e (iii) cultura ou sub- cultura dos hospedeiros de expressão compreendendo OS referidos ácidos nucléicos inseridos para produzir a referida população de célula de hospedeiro de expressão.

Composições Farmacêuticas A invenção provê uma composição farmacêutica contendo os anticorpos e/ou fragmentos de anticorpos da invenção e/ou ácido nucléico que codifica os referidos anticorpos e/ou células B imortalizadas que expressam os referidos anticorpos e/ou os epítopos reconhecidos pelos anticorpos da invenção. A composição farmacêutica também pode conter um veículo farmaceuticamente aceitável para permitir a administração. O veículo não deve induzir a produção de anticorpos prejudiciais ao individual que recebe a composição e não deve ser tóxico. Veículos adequados podem ser macromoléculas grandes e lentamente metabolizadas, tais como proteínas, polipeptídeos, lipossomos, polisacarídeos, ácidos polilácticos, ácidos poliglicólicos, aminoácidos poliméricos, copolímeros de aminoácido e partículas virais inativas.

Sais farmaceuticamente aceitáveis podem ser utilizados, por exemplo, sais de ácido mineral, tais como cloridratos, bromidratos, fosfatos e sulfatos, ou sais de ácidos orgânicos, tais como acetatos, propionatos, malonatos e benzoatos.

Veículos farmaceuticamente aceitáveis em composições terapêuticas podem ainda conter líquidos tais como água, solução fisiológica, glicerol e etanol. Além disso, substâncias auxiliares, tais como agentes umectantes ou emulsificantes ou substâncias tampão de pH, podem estar presentes nessas composições. Esses veículos permitem que as composições farmacêuticas sejam formuladas como comprimidos, pílulas, drágeas, cápsulas, líquidos, géis, xaropes, massas fluidas e suspensões, para ingestão pelo paciente.

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No escopo da invenção, formas de administração podem incluir aquelas adequadas para administração parenteral, por exemplo, por injeção ou infusão, por exemplo por injeção em bolus ou infusão contínua. Quando o produto for para injeção ou infusão, pode assumir a forma de uma suspensão, solução ou emulsão em um veículo oleoso Ou aquoso e pode conter agentes de formulação, tais como agentes de suspensão, conservantes, estabilizantes e/ou dispersantes. Alternativamente, a molécula do anticorpo pode estar na forma anidra para reconstituição antes do uso com um líquido estéril adequado.

Uma vez formuladas, as composições da invenção podem ser administradas diretamente ao indivíduo. Em uma configuração, as composições são adaptadas para administração a humanos.

As composições farmacêuticas da presente invenção podem ser administradas por diversas vias incluindo, entre outras, as vias oral, intravenosa, intramuscular, intra- arterial, intramedular, intraperitoneal, intratecal, intraventricular, transdérmica, transcutânea, tópica, subcutânea, intranasal, enteral, sublingual, intravaginal ou retal. Hiposprays também “podem ser utilizados para administrar as composições farmacêuticas da invenção. Tipicamente, as composições terapêuticas podem ser preparadas como injetáveis, soluções líquidas ou Suspensões. Formas sólidas adequadas para solução em, ou suspensão em, veículos líquidos antes da injeção também podem ser preparadas.

A administração direta das composições será geralmente realizada por injeção subcutânea, intraperitoneal, intravenosa ou intramuscular, ou pelo espaço intersticial de um tecido. O tratamento posológico pode ser um cronograma de dose única ou um cronograma de múltiplas doses. Os produtos farmacêuticos à base de anticorpos incluem orientações sobre | a frequência de administração, por exemplo, se o produto farmacêutico deve ser administrado diariamente, semanalmente, mensalmente, etc. A frequência e a dosagem também podem depender da gravidade dos sintomas.

As composições da invenção podem ser preparadas de várias formas. Por exemplo, as composições podem ser preparadas como injetáveis, tanto como soluções líquidas como suspensões. As formas sólidas adequadas para solução, Ou suspensão, em veículos líquidos antes da injeção também podem ser preparadas (por exemplo, uma composição liofilizada, tal como Synagis" e Herceptin", para reconstituição com água estéril contendo um conservante). A composição pode ser preparada para administração tópica, por exemplo, como uma pomada, creme ou pó. A composição pode ser preparada para administração oral, por exemplo, como um comprimido ou cápsula, como um spray, ou como um xarope (opcionalmente aromatizado). A composição pode ser preparada para administração pulmonar, por exemplo, como um inalador, utilizando um pó fino ou um spray. A composição pode ser preparada como um supositório ou pessário. A composição pode ser preparada para administração nasal, aural ou ocular, por exemplo, como gotas. A composição pode estar na forma de um kit, projetado de modo que uma composição combinada seja reconstituída pouco antes da administração a um paciente, Por exemplo, um anticorpo liofilizado pode ser provido em forma de kit com água estéril ou um tampão estéril.

Será apreciado que o princípio ativo na composição será uma molécula de anticorpo, um fragmento de anticorpo ou variantes e derivados destes. Assim, este será susceptível à degradação no trato gastrointestinal. Desta forma, se a composição precisar ser administrada por uma via que utiliza o trato gastrointestinal, a composição precisará conter agentes que protejam o anticorpo contra a degradação, porém |

' . que libere o anticorpo depois de absorvido do trato gastrointestinal.

Uma discussão completa de veículos farmaceuticamente aceitáveis está disponível em Gennaro (2000) Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20th edition, ISBN: 0683306472.

As composições farmacêuticas da invenção têm geralmente um pH entre 5,5 e 8,5, em algumas configurações este valor pode variar entre 6 e 8, e ainda em outras configurações pode ser de aproximadamente 7. O pH pode ser mantido utilizando-se um tampão. A composição pode ser estéril e/ou apirogênica. A composição pode ser isotônica aos humanos. Em uma configuração, as composições farmacêuticas da invenção são fornecidas em recipientes hermeticamente vedados.

As composições farmacêuticas incluirão uma quantidade terapeuticamente eficaz de um ou mais anticorpos da invenção e/ou de um polipeptídeo compreendendo um epítopo que liga um anticorpo da invenção, ou seja, uma quantidade que é suficiente para tratar, melhorar ou evitar uma doença ou condição pretendida, Ou para apresentar um efeito terapêutico detectável. Os efeitos terapêuticos também incluem a redução dos sintomas físicos. A quantidade eficaz precisa para qualquer indivíduo em particular dependerá do tamanho e da saúde, a natureza e a extensão da condição, e os agentes terapêuticos ou combinação de agentes terapêuticos selecionados para administração. A quantidade eficaz para uma determinada situação é determinada pela experimentação de rotina e está dentro do julgamento de um clínico. Para os propósitos da presente invenção, uma dose eficaz geralmente variará de aproximadamente 0,01 mg/kg a aproximadamente 50 mg/kg, ou de aproximadamente 0,05 mg/kg a aproximadamente 10 mg/kg das composições da presente invenção no indivíduo ao | qual é administrada. Produtos farmacêuticos conhecidos à base de anticorpos incluem orientações a este respeito, por exemplo, o Herceptin" é administrado por infusão intravenosa de uma solução de 21 mg/ml, com uma dose inicial de ataque de 4 mg/kg de peso corporal e uma dose semanal de manutenção de 2 mg/kg de peso corporal; o Rituxan" é administrado semanalmente na dose de 375 mg/mº; etc.

