WO2023009028A1 - Однодоменное антитело и его модификации, специфически связывающиеся с rbd s белка вируса sars-cov-2 - Google Patents

Однодоменное антитело и его модификации, специфически связывающиеся с rbd s белка вируса sars-cov-2 Download PDF

Info

Publication number
WO2023009028A1
WO2023009028A1 PCT/RU2022/000168 RU2022000168W WO2023009028A1 WO 2023009028 A1 WO2023009028 A1 WO 2023009028A1 RU 2022000168 W RU2022000168 W RU 2022000168W WO 2023009028 A1 WO2023009028 A1 WO 2023009028A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
seq
virus
cov
sars
antibody
Prior art date
Application number
PCT/RU2022/000168
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Ирина Алексеевна ФАВОРСКАЯ
Дмитрий Викторович ЩЕБЛЯКОВ
Ильяс Булатович Есмагамбетов
Артем Алексеевич ДЕРКАЕВ
Ирина Александровна АЛЕКСЕЕВА
Екатерина Игоревна РЯБОВА
Дарья Владимировна ВОРОНИНА
Владимир Владимирович ПРОКОФЬЕВ
Инна Вадимовна ДОЛЖИКОВА
Илья Дмитриевич ЗОРКОВ
Анна Алексеевна ИЛЮХИНА
Андрей Геннадьевич Ботиков
Дарья Михайловна Гроусова
Дарья Андреевна ЕГОРОВА
Борис Савельевич НАРОДИЦКИЙ
Денис Юрьевич ЛОГУНОВ
Александр Леонидович ГИНЦБУРГ
Original Assignee
федеральное государственное бюджетное учреждение "Национальный исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф. Гамалеи" Министерства здравоохранения Российской Федерации
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by федеральное государственное бюджетное учреждение "Национальный исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф. Гамалеи" Министерства здравоохранения Российской Федерации filed Critical федеральное государственное бюджетное учреждение "Национальный исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф. Гамалеи" Министерства здравоохранения Российской Федерации
Publication of WO2023009028A1 publication Critical patent/WO2023009028A1/ru

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/40—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum bacterial
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/08—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses
    • C07K16/10—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses from RNA viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing

Definitions

  • the group of inventions relates to the field of biotechnology, immunology and virology.
  • Single-domain antibodies have been created, as well as their modifications that specifically bind to the RBD S protein of the SARS-CoV-2 virus and have virus-neutralizing activity; the use of such antibodies for the treatment and emergency prevention of diseases caused by the SARS-CoV-2 virus has been proposed.
  • the causative agent of the disease was a single-stranded RNA-containing virus SARS-CoV-2, belonging to the Coronaviridae family, to the Beta-CoV B line.
  • Coronavirus SARS-CoV-2 can be transmitted by airborne droplets, airborne dust, contact, fecal-oral methods, as well as through contaminated objects and surfaces (fomites), through blood, from mother to child and from animals to humans (Mechanisms of transmission of the SARS virus -CoV-2 and their implications for prevention choices, Research Summary, 9 July 2020 WHO). In a few months, the virus spread around the world, and in January 2020, WHO declared the epidemic associated with SARS-CoV-2 an international health emergency, and in March 2020 described the spread of the disease as a pandemic.
  • COVID-19 The disease that SARS-CoV-2 causes has been given its own name, COVID-19. This is a potentially severe acute respiratory infection that can be mild or severe, and is accompanied by complications such as pneumonia, acute respiratory distress syndrome, acute respiratory failure, acute heart failure, acute renal failure, septic shock, cardiomyopathies. , etc. Currently, the number of cases of COVID-19 is more than 185 million people, and more than 4 million people have died, and these numbers continue to grow. Clearly, there is an urgent need worldwide for the development of safe and effective means of prevention and treatment. One of the promising approaches to the treatment of coronavirus infection is the use of antibodies against certain antigenic determinants of the virus.
  • REGEN-COV consists of two monoclonal antibodies, casirivimab (REGN10933) and imdevimab (REGN 10987), that bind to non-overlapping epitopes of the S protein of SARS-CoV-2.
  • the results of clinical studies of this drug showed that it is able to reduce the viral load, with a large effect in patients in whom the immune response has not yet been initiated or who initially had a high viral load (Weinreich DM, Sivapalasingam S, Norton T, Ali S, Gao H, Bhore R, Musser BJ, Soo Y, Rofail D, Im J, Perry C, Pan C, Hosain R, Mahmood A, Davis JD, Turner KS, Hooper AT, Hamilton JD, Baum A, Kyratsous CA, Kim Y, Cook A, Kampman W, Kohli A, Sachdeva Y, Graber X, Kowal B, DiCioccio T, Stahl N, Lipsich L, Braun
  • bamlanivimab (LY-CoV555, developer: Eli Lilly) received FDA emergency approval for the treatment of mild to moderate COVID-19 in hospitalized adults and children. However, the results of clinical studies are mixed. Among hospitalized patients with COVID-19, co-administration of bamlanivimab with remdesivir was not effective.
  • bamlanivimab and etsevimab.
  • bamlanivimab and etsevimab.
  • etsevimab The best effect was observed with combination therapy with two monoclonal antibodies: bamlanivimab and etsevimab.
  • Gottling RL Nirula A, Chen P, Boscia J, Heller B, Morris J, Huhn G, Cardona J, Mocherla B, Stosor V, Shawa I, Kumar P, Adams AC, Van Naarden J, Custer KL, Durante M, Oakley G, Schade AE, Holzer TR, Ebert PJ, Higgs RE, Kallewaard NL, Sabo J, Patel DR, Klekotka P, Shen L, Skovronsky DM Effect of Bamlanivimab as Monotherapy or in Combination With Etesevimab on Viral Load in Patients With Mild to Moderate COVID-19:
  • drugs based on classical antibodies have a number of disadvantages, which include:
  • nanoantibodies can be found in nature in representatives of the camelid family. Due to their relatively small size, single domain antibodies have favorable biophysical properties and are cheaper to produce than standard monoclonal antibodies. They can be produced using prokaryotic or eukaryotic expression systems. Their small size, as well as long complementarity-determining regions of the heavy chain, allow them to target concave epitopes.
  • nanoantibodies can be sprayed and delivered directly to the lungs of a Covid-19 patient using an inhaler, which is a better alternative to classical antibodies administered intravenously (Ram Sasisekharan. Preparing for the Future — Nanobodies for Covid-19? April 22, 2021 N Engl J Med 2021;384:1568-1571 DOI: 10.1056/NEJMcibr2101205)
  • a solution (CN112500480A) is known, in which variants of a single-domain antibody against the SARS-CoV-2 virus, an appropriate expression vector, as well as a cell line capable of expressing the above variants of a single-domain antibody, and a method for producing variants of this antibody are developed.
  • Solution CN111825762 A is known, in which several variants of nanoantibodies to the RBD S domain of the SARS-COV-2 virus protein have been developed, as well as a method for using nanoantibody variants for the preparation of drugs for inhibiting the SARS-COV-2 viral infection and the preparation of reagents or kits for testing the virus SARS-COV-2.
  • CN 112094342 A presents an alpaca-derived bi-epitope specific antibody or antigen-binding fragment thereof that binds to the RBD domain of SARS-CoV-2 with high affinity, which can be used to prevent, treat and/or diagnose SARS-CoV-2 infection. .
  • Solution CN112062839A is known, which describes the creation of a nanoantibody to the S protein of SARS-CoV-2, as well as a method of using it to prepare a reagent for the treatment and / or diagnosis of an infection caused by the SARS-CoV-2 coronavirus.
  • CN111303279A describes the creation of a humanized single-domain antibody against the SARS-CoV-2 coronavirus, a nucleic acid molecule encoding a single-domain antibody, as well as the creation of an expression cassette, a recombinant vector, a recombinant bacterium or a transgenic cell line containing the nucleic acid molecule described above.
  • a method has been developed for using a single-domain antibody or engineered nucleic acid molecule or engineered expression cassette, recombinant vector, recombinant bacterium, or transgenic cell line in the manufacture of a product that can be used to prevent and/or treat diseases caused by infection with the novel coronavirus SARS-CoV- 2; as well as to suppress infection with the novel coronavirus SARS-CoV-2.
  • the product may: communicate with the new coronavirus SARS-CoV-2; detect binding of the novel coronavirus SARS-CoV-2; bind to the S protein of the novel coronavirus SARS-CoV-2; detect the S protein of the new SARS-CoV-2 coronavirus.
  • a pharmaceutical composition has also been developed containing the created single-domain antibody and a pharmaceutically acceptable excipient, diluent or carrier.
  • the technical task of the claimed group of inventions is to expand the arsenal of antibodies for therapy and emergency prevention of diseases caused by the SARS-CoV-2 virus.
  • the technical result consists in creating a single-domain antibody and its modifications that effectively bind the receptor-binding domain (RBD) S protein of the SARS-CoV-2 virus, neutralize the SARS-CoV-2 virus and can be used for the treatment and emergency prevention of diseases caused by the virus SARS-CoV-2.
  • RBD receptor-binding domain
  • the technical result is that an antibody has been developed that has improved pharmacokinetics compared to single-domain antibodies.
  • This technical result is achieved by creating a single-domain antibody that specifically binds to the RBD S protein of the SARS-CoV-2 virus, has virus-neutralizing activity and has the amino acid sequence of SEQ ID NO:1, or SEQ ID NO:2, or SEQ ID NO:3 .
  • an oligomerized single-domain antibody has been created that specifically binds to the RBD S protein of the SARS-CoV-2 virus, has virus-neutralizing activity, and contains any variant of the created single-domain antibody as a monomeric block.
  • fusion antibody is a single-domain antibody fused to the Fc fragment of human immunoglobulin G1, specifically binding to the RBD S protein of the SARS-CoV-2 virus, having virus neutralizing activity, having the final amino acid sequence of SEQ ID NO: 7, or SEQ ID NO:8, or SEQ ID NO:9.
  • An oligomerized fusion antibody was also created, which is an oligomerized single-domain antibody fused with the Fc fragment of human immunoglobulin G1, which specifically binds to the RBD S protein of the SARS-CoV-2 virus and has virus neutralizing activity.
  • nucleic acid having a nucleotide sequence encoding a single domain antibody has been created. Created nucleic acid having a nucleotide sequence encoding an oligomerized single-domain antibody. A nucleic acid having a nucleotide sequence encoding a fusion antibody has also been created. Created nucleic acid having a nucleotide sequence encoding an oligomerized fusion antibody.
  • a producer cell was created containing a nucleic acid having the nucleotide sequence of any of the created antibodies and expressing this antibody.
  • a method has also been developed for the treatment or emergency prevention of diseases caused by the SARS-CoV-2 virus, which consists in introducing into the body of mammals in an effective amount of any created antibody.
  • FIG. 1 shows data on the determination of the titer of specific antibodies to RBD in the blood serum of alpaca after immunization with recombinant RBD.
  • the y-axis is the optical density of the solution at a wavelength of 450 nm
  • the abscissa axis is the dilutions of alpaca blood serum f - Alpaca serum signal level for BSA (negative control)
  • FIG. 2 shows an electrophoregram of the analysis of the results of purification of single-domain antibodies by affinity chromatography
  • FIG. 3 is a schematic representation of the amino acid sequence of single domain antibodies, where
  • FIG. 4 is a schematic representation of the amino acid sequence of oligomerized single domain antibodies, where
  • FIG. 5 is a schematic representation of the amino acid sequence of single domain antibodies modified with a human IgGl Fc fragment
  • FIG. 6 is a schematic representation of the amino acid sequence of oligomerized single domain antibodies modified with a human IgGl Fc fragment, where
  • FIG. 7 shows the results of the analysis of the change in weight of animals that were injected with the created antibodies and animals from the placebo group within 14 days after infection with SARS-CoV-2.
  • the weight is presented as an arithmetic mean and 95% confidence interval.
  • the dotted line marks the area of 95% of the weight.
  • the y-axis is the change in the weight of animals from the initial one, %
  • the abscissa axis is the time after infection of animals with the SARS-CoV-2 virus, days B - animals that were injected with the antibody preparation; - placebo group.
  • FIG. 8 shows the results of the analysis of the change in weight of animals that were injected with the created antibodies and animals from the placebo group within 30 days after infection with SARS-CoV-2.
  • the weight presented as an arithmetic mean.
  • the dotted line marks the area of 95% of the weight.
  • the y-axis is the change in the weight of animals from the initial one, %
  • the abscissa axis is the time after infection of animals with the SARS-CoV-2 virus, days
  • a - animals that were intranasally injected with p2c5-fc (200ng), simultaneously with infection with SARS-CoV-2;
  • a variant of the present invention is a single-domain antibody that specifically binds to the RBD domain S of the SARS-CoV-2 virus protein, has virus-neutralizing activity and has the amino acid sequence of SEQ ID NO:1, or SEQ ID NO:2, or SEQ ID NO:3.
  • alpaca was immunized with recombinant RBD of the SARS-CoV-2 virus, obtained in the CHO cell line and purified by metal affinity and size exclusion chromatography. The effectiveness of immunization was confirmed by assessing the titer of RBD-specific antibodies in the animal's blood serum. Further, peripheral blood mononuclear cells were isolated from animals, from which RNA was obtained. Based on RNA, cDNA was synthesized. Nested PCR was placed on the matrix of the obtained cDNA, which made it possible to amplify the sequences of single-domain antibodies. Thus, a library of amplicons of single-domain antibody sequences was obtained.
  • Antibody selection was performed by phage display using antigen panning (RBD).
  • RBD antigen panning
  • Those skilled in the art will recognize that other selection approaches such as panning on viral particles, panning in a biotinylated antigen solution, panning using competitive binding and elution are possible for the purposes of the present invention.
  • other selection methods such as ribosome display, yeast display, may be used to carry out the present invention.
  • single-domain antibodies were selected that specifically bind to the RBD domain S of the protein of the SARS-CoV-2 virus (SEQ ID NO:l, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3). In subsequent experiments, it was shown that these antibodies have virus-neutralizing activity.
  • sequences of SARS-CoV-2 RBD-specific single-domain antibodies may contain amino acid substitutions that do not affect the secondary and tertiary structure of single-domain antibodies and do not affect their ability to bind and neutralize the RBD of the SARS-CoV-2 virus.
  • antigen-binding loops (CDR domains) of single-domain antibodies are involved in antigen binding, as known to those skilled in the art, any immunoglobulin or analogue thereof containing the same amino acid sequences of the CDR domains falls within the scope of the present invention.
  • sequences of CDR domains may contain substitutions/deletions/insertions of amino acids, which, when paired with amino acid sequences, provide homology of at least 70% and do not qualitatively affect the ability to bind to the antigen.
  • amino acids when paired with amino acid sequences, provide homology of at least 70% and do not qualitatively affect the ability to bind to the antigen.
  • all immunoglobulins or their analogues containing sequences of CDR domains that have at least 70% homology with the proposed sequences fall within the scope of the present invention.
  • sequences of single-domain antibodies specific to the RBD of the SARS-CoV-2 virus can be modified by adding various proteins, protein domains, and tags, such as, for example, the HA tag, Flag- tag, GST tag, GFP protein, RFP protein, biotin and others.
  • the nucleotide sequence of single domain antibodies was determined by sequencing. It is known to those skilled in the art that, for purposes of the present invention, the nucleotide sequences encoding single domain antibodies may differ based on the principle of degeneracy of the genetic code.
  • nucleotide sequences encoding the amino acid sequences of single domain antibodies of SEQ ID NO:l, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3 fall within the scope of the present invention.
  • nucleotide sequences of SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15 are examples of nucleotide sequences of SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15.
  • a producer cell was obtained containing the nucleotide sequence of a single-domain antibody and expressing a single-domain antibody SEQ ID NO:1, or SEQ ID NO:2, or SEQ GO NO:3.
  • a producer cell based on Escherichia coli (E. coli), expressing single-domain antibody SEQ ID NO:1; an Escherichia coli (E. coli)-based producer cell expressing a single-domain antibody SEQ ID NO:2, an Escherichia coli (E. coli)-based producer cell expressing a single-domain antibody SEQ ID NO:3.
  • the preparation method further includes isolation and purification by any method known in the art.
  • Another variant of the present invention is an oligomerized single-domain antibody that specifically binds to the RBD domain S of the SARS-CoV-2 virus protein, has virus-neutralizing activity, containing as a monomeric block any single-domain antibody variant selected from SEQ ID NO:l, SEQ ID NO:2, SEQID NO:3.
  • a dimerized single-domain antibody in which the monomers are connected by a glycine-serine linker SEQ ID NO 4
  • a dimerized single-domain antibody in which the monomers are connected by a glycine-serine linker SEQ ID NO 5
  • a dimerized single-domain antibody in which the monomers are connected by glycine ⁇ -serine linker SEQ ID NO 6.
  • nucleotide sequence of the oligomerized single domain antibody was obtained by genetic engineering. It is known to those skilled in the art that, for purposes of the present invention, the nucleotide sequences encoding single domain antibodies may differ based on the principle of degeneracy of the genetic code. Thus, all nucleotide sequences encoding the amino acid sequences of oligomerized single domain antibodies in which the monomers are single domain antibodies (SEQ ID NO:1 or SEQ ID NO:2 or SEQ ID NO:3) fall within the scope of the present invention. For example, the nucleotide sequences of SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18.
  • a producer cell was obtained containing the nucleotide sequence of an oligomerized single-domain antibody, in which monomers are single-domain antibodies (SEQ ID NO:1, or SEQ ID NO:2, or SEQ ID NO:3) and expressing an oligomerized single-domain antibody , in which the monomers are single-domain antibodies (SEQ ID NO:1, or SEQ ID NO:2, or SEQ ID NO:3).
  • a producer cell based on Escherichia coli (E. coli) expressing an oligomerized single-domain antibody, in which the monomers are single-domain antibodies of SEQ GO NO:1; an Escherichia coli (E.
  • the preparation method further includes isolation and purification by any method known in the art.
  • a variant of the invention is a fusion antibody, which is a single-domain antibody modified with the Fc fragment of human immunoglobulin G1, which specifically binds to the RBD domain of the S protein of the SARS-CoV-2 virus, has virus-neutralizing activity, and has a final amino acid sequence of SEQ ID NO: 7, or SEQ ID NO:8 or SEQ ID NO:9.
  • This antibody was obtained by expression of the antibody fusion nucleotide sequence in producer cells.
  • the antibody fusion nucleotide sequences were genetically engineered based on the nucleotide sequence of single domain antibodies and the nucleotide sequence of the human immunoglobulin G1 Fc fragment.
  • the nucleotide sequences encoding antibody fusion may differ based on the principle of degeneracy of the genetic code.
  • all nucleotide sequences encoding amino acid fusion antibody sequences (SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9) fall within the scope of the present invention.
  • the nucleotide sequences of SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21 are nucleotide sequences of SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21.
  • a producer cell was obtained containing the nucleotide sequence of the fusion antibody and expressing the fusion antibody of SEQ ID NO:7, or SEQ ID NO:8, or SEQ ID NO:9.
  • a producer cell based on the CHO cell line expressing the fusion antibody of SEQ ID NO:7 a producer cell based on the CHO cell line expressing the fusion antibody of SEQ ID NO:8; a producer cell based on the CHO cell line expressing the fusion antibody of SEQ ID NO:9.
  • the preparation method further includes isolation and purification by any method known in the art.
  • a variant of the invention is an oligomerized fusion antibody, which is an oligomerized single-domain antibody containing as a monomeric block any variant of a single-domain antibody selected from SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, modified with an Fc fragment of immunoglobulin G1 human, specifically binding to the RBD S protein of the SARS-CoV-2 virus and having virus-neutralizing activity.