Em uma configuração, as composições farmacêuticas podem incluir mais que um (por exemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, eto.) anticorpo da invenção. Em outra configuração, a composição compreende dois ou mais (por exemplo, 2, 3, 4, 5, etc.) anticorpos, onde o primeiro anticorpo ê específico para um primeiro epítopo DENV, e o segundo anticorpo é específico para um segundo epítopo DENV. Ainda, em outra configuração, a composição farmacêutica compreende três anticorpos da invenção. Em outra configuração, a composição compreende dois ou mais (por exemplo, 2, 3, 4, 5, etc.) anticorpos que, juntos, neutralizam mais que um sorotipo do vírus da dengue. Ainda, em outra configuração, os dois ou mais anticorpos da invenção juntos neutralizam todos os quatro sorotipos do vírus da dengue, DENV-l, DENV-2, DENV-3 e DENV-4. Em uma outra configuração, dois ou mais anticorpos da invenção juntos neutralizan todos os quatro sorotipos do vírus da dengue pela ligação de pelo menos dois epítopos distintos em cada sorotipo do vírus da dengue.

Exemplos de anticorpos da invenção, para uso em uma composição farmacêutica, que neutralizam um vírus da dengue sem contribuir para o aumento da infecção pelo vírus da dengue dependente do anticorpo incluem, entre outros, HMB- DV1, HMB-DV2, HMB-DV3, HMB-DV4, HMB-DV5, HMB-DV6, HMB-DV7, HMB-DV8, HMB-DV9, HMB-DV10, HMB-DV11, HMB-DV12, HMB-DV13 e HMB-DV14.

Em uma configuração, uma composição farmacêutica | inclui dois exemplos de anticorpos da invenção, por exemplo, HMB-DV3 e HMB-DV7; HMB-DV3 e HMB-DV9; HMB-DV3 e HMB-DV12; HMB-DV3 e HMB-DV14; HMB-DV6 e HMB-DV7; HMB-DV6 e HMB-DV8. Em outra configuração, a composição farmacêutica inclui três exemplos de anticorpos da invenção, por exemplo, HMB-DV2, HMB-DV3 e HMB-DV6; HMB-DV2, HMB-DV6 e HMB-DV8; HMB-DV2, HMB- DV8 e HMB-DV9; HMB-DV2, HMB-DV8 e HMB-DV12; HMB-DV2, HMB-DV8 e HMB-DVI4; HMB-DVS5, HMB-DV6 e HMB-DV8. Com base nos ensinamentos da presente invenção, um técnico no assunto pode determinar outras combinações de anticorpos para uso em uma composição farmacêutica.

Em uma configuração, a invenção provê uma composição farmacêutica compreendendo o anticorpo HMB-DV1 ou um fragmento de ligação do antígeno do mesmo, e um diluente ou veículo farmaceuticamente aceitável. Em outra configuração, a invenção provê a composição farmacêutica compreendendo o anticorpo HMB-DV2 ou um fragmento de ligação do antígeno do mesmo, e um diluente ou veículo farmaceuticamente aceitável. Em outra configuração, a invenção provê uma composição farmacêutica compreendendo o anticorpo HMB-DV3 ou um fragmento de ligação do antígeno do mesmo, e um diluente ou veículo farmaceuticamente aceitável. Em outra configuração, a invenção provê uma composição farmacêutica compreendendo o anticorpo HMB-DV4 Ou um fragmento de ligação do antígeno do mesmo, e um diluente ou veículo farmaceuticamente aceitável. Ainda, em outra configuração, a invenção provê uma composição farmacêutica compreendendo o anticorpo HMB-DV5 ou um fragmento de ligação do antígeno do mesmo, e um diluente ou veículo farmaceuticamente aceitável. Em outra configuração, a invenção provê uma composição farmacêutica compreendendo o anticorpo HMB-DV6 ou um fragmento de ligação do antígeno do mesmo, e um diluente ou veículo farmaceuticamente aceitável.

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Em outra configuração, a invenção provê uma composição farmacêutica compreendendo oO anticorpo HMB-DV7 ou um fragmento de ligação do antígeno do mesmo, e um diluente ou veículo farmaceuticamente aceitável.

Ainda, em outra configuração, a invenção provê uma composição farmacêutica compreendendo o anticorpo HMB-DV8 ou um fragmento de ligação do antígeno do mesmo, e um diluente ou veículo farmaceuticamente aceitável. Em outra configuração, a invenção provê uma composição farmacêutica compreendendo o anticorpo HMB-DV9 ou um fragmento de ligação do antígeno do mesmo, e um diluente ou veículo farmaceuticamente aceitável. Em outra configuração, a invenção provê uma composição farmacêutica compreendendo O anticorpo HMB-DV10 ou um fragmento de ligação do antígeno do mesmo, e um diluente ou veículo farmaceuticamente aceitável. Ainda, em outra configuração, a invenção provê uma composição farmacêutica compreendendo o anticorpo HMB-DVI1l Ou um fragmento de ligação do antígeno do mesmo, e um diluente ou veículo farmaceuticamente aceitável. Em outra configuração, a invenção provê uma composição farmacêutica compreendendo o anticorpo HMB-DV12 ou um fragmento de ligação do antígeno do mesmo, e um diluente ou veículo farmaceuticamente aceitável. Em outra configuração, a invenção provê uma composição farmacêutica compreendendo o anticorpo HMB-DVI3 ou um fragmento de ligação do antígeno do mesmo, e um diluente ou veículo . farmaceuticamente aceitável. Ainda, em outra configuração, a invenção provê uma composição farmacêutica compreendendo o anticorpo HMB-DV14 ou um fragmento de ligação do antígeno do mesmo, e um diluente ou veículo farmaceuticamente aceitável.

Anticorpos da invenção podem ser administrados (tanto “combinados como separados) com outros agentes terapêuticos, por exemplo, com compostos quimioterápicos, com | radioterapia, etc.

Os compostos terapêuticos preferidos incluem compostos anti-virais.

Essa terapia combinada provê uma melhora aditiva ou sinergística da eficácia terapêutica em relação aos agentes terapêuticos individuais quando administrados isoladamente.

O termo “sinergia” é utilizado para descrever um efeito combinado de dois ou mais agentes ativos que é maior que à soma dos efeitos individuais de cada respectivo agente ativo.