  • dimerized fusion antibody SEQ ID NO 10 in which the monomers are connected by a glycine-serine linker
  • dimerized single-domain antibody SEQ ID NO 11 in which the monomers are connected by a glycine-serine linker
  • dimerized single-domain antibody SEQ ID NO 12 in which the monomers are connected by a glycine-serine linker.
  • nucleotide sequence of the oligomerized fusion antibody was obtained by genetic engineering. It is known to those skilled in the art that, for purposes of the present invention, the nucleotide sequences encoding antibodies may differ based on the principle of degeneracy of the genetic code. Thus, all nucleotide sequences encoding the amino acid sequences of the oligomerized fusion antibodies of SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9 fall within the scope of the present invention. For example, the nucleotide sequences of SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:24.
  • a producer cell containing the nucleotide sequence of an oligomerized fusion antibody, in which the monomers are antibody fusion (SEQ ID NO:7, or SEQ ID NO:8, or SEQ ID NO:9) and expressing an oligomerized fusion antibody in which the monomers are fusion antibodies (SEQ ID NO:7, or SEQ ID NO:8, or SEQ GO NO:9).
  • the preparation method further includes isolation and purification by any method known in the art.
  • the authors of the patent obtained antibody variants that specifically bind to the RBD S protein of the SARS-CoV-2 virus, have virus-neutralizing activity and have improved pharmacokinetics compared to single-domain antibodies.
  • the authors of the patent have developed a method for the treatment and emergency prevention of diseases caused by the SARS-CoV-2 virus, which consists in introducing an effective amount of any of the developed antibody variants into the body of mammals.
  • Example 1 Obtaining an immune cDNA library of alpaca single-domain antibodies.
  • an immunogen was obtained - the receptor-binding domain (RBD) S protein of the SARS-CoV-2 virus.
  • RBD receptor-binding domain
  • the amino acid sequence of the receptor-binding domain (RBD) of the surface Spike protein of the SARS-CoV-2 virus was modified from the N-terminus with the signal peptide of alkaline phosphatase SEAP ( MLLLLLLLGLRLQLSLGI) and from the C-terminus with a glycine-serine linker and histidine tag sequence (GSHHHHHHHHH).
  • a nucleotide sequence was obtained, which was synthesized by Evrogen CJSC. After that, the nucleotide sequence of the resulting polypeptide was cloned into a plasmid for transient expression in mammalian cells. Further, the CHO cell culture was tariffed with the obtained plasmid using the CHO Gro kit (Minis Bio, USA) in accordance with the manufacturer's protocol. The cells were then cultured in Erlenmeyer flasks for 10 days. After this period, the culture liquid was clarified by centrifugation at 5000g.
  • the alpaca (Lama pacos - a representative of the Cameliedae family) was immunized with the obtained RBD (10 ⁇ g per immunization) 5 times at intervals of 10-14 days.
  • the antibody titer in the alpaca blood serum was determined, which was 1/1638400 (figure 1).
  • amplicons were obtained, which are an immune cDNA library of alpaca single-domain antibodies.
  • Example 2 Obtaining a library of recombinant bacteriophages.
  • the amplicons obtained in example 1 were digested with restriction enzymes and cloned into a phagemid vector digested at the same sites. Then the E.coH cells (TG1 strain) were transformed with phagemid vectors obtained by cloning.
  • a suspension of bacterial clone-transformants of E.coH cells (TG1 strain) was used for the production of recombinant bacteriophages using the M13K07 helper bacteriophage (NEB, UK) according to the manufacturer's protocol.
  • Recombinant bacteriophages were precipitated by polyethylene glycol (PEG/NaCl) precipitation.
  • PEG/NaCl polyethylene glycol
  • recombinant bacteriophages was carried out by panning on the antigen of the original bacteriophage library. For this, recombinant RBD (Example 1) was immobilized in the well of an immunological plate in 50.0 mm carbonate-bicarbonate buffer overnight. Unbound protein was removed and the well was blocked with 5% milk powder in phosphate buffer for 1 hour at room temperature. Then a suspension of 10 11 recombinant bacteriophages was added and incubated for 1 hour at room temperature. Unbound bacteriophages were washed with a colloidal 0.1% solution of Tween-20 detergent in phosphate buffer. The bound bacteriophages were eluted with a trypsin solution (0.1 mg/ml).
  • the eluted bacteriophages were used to transduce E.coH TG1 cells, which were then seeded on agar plates at a dilution to allow the isolation of individual colonies. The resulting colonies were used to build up the bacterial mass and isolate plasmid DNA. Plasmids were sequenced to determine the nucleotide sequences encoding single domain antibodies. 8 individual sequences were determined.
  • Example 5 Determination of virus-neutralizing activity on the bottom of domain antibodies.
  • the aim of this work was to evaluate the ability of the obtained single-domain antibodies to neutralize the SARS-CoV-2 virus.
  • the SARS-CoV-2 virus neutralization test was performed in the variant of a constant dose of the virus - dilution of a sample of single-domain antibodies.
  • Samples of single domain antibodies were prepared in DMEM culture medium with 2% inactivated fetal bovine serum, then mixed with 100 PFU of SARS-CoV-2 virus, incubated for 1 hour at 37°C, and added to Vero E6 cells.
  • Initial concentrations of single-domain antibody preparations were 0.5-1 mg/ml.
  • Final dilutions of single domain antibodies were 1/20-1/1280. Cells were incubated at 37°C in 5% CO2.
  • Example 6 Determination of interaction constants about the bottom of domain antibodies
  • Interaction constants (KD) of single domain antibodies p2c5, p5f8, and p2gl were determined by detecting changes in surface plasmon resonance parameters on a Biacore3000 instrument (General Electric, Sweden). To do this, recombinant RBD was covalently immobilized on the surface of the dextran matrix of the CM5 chip (General Electric, Sweden), and then various concentrations of the obtained single-domain antibodies were passed over the chip surface. Data processing and calculation of constants were carried out automatically using the Bioevaluation program (General Electric, Sweden). The data obtained are presented in table 2
  • the data obtained demonstrate high values of the equilibrium dissociation constants of the selected single-domain antibodies with recombinant RBD, which indicates a high binding affinity of single-domain antibodies to the RBD of the SARS-CoV-2 virus.
  • This example illustrates the production of oligomerized single domain antibodies, in particular dimerized single domain antibodies p2gl-dimer (SEQ ID NO:4), p2c5-dimer (SEQ ID NO:5), p5f8-dimer (SEQ ID NO:6).
  • SEQ ID NO:4 dimerized single domain antibodies
  • SEQ ID NO:5 dimerized single domain antibodies
  • SEQ ID NO:6 dimerized single domain antibodies
  • the obtained nucleotide sequences were cloned into the expression vector pET30a, thus obtaining the plasmid vectors pET30a-p2c5-dimer, pET30a-p5f8-dimer and pET30a-p2gl-dimer.
  • the resulting expression vectors were used to transform E. coli strain BL21 cells, expression was induced by adding 1.0 ⁇ M IPTG (Helikon, Russia). After 4 hours, dimerized single-domain antibodies were isolated from the bacterial mass on a HisTrap FF 5 ml column (GE Healthcare Life Sciences, USA) using an AKTA start chromatographic system (GE Healthcare Life Sciences, USA) according to the manufacturer's protocol.
  • oligomerized single-domain antibodies were obtained, the monomers of which are the developed single-domain antibodies (SEQ ID NO:1 or SEQ ID NO:2 or SEQ ID NO:3).
  • Example 8 Determination of the virus-neutralizing activity of dimerized one-domain antibodies.
  • the purpose of this experiment was to evaluate the ability of the developed dimerized single-domain antibodies to neutralize the SARS-CoV-2 virus.
  • samples of dimerized single domain antibodies (SEQ ID NO:4 or SEQ ID NO:5 or SEQ ID NO:6) were prepared in DMEM culture medium with 2% inactivated fetal bovine serum. Then, the obtained antibody samples were mixed with 100 PFU of the SARS-CoV-2 virus, incubated for 1 hour at 37°C, and added to Vero E6 cells. Cells were incubated at 37°C in 5% CO2. After 96 hours, the development of the cytopathic effect of the virus on the cell culture was recorded visually by assessing the violation of the cell monolayer.
  • the titer of single-domain antibodies was taken as their highest dilution, at which the cytopathic effect is suppressed in 2 out of 3 wells.
  • virus-neutralizing activity of dimerized single-domain antibodies is higher than that of single-domain antibodies (SEQ ID NO:l, SEQ ID NO:2, SEQ ID NOG).
  • Fusion antibody is a single domain antibody modified with a human immunoglobulin Fc fragment.
  • This modification of single-domain antibodies will improve their pharmacokinetic properties by adding the human IgGl Fc fragment and its proper glycosylation in eukaryotic producer cells.
  • modification with an Fc fragment will allow antibodies to activate the complement system and bind to Fc receptors on the surface of immunocompetent cells.
  • the amino acid sequence of the fusion antibody (SEQ ID NO:7, or SEQ ID NO:8, or SEQ ID NO:9), which is a single-domain antibody (SEQ ID NO:1, or SEQ ID NO:2 , or SEQ ID NO:3) modified with a human immunoglobulin G1 Fc fragment.
  • the nucleotide sequences of fusion antibodies were obtained, which were synthesized at ZAO Evrogen. The resulting nucleotide sequences were cloned into a vector for expression in eukaryotic cells.
  • CHO cells were transfected with the obtained expression vectors using the CHO Gro system (Minis Bio, USA) in accordance with the manufacturer's protocol.
  • Cells were cultured in Erlenmeyer flasks for 10 days. After that, the culture liquid was clarified by centrifugation at 5000g.
  • the antibody was purified by affinity chromatography on an AKTA start system (Cytiva, Sweden) using 1 ml MAbSelect SuRe columns (Cytiva, Sweden) according to the manufacturer's protocol. Additional purification and buffer replacement were carried out on an XK 26/100 column (Cytiva, Sweden) packed with a Superdex 200 pg sorbent (Cytiva, Sweden).
  • the purity of the obtained preparations of fusion antibodies p2gl-fc (SEQ ID NO:7), p2c5-fc (SEQ ID NO:8), p5f8-fc (SEQ ID NO:9) was determined by vertical polyacrylamide gel electrophoresis under non-denaturing conditions and denaturing conditions.
  • a schematic representation of the amino acid sequence of antibody fusion is shown in the figure. 5.
  • a fusion antibody which is a developed single-domain antibody modified with the Fc fragment of human immunoglobulin G1, having a final amino acid sequence of SEQ ID NO:7, or SEQ ID NO:8, or SEQ ID NO:9.
  • Example 10 Determination of the virus-neutralizing activity of fusion antibodies.
  • fusion antibody samples (SEQ ID NO:7, or SEQ ID NO:8, or SEQ ID NO:9) were prepared in DMEM culture medium with 2% inactivated fetal bovine serum. Then, the obtained antibody samples were mixed with 100 PFU of the SARS-CoV-2 virus, incubated for 1 hour at 37°C, and added to Vero E6 cells. Cells were incubated at 37°C in 5% CO2. After 96 hours, the development of the cytopathic effect of the virus on the cell culture was recorded visually by assessing the violation of the cell monolayer.
  • Example 11 Preparation, production and purification of an oligomerized fusion antibody.
  • An oligomerized fusion antibody is an oligomerized single domain antibody modified with a human immunoglobulin Fc fragment.
  • This modification contains two antigen-binding sites of the antibody, which can potentially increase the virus-neutralizing activity of antibodies by increasing avidity.
  • the resulting nucleotide sequences were cloned into a vector for expression in eukaryotic cells.
  • CHO cells were transfected with the obtained expression vectors using the CHO Gro system (Mims Bio, USA) in accordance with the manufacturer's protocol.
  • Cells were cultured in Erlenmeyer flasks for 10 days. After that, the culture liquid was clarified by centrifugation at 5000g.
  • the antibody was purified by affinity chromatography on an AKTA start system (Cytiva, Sweden) using 1 ml MAbSelect SuRe columns (Cytiva, Sweden) according to the manufacturer's protocol.
  • an oligomerized fusion antibody which is a developed oligomerized single-domain antibody modified with the Fc fragment of human immunoglobulin G1, having a final amino acid sequence of SEQ ID NO: 10, or SEQ ID NOT 1, or SEQ ID NO: 12 .
  • Example 12 Determination of virus neutralizing activity of oligomerized fusion antibodies.
  • the purpose of this experiment was to evaluate the ability of the obtained oligomerized fusion antibodies to neutralize the SARS-CoV-2 virus.
  • samples of dimerized fusion antibodies (SEQ ID NO:10, or SEQ ID NO:11, or SEQ ID NO:12) were prepared in DMEM culture medium with 2% inactivated fetal bovine serum.
  • the obtained antibody samples were mixed with 100 PFU of the SARS-CoV-2 virus, incubated for 1 hour at 37°C, and added to Vero E6 cells. Cells were incubated at 37°C in 5% CO2. After 96 hours, the development of the cytopathic effect of the virus on the cell culture was recorded visually by assessing the violation of the cell monolayer.
  • oligomerized fusion antibodies have virus-neutralizing activity against SARS-CoV-2 coronavirus.
  • dimerized forms of fusion antibodies have virus-neutralizing activity. Therefore, any oligomerized fusion antibodies (monomers, dimers, trimers, etc.) can have virus-neutralizing activity.
  • Example 13 Study of the pharmacokinetic properties of single-domain antibodies and their modifications.
  • the aim of this work was to study the pharmacokinetic properties of the obtained single-domain antibodies and their modifications.
  • mice weighing 20 g (6 animals/group) were injected intravenously with preparations of the obtained single-domain antibodies and their modifications at a dose of 10 mg/kg once.
  • the following groups of animals were obtained:
  • blood serum was taken from mice 30 min, 1, 2, 4, 6, 24, 48, 72, 168, 240, 336 hours after drug administration.
  • concentration of the administered antibody preparation was determined in indirect ELISA.
  • recombinant RBD 100 ng/well was adsorbed into the wells of a 96-well plate.
  • concentration of antibodies at different time intervals was calculated based on the optical density of the specific signal of the test samples relative to the standards (samples of the drug at given concentrations).
  • Pharmacokinetic parameters were calculated using the PK solver 2.0 program. The results are presented in table 3.
  • Tmax the period until the maximum concentration is reached, hour Stah - the maximum concentration, mg / ml T of excretion - the time of excretion, hour
  • Example 13 Method for the treatment of a disease caused by the SARS-CoV-2 virus.
  • antibodies can be administered subcutaneously, intramuscularly, intravenously, intraperitoneally.
  • Single domain antibodies and oligomerized single domain antibodies can also be administered intranasally, intravenously and intramuscularly.
  • the aim of this work was to develop a method for emergency prevention of diseases caused by the SARS-CoV-2 virus.
  • the p2c5-fc fusion antibody (SEQ ID NO: 8) was chosen to study protective activity.
  • the intraperitoneal route of administration of the drug was chosen, but the drug can also be administered intravenously, intramuscularly or subcutaneously.
  • One domain antibodies can be administered intranasally.
  • the study used 20 Syrian hamsters, weighing 35-45 grams, 10 animals each in the experimental (antibody preparation) and control (placebo) groups.
  • the study used the SARS-CoV-2 virus (hCoV-19/Russia/Moscow_PMVL-l/2020) isolated in 2020 at the N.N. N.F. Gamaleya" of the Ministry of Health of Russia, stored in the State Collection of Viruses.
  • the infectious titer of the virus is 10 7 TSGO50/ml and 3.5x10 7 PFU/ml.
  • the experiments used a permanent culture of African green monkey kidney cells - Vero E6. DMEM medium containing 10% and 2% fetal calf serum, respectively, was used as a growth and maintenance medium.
  • Animals were injected with fusion antibody p2c5-fc (SEQ ID NO:8) once 24 hours before infection at a dose of 10 mg/kg, control animals received an injection of phosphate-buffered saline (placebo). 24 hours after the administration of the drug or placebo, the animals were infected with the SARS-CoV-2 virus intranasally at a dose of 5x10 5 TCID50 per day. animal (table 2). The animals were observed for 14 days. The most pronounced clinical manifestation of SARS-CoV-2 infection in golden hamsters is weight loss in the first days after infection. Weight assessment in infected animals was performed daily throughout the study.
  • the figure 7 presents the data on the dynamics of the weight of animals after infection. According to the results of the study, it was shown that a single administration of the p2c5-fc antibody preparation (SEQ ID NO: 8) at a dose of 10 mg/kg to animals one day before infection can protect animals from infection caused by the SARS-CoV-2 virus. In the control group of animals after infection, a decrease in body weight is observed, which reaches a maximum by 4 days after infection. At the same time, in animals treated with the created p2c5-fc antibody (SEQ ID NO: 8), body weight after infection does not decrease, but gradually increases, which indicates the absence of clinical signs of infection.
  • SEQ ID NO: 8 the created p2c5-fc antibody
  • results obtained indicate that administration of the p2c5-fc antibody fusion preparation (SEQ ID NO:8) can protect mammals from the clinical manifestations of infection caused by the SARS-CoV-2 virus (5x10 5 TCID50). It will be apparent to the skilled artisan that other engineered antibodies with virus-neutralizing activity can also protect mammals from the clinical manifestations of infection with the SARS-CoV-2 virus.
  • Example 15 Development of a method for the treatment of a disease caused by the SARS-CoV-2 virus.
  • the therapeutic efficacy of the p2c5-fc antibody fusion preparation was evaluated in a SARS-CoV-2 infection model in ACE2 transgenic mice. These animals were chosen because they are highly susceptible to SARS-CoV-2 infection. The lethality of animals after infection with the SARS-CoV-2 virus is 100%.
  • SARS-CoV-2 virus (hCoV-19/Russia/Moscow_PMVL-1/2020) isolated in 2020 at the N.N. N.F.Gamalei» of the Ministry of Health of Russia, stored in the State Virus Collection.
  • the infectious titer of the virus is 10 7 TSGO50/ml and 3.5x10 7 PFU/ml.
  • Animals were infected with the SARS-CoV-2 virus intranasally at a dose of 10 5 TCGO 5 o per animal, then a preparation of monoclonal antibodies or a placebo was administered, according to Table 5.
  • FIG. 8 shows the data on the dynamics of the weight of animals after infection.
  • a single systemic (intraperitoneal) administration of the fusion antibody 2 preparation at a dose of 10 and 5 mg/kg to animals one hour after infection can protect animals from infection caused by the SARS-CoV-2 virus.
  • the administration of the drug at a dose of 5 ⁇ g/kg intranasally simultaneously with infection and the administration of the drug at doses of 25 ⁇ g/kg intranasally one hour after infection can protect animals from infection caused by the SARS-CoV-2 virus.
  • the antibody preparation may also be administered intramuscularly, intravenously, or subcutaneously.