Assim, quando o efeito combinado de dois ou mais agentes resulta na “inibição sinergística” de uma atividade ou processo, a intenção é que a inibição da atividade ou processo seja maior que à Soma dos efeitos inibitórios de cada respectivo agente ativo.

O termo “efeito terapêutico sinergístico” refere-se a um efeito terapêutico observado com uma combinação de duas ou mais terapias, onde o efeito terapêutico (conforme medido por qualquer número de parâmetros) é maior que a soma dos efeitos terapêuticos individuais observados com as respectivas terapias individuais.

Em composições da invenção que incluem anticorpos da invenção, os anticorpos podem totalizar pelo menos 50% em peso (por exemplo, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 297%, 98%, 99% ou mais) da proteína total na composição.

Os anticorpos estão assim na forma purificada.

A invenção provê um método de preparação de uma composição farmacêutica compreendendo as etapas de: (i) preparação de um anticorpo da invenção; e (ii) mistura do anticorpo purificado com um ou mais veículos farmaceuticamente aceitáveis.

A invenção também provê um método de preparação de uma composição farmacêutica, compreendendo a etapa de mistura de um anticorpo com um ou mais veículos farmaceuticamente aceitáveis, onde o anticorpo é um anticorpo monoclonal que foi obtido a partir de uma célula B transformada da invenção. |

, + Assim, os procedimentos para primeira obtenção do anticorpo monoclonal e então preparação da composição farmacêutica podem ser realizados em horários muito diferentes, por pessoas diferentes e em diferentes locais (por exemplo, em diferentes países).

Como uma alternativa à administração dos anticorpos para fins terapêuticos, é possível administrar o ácido nucléico (geralmente DNA) que codifica o anticorpo monoclonal (ou fragmento ativo deste) de interesse a um indivíduo, de modo que O ácido nucléico possa ser expresso no indivíduo in situ para proporcionar um efeito terapêutico desejado. A terapia genética adequada e Os vetores de administração do ácido nucléico são conhecidos na técnica.

As composições da invenção podem ser composições imunogênicas e, em algumas configurações, podem ser composições de vacina compreendendo um antígeno compreendendo um epítopo DENV. As vacinas de acordo com a invenção podem ser tanto profiláticas (ou seja, para prevenir a infecção) como terapêuticas (ou seja, para tratar a infecção).

As composições podem incluir um agente antimicrobiano, particularmente se acondicionado em um formato de dose múltipla. As composições podem compreender detergente, por exemplo, um Tween (polissorbato), tal como Tween 80. Os detergentes estão geralmente presentes em baixos níveis, por exemplo, <0,01%. As composições podem incluir sais de sódio (por exemplo, cloreto de sódio) para conferir tonicidade. Uma concentração de 10 + 2 mg/ml de NaCl é típica.

As composições podem compreender um álcool de açúcar (por exemplo, manitol) ou um dissacarídeo (por exemplo, sacarose ou trealose), por exemplo, por volta de 15- 30 mg/ml (por exemplo, 25 mg/ml), particularmente se precisarem ser liofilizados ou se incluírem material que foi | reconstituído a partir de material liofilizado.

O pH de uma composição “para liofilização pode ser ajustado para aproximadamente 6.1 antes da liofilização.

As composições da invenção também podem compreender um ou mais agentes imunorreguladores.

Em uma configuração, um ou mais dos agentes imunorreguladores inclui um adjuvante.

Tratamentos e usos clínicos Os anticorpos, fragmentos de ligação a antígeno, derivados e variantes destes, ou os coquetéis e composições farmacêuticas da invenção, podem ser utilizados para O tratamento da infecção por DENV, para a prevenção da infecção por DENV ou para o diagnóstico da infecção por DENV.

Os métodos de diagnóstico podem incluir o contato de um anticorpo ou de um fragmento de anticorpo com uma amostra.

Essas amostras podem ser amostras de tecido retiradas, por exemplo, de glândulas salivares, pulmão, fígado, pâncreas, rins, orelhas, olhos, placenta, trato alimentar, coração, ovários, hipófise, adrenais, tireóide, cérebro ou pele.

Os métodos de diagnóstico também podem incluir a detecção de um complexo antígeno/anticorpo. - A invenção, portanto, provê (i) um anticorpo, um fragmento de anticorpo, ou variantes e derivados deste de acordo com a invenção, (ii) um clone de célula B imortalizado de acordo com à invenção, (iii) um epítopo capaz de se ligar a um anticorpo da invenção Ou (iv) um ligante, preferencialmente um anticorpo, capaz de se ligar a um epítopo que liga um anticorpo da invenção para uso em terapia.

É também provido um método de tratamento de um indivíduo compreendendo a administração ao referido indivíduo de (i) um anticorpo, um fragmento de anticorpo, variantes e derivados deste, ou uma composição farmacêutica de acordo com a invenção, ou, um ligante, preferencialmente um anticorpo, | capaz de se ligar a um epítopo que liga um anticorpo da invenção.

A invenção também provê o uso de (i) um anticorpo, um fragmento de anticorpo, ou variantes e derivados deste, de acordo com a invenção, (ii) um clone de célula B imortalizado de acordo com a invenção, (iii) um epítopo capaz de se ligar a um anticorpo da invenção, ou (iv) um ligante, preferencialmente um anticorpo, que se liga a um epítopo capaz de se ligar a um anticorpo da invenção, na produção de um medicamento para a prevenção ou tratamento da infecção por DENV.

A invenção provê uma composição farmacêutica para uso como um medicamento para a prevenção ou tratamento da infecção por DENV. Provê também o uso de um anticorpo da invenção e/ou uma proteína compreendendo um epítopo ao qual esse anticorpo se liga na produção de um medicamento para o tratamento de um paciente e/ou para o diagnóstico em um paciente. Provê também um método para o tratamento de um indivíduo, por exemplo, um humano. O método compreende a etapa de administração, ao indivíduo, de uma dose terapeuticamente eficaz de uma composição da invenção. Uma forma de verificar a eficácia do tratamento terapêutico envolve o monitoramento de sintomas da doença após à administração da composição da invenção. O tratamento pode ser um cronograma de dose única ou um cronograma de dose múltipla.

Em uma configuração, um anticorpo, fragmento de anticorpo, uma variante de anticorpo, epítopo ou composição farmacêutica de acordo com a invenção é administrado a um indivíduo que necessita do referido tratamento. Esse indivíduo inclui, entre outros, aquele que particularmente corre risco ou está susceptível à infecção por DENV, Os anticorpos da invenção podem ser utilizados na | imunização passiva. Os anticorpos e fragmentos ou variantes destes, ou um ácido nucléico que codifica um anticorpo ou um fragmento de anticorpo ou uma variante conforme descrito na presente invenção, também pode ser utilizado em um kit para o diagnóstico da infecção pelo vírus da dengue.

Os epítopos capazes de se ligar a um anticorpo da invenção, por exemplo, os anticorpos monoclonais HMB-DV1, HMB-DV2, HMB-DV3, HMB-DV4, HMB-DV5, HMB-DV6, HMB-DV7, HMB- DV8, HMB-DV9, HMB-DVl10, HMB-DV11, HMB-DV12, HMB-DV13 e HMB- DVl4, podem ser utilizados em um kit para monitoramento da eficácia dos procedimentos de vacinação pela detecção da presença de anticorpos protetores anti-DENV.

Os anticorpos, fragmentos “de anticorpo, ou variantes e derivados destes, conforme descritos na presente invenção, também podem ser utilizados em um kit para monitorar a produção de vacina com a imunogenicidade desejada.

A invenção também provê um método de preparação de uma composição farmacêutica, compreendendo a etapa de mistura de um anticorpo monoclonal com um ou mais veículos farmaceuticamente aceitáveis, onde o anticorpo monoclonal é um anticorpo monoclonal que foi obtido a partir de um hospedeiro de expressão da invenção. Assim, os procedimentos para a primeira obtenção do anticorpo monoclonal (por exemplo, que Oo expressa e/ou o purifica) e então a mistura deste com o(s) veículo(s) farmacêutico(s), podem ser realizados em horários muito diferentes, por pessoas diferentes e em diferentes locais (por exemplo, em diferentes países).

Começando com uma célula B transformada da invenção, várias etapas de cultura, Sub-cultura, clonagem, sub-clonagem, sequenciamento, preparação de ácido nucléico etc., podem ser realizadas para perpetuar O anticorpo | expresso pela célula B transformada, com a otimização ideal de cada etapa.

Em uma configuração preferida, os métodos acima compreendem ainda técnicas de otimização (por exemplo, maturação ou otimização da afinidade) aplicadas aos ácidos nucléicos que codificam o anticorpo.

A invenção abrange todas as células, ácidos nucléicos, vetores, sequências, anticorpos etc. utilizadas e preparadas durante essas etapas.

Em todos esses métodos, o ácido nucléico utilizado no hospedeiro de expressão pode ser manipulado para inserir, deletar ou alterar determinadas sequências de ácido nucléico.

Alterações a partir dessa manipulação incluem, entre outras, alterações para introduzir sítios de restrição, para alterar o uso de códon, para acrescentar ou otimizar sequências reguladoras de transcrição e/ou tradução, etc.

É também possível alterar o ácido nucléico para assim alterar oOs aminoácidos codificados.

Por exemplo, pode ser útil introduzir uma ou mais (por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, etc.) substituições, deleções e/ou inserções de aminoácido na seqúência de aminoácido do anticorpo.

Essas mutações de ponto podem modificar funções efetoras, afinidade de ligação ao antígeno, modificações pós-tradução, imunogenicidade, etc., podem introduzir aminoácidos para a ligação de grupos covalentes (por exemplo, marcadores) ou podem “introduzir tags (por "exemplo, para fins de purificação). As mutações podem ser introduzidas em sítios específicos ou podem ser introduzidas aleatoriamente, seguidas pela seleção (por exemplo, avaliação molecular). Por exemplo, um ou mais ácidos nucléicos que codificam quaisquer das regiões CDR, regiões variáveis de cadeia pesada Ou regiões variáveis de cadeia leve de anticorpos da invenção podem aleatoriamente ou direcionalmente sofrer mutação para introduzir diferentes propriedades nos aminoácidos codificados.

Essas alterações podem ser o resultado de um

| processo iterativo onde alterações iniciais são mantidas e novas alterações em outras posições no nucleotídeo são introduzidas. Além disso, alterações realizadas em etapas independentes podem ser combinadas. Diferentes propriedades introduzidas nos aminoácidos codificados podem incluir, entre outras, afinidade aperfeiçoada.

Aspectos gerais O termo “compreendendo” abrange “incluindo”, bem como “consistindo em”, por exemplo, uma composição “compreendendo” X pode consistir exclusivamente em X ou pode incluir algo a mais, por exemplo, X + Y.

A palavra “substancialmente” não exclui a palavra “completamente”, por exemplo, uma composição que é “substancialmente livre” de Y pode ser completamente livre de Y. Quando necessário, a palavra “substancialmente” “pode ser omitida da definição da invenção.

O termo “aproximadamente” em relação a um valor numérico x significa, por exemplo, x + 10%.

O termo “doença” conforme aqui utilizado deve ser geralmente sinônimo e é utilizado de forma intercambiável com os termos “distúrbio” e “condição” (como em uma condição clínica), pois todos refletem uma condição anormal do corpo humano ou animal ou de uma de suas partes que compromete o funcionamento normal, é geralmente manifestada por sinais e sintomas distintos, e faz com que o humano ou animal tenha uma duração ou qualidade de vida reduzida.

Conforme aqui utilizado, a referência ao “tratamento” de um paciente deve incluir a prevenção e a profilaxia, bem como a terapia. O termo “paciente” significa todos os mamíferos, incluindo os humanos. De modo geral, o paciente é um humano.

EXEMPLOS , Exemplos de configurações da presente invenção são | providos a seguir.

Os exemplos a seguir são apresentados somente por meio de ilustração e para auxiliar os técnicos no assunto durante o uso da invenção.

Os exemplos não devem de forma alguma limitar o escopo da invenção.

Exemplo 1. Clonagem de Células B e Triagem para Identificação de Abs Específico do Vírus da Dengue.

As células B de memória foram isoladas a partir do sangue de doadores imunes ao DENV e imortalizadas utilizando EBV e CpG conforme descrito na referência.

Em suma, células B de memória IgG* foram isoladas utilizando beads de CD22, seguida da remoção de células B de IgM', IgD' IgA* utilizando anticorpos específicos e classificação celular.

As células (Ige*) classificadas foram imortalizadas com EBV na presença . de CpG 2006 e de células mononucleares alogênicas irradiadas. " 15 As culturas em replicata, cada uma contendo de 30 a 50 - células B de memória foram dispostas em várias placas de fundo em U de 96 poços.

Após duas semanas, os sobrenadantes da cultura foram coletados e testados quanto à sua capacidade de corar células C6/36 infectadas com DENV dos sorotipos 1, 2, 30ou4 por análise de imunofluorescência e/ou quanto à sua capacidade de se ligar a proteínas DENV1-4 E2 recombinantes por ELISA.

Os sobrenadantes foram testados quanto à sua capacidade de neutralizar a infecção por DENV tanto de células VERO como de células Raji transfectadas com DC-SIGN e quanto à sua capacidade de aumentar a infecção de células K562. Clones de célula B foram isolados a partir de culturas policlonais positivas conforme descrito anteriormente [28]. Concentrações de IgG no sobrenadante de clones selecionados foram determinadas utilizando um teste ELISA específico de IgG.