Abstract

Заявлено однодоменное антитело, специфически связывающееся с RBDS белка вируса SARS-CoV-2, обладающее вируснейтрализующей активностью, олигомеризованное однодоменное антитело, содержащее в качестве мономерного блока вышеуказанное однодоменного антитело, однодоменное антитело, слитое с Fc-фрагментом иммуноглобулина G1человека и олигомеризованное однодоменное антитело, слитое с Fc-фрагментом иммуноглобулина G1человека. Способ терапии или экстренной профилактики заболеваний, вызываемых вирусом SARS-CoV-2, заключается во введении в организм млекопитающих в эффективном количестве любого созданного антитела. В одном из вариантов реализации одно доменное антитело имеет аминокислотную последовательность, выбранную из SEQIDNO: 1, или SEQIDNO: 2, или SEQIDNO: 3. Изобретение направлено на расширение арсенала однодоменных антител, которые эффективно связывают рецептор-связывающий домен (RBD) S белка вируса SARS-CoV-2, нейтрализуют вирус SARS- CoV-2 и могут быть использованы для терапии экстренной профилактики заболеваний, вызываемых вирусом SARS- CoV-2.

Description

ОДНОДОМЕННОЕ АНТИТЕЛО И ЕГО МОДИФИКАЦИИ, СПЕЦИФИЧЕСКИ СВЯЗЫВАЮЩИЕСЯ С RBD S БЕЛКА ВИРУСА SARS-COV-2
Область техники
Группа изобретений относится к области биотехнологии, иммунологии и вирусологии. Созданы однодоменные антитела, а также их модификации, специфически связывающиеся с RBD S белка вируса SARS-CoV-2 и обладающие вируснейтрализующей активностью, предложено применение таких антител для терапии и экстренной профилактики заболеваний, вызываемых вирусом SARS-CoV-2.
Предшествующий уровень техники.
31 декабря 2019 года во Всемирную организацию здравоохранения (ВОЗ) поступила информация о вспышке пневмонии неизвестной этиологии в городе Ухань (Китайская Народная Республика). Возбудителем заболевания оказался одноцепочечный РНК- содержащий вирус SARS-CoV-2, относящийся к семейству Coronaviridae, к линии Beta- CoV В.
Коронавирус SARS-CoV-2 может передаваться воздушно-капельным, воздушно- пылевым, контактным, фекально-оральным способами, а также через контаминированные предметы и поверхности (фомиты), через кровь, от матери ребенку и от животных к человеку (Механизмы передачи вируса SARS-CoV-2 и их значение для выбора мер профилактики, Резюме научных исследований, 9 июля 2020 г. ВОЗ). За несколько месяцев вирус распространился по всему миру, и в январе 2020 года ВОЗ объявила эпидемию, связанную с SARS-CoV-2, чрезвычайной ситуацией в области здравоохранения международного значения, а в марте 2020 года охарактеризовала распространение болезни как пандемию.
Заболевание, которое вызывает SARS-CoV-2 получило собственное название COVID-19. Это потенциально тяжёлая острая респираторная инфекция, которая может протекать как в легкой, так и в тяжелой форме, и сопровождаться такими осложнениями, как пневмония, острый респираторный дистресс-синдром, острая дыхательная недостаточность, острая сердечная недостаточность, острая почечная недостаточность, септический шок, кардиомиопатии, и др. В настоящее время число заболевших COVID-19 более 185 млн человек, а погибших- более 4 млн человек и эти числа продолжают расти. Очевидно, что во всем мире в настоящее время есть острая необходимость в разработке безопасных и эффективных средств профилактики и лечения. Одним из перспективных подходов к терапии коронавирусной инфекции является применение антител против определенных антигенных детерминант вируса. Это обусловлено двумя основными причинами: высокой специфичностью антител и технологичностью их промышленного производства. (В. С. Смирнов, Арег А. Тотолян. Некоторые возможности иммунотерапии при коронавирусной инфекции. Инфекция и иммунитет 2020, Т. 10, М° 3, с. 446—458).
В настоящее время в мире проводится более 50 клинических исследований, связанных с моноклональными антителами (Deb Р, Molla ММА, Saif-Ur-Rahman КМ. Ап update to monoclonal antibody as therapeutic option against COVID-19. Biosaf Health. 2021 Apr;3(2):87-91. doi: 10.1016/j.bsheal.2021.02.001. Epub 2021 Feb 10. PMID: 33585808; PMCID: PMC7872849).
(https://www.sciencedirect.eom/science/article/pii/S2590053621000197#s0005).
В настоящий момент разрешено к экстренному использованию два препарата на основе моноклональных антител. 21 ноября 2020 года Управление по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов США (FDA) выдало разрешение на экстренное использование (EUA) препарата REGEN-COV (Regeneron Pharmaceuticals), для лечения COVID-19 от легкой до умеренной степени у людей в возрасте от двенадцати лет и старше с массой тела не менее 40 кг (88 фунтов) с положительными результатами прямого тестирования на вирус SARS-CoV-2 и которые имеют высокий риск развития тяжелой формы COVID-19. Сюда входят лица в возрасте 65 лет и старше или лица, страдающие определенными хроническими заболеваниями. REGEN-COV состоит из двух моноклональных антител: казиривимаба (REGN10933) и имдевимаба (REGN 10987), которые связываются с неперекрывающимися эпитопами S белка SARS-CoV-2. Результаты клинических исследований данного препарата показали, что он способен снижать вирусную нагрузку, с большим эффектом у пациентов, у которых иммунный ответ еще не был инициирован или у которых исходно была высокая вирусная нагрузка (Weinreich DM, Sivapalasingam S, Norton T, Ali S, Gao H, Bhore R, Musser BJ, Soo Y, Rofail D, Im J, Perry C, Pan C, Hosain R, Mahmood A, Davis JD, Turner КС, Hooper AT, Hamilton JD, Baum A, Kyratsous CA, Kim Y, Cook A, Kampman W, Kohli A, Sachdeva Y, Graber X, Kowal B, DiCioccio T, Stahl N, Lipsich L, Braunstein N, Herman G, Yancopoulos GD; Trial Investigators. REGN-COV2, a Neutralizing Antibody Cocktail, in Outpatients with Covid-19. N Engl J Med. 2021 Jan 21;384(3):238-251. doi: 10.1056/NEJMoa2035002. Epub 2020 Dec 17. PMID: 33332778; PMCID: PMC7781102).
Другой препарат на основе моноклонального антитела - бамланивимаб (LY-CoV555, разработчик: Eli Lilly) получил разрешение FDA на экстренное применение для лечения COVID-19 от легкой до умеренной степени тяжести у негоспитализированных взрослых и детей. Однако результаты клинических исследований неоднозначны. Среди госпитализированных пациентов с COVID-19 одновременное применение бамланивимаба с ремдесивиром не было эффективно. (ACTIV-3/TICO LY-CoV555 Study Group, Lundgren JD, Grund B, Barkauskas CE, Holland TL, Gottlieb RL, Sandkovsky U, Brown SM, Knowlton KU, Self WH, Files DC, Jain MK, Benfield T, Bowdish ME, Leshnower BG, Baker JV, Jensen JU, Gardner EM, Ginde AA, Harris ES, Johansen IS, Markowitz N, Matthay MA, Ostergaard L, Chang CC, Davey VJ, Goodman A, Higgs ES, Murray DD, Murray ТА, Paredes R, Parmar MKB, Phillips AN, Reilly C, Sharma S, Dewar RL, Teitelbaum M, Wentworth D, Cao H, Klekotka P, Babiker AG, Gelijns AC, Kan VL, Polizzotto MN, Thompson ВТ, Lane HC, Neaton JD. A Neutralizing Monoclonal Antibody for Hospitalized Patients with Covid-19. N Engl J Med. 2021 Mar 11;384(10):905-914. doi: 10.1056/NEJMoa2033130. Epub 2020 Dec 22. PMID: 33356051; PMCID: PMC7781100). Клинические исследования на амбулаторных пациентах показали, что только одна из трех доз исследуемого препарата (2800 мг LY-CoV555) достоверно ускоряла естественное снижение вирусной нагрузки. (Chen Р, Nirula A, Heller В, Gottlieb RL, Boscia J, Morris J, Huhn G, Cardona J, Mocherla B, Stosor V, Shawa I, Adams AC, Van Naarden J, Custer KL, Shen L, Durante M, Oakley G, Schade AE, Sabo J, Patel DR, Klekotka P, Skovronsky DM; BLAZE-1 Investigators. SARS-CoV-2 Neutralizing Antibody LY- CoV555 in Outpatients with Covid-19. N Engl J Med. 2021 Jan 21;384(3):229-237. doi:10.1056/NEJMoa2029849. Epub 2020 Oct 28. PMID: 33113295; PMCID: PMC7646625).
Наилучший эффект наблюдался при комбинированной терапии двумя моноклональными антителами: бамланивимаб и этесевимаб. (Gottlieb RL, Nirula A, Chen Р, Boscia J, Heller В, Morris J, Huhn G, Cardona J, Mocherla B, Stosor V, Shawa I, Kumar P, Adams AC, Van Naarden J, Custer KL, Durante M, Oakley G, Schade AE, Holzer TR, Ebert PJ, Higgs RE, Kallewaard NL, Sabo J, Patel DR, Klekotka P, Shen L, Skovronsky DM. Effect of Bamlanivimab as Monotherapy or in Combination With Etesevimab on Viral Load in Patients With Mild to Moderate COVID-19: A Randomized Clinical Trial. JAMA. 2021 Feb 16;325(7):632-644. doi: 10.1001/jama.2021.0202. PMID: 33475701; PMCID: PMC7821080).
В целом, препараты на основе классических антител имеют ряд недостатков, к которым относятся:
- трудоемкость генно-инженерных манипуляций;
- трудности, связанные с узнаванием некоторых «скрытых» эпитопов;
- необходимость внутривенного введения, что влечет за собой дополнительную нагрузку на систему здравоохранения; - дорогостоящее производство антител.
Решением проблемы может стать использование однодоменных антител (наноантител), которые в природе можно найти у представителей семейства верблюдовые. Благодаря относительно небольшому размеру однодоменные антитела обладают благоприятными биофизическими свойствами и дешевле в производстве, чем стандартные моноклональные антитела. Они могут быть получены с использованием прокариотических или эукариотических систем экспрессии. Их небольшой размер, а также длинные, определяющие комплементарность участки тяжелой цепи позволяют им нацеливаться на вогнутые эпитопы. Кроме того, наноантитела можно распылять и доставлять прямо в легкие пациента с Covid-19 с помощью ингалятора, что представляет собой лучшую альтернативу внутривенно вводимым классическим антителам (Ram Sasisekharan. Preparing for the Future — Nanobodies for Covid-19? April 22, 2021 N Engl J Med 2021; 384:1568-1571 DOI: 10.1056/NEJMcibr2101205)
В настоящее время нет препаратов на основе однодоменных антител, разрешенных к применению для лечения COVID-19.
Известно решение (CN112500480А), в котором разработаны варианты однодоменного антитела против вируса SARS-CoV-2, соответствующий вектор экспрессии, а также линия клеток, способная экспрессировать вышеуказанные варианты однодоменного антитела, и способ получения вариантов данного антитела.
Известно решение CN111825762 А, в котором разработано несколько вариантов наноантитела к домену RBD S белка вируса SARS-COV-2, а также способ применения вариантов наноантитела для приготовления лекарственных средств для ингибирования вирусной инфекции SARS-COV-2 и приготовлении реагентов или наборов для тестирования вируса SARS-COV-2.
В патенте CN 112094342 А представлено биэпитопное специфическое антитело, происходящее из альпака, или его антигенсвязывающий фрагмент, который связывается с доменом RBD SARS-CoV-2 с высоким сродством, что может использоваться для профилактики, лечения и / или диагностики инфекции SARS-CoV-2.
Известно решение CN112062839А, в котором описано создание наноантитела к S белку SARS-CoV-2, а также способ его использования для приготовления реагента для лечения и / или диагностики инфекции, вызванной коронарирусом SARS-CoV-2.
Также известно решение CN112062840 А, предусматривающее разработку наноантитела к S белку SARS-CoV-2 , а также способ его использования для приготовления реагента для лечения и / или диагностики инфекции, вызванной коронарирусом SARS-CoV-2. В патенте CN111303279A описано создание гуманизированного однодоменного антитела против коронавируса SARS-CoV-2, молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей однодоменное антитело, а также создание кассеты экспрессии, рекомбинантного вектора, рекомбинантной бактерии или линии трансгенных клеток, содержащей вышеописанную молекулу нуклеиновой кислоты. Кроме того, разработан способ применения однодоменного антитела или созданной молекулы нуклеиновой кислоты или созданной экспрессионной кассеты, рекомбинантного вектора, рекомбинантной бактерии или линии трансгенных клеток при производстве продукта, который может применяться для предотвращения и / или лечение заболеваний, вызванных инфицированием новым коронавирусом SARS-CoV-2; а также для подавления заражения новым коронавирусом SARS-CoV-2. При этом продукт может: связываться с новым коронавирусом SARS-CoV-2; обнаруживать связывание нового коронавируса SARS-CoV- 2; связываться с белком S нового коронавируса SARS-CoV-2; обнаруживать белок S нового коронавируса SARS-CoV-2. Также разработана фармацевтическая композиция, содержащая созданное однодоменное антитело и фармацевтически приемлемый наполнитель, разбавитель или носитель.
Данное решение, как наиболее близкое к заявляемому, было выбрано авторами патента за прототип. Однако, недостатком прототипа является то, что однодоменные антитела быстро выводятся из организма в следствии низкой молекулярной массы и, таким образом, требуют многократного введения.
Таким образом, в уровне техники существует потребность в создании нового антитела, специфически связывающегося с S белком вируса SARS-CoV-2, для терапии и экстренной профилактики заболеваний, вызываемых вирусом SARS-CoV-2, лишенного указанного недостатка.
Раскрытие сущности изобретения
Технической задачей заявленной группы изобретений является расширение арсенала антител для терапии и экстренной профилактики заболеваний, вызываемых вирусом SARS-CoV-2.
Технический результат заключается в создании однодоменного антитела и его модификаций, которые эффективно связывают рецептор-связывающий домен (RBD) S белка вируса SARS-CoV-2, нейтрализуют вирус SARS-CoV-2 и могут быть использованы для терапии и экстренной профилактики заболеваний, вызываемых вирусом SARS-CoV-2. Кроме того, технический результат заключается в том, что разработано антитело, которое обладает улучшенной фармакокинетикой, по сравнению с однодоменными антителами. Указанный технический результат достигается тем, что создано однодоменное антитело, специфически связывающееся с RBD S белка вируса SARS-CoV-2, обладающее вируснейтрализующей активностью и имеющее аминокислотную последовательность SEQ ID NO:1, или SEQ ID NO:2, или SEQ ID NO:3.
Также технический результат достигается тем, что создано олигомеризованное однодоменное антитело, специфически связывающееся с RBD S белка вируса SARS-CoV- 2, обладающее вируснейтрализующей активностью, содержащее в качестве мономерного блока любой вариант созданного однодоменного антитела.
Кроме того, создано фьюжн антитело, представляющее собой однодоменное антитело, слитое с Fc-фрагментом иммуноглобулина G1 человека, специфически связывающееся с RBD S белка вируса SARS-CoV-2, обладающее вируснейтрализующей активностью, имеющее конечную аминокислотную последовательность SEQ ID NO:7, или SEQ ID NO:8, или SEQ ID NO:9.
Также создано олигомеризованное фьюжн антитело, представляющее собой олигомеризованное однодоменное антитело, слитое с Fc-фрагментом иммуноглобулина G1 человека, специфически связывающееся с RBD S белка вируса SARS-CoV-2 и обладающее вируснейтрализующей активностью.
Кроме того, создана нуклеиновая кислота, имеющая нуклеотидную последовательность, кодирующую однодоменное антитело. Создана нуклеиновая кислота, имеющая нуклеотидную последовательность, кодирующую олигомеризованное однодоменное антитело. Также создана нуклеиновая кислота, имеющая нуклеотидную последовательность, кодирующую фьюжн антитело. Создана нуклеиновая кислота, имеющая нуклеотидную последовательность, кодирующую олигомеризованное фьюжн антитело.
Кроме того, создана клетка-продуцент, содержащая нуклеиновую кислоту, имеющую нуклеотидную последовательность любого из созданных антител, и экспрессирующая данное антитело.
А также разработан способ терапии или экстренной профилактики заболеваний, вызываемых вирусом SARS-CoV-2, заключающийся во введении в организм млекопитающих в эффективном количестве любого созданного антитела.
Краткое описание чертежей.