Exemplo 2. mAbs Humanos de Células B Imortalizadas Reconhecem as Proteínas do Vírus da Dengue e Neutralizam a Infecção. |

Para a neutralização viral e o ensaio de aumento viral, quantidades tituladas de DENV atenuado de sorotipos 1, 2, 3 ou 4 foram misturadas com um volume igual de sobrenadantes de cultura. Os vírus e a multiplicidade de infecção (MOI) utilizados foram: rDEN1IA30 (03JB186-1A+V2) MOI 0,04; rDEN2/4A30 (04IBV351-1A-V2) MOI 0,04; YDEN3/4430 (DEN3tH107C) MOI 0,02; rDEN4A30 (O6JBV591-V3+1Al+v2) MOI 0,04. Após a incubação de 1 hora em temperatura ambiente, a mistura foi adicionada às células-alvo (por exemplo, células VERO, células Raji transfectadas com DC-SIGN ou células K562) em placas de fundo plano de 96 poços e incubadas a 37ºC por 72 à 96 horas. As células foram então coradas com um anticorpo monoclonal de camundongo contra as proteínas E do vírus da « dengue 1-4 (clone 4G2), seguido de um Ig de cabra anti- ': 15 camundongo marcado com fluoresceína e analisadas por FACS. O ' título neutralizante é indicado como a concentração de anticorpo (pg/ml) que proporciona uma redução de 50% da infecção por DENV.

Para identificação dos antígenos-alvo reconhecidos pelos anticorpos monoclonais, as leveduras que apresentam domínios III ou domínio I-II de proteína E do vírus da dengue foram coradas com os anticorpos monoclonais seguidos de anticorpos de IgG de cabra anti-humano marcados com Cy5 e analisados por FACS. Experimentos de Western blotting foram realizados utilizando lisados de células infectadas por DENV. A Tabela 3 demonstra que três diferentes tipos de anticorpos “foram identificados. Eles incluem aqueles específicos para o domínio III (DIII) da proteína E, aqueles específicos para os domínios I-II (DI-II) da proteína E e aqueles específicos para prM. Os anticorpos demonstram diferentes graus de reatividade cruzada com 4 diferentes DENV sorotipos e neutralizam os sorotipos aos quais se ligam.

|

Essa propriedade poderia limitar a eficácia terapêutica de | anticorpos contra o vírus da dengue para uso em situações e clínicas.

Portanto, mRNAS das linhagens de célula B imortalizadas que expressam os anticorpos HMB-DV-5, HMB-DV-6 e HMB-DV-8 foram isoladas, o CDNA foi sintetizado utilizando primers específicos oligo-dT, regiões variáveis de cadeia pesada e leve foram sequenciadas e clonadas em um vetor de expressão utilizando primers específicos.

Os vetores foram transfectados em células hospedeiras para expressão recombinante.

Além da produção recombinante dos anticorpos IgGl do tipo selvagem, cada uma das cadeias pesadas sofreu mutação nos aminoácidos 4 e 5 do domínio CH2 pela ' substituição de uma alanina no lugar da leucina natural utilizando mutagênese direcionada ao sítio, criando assim a variante LALA de cada anticorpo.

Tanto os anticorpos recombinantes do tipo selvagem como aqueles que sofreram mutação foram coletados das linhagens de célula de expressão e purificados.

Tanto o anticorpo IgG1l do tipo selvagem contra o vírus da dengue como a variante LALA se ligam à proteína- |

. » alvo de forma comparável (dados não mostrados).

A neutralização e o aumento viral foram determinados conforme acima em células VERO e em células K562. Cada um destes três anticorpos tem um alvo molecular definido, bem como o alvo do sorotipo (vide Tabela 3). A Figura 1 mostra que os anticorpos recombinantes não- modificados neutralizam a infecção pelo vírus-alvo de células VERO de forma dependente da dose (LINHAS PONTILHADAS). Nas células K562, uma linhagem celular que não é eficientemente infectada pelo vírus da dengue, os anticorpos não-modificados demonstram um aumento da infecção viral em concentrações que são geralmente maiores que aquelas exigidas para a neutralização (LINHAS CONTÍNUAS). O experimento foi repetido utilizando as variantes LALA de cada anticorpo. A Figura 2 . 15 mostra que cada uma das variantes LALA dos anticorpos recombinantes contra o vírus da dengue também neutralizou o " vírus-alvo em células VERO (LINHAS PONTILHADAS) de uma forma dependente da dose. No entanto, nenhum dos anticorpos LALA demonstrou evidência de aumento da infecção dependente do anticorpo em células K562 (LINHAS CONTÍNUAS). Nota: a resposta à dose é plana nas células K562 nas concentrações dos anticorpos utilizados neste experimento e a linha parece muito próxima do eixo X.

Todas as patentes e publicações aqui mencionadas são expressamente incorporadas na íntegra por referência.

Deve ser observado que existem formas alternativas de implementar a presente invenção e que várias modificações podem ser feitas sem sair do escopo e do espírito da invenção. Assim, as presentes configurações devem ser consideradas como ilustrativas e não como limitativas, e a invenção não deve ser limitada aos detalhes apresentados abaixo, porém podem ser modificadas no escopo e equivalentes das reivindicações anexas.

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“ ho REFERÊNCIAS (cujo teor é aqui incorporado por referência)

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[9] US 4,766,106

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[27] US 6,300,104

[28] Traggiai et al. (2004) Nat Med 10(8) :871-875 |

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. ANTICORPO HUMANO, ou um fragmento de ligação do antígeno do mesmo, que neutraliza um vírus da dengue, E Fes! caracterizado em que O anticorpo não contribui para O aumento -—5 da infecção pelo vírus da dengue dependente do anticorpo.

e. 2. ANTICORPO HUMANO, ou um fragmento de ligação do antígeno do mesmo, que neutraliza um vírus da dengue, caracterizado em que o anticorpo compreende uma mutação na região Fc, e onde a mutação reduz a ligação do anticorpo à um receptor de Fc.

3. ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, ou um fragmento de ligação do antígeno do mesmo, caracterizado em que a região Fc do anticorpo compreende uma mutação CH2 L4A, uma mutação cH2 L5A,. ou ambas. eee ecra Ee á 15 AA

4. ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado em que O anticorpo é um anticorpo monoclonal ou um anticorpo recombinante. . . . 1. -=-=---—>—->- -.- niatããa

5, ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado em que O anticorpo neutraliza mais que um vírus da dengue de dois, três ou quatro diferentes sorotipos do vírus da dengue.

6. COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, compreendendo dois ou mais anticorpos humanos, ou fragmentos de ligação do antígeno do mesmo, caracterizada em que os anticorpos, Ou fragmentos de ligação a antígeno destes, neutralizam os sorotipos do vírus da dengue DENV-l, DENV-2, DENV-3 e DENV-4 pela ligação de pelo menos dois epítopos distintos em cada sorotipo do Ê vírus da dengue, e onde os anticorpos não contribuem para O aumento da infecção pelo vírus da dengue dependente do anticorpo.

VV. COMPOSIÇÃO, de acordo com a reivindicação 6, . caracterizada por compreender três ou mais anticorpos humanos, ou fragmentos de ligação do antígeno do mesmo, que neutralizam os sorotipos do vírus da dengue DENV-1, DENV-2, DENV-3 e DENV-4.

8. COMPOSIÇÃO, de acordo com a reivindicação 65, e. caracterizada em que os anticorpos, ou fragmentos de ligação .5 dos antígenos dos mesmos, compreendem, cada um, uma mutação -- na região Fc que reduz a ligação dos anticorpos aos receptores de Fc.

9. COMPOSIÇÃO, de acordo com a reivindicação 6, caracterizada em que a região Fc de cada um dos anticorpos, ou fragmentos de ligação a antígeno dos mesmos, compreende uma mutação CH2 L4A, uma mutação CH2 L5A, Ou ambas.

10. COMPOSIÇÃO, de acordo com a reivindicação 6, caracterizada em que os anticorpos, ou fragmentos de ligação a antígeno dos mesmos, são anticorpos monoclonais OU... anticorpos recombinantes.

11. ANTICORPO, ou um fragmento de ligação do antígeno do mesmo, compreendendo pelo menos, uma sequência. de. . a. Ê região de determinação de complementaridade (CDR) tendo a sequência de qualquer um dos IDs de SEQ Nº: 1-6, 17-22, 33- 38, 49-54, 67-72, 83-88, 99, 100, 105-110, 121-123, 124, 125, 135-139, 149, 153-158, 169-174, 185-188 ou 189, caracterizado em que o anticorpo neutraliza a infecção pelo vírus da dengue.

12. ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 1, 2 ou 11, ou um fragmento de ligação do antígeno do mesmo, compreendendo uma CDRl de cadeia pesada selecionada do grupo Â consistindo nos IDs de SEQ Ne: 1 7 sa, 149, 67, 83, 105, À 121, 135, 149, 153, 169, e 185; uma CDR2 de cadeia pesada selecionada do grupo consistindo nos IDs de SEQ Nº: 2, 18, 34, 50, 68, 84, 106, 122, 136, 154, 170, e 186; e uma CDR3 de cadeia pesada selecionada do grupo consistindo nos IDs de SEQ Nº: 3, 19, 35, 51, 69, 85, 107, 123, 137, 155, 171, e 187, caracterizado em que o anticorpo neutraliza a infecção pelo —

vírus da dengue.

13. ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 1, 2 ou 11, ou um fragmento de ligação do antígeno do mesmo, ss. compreendendo uma CDR1 de cadeia leve selecionada do grupo 15 consistindo nos IDs de SEQ Nº: 4, 20, 36, 52, 70, 86, 99, e. 108, 138, 156, 272, e 188; uma CDR2 de cadeia leve selecionada do grupo consistindo nos IDs de SEQ Nº: 5, 21, 37, 53, 71, 87, 109, 124, 157, e 173; e uma CDR3 de cadeia leve selecionada do grupo consistindo nos IDs de SEQ Nº: &, 22, 38, 54, 72, 88, 100, 110, 125, 139, 158, 174, e 189, caracterizado em que o anticorpo neutraliza a infecção pelo vírus da dengue.

14. ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 12, ou um fragmento de ligação do antígeno do mesmo, . . .. e “35” caracterizado por compreender uma cadeia pesada compreendendo ID de SEQ Nº: 1 para CDRH1, ID de SEQ Nº: 2 para CDRH2, ID de SEQ Nº: 3 para CDRH3; ID de SEQ Nº: 17 para CDRH1,. TD de. SEQ: f À Nº: 18 para CDRH2 e ID de SEQ Nº: 19 para CDRH3; ID de SEQ Nº: 33 para CDRH1, ID de SEQ Nº: 34 para CDRH2 e ID de SEQ Nº: 35 para CDRH3; ID de SEQ Nº: 49 para CDRH1, ID de SEQ Nº: 50 para CDRH2 e ID de SEQ Nº: 51 para CDRH3; ID de SEQ Nº: 67 para CDRH1, ID de SEQ Nº: 68 para CDRH2 e ID de SEQ Nº: 69 para CDRH3; ID de SEQ Nº: 83 para CDRH1, ID de SEQ Nº: 84 para CDRH2 e ID de SEQ Nº: 85 para CDRH3; ID de SEQ Nº: 105 para CDRHI, ID de SEQ Nº: 106 para CDRH2 e ID de SEQ Nº: 107 para CDRH3; ID de SEQ Nº: 121 para CDRH1, ID de SEQ Nº: 122 para CDRH2 e ID de SEQ Nº: 123 para CDRH3; ID de SEQ Nº: 135 f para CDRH1, ID de SEQ Nº: 136 para CDRH2 e ID de SEQ Nº: 137 para CDRH3; ID de SEQ Nº: 149 para CDRH1, ID de SEQ Nº: 136 para CDRH2 e ID de SEQ Nº: 137 para CDRH3; ID de SEQ Nº: 153 para CDRH1, ID de SEQ Nº: 154 para CDRH2 e ID de SEQ Nº: 155 para CDRH3; ID de SEQ Nº: 169 para CDRH1, ID de SEQ Nº: 170 para CDRH2 e ID de SEQ Nº: 171 para CDRH3; e ID de SEQ Nº:

185 para CDRH1, ID de SEQ Nº: 186 para CDRH2 e ID de SEQ Nº: 187 para CDRH3.

15. ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 13, Naa ou um fragmento de ligação do antígeno do mesmo, 15 caracterizado por compreender uma cadeia leve compreendendo “ ID de SEQ Nº: 4 para CDRLI, ID de SEQ Nº: 5 para CDRL2; ID de SEQ Nº: 6 para CDRL3; ID de SEQ Nº: 20 para CDRL1, ID de SEQ Nº: 21 para CDRL2; ID de SEQ Nº: 22 para CDRL3; ID de SEQ Nº: 36 para CDRL1, ID de SEQ Nº: 37 para CDRL2; ID de SEQ Nº: 38 para CDRL3; ID de SEQ Nº: 52 para CDRL1, ID de SEQ Nº: 53 para CDRL2; ID de SEQ Nº: 54 para CDRL3; ID de SEQ Nº: 70 para CDRL1, ID de SEQ Nº: 71 para CDRL2; ID de SEQ Nº: 72 para CDRL3; ID de SEQ Nº: 86 para CDRL1, ID de SEQ Nº: 87 para CDRL2; ID de SEQ Nº: 88 para CDRL3; ID de SEQ Nº: 99 pará CDRLI, ID de SEQ Nº: 53 para CDRL2; ID de SEQ Nº: 100 para CDRL3; ID de SEQ Nº: 108 para CDRL1, ID de SEQ Nº: 109 para CDRL2; ID de SEQ Nº: 110 para CDRL3; TD de SEQ Nº: 70 .- õ para CDRL1, ID de SEQ Nº: 124 para CDRL2; ID de SEQ Nº: 125 para CDRL3; ID de SEQ Nº: 138 para CDRL1I, ID de SEQ Nº: 109 para CDRL2; ID de SEQ Nº: 139 para CDRL3; ID de SEQ Nº: 156 para CDRL1, ID de SEQ Nº: 157 para CDRL2; ID de SEQ Nº: 158 para CDRL3; ID de SEQ Nº: 172 para CDRLI, ID de SEQ Nº: 173 para CDRL2; ID de SEQ Nº: 174 para CDRL3; e ID de SEQ Nº: 188 para CDRL1, ID de SEQ Nº: 37 para CDRL2; ID de SEQ Nº: 189 para CDRL3. era ea ea Aeoaaaaa

16. ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 14, ou um fragmento de ligação do antígeno do mesmo, : caracterizado por compreender uma cadeia leve compreendendo ID de SEQ Nº: 4 para CDRL1, ID de SEQ Nº: 5 para CDRL2; ID de SEQ Nº: 6 para CDRL3; ID de SEFQ Nº: 20 para CDRL1, ID de SEQ Nº: 21 para CDRL2; ID de SEQ Nº: 22 para CDRL3; ID de SEQ Nº: 36 para CDRL1, ID de SEQ Nº: 37 para CDRL2; ID de SEQ Nº: 38 para CDRL3; ID de SEQ Nº: 52 para CDRL1, ID de SEQ Nº: 53 para CDRL2; ID de SEQ Nº: 54 para CDRL3; ID de SEQ Nº: 70 para CDRL1, ID de SEQ Nº: 71 para CDRL2; ID de SEQ Nº: 72 para CDRL3; ID de SEQ Nº: 86 para CDRL1, ID de SEQ Nº: 87 .. bara CDRL2; ID de SEQ Nº: 88 para CDRL3; ID de SEQ Nº: 99 15 para CDRL1, ID de SEQ Nº: 53 para CDRL2; ID de SEQ Nº: 100 « * para CDRL3; ID de SEQ Nº: 108 para CDRL1, ID de SEQ Nº: 109 para CDRL2; ID de SEQ Nº: 110 para CDRL3; ID de SEQ Nº: 70 para CDRL1, ID de SEQ Nº: 124 para CDRL2; ID de SEQ Nº: 125 para CDRL3; ID de SEQ Nº: 138 para CDRL1, ID de SEQ Nº: 109 para CDRL2; ID de SEQ Nº: 139 para CDRL3; ID de SEQ Nº: 156 para CDRL1, ID de SEQ Nº: 157 para CDRL2; ID de SEQ Nº: 158 para CDRL3; ID de SEQ Nº: 172 para CDRLI, ID de SEQ Nº: 173 para CDRL2; ID de SEQ Nº: 174 para CDRL3; e ID de SEQ Nº: 188 para CDRL1, ID de SEQ Nº: 37 para CDRL2; ID de SEQ Nº: 189. . para CDRL3. AAA A

17. ANTICORPO, de acordo com à reivindicação 1, 2 ou 11, Ou um fragmento 2 ae ligação do antígeno .do mesmo, E caracterizado por compreender uma região variável de cadeia pesada tendo pelo menos 70% de identificação de sequência com qualquer um dos IDs de SEQ Nº: 13, 29, 45, 61, 65, 79, 95, 117, 131, 145, 151, 165, 181 Ou 195.

18. ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 1, 2 ou 11, ou um fragmento de ligação do antígeno do mesmo, caracterizado por compreender uma região variável de cadeia leve tendo pelo menos 70% de identificação de sequência com : qualquer um dos IDs de SEQ Nº: 14, 30, 46, 62, 80, 96, 103; 118, 132, 146, 166, 182 ou 196.

19. ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 1, 2 Y ou 11, ou um fragmento de ligação do antígeno do mesmo, caracterizado em que o anticorpo compreende uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácido de qualquer um dos IDs de SEQ Nº: 13, 29, 45, 61, 65, 79, 95, 117, 131, 145, 151, 165, 181 OU 195, e onde O anticorpo compreende uma região variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácido de qualquer um dos IDs de SEQ Nº: 14, 30, 46, 62, 80, 96, 103, 118, 132, 146, ns 166, 182 ou 196. 15

20. ANTICORPO, ou um fragmento de ligação do .. antígeno do mesmo, caracterizado em que O anticorpo compreende uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácido da ID de SEQ Nº: 13 e uma região variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácido da ID de SEQ Nº: 14; Ou uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácido da ID de SEQ Nº: 29 e uma região variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácido da ID de SEQ Nº: 30; ou uma região variável de cadeia pesada compreendendo a * sequência de aminoácido da ID de SEQ Nº: 45 e uma região variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácido da ID de SEQ Nº: 46; Ou uma. região variável, de. . : cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácido da ID de SEQ Nº: 61 e uma região variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácido da ID de SEQ Nº: 62; ou uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácido da ID de SEQ Nº: 65 e uma região variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácido da ID de SEQ Nº: 62; Ou uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácido da ID de SEQ.

Nº: 79 e uma região. variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácido da ID de SEQ Nº: 80; Ã ou uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácido da ID de SEQ Nº: 95 e uma região 3o variável de cadeia leve compreendendo à sequência de aminoácido da ID de SEQ Nº: 96; Ou uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácido da ID de SEQ Nº: 95 e uma região variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácido da ID de SEQ Nº: 103; ou uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácido da ID de SEFQ Nº: 117 e uma região .. variável de cadeia leve compreendendo a sequência de 75 amincácido da ID de SEQ Nº: 118; Ou uma região variável de e cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácido da ID de SEQ Nº: 131 e uma região variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácido da ID de SEQ Nº: 132; ou uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácido da ID de SEQ Nº: 145 e uma região variável de cadeia leve compreendendo à sequência de aminoácido da ID de SEQ Nº: 146; Ou uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácido da ID de SEQ Nº: 151 e uma região variável de cadeia leve É 15 compreendendo a sequência de aminoácido da ID de SEQ Nº: 146; ou uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácido da ID de SEQ Nº: 165 e uma região. E sa variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácido da ID de SEQ Nº: 166; Ou uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácido da ID de SEQ Nº: 181 e uma região variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácido da ID de SEQ Nº: 182; ou uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácido da ID de SEQ Nº: 195 e uma região variável de cadeia leve compreendendo —a sequência de aminoácido da. ID de SEQ Nº: 196, onde o anticorpo neutraliza a infecção pelo vírus da dengue. f

21. ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 1, 2, 6 ou 11, caracterizado em que O anticorpo ou anticorpos são selecionados do grupo consistindo em HMB-DV1, HMB-DV2, HMB- DV3, HMB-DV4, HMB-DVS5, HMB-DV6, HMB-DV7, HMB-DV8, HMB-DV9, HMB-DV10, HMB-DV11, HMB-DV12, HMB-DV13, e HMB-DV14.