На фиг. 1 представлены данные по определению титра специфических антител к RBD в сыворотке крови альпака после иммунизации рекомбинантным RBD. Ось ординат - оптическая плотность раствора при длине волны 450 нм Ось абсцисс - разведения сыворотки крови альпака ф - Уровень сигнала сыворотки альпака на BSA (отрицательный контроль)
· - Уровень специфического сигнала сыворотки альпака на рекомбинантный RBD
На фиг. 2 представлена электрофореграмма анализа результатов очистки однодоменных антител аффинной хроматографией, где
1 - препарат однодоменных антител p2h5 ;
2- препарат однодоменных антител p2h2;
3- препарат одно доменных антител p2gl ;
4- препарат однодоменных антител p3d3;
5 - препарат о днод оменных антител р 1 d3 ;
6- препарат однодоменных антител pld5;
7- препарат однодоменных антител р2с5;
8- препарат однодоменных антител p5f8.
На фиг. 3 представлено схематическое изображение аминокислотной последовательности однодоменных антител, где
1 - N-конец;
2 - последовательность однодоменного антитела;
3 - His-tag (гистидиновая метка);
4 - С-конец.
На фиг. 4 представлено схематическое изображение аминокислотной последовательности олигомеризованных однодоменных антител, где
1 - N-конец;
2 — последовательность однодоменного антитела;
3 - глицин-сериновый линкер;
4 - последовательность однодоменного антитела;
5 - His-tag (гистидиновая метка);
6 - С-конец. На фиг. 5 представлено схематическое изображение аминокислотной последовательности однодоменных антител, модифицированных Fc-фрагментом IgGl человека,
1 - глицин-сериновый линкер;
2 - последовательность однодоменного антитела;
2 - шарнирный регион;
3 - Fc-фрагмент IgGl человека.
На фиг. 6 представлено схематическое изображение аминокислотной последовательности олигомеризованных однодоменных антител, модифицированных Fc- фрагментом IgGl человека, где
1 - глицин-сериновый линкер;
2 - димеризованное через серин-глициновый линкер однодоменное антитело;
2 - шарнирный регион;
3 - Fc-фрагмент IgGl человека.
На фиг. 7 представлены результаты анализа изменения веса животных, которым вводили созданные антитела, и животных из группы плацебо в течение 14 суток после заражения SARS-CoV-2. В каждой временной точке для каждой группы животных вес представлен в виде арифметического среднего и 95% доверительного интервала. Также на рисунке пунктирной линией отмечена область 95% веса.
Ось ординат - изменение веса животных от начального, %
Ось абсцисс - время после заражения животных вирусом SARS-CoV-2, дни В - животные, которым вводили препарат антител; - группа плацебо.
На фиг. 8 представлены результаты анализа изменения веса животных, которым вводили созданные антитела, и животных из группы плацебо в течение 30 суток после заражения SARS-CoV-2. В каждой временной точке для каждой группы животных вес представлен в виде арифметического среднего. Также на рисунке пунктирной линией отмечена область 95% веса.
Ось ординат - изменение веса животных от начального, %
Ось абсцисс - время после заражения животных вирусом SARS-CoV-2, дни
Ф - животные, которым внутрибрюшинно вводили p2c5-fc (10 мг/кг), через 1 час после заражения SARS-CoV-2;
В - животные, которым внутрибрюшинно вводили p2c5-fc (5 мг/кг), через 1 час после заражения SARS-CoV-2;
А - животные, которым интраназально вводили p2c5-fc (200нг), одновременно с заражением SARS-CoV-2;
- животные, которым интраназально вводили p2c5-fc (ЮООнг), через 1 час после заражения SARS-CoV-2; - группа плацебо.
Осуществление изобретения.
Вариантом данного изобретения является однодоменное антитело, специфически связывающееся с RBD доменом S белка вируса SARS-CoV-2, обладающее вируснейтрализующей активностью и имеющее аминокислотную последовательность SEQ ID NO:1, или SEQ ID NO:2, или SEQ ID NO:3.
Для получения данного антитела осуществляли иммунизацию альпаки рекомбинантным RBD вируса SARS-CoV-2, полученным в клеточной линии СНО и очищенным металл-аффинной и эксклюзионной хроматографией. Эффективность иммунизации подтверждали оценкой титра специфических к RBD антител в сыворотке крови животного. Далее у животных выделяли мононуклеарные клетки периферической крови, из которых получали РНК. На основе РНК синтезировали кДНК. На матрице полученной кДНК ставили гнездовую ПЦР, позволяющую амплифицировать последовательности однодоменных антител. Таким образом была получена библиотека ампликонов последовательностей однодоменных антител.
Специалистам в данной области известно, что в целях осуществления настоящего изобретения, возможно использование не только мононуклеарных клеток, а также цельной крови, лимфатических узлов, селезенки, тимуса или других клеток и органов иммунизированного животного, экспрессирующих однодоменные антитела. Также специалистам в данной области известно, что в целях осуществления настоящего изобретения возможно использование синтетических библиотек последовательностей одно доменных антител.
Селекцию антител проводили методом фагового дисплея с использованием паннинга на антигене (RBD). Специалистам в данной области известно, что в целях осуществления настоящего изобретения, возможно использование других подходов селекции, таких как паннинг на вирусных частицах, паннинг в растворе биотинилированного антигена, паннинг с использованием конкурентного связывания и элюции. Также специалистам в данной области известно, что в целях осуществления настоящего изобретения возможно использование других методов селекции, таких как рибосомный дисплей, дрожжевой дисплей. В результате селекции были отобраны однодоменные антитела, специфически связывающиеся с RBD доменом S белка вируса SARS-CoV-2 (SEQ ID NO:l, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3). В последующих экспериментах было показано, что данные антитела обладают вируснейтрализующей активностью.
Специалистам в данной области известно, что в целях осуществления настоящего изобретения последовательности однодоменных антител, специфических к RBD вируса SARS-CoV-2, могут содержать в себе аминокислотные замены, которые не сказываются на вторичной и третичной структуре однодоменных антител и не влияют на их способность связывать и нейтрализовать RBD вируса SARS-CoV-2. Более того, поскольку в связывании с антигеном участвуют только антигенсвязывающие петли (CDR домены) однодоменных антител, то, как известно специалистам в данной области, любой иммуноглобулин или его аналог, содержащий такие же аминокислотные последовательности CDR доменов, попадает под объем настоящего изобретения. Более того, последовательности CDR доменов могут содержать замены/делеции/вставки аминокислот, которые при парном выравнивании аминокислотных последовательностей обеспечивают гомологичность не менее 70% и не оказывают качественного влияния на способность связываться с антигеном. Таким образом, под объем настоящего изобретения попадают все иммуноглобулины или их аналоги, содержащие последовательности CDR доменов, гомология которых составляет не менее 70% с предлагаемыми последовательностями .
Специалистам в данной области известно, что в целях осуществления настоящего изобретения последовательности однодоменных антител, специфических к RBD вируса SARS-CoV-2, могут быть модифицированы путем присоединения различных белков, белковых доменов и тэгов, таких, например, как НА-тэг, Flag-тэг, GST-тэг, GFP белок, RFP белок, биотин и другие. Нуклеотидную последовательность однодоменных антител определяли методом секвенирования. Специалистам в данной области известно, что в целях осуществления настоящего изобретения нуклеотидные последовательности, кодирующие однодоменные антитела, могут отличаться, основываясь на принципе вырожденное™ генетического кода. Таким образом, под объем настоящего изобретения попадают все последовательности нуклеотидов, кодирующие аминокислотные последовательности однодоменных антител SEQ ID NO:l, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3. Например, нуклеотидные последовательности SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15.
С помощью методов генной инженерии была получена клетка-продуцент, содержащая нуклеотидную последовательность однодоменного антитела и экспрессирующая однодоменное антитело SEQ ID NO:1, или SEQ ID NO:2, или SEQ ГО NO:3. Таким образом, например, были получены: клетка-продуцент на основе Escherichia coli (E.coli), экспрессирующая однодоменное антитело SEQ ID NO:1; клетка-продуцент на основе Escherichia coli (E.coli), экспрессирующая однодоменное антитело SEQ ID NO:2, клетка-продуцент на основе Escherichia coli (E.coli), экспрессирующая однодоменное антитело SEQ ID NO:3. Специалистам в данной области известно, что в целях осуществления настоящего изобретения в качестве продуцента можно использовать другие про- и эукариотические системы экспрессии, такие как лактобактерии, бациллы, растения, дрожжи, культуры клеток и другие. При необходимости способ получения дополнительно включает в себя выделение и очистку любым способом, известным в данной области.
Другим вариантом данного изобретения является олигомеризованное однодоменное антитело специфически связывающееся с RBD доменом S белка вируса SARS-CoV-2, обладающее вируснейтрализующей активностью, содержащее в качестве мономерного блока любой вариант однодоменного антитела, выбранный из SEQ ID NO:l, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3. Частными случаями данного варианта изобретения являются: димеризованное однодоменное антитело, в котором мономеры соединены глицин- сериновым линкером SEQ ID NO 4, димеризованное однодоменное антитело, в котором мономеры соединены глицин-сериновым линкером SEQ ID NO 5, димеризованное однодоменное антитело, в котором мономеры соединены глицин-сериновым линкером SEQ ID NO 6. Специалистам в данной области известно, что в целях осуществления настоящего изобретения, олигомеризацию однодоменных антител можно осуществлять при помощи других линкеров. Олигомеризованное однодоменное антитело было получено путем экспрессии соответствующей нуклеотидной последовательности в клетках-продуцентах. В последующих экспериментах было показано, что данные антитела обладают вируснейтрализующей активностью.
Нуклеотидная последовательность олигомеризованного однодоменного антитела была получена генно-инженерным методом. Специалистам в данной области известно, что в целях осуществления настоящего изобретения нуклеотидные последовательности, кодирующие однодоменные антитела, могут отличаться, основываясь на принципе вырожденное™ генетического кода. Таким образом, под объем настоящего изобретения попадают все последовательности нуклеотидов, кодирующие аминокислотные последовательности олигомеризованных однодоменных антител, в которых мономерами являются однодоменные антитела (SEQ ID NO:1, или SEQ ID NO:2, или SEQ ID NO:3). Например, нуклеотидные последовательности SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18.
С помощью методов генной инженерии была получена клетка-продуцент, содержащая нуклеотидную последовательность олигомеризованного однодоменного антитела, в котором мономерами являются однодоменные антитела (SEQ ID NO:1, или SEQ ID NO:2, или SEQ ID NO:3) и экспрессирующая олигомеризованное однодоменное антитело, в котором мономерами являются однодоменные антитела (SEQ ID NO:1, или SEQ ID NO:2, или SEQ ID NO:3). Таким образом, например, были получены: клетка- продуцент на основе Escherichia coli (E.coli), экспрессирующая олигомеризованное однодоменное антитело, в котором мономерами являются однодоменные антитела SEQ ГО NO:1; клетка-продуцент на основе Escherichia coli (E.coli), экспрессирующая олигомеризованное однодоменное антитело, в котором мономерами являются однодоменные антитела SEQ ID NO:2, клетка-продуцент на основе Escherichia coli (E.coli), экспрессирующая олигомеризованное одно доменное антитело, в котором мономерами являются однодоменные антитела SEQ ID NO:3. Специалистам в данной области известно, что в целях осуществления настоящего изобретения в качестве продуцента можно использовать другие про- и эукариотические системы экспрессии, такие как лактобактерии, бациллы, растения, дрожжи, культуры клеток и другие. При необходимости способ получения дополнительно включает в себя выделение и очистку любым способом, известным в данной области.
Кроме того, вариантом изобретения является фьюжн антитело, представляющее собой однодоменное антитело, модифицированное Fc-фрагментом иммуноглобуллина G1 человека, специфически связывающееся с RBD доменом S белка вируса SARS-CoV-2, обладающее вируснейтрализующей активностью, имеющее конечную аминокислотную последовательность SEQ ID NO:7, или SEQ ID NO:8, или SEQ ID NO:9. Данное антитело было получено путем экспрессии нуклеотидной последовательности фьюжн антитела в клетках-про дуцентах .
Нуклеотидные последовательности фьюжн антител были созданы генно- инженерным путем на основе нуклеотидной последовательности однодоменных антител и нуклеотидной последовательности Fc-фрагмента иммуноглобуллина G1 человека. Специалистам в данной области известно, что в целях осуществления настоящего изобретения нуклеотидные последовательности, кодирующие фьюжн антитела, могут отличаться, основываясь на принципе вырожденности генетического кода. Таким образом, под объем настоящего изобретения попадают все последовательности нуклеотидов, кодирующие аминокислотные последовательности фьюжн антител (SEQ ГО NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9). Например, нуклеотидные последовательности SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:21.
С помощью методов генной инженерии была получена клетка-продуцент, содержащая нуклеотидную последовательность фьюжн антитела и экспрессирующая фьюжн антитело SEQ ID NO:7, или SEQ ID NO:8, или SEQ ID NO:9. Таким образом, например, были получены: клетка-продуцент на основе клеточной линии СНО, экспрессирующая фьюжн антитело SEQ ID NO:7; клетка-продуцент на основе клеточной линии СНО, экспрессирующая фьюжн антитело SEQ ID NO:8, клетка-продуцент на основе клеточной линии СНО, экспрессирующая фьюжн антитело SEQ ID NO:9. Специалистам в данной области известно, что в целях осуществления настоящего изобретения в качестве продуцента можно использовать другие эукариотические системы экспрессии. При необходимости способ получения дополнительно включает в себя выделение и очистку любым способом, известным в данной области.
Также вариантом изобретения является олигомеризованное фьюжн антитело, представляющее собой олигомеризованное однодоменное антитело, содержащее в качестве мономерного блока любой вариант однодоменного антитела, выбранный из SEQ ID NO:l, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, модифицированное Fc-фрагментом иммуноглобуллина G1 человека, специфически связывающееся с RBD S белка вируса SARS-CoV-2 и обладающее вируснейтрализующей активностью. Частными случаями данного варианта изобретения являются: димеризованное фьюжн антитело SEQ ID NO 10, в котором мономеры соединены глицин-сериновым линкером; димеризованное однодоменное антитело SEQ ID NO 11, в котором мономеры соединены глицин- сериновым линкером; димеризованное однодоменное антитело SEQ ID NO 12, в котором мономеры соединены глицин-сериновым линкером. Специалистам в данной области известно, что в целях осуществления настоящего изобретения, олигомеризацию однодоменных антител можно осуществлять при помощи других линкеров.
Нуклеотидная последовательность олигомеризованного фьюжн антитела была получена генно-инженерным методом. Специалистам в данной области известно, что в целях осуществления настоящего изобретения нуклеотидные последовательности, кодирующие антитела, могут отличаться, основываясь на принципе вырожденное™ генетического кода. Таким образом, под объем настоящего изобретения попадают все последовательности нуклеотидов, кодирующие аминокислотные последовательности олигомеризованных фьюжн антител SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9. Например, нуклеотидные последовательности SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:24.
С помощью методов генной инженерии была получена клетка-продуцент, содержащая нуклеотидную последовательность олигомеризованного фьюжн антитела, в котором мономерами являются фьюжн антитела (SEQ ID NO:7, или SEQ ID NO:8, или SEQ ID NO:9) и экспрессирующая олигомеризованное фьюжн антитело, в котором мономерами являются фьюжн антитела (SEQ ID NO:7, или SEQ ID NO:8, или SEQ ГО NO:9). Таким образом, например, были получены: клетка-продуцент на основе клеточной линии СНО, экспрессирующая олигомеризованное фьюжн антитело, в котором мономерами являются фьюжн антитела SEQ ID NO:7; клетка-продуцент на основе клеточной линии СНО, экспрессирующая олигомеризованное фьюжн антитело, в котором мономерами являются фьюжн антитела SEQ ID NO:8, клетка-продуцент на основе клеточной линии СНО, экспрессирующая олигомеризованное фьюжн антитело, в котором мономерами являются фьюжн антитела SEQ ID NO:9. Специалистам в данной области известно, что в целях осуществления настоящего изобретения в качестве продуцента можно использовать другие эукариотические системы экспрессии. При необходимости способ получения дополнительно включает в себя выделение и очистку любым способом, известным в данной области.
Изучена фармакокинетика однодоменных антител и их модификаций. Продемонстрировано что модификация о дно доменных антител и их олигомеров Fc- фрагментом IgGl человека, позволяет увеличить время их циркуляции в организме с нескольких часов до нескольких недель.
Таким образом, авторами патента были получены варианты антител, специфически связывающееся с RBD S белка вируса SARS-CoV-2, обладающее вируснейтрализующей активностью и обладающие улучшенной фармакокинетикой по сравнению с однодоменными антителами. Кроме того, авторами патента разработан способ терапии и экстренной профилактики заболеваний, вызываемых вирусом SARS-CoV-2, заключающийся во введении в организм млекопитающих в эффективном количестве любого из разработанных вариантов антител.
Осуществление изобретения подтверждается следующими примерами.
Пример 1. Получение иммунной библиотеки кДНК однодоменных антител альпака.
На первом этапе работы был получен иммуноген - рецептор-связывающий домен (RBD) S белка вируса SARS-CoV-2. Для этого аминокислотную последовательность рецептор-связывающего домена (RBD) поверхностного Spike-белка вируса SARS-CoV-2 (а.о. 319 - 541, UniProtKB: locus SPIKE SARS2, accession P0DTC2) модифицировали с N- конца сигнальным пептидом щелочной фосфатазы SEAP (MLLLLLLLGLRLQLSLGI) и с С-конца последовательностью глицин-серинового линкера и гистидиновой метки (GSHHHHHHHHH). На основе аминокислотной последовательности получили нуклеотидную последовательность, которая была синтезирована ЗАО «Евроген». После этого нуклеотидную последовательность полученного полипептида клонировали в плазмиду для транзиентной экспрессии в клетках млекопитающих. Далее, культуру клеток СНО тарифицировали полученной плазмидой с помощью набора СНО Gro (Minis Bio, США) в соответствии с протоколом производителя. Затем клетки культивировали в колбах Эрленмейера в течение 10 дней. По истечении этого срока культуральную жидкость осветляли центрифугированием при 5000g. Рецептор-связывающий домен (RBD) очищали металл-аффинной хроматографией на системе АКТА start («GE Healthcare Life Sciences», США), используя колонки HisTrap FF 5 мл («GE Healthcare Life Sciences», США) в соответствии с протоколом производителя. Дополнительную очистку и замену буфера на 20 мМ фосфат натрия, 500 мМ натрия хлорид (рН=7,2) проводили на колонке ХК 26/100 («GE Healthcare Life Sciences», США), упакованной сорбентом Superdex 200 pg («GE Healthcare Life Sciences», США). Таким образом, в результате проведенной работы был получен очищенный рекомбинантный RBD S белка вируса SARS-CoV-2.
На следующем этапе работы альпака (Lama pacos - представитель семейства Cameliedae) иммунизировали полученным RBD (ЮОмкг на иммунизацию) 5 раз с промежутками в 10-14 дней. Через неделю после последней иммунизации определили титр антител в сыворотке крови альпака, который составил 1/1638400 (фигура 1).
Через 7 дней после последней иммунизации у альпака отбирали 50,0 мл периферической крови и выделяли мононуклеарные клетки на градиенте фиколла 1,077 (Панэко, Россия). Изолированные мононуклеарные клетки использовали для выделения тотальной РНК реагентом Trizol (Invitrogene, США) согласно протоколу фирмы- производителя. Выделенную РНК использовали в качестве матрицы для синтеза кДНК со случайными праймерами и ревертазой SuperScriptlll (Invitrogene, США). На матрице, полученной кДНК, ставили гнездовую ПЦР, позволяющую амплифицировать последовательности однодоменных антител. Для этой процедуры использовали высокоточную полимеразу Q5 (NEB, Великобритания) и специфические праймеры, содержащие на концах сайты рестрикции.
Таким образом, в результате проведенной работы были получены ампликоны, которые являются иммунной библиотекой кДНК однодоменных антител альпака.
Пример 2. Получение библиотеки рекомбинантных бактерифагов.
Ампликоны, полученные в примере 1 гидролизовали рестриктазами и клонировали в фагмидный вектор, гидролизованный по тем же сайтам. Затем трансформировали клетки Е.соН (штамм TG1) фагмидными векторами, полученными в результате клонирования.
Суспензию бактериальных клонов-трансформантов клеток Е.соН (штамм TG1) использовали для продукции рекомбинантных бактериофагов с использованием бактериофага-помощника М13К07 (NEB, Великобритания) согласно протоколу фирмы- производителя. Рекомбинантные бактериофаги осаждали путем преципитации полиэтиленгликолем (PEG/NaCl). Таким образом, получена библиотека рекомбинантных бактерифагов с титром 1012 трансдуцирующих единиц/мл суспензии.
Пример 3. Селекция и определение последовательности специфических однодоменных антител
Селекцию специфических рекомбинантных бактериофагов осуществляли путем паннинга на антигене исходной библиотеки бактериофагов. Для этого рекомбинантный RBD (пример 1) иммобилизовали в лунке иммунологического планшета в 50,0 мМ карбонатно-бикарбонатном буфере в течение ночи. Не связавшийся белок удаляли, а лунку блокировали 5% раствором сухого молока в фосфатном буфере в течение 1 часа при комнатной температуре. Затем добавляли суспензию 1011 рекомбинантных бактерифагов и инкубировали 1 час при комнатной температуре. Не связавшиеся бактерифаги отмывали коллоидным 0,1% раствором детергента Твин-20 в фосфатном буфере. Связавшиеся бактериофаги элюировали при помощи раствора трипсина (0,1 мг/мл). Элюированные бактериофаги использовали для трансдукции клеток Е.соН TG1, которые затем высевали на агаризованные чашки в разведении, позволяющем изолировать индивидуальные колонии. Полученные колонии использовали для наращивания бактериальной массы и выделения плазмидной ДНК. Плазмиды секвенировали для определения нуклеотидных последовательностей, кодирующих однодоменные антитела. Было определено 8 индивидуальных последовательностей .
Пример 4. Продукция и очистка о дно доменных антител
Для продукции однодоменных антител к интенсивно делящимся клеткам E.coli TG1, полученных из колоний на предыдущем этапе, добавляли 1,0 мкМ изопропил тиогалактопиранозид (IPTG) (Хеликон, Россия), спустя 4 часа бактериальную массу использовали для выделения рекомбинантных белков на колонке HisTrap FF 5 мл («GE Healthcare Life Sciences», США) с использованием хроматографической системы АКТА start («GE Healthcare Life Sciences», США), согласно протоколу фирмы-производителя. Результаты хроматографической очистки однодоменных антител представлены на фигуре 2 . Данный пример демонстрирует простоту и эффективность продукции и очистки о дно доменных антител в бактериальной системе экспрессии. Таким образом были получены очищенные препараты однодоменных антител. Одинаковые результаты были получены для всех 8 однодоменных антител. Схематичное изображение аминокислотных последовательностей однодоменных антител представлено на фигуре 3.
Пример 5. Определение вируснейтрализующей активности о дно доменных антител.
Целью данной работы являлась оценка способности полученных однодоменных антител нейтрализовать вирус SARS-CoV-2. Реакцию нейтрализации вируса SARS-CoV-2 ставили в варианте постоянная доза вируса - разведения образца однодоменных антител. Готовили образцы однодоменных антител в культуральной среде ДМЕМ с 2% инактивированной фетальной бычьей сывороткой, далее смешивали со 100 БОЕ вируса SARS-CoV-2, инкубировали 1 час при 37°С и добавляли к клеткам Vero Е6. Исходные концентрации препаратов однодоменных антител составляла 0,5-1 мг/мл. Конечные разведения однодоменных антител составили 1/20-1/1280. Клетки инкубировали при 37°С в 5% С02. Через 96 часов производили учет развития цитопатического действия вируса на культуру клеток визуально по оценке нарушения монослоя клеток. За вируснейтрализующий титр однодоменных антител принимали высшее их разведение, при котором происходит подавление цитопатического действия в 2-х лунках из 3-х. Данные по вируснейтрализующей активности выбранных антител представлены в таблице 1.
Таблица 1. Вируснейтрализующая активность полученных однодоменных антител.
Figure imgf000021_0001
Как видно из представленных данных все 8 образцов обладали выраженной вируснейтрализующей активностью (рабочая концентрация от 1 до 12,5 мкг/мл), из которых 3 образца обладали наиболее выраженной вируснейтрализующей активностью (рабочая концентрация от менее 1 мкг/мл). Три образца однодоменных антител, обладающих наиболее выраженной вируснейтрализующей активностью, были выбраны для дальнейших исследований.
Таким образом, в результате проведенной работы было получено три однодоменных антитела (SEQ ID NOT, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3), обладающих высокой вируснейтрализующей активностью.
Пример 6. Определение констант взаимодействия о дно доменных антител Константы взаимодействия (KD) однодоменных антител р2с5, p5f8 и p2gl определяли путем детекции изменения показателей поверхностного плазмонного резонанса на приборе Biacore3000 (General Electric, Швеция). Для этого рекомбинантный RBD ковалентно иммобилизировали на поверхности декстранового матрикса чипа СМ5 (General Electric, Швеция), а затем пропускали над поверхностью чипа различные концентрации полученных однодоменных антител. Обработку данных и вычисление констант проводили в автоматическом режиме при помощи программы Bioevaluation (General Electric, Швеция). Полученные данные представлены в таблице 2
Таблица 2. Константа равновесной диссоциации полученных о дно доменных антител с рекомбинантным RBD.
Figure imgf000022_0001
Полученные данные демонстрируют высокие значения констант равновесных диссоциаций отобранных однодоменных антител с рекомбинантным RBD, что свидетельствует о высокой аффинности связывания однодоменных антител с RBD вируса SARS-CoV-2.
Пример 7. Получение, продукция и очистка олигомеризованных однодоменных антител
Данный пример иллюстрирует получение олигомеризованных однодоменных антител, в частности димеризованных однодоменных антител p2gl -dimer (SEQ ID NO:4), p2c5-dimer (SEQ ID NO:5), p5f8-dimer (SEQ ID NO:6). На первом этапе разработали дизайн нуклеотидной последовательности димеризованных антител, которые представляют собой две аминокислотные последовательности однодоменного антитела ((SEQ ID NO:1 или (SEQ ID NO:2 или (SEQ ID NO:3), соединенные через глицин-сериновый линкер (GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS). Нуклеотидные последовательности димеризованных антител были синтезированы компанией ЗАО «Евроген». Полученные нуклеотидные последовательности клонировали в экспрессионный вектор рЕТЗОа, получая таким образом плазмидные векторы рЕТ30а-р2с5 -dimer, pET30a-p5f8-dimer и pET30a-p2gl- dimer. Полученными экспрессионными векторами были трансформированы клетки E.coli штамма BL21, экспрессия была индуцирована путем добавления 1,0 мкМ IPTG (Хеликон, Россия). Спустя 4 часа из бактериальной массы выделяли димеризованные однодоменные антитела на колонке HisTrap FF 5 мл («GE Healthcare Life Sciences», США) с использованием хроматографической системы АКТА start («GE Healthcare Life Sciences», США), согласно протоколу фирмы-производителя. Так были получены препараты димеризованных однодоменных антител p2gl -dimer (SEQ ID NO:4), p2c5-dimer (SEQ ID NO:5), p5f8-dimer (SEQ ID NO:6). Схематичное изображение аминокислотных последовательностей димеризованных однодоменных антител представлено на фигуре 4.
Таким образом, в результате проведенной работы были получены олигомеризованные однодоменные антитела, мономерами которых являются разработанные однодоменные антитела (SEQ ID NO:1 или SEQ ID NO:2 или SEQ ID NO:3).
Пример 8. Определение вируснейтрализующей активности димеризованных о дно доменных антител.
Целью данного эксперимента являлась оценка способности разработанных димеризованных однодоменных антител нейтрализовать вирус SARS-CoV-2.
На первом этапе работы подготовили образцы димеризованных однодоменных антител (SEQ ID NO:4 или SEQ ID NO:5 или SEQ ID NO:6) в культуральной среде ДМЕМ с 2% инактивированной фетальной бычьей сывороткой. Затем полученные образцы антител смешивали со 100 БОЕ вируса SARS-CoV-2, инкубировали 1 час при 37°С и добавляли к клеткам Vero Е6. Клетки инкубировали при 37°С в 5% С02. Через 96 часов производили учет развития цитопатического действия вируса на культуру клеток визуально по оценке нарушения монослоя клеток. За вируснейтрализуюгций титр однодоменных антител принимали высшее их разведение, при котором происходит подавление цитопатического действия в 2-х лунках из 3-х. В результате были определены следующие рабочие вируснейтрализующие концентрации антител: p2gl -dimer (SEQ ID NO:4) = 238 нг/мл, p2c5-dimer(SEQ ID NO:5) = 17 нг/мл, p5f8-dimer (SEQ ID NO:6) = 59 нг/мл. Как видно из представленных данных все полученные димеризованные однодоменные антитела способны нейтрализовать вирус SARS-CoV-2. При этом, вируснейтрализующая активность димеризованных однодоменных антител (SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6) выше, чем однодоменных антител (SEQ ID NO:l, SEQ ID NO:2, SEQ ID NOG).
Пример 9. Получение, продукция и очистка фьюжн антител.
Фьюжн антитело представляет собой однодоменное антитело, модифицированное Fc-фрагментом иммуноглобуллина человека.
Данная модификация однодоменных антител позволит улучшить их фармакокинетические свойства за счет добавления Fc-фрагмента IgGl человека и его правильного гликозилирования в эукариотических клетках-продуцентах. Кроме того, модификация Fc-фрагментом позволит антителам активировать систему комплимента и связываться с Fc-рецепторами на поверхности иммунокомпитентных клеток.
На первом этапе работы разработали дизайн аминокислотной последовательности фьюжн антитела (SEQ ID NO:7, или SEQ ID NO:8, или SEQ ID NO:9), которое представляет собой однодоменное антитело (SEQ ID NO:1, или SEQ ID NO:2, или SEQ ID NO:3), модифицированное Fc-фрагментом иммуноглобулина G1 человека. На основе аминокислотной последовательности были получены нуклеотидные последовательности фьюжн антител, которые были синтезированы в компании ЗАО «Евроген». Полученные нуклеотидные последовательности клонировали в вектор для экспрессии в эукариотических клетках. Далее проводили трансфекцию клеток линии СНО полученными экспрессионными векторами с использованием системы СНО Gro (Minis Bio, США) в соответствии с протоколом производителя. Клетки культивировали в колбах Эрленмейера в течение 10 дней. После чего культуральную жидкость осветляли центрифугированием при 5000g. Антитело очищали аффинной хроматографией на системе АКТА start (Cytiva, Швеция), используя колонки MAbSelect SuRe 1 мл (Cytiva, Швеция) в соответствии с протоколом производителя. Дополнительную очистку и замену буфера проводили на колонке ХК 26/100 (Cytiva, Швеция), упакованной сорбентом Superdex 200 pg (Cytiva, Швеция). Чистоту полученных препаратов фьюжн антител p2gl- fc (SEQ ID NO:7), p2c5-fc (SEQ ID NO:8), p5f8-fc (SEQ ID NO:9), определяли методом вертикального электрофореза в полиакриламидном геле в неденатурирующих условиях и денатурирующих условиях. Схематичное изображение аминокислотной последовательности фьюжн антител представлено на фигуре. 5.