22. ANTICORPO, de acordo com qualquer uma das h reivindicações 1 a 5 e 11 a 21, ou um fragmento de ligação do antígeno deste, caracterizado em que oO anticorpo é um anticorpo monoclonal, um anticorpo de cadeia simples, Fab, a Fab', F(ab'),x, Fv Ou SCEV. os

23. ANTICORPO, ou um fragmento de ligação do “- antígeno do mesmo, que se liga ao mesmo epítopo que o anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a e 11 a 22, caracterizado em que o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno deste, neutraliza a infecção pelo vírus da dengue. :

24. ANTICORPO, ou um fragmento de ligação do antígeno do mesmo, que compete de forma cruzada com O anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5 e 11 a 23, caracterizado em que O anticorpo ou fragmento de TT > "15 "1igação a antígeno deste, neutraliza a infecção-pelo-vírus da dengue.

25. MOLÉCULA DE ÁCIDO NUCLÉICO, caracterizada por SieEEcAc compreender um polinucleotídeo que “codifica oO ânticorpo, anticorpos, ou fragmentos de ligação do antígeno dos mesmos, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 24.

26. MOLÉCULA DE ÁCIDO NUCLÉICO, de acordo com a reivindicação 25, caracterizada em que à sequência de polinucleotídeo é pelo menos 70% idêntica às sequências de ácido nucléico das IDs de SEQ Nº: 7-12, 15, 16, 23-28, 31, 32, 39-44, 47, 48, 55-60, 63, 64, 66, 73-78, 81, 82, 89-94, 97, 98, 101, 102, 104, 2111-116, 119, 120, 126-128, 129, 130, 133, 134, 140-143, 144, 147, 148, 150, 152 159-164, 167, 168, 175-180, 183, 184, 190-193, 194, 197 e 198.

27. CÉLULA, caracterizada por expressar o “30 anticorpo, ou um fragmento de ligação do antígeno do mesmo, conforme definido em uma das reivindicações 1-24.

28. CLONE DE CÉLULA B IMORTALIZADO, caracterizado por expressar o anticorpo conforme definido em uma das reivindicações 1-24.

29. POLIPEPTÍDEO IMUNOGÊNICO ISOLADO OU PURIFICADO, caracterizado por compreender um epítopo que se raso liga ao anticorpo, conforme definido em uma das 4 5 reivindicações 1-24. es

30. POLIPEPTÍDEO IMUNOGÊNICO, caracterizado por compreender o epítopo conforme definido na reivindicação 29.

31. COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, caracterizada por compreender pelo menos um anticorpo conforme definido em uma das reivindicações 1-5 ou 11-24, ou um fragmento de ligação do antígeno do mesmo, o ácido nucléico conforme definido na reivindicação 25 ou na reivindicação 26, Ou O polipeptídeo imunogênico conforme definido na reivindicação 30, Ee um à diluente — Ou veículo farmaceuticamente = aceitável e, t opcionalmente, um agente útil para aumentar a meia-vida do anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno deste.

— + - 32. COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, de acordo com uma das. — reivindicações 6-10, caracterizada por compreender ainda um diluente ou veículo farmaceuticamente aceitável e, opcionalmente, um agente útil para aumentar a meia-vida do anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno deste.

33. COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, de acordo com à reivindicação 31, caracterizada por compreender um primeiro anticorpo ou fragmento de ligação do antígeno do mesmo, específico para um primeiro epítopo, e um segundo anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno deste, específico para um segundo epítopo.

F 34. MÉTODO DE INIBIÇÃO DA INFECÇÃO PELO VÍRUS DA DENGUE, ou de uma doença relacionada ao vírus da dengue, caracterizado por compreender as etapas de: administrar, a um indivíduo em necessidade, uma quantidade terapeuticamente eficaz de pelo menos um anticorpo, ou fragmento de ligação do antígeno do mesmo, conforme definido em uma das reivindicações 1-5 ou 11-24, ou a composição conforme definida em uma das reivindicações 6-10 ou 31-33.

F 35. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 34, e. caracterizado por compreender ainda a administração de um «5 segundo agente terapêutico.

e: 36. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 35, caracterizado em que o referido segundo agente terapêutico é um agente anti-viral.

37. MÉTODO DE INIBIÇÃO DA INFECÇÃO PELO VÍRUS DA DENGUE, Ou de uma doença relacionada ao vírus da dengue, caracterizado por compreender as etapas de: administrar, a um indivíduo em necessidade, uma quantidade terapeuticamente eficaz de: um primeiro anticorpo, ou fragmento de ligação do — antígeno do mesmo, conforme definido em uma das is aee: reivindicações 1-5 ou 11-24, específico para um primeiro epítopo, e um segundo anticorpo Ou fragmento de ligação do — antígeno do mesmo, específico para um. segundo epítopo : diferente.

38. “MÉTODO DE TRATAMENTO DA INFECÇÃO PELO VÍRUS DA DENGUE, ou de uma doença relacionada ao vírus da dengue, caracterizado por compreender as etapas de identificar um paciente que necessita do referido tratamento e administrar ao referido paciente uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo monoclonal humano neutralizante purificado, ou de fragmento de anticorpo conforme definido em uma das reivindicações 1-5 ou 11-24, ou da composição farmacêutica, conforme definido em uma das reivindicações 6-10 Ou 31-33.

.

39. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 38, : caracterizado em que o referido tratamento compreende a administração de dois ou mais dos anticorpos ou fragmento de ligação do antígeno do mesmo.

40. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 38, caracterizado em que o referido tratamento compreende à

12/12 : antígeno da referida vacina contém o epítopo específico na conformação correta.

46. EPÍTOPO, que se liga especificamente ao -. anticorpo, conforme definido em uma das reivindicações 1-24, 55 ouum fragmento de ligação do antígeno do mesmo, para uso (i) n. em terapia, (ii) na produção de um medicamento para O tratamento de infecção pelo vírus da dengue, (iii) como uma vacina, ou (iv) na triagem de ligantes capazes de neutralizar a infecção pelo vírus da dengue.