Таким образом, в результате проведенной работы было получено фьюжн антитело, представляющее собой разработанное однодоменное антитело, модифицированное Fc- фрагментом иммуноглобулина G1 человека, имеющее конечную аминокислотную последовательность SEQ ID NO:7, или SEQ ID NO:8, или SEQ ID NO:9.
Пример 10. Определение вируснейтрализующей активности фьюжн антител.
Целью данного эксперимента являлась оценка способности разработанных фьюжн антител нейтрализовать вирус SARS-CoV-2. На первом этапе работы подготовили образцы фьюжн антител (SEQ ID NO:7, или SEQ ID NO:8, или SEQ ID NO:9) в культуральной среде ДМЕМ с 2% инактивированной фетальной бычьей сывороткой. Затем полученные образцы антител смешивали со 100 БОЕ вируса SARS-CoV-2, инкубировали 1 час при 37°С и добавляли к клеткам Vero Е6. Клетки инкубировали при 37°С в 5% С02. Через 96 часов производили учет развития цитопатического действия вируса на культуру клеток визуально по оценке нарушения монослоя клеток. За вируснейтрализующий титр однодоменных антител принимали высшее их разведение, при котором происходит подавление цитопатического действия в 2-х лунках из 3-х. В результате были определены следующие рабочие вируснейтрализующие концентрации фьюжн антител: p2gl-fc (SEQ ID NO:7) - 1750 нг/мл, p2c5-fc (SEQ ID NO:8) - 5 нг/мл, p5f8-fc (SEQ ID NO:9) - 860 нг/мл,
Как видно из представленных данных все полученные фьюжн антитела обладают вируснейтрализующей активностью против коронавируса SARS-CoV-2.
Пример 11. Получение, продукция и очистка олигомеризованного фьюжн антитела.
Олигомеризованное фьюжн антитело представляет собой олигомеризованное однодоменное антитело, модифицированное Fc-фрагментом иммуноглобулина человека.
Данная модификация содержит два антиген связывающих сайта антитела, что может потенциально увеличить вируснейтрализующую активность антител за счет увеличения авидности.
В данном примере проиллюстрировано создание димеризованного фьюжн антитела. Специалисту среднего уровня понятно, что аналогичным образом может быть сделано и тримеризованное фьюжн антитело. На первом этапе работы разработали дизайн аминокислотной последовательности димеризованного фьюжн антитела (SEQ ID NO:10, или SEQ ID NO:11, или SEQ ID NO: 12), которое представляет собой димеризованное однодоменное антитело (SEQ Ш NO:4, или SEQ ID NO:5, или SEQ ID NO:6, соответственно), модифицированное Fc- фрагментом иммуноглобулина G1 человека. На основе аминокислотной последовательности были получены нуклеотидные последовательности димеризованного фьюжн антител, которые были синтезированы в компании ЗАО «Евроген». Полученные нуклеотидные последовательности клонировали в вектор для экспрессии в эукариотических клетках. Далее проводили трансфекцию клеток линии СНО полученными экспрессионными векторами с использованием системы СНО Gro (Mims Bio, США) в соответствии с протоколом производителя. Клетки культивировали в колбах Эрленмейера в течение 10 дней. После чего культуральную жидкость осветляли центрифугированием при 5000g. Антитело очищали аффинной хроматографией на системе АКТА start (Cytiva, Швеция), используя колонки MAbSelect SuRe 1 мл (Cytiva, Швеция) в соответствии с протоколом производителя. Дополнительную очистку и замену буфера проводили на колонке ХК 26/100 (Cytiva, Швеция), упакованной сорбентом Superdex 200 pg (Cytiva, Швеция). Чистоту полученных препаратов антител p2gl- dimer-fc (SEQ ID NO: 10), p2c5- dimer-fc (SEQ ID NO: 11), p5f8- dimer-fc (SEQ ID NO: 12), определяли методом вертикального электрофореза в полиакриламидном геле в денатурирующих и не денатурирующих условиях. Схематичное изображение аминокислотной последовательности олигомеризованных фьюжн антител представлено на фигуре. 6.
Таким образом, в результате проведенной работы было получено олигомеризованное фьюжн антитело, представляющее собой разработанное олигомеризованное однодоменное антитело, модифицированное Fc-фрагментом иммуноглобуллина G1 человека, имеющее конечную аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 10, или SEQ ID NOT 1, или SEQ ID NO: 12.
Пример 12. Определение вируснейтрализующей активности олигомеризованных фьюжн антител.
Целью данного эксперимента являлась оценка способности полученных олигомеризованных фьюжн антител нейтрализовать вирус SARS-CoV-2. На первом этапе работы подготовили образцы димеризованные фьюжн антител (SEQ ID NO:10, или SEQ ID NO:11, или SEQ ID NO:12) в культуральной среде ДМЕМ с 2% инактивированной фетальной бычьей сывороткой. Затем полученные образцы антител смешивали со 100 БОЕ вируса SARS-CoV-2, инкубировали 1 час при 37°С и добавляли к клеткам Vero Е6. Клетки инкубировали при 37°С в 5% С02. Через 96 часов производили учет развития цитопатического действия вируса на культуру клеток визуально по оценке нарушения монослоя клеток. За вируснейтрализующий титр однодоменных антител принимали высшее их разведение, при котором происходит подавление цитопатического действия в 2-х лунках из 3-х. В результате были определены следующие рабочие вируснейтрализующие концентрации фьюжн антител: p2gl-dimer-fc (SEQ ID NO:10) - 4125 нг/мл, p2c5-dimer-fc (SEQ ID NO:l l) - 60 нг/мл, p5f8-dimer-fc (SEQ ID NO:12) - 390 нг/мл.
Как видно из представленных данных все полученные олигомеризованные фьюжн антитела обладают вируснейтрализующей активностью против коронавируса SARS-CoV- 2. Таким образом, продемонстрировано, что, как и мономеры, димеризованные формы фьюжн антител обладают вируснейтрализующей активностью. Следовательно, любые олигомеризованные фьюжн антитела (мономеры, димеры, тримеры и т.д) могут обладать вируснейтрализующей активностью.
Пример 13. Изучение фармакокинетических свойств однодоменных антител и их модификаций.
Целью данной работы являлось изучение фармакокинетических свойств полученных однодоменных антител и их модификаций.
Для этого самкам мышей линии Balb/c весом 20 г. (6 животных/группе) вводили внутривенно препараты полученных однодоменных антител и их модификаций в дозе 10 мг/кг однократно. Таким образом были получены следующие группы животных:
1) p2gl (SEQ ID NO:l);
2) р2с5 (SEQ ID NO:2);
3) p5f8 (SEQ ID NO:3);
4) p2gl -dimer (SEQ ID NO:4);
5) p2c5-dimer (SEQ ID NO: 5);
6) p5f8-dimer (SEQ ID NO:6); 7) p2gl-fc (SEQ ID NO:7);
8) p2c5-fc (SEQ ID NO:8);
9) p5f8-fc (SEQ ID NO:9);
10) p2gl-dimer-fc (SEQ ID NO: 10);
11)p2c5-dimer-fc (SEQ ID NO: 11);
12)p5f8-dimer-fc (SEQ ID NO: 12).
Далее у мышей отбирали сыворотку крови спустя 30 мин, 1, 2, 4, 6, 24, 48, 72, 168, 240, 336 часов после введения препарата. В образцах сыворотки крови животных определяли концентрацию вводимого препарата антител в непрямом ИФА. Для этого в лунки 96-луночного планшета сорбировали рекомбинантный RBD (100 нг/лунку). Концентрацию антител в различные временные интервалы рассчитывали исходя из оптической плотности специфического сигнала испытуемых образцов относительно стандартов (образцы препарата в заданных концентрациях). Параметры фармакокинетики вычисляли использую программу РК solver 2.0. Результаты представлены в таблице 3.
Таблица 3. Фармакокинетические свойства разработанных однодоменных антител и их модификаций
Figure imgf000028_0001
Figure imgf000029_0001
tl/2 - период полувыведения, час
Tmax - период до достижения максимальной концентрации, час Стах- максимальная концентрация, мг/мл Т выведения - время выведения, час
Как видно из представленных данных, модификация однодоменных антител Fc- фрагментом IgGl человека приводит к увеличению циркуляции антител в организме с нескольких часов до 14 дней.
Таким образом в результате проведенной работы было получено модифицированное однодоменное антитело, которое обладает улучшенной фармакокинетикой (по сравнению с о дно доменными антителами).
Пример 13 Способ терапии заболевания, вызванного вирусом SARS-CoV-2.
Известно, что переливание плазмы крови реконвалесцентов COVID-19 с высоким титром вируснейтрализующих антител пациентам COVID-19 на ранних стадиях приводит к значительному снижению их смертности (Salazar Е, Christensen РА, Graviss ЕА, Nguyen DT, Castillo В, Chen J, Lopez BV, Eagar TN, Yi X, Zhao P, Rogers J, Shehabeldin A, Joseph D, Masud F, Leveque C, Olsen RJ, Bernard DW, Gollihar J, Musser JM. Significantly Decreased Mortality in a Large Cohort of Coronavirus Disease 2019 (COVID-19) Patients Transfiised Early with Convalescent Plasma Containing High-Titer Anti-Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2 (SARS-CoV-2) Spike Protein IgG. Am J Pathol. 2021 Jan;191(l):90-107. doi: 10.1016/j.ajpath.2020.10.008. Epub 2020 Nov 4. PMID: 33157066; PMCID: PMC7609241).
Было показано, что все созданные однодоменные антитела и их модификации обладают вируснейтрализующей активностью против SARS-CoV-2. Специалисту среднего уровня очевидно, что данные антитела могут быть использованы для терапии заболеваний, вызываемых вирусом SARS-CoV-2. При этом антитела могут вводиться подкожно, внутримышечно, внутривенно, внутрибрюшинно. Однодоменные антитела и олигомеризованные однодоменные антитела также могут вводиться интраназально, внутривенно и внутримышечно.
Экспериментальные данные показывают, антитела могут вводиться человеку в концентрации от 1 до 100 мг/мл. Пример 14 Разработка способа экстренной профилактики заболеваний, вызываемых вирусом SARS-CoV-2.
Целью данной работы являлась разработка способа экстренной профилактики заболеваний, вызываемый вирусом SARS-CoV-2.
В экспериментах использовали модель летальной инфекции сирийских хомячков по схеме представленной в таблице 4. Сирийские хомячки, выбраны в качестве модели, так как их рецепторы АСЕ2 обладают высоким сродством к SARS-CoV-2.
Таблица 4. Дизайн эксперимента по исследованию протективности фьюжн антитела
2 в профилактическом режиме применения на сирийских хомячках (летальная модель)
Figure imgf000030_0001
Для изучения протективной активности было выбрано фьюжн антитело p2c5-fc (SEQ ID NO: 8). Для исследования был выбран внутрибрюшинный путь введения препарата, однако препарат также может вводиться внутривенно, внутримышечно или подкожно. О дно доменные антитела могут вводиться интраназально.
В исследовании было использовано 20 сирийских хомячков, массой 35-45 грамм, по 10 животных в опытной (препарат антител) и контрольной (плацебо) группах. В исследовании использовали вирус SARS-CoV-2 (hCoV-19/Russia/Moscow_PMVL-l/2020), изолированный в 2020 году в ФГБУ «НИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России, хранящийся в Государственной коллекции вирусов. Инфекционный титр вируса 107 ТСГО50/мл и 3,5х107 БОЕ/мл. В экспериментах использовали постоянную культуру клеток почки африканской зеленой мартышки - Vero Е6. В качестве ростовой и поддерживающей использовали среду DMEM, содержащую соответственно 10% и 2 % фетальной телячьей сыворотки.
Животным вводили фьюжн антитело p2c5-fc (SEQ ID NO:8) однократно за 24 часа до заражения в дозе 10 мг/кг, контрольные животные получали инъекцию фосфатно- солевого буфера (плацебо). Через 24 часа после введения препарата или плацебо животных заражали вирусом SARS-CoV-2 интраназально в дозе 5x105 TCID50 на животное (таблица 2). Наблюдение за животными осуществляли в течение 14 дней. Наиболее выраженным клиническим проявлением инфекции, вызванной вирусом SARS- CoV-2, у золотистых хомяков является снижение веса в первые дни после заражения. Оценку веса у зараженных животных проводили ежедневно на протяжении всего исследования.
На фигуре 7 представлены данные динамики веса животных после заражения. По результатам исследования было показано, что однократное введение препарата антител p2c5-fc (SEQ ID NO:8) в дозе 10 мг/кг животным за сутки до заражения позволяет защитить животных от инфекции, вызванной вирусом SARS-CoV-2. В контрольной группе животных после заражения наблюдается снижение массы тела, которое достигает максимума к 4 суткам после заражения. В то же время у животных, получавших созданное антитело p2c5-fc (SEQ ID NO:8), масса тела после заражения не снижается, а постепенно возрастает, что свидетельствует об отсутствии проявления клинических признаков инфекции.
Полученные результаты свидетельствуют о том, что введение препарата фьюжн антитела p2c5-fc (SEQ ID NO:8) позволяет защитить млекопитающих от клинических проявлений инфекции, вызванной вирусом SARS-CoV-2 (5х105 TCID50). Специалисту среднего уровня очевидно, что другие созданные антитела, обладающие вируснейтрализующей активностью, также могут защищать млекопитающих от клинических проявлений инфекции, вызванной вирусом SARS-CoV-2.
Таким образом, в результате проведенных экспериментов был разработан способ экстренной профилактики заболеваний, вызываемых вирусом SARS-CoV-2, заключающийся во введении в организм млекопитающих в эффективном количестве любого созданного однодоменного антитела или его модификаций.
Пример 15. Разработка способа терапии заболевания, вызванного вирусом SARS- CoV-2.
Терапевтическую эффективность препарата фьюжн антитела p2c5-fc (SEQ ID NO: 8) оценивали на модели инфекции, вызванной вирусом SARS-CoV-2, у АСЕ2 -трансгенных мышей. Данные животные были выбраны, так как они высоко чувствительны к инфекции SARS-CoV-2. Летальность животных после заражения вирусом SARS-CoV-2 составляет 100%.
В работе использовали вирус SARS-CoV-2 (hCoV-19/Russia/Moscow_PMVL- 1/2020), изолированный в 2020 году в ФГБУ «НИЦЭМ им. Н.Ф.Гамалеи» Минздрава России, хранящийся в Государственной коллекции вирусов. Инфекционный титр вируса 107 ТСГО50/мл и 3,5х107 БОЕ/мл. Животных заражали вирусом SARS-CoV-2 интраназально в дозе 105 ТСГО5о на животное, далее вводили препарат моноклональных антител или плацебо, согласно таблице 5.
Таблица 5. Дизайн экспериментального изучения эффективности фьюжн антитела p2c5-fc
Figure imgf000032_0001
В течение 30 суток после заражения оценивали вес и выживаемость животных.
На фиг. 8 представлены данные динамики веса животных после заражения. По результатам исследования было показано, что однократное системное (внутрибрюшинное) введение препарата фьюжн антитела 2 в дозе 10 и 5 мг/кг животным через час после заражения позволяет защитить животных от инфекции, вызванной вирусом SARS-CoV-2. Также было показано, что введение препарата в дозе 5 мкг/кг интраназально одновременно с заражением и введение препарата в доз 25 мкг/кг интраназально через час после заражения позволяет защитить животных от инфекции, вызванной вирусом SARS-CoV-2. Специалисту среднего уровня очевидно, что препарат антитела также может вводиться внутримышечно, внутривенного или подкожно.
У всех животных, получивших препарат, не было зафиксировано снижения веса более 5%. Гибель зараженных животных, получивших препарат, отсутствовала. Тогда как в контрольной группе животных после заражения наблюдается снижение массы тела, к 8 суткам все животные из группы контроля погибли. Таким образом, можно сделать вывод, что разработанные одно доменные антитела и их производные могут быть использованы для терапии заболевания, вызванного вирусом SARS-CoV-2.
Промышленная применимость
Все приведенные примеры подтверждают эффективность созданных однодоменных антител и их модификаций, обладающих вируснейтрализующей активностью, и обладающих терапевтическими и протективными свойствами против вируса SARS-CoV-2 и их промышленную применимость.

Claims

Формула изобретения
1. Однодоменное антитело, специфически связывающееся с RBD S белка вируса SARS-CoV-2, обладающее вируснейтрализующей активностью и имеющее аминокислотную последовательность SEQ ID NO:1, или SEQ ID NO:2, или SEQ ID NO:3.
2. Олигомеризованное однодоменное антитело, специфически связывающееся с RBD S белка вируса SARS-CoV-2, обладающее вируснейтрализующей активностью, содержащее в качестве мономерного блока однодоменное антитело по п.1, и имеющее конечную аминокислотную последовательность SEQ ID NO:4, или SEQ ID NO:5, или SEQ ID NO:6.
3. Антитело, представляющее собой однодоменное антитело по п.1, слитое с Fc-фрагментом иммуноглобулина G1 человека, специфически связывающееся с RBD S белка вируса SARS-CoV-2, обладающее вируснейтрализующей активностью, имеющее конечную аминокислотную последовательность SEQ ID NO:7, или SEQ ID NO:8, или SEQ ID NO:9.
4. Олигомеризованное антитело, представляющее собой олигомеризованное однодоменное антитело по п.2, слитое с Fc-фрагментом иммуноглобулина G1 человека, специфически связывающееся с RBD S белка вируса SARS-CoV-2 и обладающее вируснейтрализующей активностью, и имеющее конечную аминокислотную последовательность SEQ ID NO:10, или SEQ ID NO:11, или SEQ ID NO:12.
5. Способ терапии или экстренной профилактики заболевания, вызванного вирусом SARS-CoV-2, заключающийся во введении в организм млекопитающих в эффективном количестве антитела по любому из п.п.1-4.
PCT/RU2022/000168 2021-07-29 2022-05-20 Однодоменное антитело и его модификации, специфически связывающиеся с rbd s белка вируса sars-cov-2 WO2023009028A1 (ru)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2021122686 2021-07-29
RU2021122686A RU2763001C1 (ru) 2021-07-29 2021-07-29 Однодоменное антитело и его модификации, специфически связывающиеся с RBD S белка вируса SARS-CoV-2, и способ их применения для терапии и экстренной профилактики заболеваний, вызываемых вирусом SARS-CoV-2

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2023009028A1 true WO2023009028A1 (ru) 2023-02-02

Family

ID=80039327

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/RU2022/000168 WO2023009028A1 (ru) 2021-07-29 2022-05-20 Однодоменное антитело и его модификации, специфически связывающиеся с rbd s белка вируса sars-cov-2

Country Status (2)

Country Link
RU (1) RU2763001C1 (ru)
WO (1) WO2023009028A1 (ru)

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115124615B (zh) * 2022-02-21 2023-06-16 四川一埃科技有限公司 抗新型冠状病毒rbd结构域抗原的纳米抗体
CN116813758A (zh) * 2022-03-21 2023-09-29 中国科学院微生物研究所 纳米抗体s43的构建体及其应用
CN115160434B (zh) * 2022-05-26 2023-05-02 广东菲鹏制药股份有限公司 人源化单域抗体及其应用和药物

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111303279A (zh) * 2020-03-17 2020-06-19 中国医学科学院病原生物学研究所 一种针对新型冠状病毒的单域抗体及其应用
CN112094342A (zh) * 2020-09-25 2020-12-18 中国科学技术大学 与SARS-CoV-2 RBD结合的羊驼源纳米抗体
CN111647076B (zh) * 2020-04-27 2021-02-26 南京医科大学 抗新型冠状病毒SARS-Cov-2的中和性单域抗体及其应用
CN112940111A (zh) * 2020-09-22 2021-06-11 石河子大学 一种基于新型冠状病毒s蛋白的纳米抗体及其应用

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111825762A (zh) * 2020-06-17 2020-10-27 武汉华美生物工程有限公司 抗sars-cov-2病毒s蛋白rbd结构域的纳米抗体及其用途
CN112500480B (zh) * 2020-07-17 2022-04-01 上海洛启生物医药技术有限公司 针对新型冠状病毒的纳米抗体及其应用
CN112062839A (zh) * 2020-09-22 2020-12-11 石河子大学 一种基于新型冠状病毒s蛋白s1亚基的纳米抗体及其应用
RU2744274C1 (ru) * 2020-11-20 2021-03-04 Федеральное государственное бюджетное учреждение науки институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук (ИБХ РАН) Моноклональное антитело к RBD фрагменту в составе S белка вируса SARS-CoV-2

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111303279A (zh) * 2020-03-17 2020-06-19 中国医学科学院病原生物学研究所 一种针对新型冠状病毒的单域抗体及其应用
CN111647076B (zh) * 2020-04-27 2021-02-26 南京医科大学 抗新型冠状病毒SARS-Cov-2的中和性单域抗体及其应用
CN112940111A (zh) * 2020-09-22 2021-06-11 石河子大学 一种基于新型冠状病毒s蛋白的纳米抗体及其应用
CN112094342A (zh) * 2020-09-25 2020-12-18 中国科学技术大学 与SARS-CoV-2 RBD结合的羊驼源纳米抗体

Also Published As

Publication number Publication date
RU2763001C1 (ru) 2021-12-24

Similar Documents

Publication Publication Date Title
WO2023009028A1 (ru) Однодоменное антитело и его модификации, специфически связывающиеся с rbd s белка вируса sars-cov-2
JP6048845B2 (ja) ジフテリア毒素の無毒性突然変異体ｃｒｍ１９７又はその断片を含む融合タンパク質
ES2336393T3 (es) Complejo antigenico que comprende un inmoestimulador, cd4, y un dominio receptor de quimioquina para tratamiento de vih y desordenes inmunes.
EA027069B1 (ru) Моноклональные антитела, способные взаимодействовать с множеством подтипов вируса гриппа а
EP2668208B1 (en) Cross-reactive staphylococcus aureus antibody
WO2020038147A1 (zh) 抗bcma的单域抗体及其应用
JPH05507197A (ja) 結合部位を含む可溶性ペプチド類縁体
RU2764740C1 (ru) Биспецифическое антитело против вируса бешенства и его применение
JP2001513335A (ja) 細胞内の物質移送のための抗体から誘導されたベクター
CA3165855A1 (en) Mutant rsv f protein and use thereof
CN102370979B (zh) 一种针对人TNF-α分子的自体疫苗的构建方法
KR20140146803A (ko) 가금 레오바이러스 시그마 c 단백질의 항원 결정기를 포함하는 재조합 단백질 및 이에 대한 항체
WO2021206638A1 (en) Vaccine and/or antibody for viral infection
Pavan et al. Nanobodies against SARS-CoV-2 reduced virus load in the brain of challenged mice and neutralized Wuhan, Delta and Omicron Variants
WO2022025264A1 (ja) ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来のアミノ酸配列およびその利用
RU2765731C1 (ru) Гуманизированное моноклональное антитело, специфически связывающиеся с RBD S белка вируса SARS-CoV-2, средство и способ для терапии и экстренной профилактики заболеваний, вызываемых вирусом SARS-CoV-2
RU2769223C1 (ru) Средство и способ терапии и экстренной профилактики заболеваний, вызываемых вирусом SARS-CoV-2 на основе рекомбинантного антитела и гуманизированного моноклонального антитела
RU2533802C1 (ru) Тримеризованное однодоменное антитело, специфически связывающееся с гликопротеином g вируса бешенства, нейтрализующее вирус бешенства
EP1719520B1 (en) Antigen epitopes of the regulatory protein of virulence factor in staphylococcus aureus and their mimotopes and use
KR101526886B1 (ko) 가금 아데노바이러스 섬유 2 단백질의 항원 결정기를 포함하는 재조합 단백질 및 이에 대한 항체
RU2661028C2 (ru) Фармацевтическая композиция для пассивной иммунизации против бешенства, фармацевтический набор, способ применения фармацевтического набора
EP0370090B1 (en) Immunogens and biologically active peptides derived from shared sequences from antigens and anti-idiotypic antibodies or antibodies specific for cellular receptors of the antigens
RU2644202C2 (ru) Однодоменные антитела к белку gp вируса эбола для иммунотерапии лихорадки эбола
KR100489617B1 (ko) 흰반점바이러스 감염의 예방 및 치료를 위한 수용성 항체단백질 및 이를 포함한 알, 및 이들의 제조방법
RU2793967C1 (ru) Однодоменное антитело ламы Н5 и его производное H5-Fc, специфически связывающие RBD-домен S-белка вируса SARS-CoV-2, обладающие вируснейтрализующей активностью

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 22849970

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE