CN116425871B - 抗新冠病毒s蛋白人源化抗体及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于人源化抗体制备技术领域,尤其涉及抗新冠病毒S蛋白人源化抗体及其应用。所述抗新冠病毒S蛋白人源化抗体互补决定区来源于兔源单克隆抗体1H1,框架区来源于人类抗体;轻链框架区1、轻链框架区2、轻链框架区3和轻链框架区4的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:11‑14所示;重链框架区1、重链框架区2、重链框架区3和重链框架区4的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:15‑18所示。本发明通过改造兔源单克隆抗体1H1的框架区,在大大降低或者基本消除抗体的免疫原性、提高生物安全性高生物的同时,具有与亲本抗体相当的亲和力和特异性,而且结合新冠病毒的能力强,对多种变异株具有提高的中和活性。
Description
技术领域
本发明涉及人源化抗体制备技术领域,特别涉及抗新冠病毒S蛋白人源化抗体及其应用。
背景技术
在新冠病毒感染康复中,中和抗体扮演者重要的角色,中和抗体通过与病毒表面的特异性抗原相结合,防止它们与细胞上表达的受体相结合进而阻止病毒进入细胞内。因此新冠病毒中和抗体被普遍认为是一种有效且特异的抗新冠病毒的治疗手段,是治疗新冠病毒感染药物的主要研发方向之一。
基于目前的研究,针对新冠病毒的兔源中和抗体大致可以分为三类,(a)针对S1蛋白的RBD,(b)针对S1蛋白的N末端(NTD),(c)其他针对S1蛋白的中和抗体,既不与RBD结合,也不识别NTD结构域。目前尚未有针对新冠病毒的兔源中和抗体上市,已上市兔源中和抗体只有美国诺华的Broluzuzumab和丹麦灵北制药的Eptinezumab,分别用于治疗与年龄相关的湿性黄斑变性和用于预防成人偏头痛两款。这是因为兔源中和抗体通过免疫兔子得到,相对于人体为异源性成分,会对机体造成一定程度的免疫副反应,降低了临床安全性。因此,需要对现有的兔源中和抗体进行人源化,即,在兔源单克隆抗体氨基酸序列基础上,通过基因工程技术将其部分或全部替换为人源序列,使其同时保留亲本兔源单克隆抗体的亲和力和特异性,又降低了其异源性,进而有利于临床使用。
提高抗体人源化水平是显著降低兔源亲本单克隆抗体免疫原性的关键。抗体的可变区(V)是其维持亲和力和特异性的功能区,特别是其中的互补决定区(CDR)是在抗体框架区(FR)的支持下与抗原分子上的表位氨基酸相互作用,极大程度上决定了抗原的特异性和亲和力。人源化需要将兔源亲本抗体的框架区(FR)替换成人源框架区,而框架区的一些氨基酸残基会影响互补决定区(CDR)环的构象,因此通常替换后会降低抗体的亲和力和特异性。如何平衡抗体人源化水平和亲和力、特异性等,是抗体人源化改造的技术难点,也是困扰人源化抗体临床应用的主要问题。换言之,在保持兔源单克隆抗体特异性和亲和力的基础上最大程度的提高人源化水平,是急需解决的技术问题。
虽然目前已研制出一些抗新冠病毒的人源化抗体,但新冠病毒变异快,已出现了多种变异株,自2021年11月起,奥密克戎(Omicron)变异株及其亚型逐渐成为主要流行毒株,Omicron变异株的刺突蛋白(Spike)不断积累新的突变位点,使病毒具有更强的传染性和免疫逃逸能力,已有的人源化抗体较难靶向新的变异株。因此,迫切需要开发针对SARS-CoV-2流行毒株的新型广谱人源化中和抗体。
发明内容
针对现有技术靶向新冠病毒的兔源抗体的人源化程度低、人源化后对抗原亲和力低或广谱性差的问题,本发明提供了一种抗新冠病毒S蛋白人源化抗体,并提供了编码该抗体的核苷酸分子、携带该核苷酸分子的重组载体以及宿主细胞,并提供了前述新冠病毒S蛋白人源化抗体、核苷酸分子、重组载体和宿主细胞的应用。
为实现上述目的,本发明具体通过以下技术方案实现:
本发明第一方面提供了一种抗新冠病毒S蛋白人源化抗体,所述抗新冠病毒S蛋白人源化抗体的互补决定区来源于兔源单克隆抗体1H1,框架区来源于人类抗体;其中,轻链框架区1、轻链框架区2、轻链框架区3和轻链框架区4的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:11-14所示;重链框架区1、重链框架区2、重链框架区3和重链框架区4的氨基酸序列分别如SEQ IDNO:15-18所示。
进一步地,兔源单克隆抗体1H1的轻链互补决定区1、轻链互补决定区2和轻链互补决定区3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:5-7所示,重链互补决定区1、重链互补决定区2和重链互补决定区3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:8-10所示。
进一步地,所述新冠病毒S蛋白人源化抗体的轻链可变区的氨基酸序列SEQ IDNO:3所示,重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。
进一步地,所述抗新冠病毒S蛋白人源化抗体的轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示,重链的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
本发明第二方面提供了一种核苷酸分子,所述核苷酸分子用于编码如上所述的抗新冠病毒S蛋白人源化抗体。
本发明第三方面提供了一种重组载体,所述重组载体携带如上所述的核苷酸分子。
本发明第四方面提供了一种宿主细胞,所述宿主细胞携带如上所述的核苷酸分子或包含如上所述的重组载体。
本发明第五方面提供了如上所述的抗新冠病毒S蛋白人源化抗体、核苷酸分子、重组载体或宿主细胞在制备预防和/或治疗新冠病毒药物或检测新冠病毒试剂中的应用。
本发明第六方面提供了一种预防和/或治疗新冠病毒药物,其活性成分为以下A-D中的任一种或多种:
A、如上所述的抗新冠病毒S蛋白人源化抗体;
B、编码A中所述抗新冠病毒S蛋白人源化抗体的核苷酸分子;
C、携带B中所述核苷酸分子的表达载体;
D、携带B中所述核苷酸分子或C中所述表达载体的宿主细胞。
进一步地,所述新冠病毒包括野生型、Delta变异株和/或Omicron变异株,所述Omicron变异株包括Omicron亚系BA.1、BA.1.1、BA.2、BA.2.12.1、BA.2.75、BA.3和BA.4/5中的一种或多种。
本发明的优点及积极效果为:
本发明通过改造兔源单克隆抗体1H1的框架区,在最大限度人源化的基础上基本维持了1H1的CDR环构象,使其在保持与原有亲本抗体相当亲和力的情况下同时具有和人体内的抗体分子极其相似的轮廓,从而逃避人免疫系统的识别,大大降低或者基本消除抗体的免疫原性,生物安全性高。具有上述框架区的人源化单克隆抗体1H1在人源化降低异源性的同时具有与亲本抗体相当的亲和力和特异性,结合新冠病毒的能力强,对新冠病毒S蛋白的亲和常数在pM级别,结合新冠病毒S蛋白的半数有效浓度在0.1μg/mL以下,且中和假病毒的半数抑制浓度在0.05μg/mL以下,对多种变异株具有提高的中和活性,有望作为中和抗体用于开发治疗新冠病毒的药物,具有广泛的临床应用前景和重要的医学意义。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案,下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单的介绍,显而易见地,下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例,对于本领域普通技术人员来讲,在不付出创造性劳动的前提下,还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例2抗新冠病毒S蛋白的兔源亲本抗体和人源化抗体的HPLC色谱图,其中,图A为兔源亲本抗体的HPLC色谱图,图B为人源化抗体的HPLC色谱图;
图2为本发明实施例3抗新冠病毒S蛋白的兔源亲本抗体的亲和力曲线;
图3为本发明实施例3抗新冠病毒S蛋白的人源化抗体的亲和力曲线;
图4为本发明实施例4抗新冠病毒S蛋白的兔源亲本抗体与新冠病毒S蛋白的结合曲线;
图5为本发明实施例4抗新冠病毒S蛋白的人源化抗体与新冠病毒S蛋白的结合曲线;
图6为本发明实施例5抗新冠病毒S蛋白的兔源亲本抗体对新冠病毒的中和滴度曲线;
图7为本发明实施例5抗新冠病毒S蛋白的人源化抗体对新冠病毒的中和滴度曲线。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白,以下结合实施例对本发明进行进一步详细说明。此处所描述的实施例仅用以解释本发明,并不用于限定本发明。
根据本发明包含的信息,对于本领域技术人员来说可以轻而易举地对本发明的精确描述进行各种改变,而不会偏离所附权利要求的精神和范围。应该理解,本发明的范围不局限于所限定的过程、性质或组分,因为这些实施方案以及其他的描述仅仅是为了示意性说明本发明的特定方面。实际上,本领域或相关领域的技术人员明显能够对本发明实施方式作出的各种改变都涵盖在所附权利要求的范围内。
为了更好地理解本发明而不是限制本发明的范围,在本发明中所用的表示用量、百分比的所有数字以及其他数值,在所有情况下都应理解为以词语“大约”所修饰。因此,除非特别说明,否则在说明书和所附权利要求书中所列出的数字参数都是近似值,其可能会根据试图获得的理想性质的不同而加以改变。各个数字参数至少应被看作是根据所报告的有效数字和通过常规的四舍五入方法而获得的。另外,术语“包括”、“包含”、“含有”、“具有”等类似词语的含义是非限制性的,即可加入不影响结果的其它步骤和其它成分。
需要说明的是,在本发明中使用的“和/或”应被视对在具有或不具有另一者的情况下两种指定特征或组分中的每一种的具体公开。例如,“A和/或B”将被视为(i)A、(ii)B、以及(iii)A和B。
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更为明显易懂,下面结合附图对本发明的具体实施例做详细说明。
传统的抗体分子结构类似于“Y”形,是由两条重链(H)和两条轻链(L)构成的对称结构。重链和轻链靠近N端的氨基酸序列变化很大,其他部分氨基酸序列相对恒定,将轻链和重链中靠近N端氨基酸序列变化较大的区域称为可变区(variable region,V),将靠近C端的氨基酸序列相对稳定的区域,称为恒定区(constant region,C)。重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)中氨基酸组成和排列顺序高度可变的区域称为高变区(hypervariableregion,HVR)或互补决定区(complementarity determining region,CDR),VH与VL各有3个CDR,分别用CDR1、CDR2和CDR3表示;在可变区中,CDR区域之外的氨基酸组成和排列顺序相对保守,称为框架区(framework region,FR),VH与VL各有4个框架区,分别用FR1、FR2、FR3和FR4表示,重链与轻链的3个CDR通过4个FR紧密地靠在一起并相互配合,共同组成抗体的抗原结合部位(antigen-binding site),决定抗体的特异性。每个VH与VL按以下顺序从氨基端到羧基端排列:FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。轻链恒定区(CL)和重链恒定区(CH)不直接参与抗体与抗原的结合,但是它们表现出不同的效应功能,例如参与抗体的依赖于抗体的细胞毒性。抗体CL与CH的氨基酸序列是本领域众所周知的。
随着抗体的技术发展,抗体新药进入临床的数量呈现明显增加趋势,非人源性抗体进入人体内会引起严重的机体排异反应,进而影响抗体在临床应用时的安全性和治疗效果。因此需要对抗体进行人源化改造,尽可能降低抗体的异源性,并且使其特异性和亲和力保持不变。抗体人源化是非人源抗体如兔源单克隆抗体(亲本抗体)的CDR区或者其所有由人类抗体基因所编码,以降低机体排斥反应,同时保持所需的特异性、亲和性和原始抗体的能力。在一些情况下,非人源抗体的可变区与人源抗体的恒定区结合,例如人兔嵌合抗体。“人源化”还包括CDR移植或重构的抗体,此类抗体具有源自(或基本上源自)非人源抗体的CDR区,和源自(或基本上源自)人源抗体序列的FR区和恒定区,即将非人源抗体的CDR区序列嫁接到人类抗体框架(FR)序列上,这种框架序列来源于单个或多个其他人类抗体可变区框架序列。与嵌合抗体相比,此类抗体应更具人源性且免疫原性更低,然而,FR区序列的变化将影响CDR的空间构型,极大程度上造成抗体的CDR环结合抗原的能力下降甚至明显下降。因此,通过FR区改造,在保持抗体特异性和亲和力的基础上最大程度的提高人源化水平,是人源化抗体制备需要解决的主要技术问题。
在本发明的前期研究(文献:Guo H,Yang Y,Zhao T,et al.Mechanism of arabbit monoclonal antibody broadly neutralizing SARS-CoV-2 variants[J].Communications Biology,2023,6(1).)中,发现了一种兔源单克隆抗体1H1能够有效中和多种新冠假病毒,包括野生型(WT)、Delta和新近流行的Omicron亚系BA.1、BA.1.1、BA.2、BA.2.12.1、BA.2.75、BA.3以及BA.4/5毒株,这表明1H1具有潜在广谱中和活性,可以对抗不同的新冠病毒变异株。ELISA实验和BLI实验也从生化水平证明1H1对这些毒株Spike蛋白的ECD和RBD均表现出很强的结合亲和力。实现该抗体的人源化具有重要意义和广阔的应用前景。
本发明基于兔源单克隆抗体1H1(亲本抗体)的优良特性,以其可变区的氨基酸序列作为探针在NCBI-Blastp工具上进行序列比对,在Genbank上找到与轻链可变区(VL)和重链可变区(VH)相似性最高的人抗体序列,作为人源化框架区(FR)改造的参考模板,合成若干人源化抗体序列,将其分别构建表达载体,经过抗体亲和力和活性试验检测,获得本发明人源化改造的氨基酸序列,与亲本抗体的CDR区组合之后得到本发明的抗新冠病毒S蛋白人源化抗体,本发明提供的人源化抗体的免疫原性风险低,能够广谱识别不同的新冠病毒(SARS-CoV-2)变异株Spike蛋白且具有较高的亲和力,甚至相比于亲本抗体对部分变异株具有提高的新型冠状病毒中和活性,临床使用价值高。
本发明实施例提供了一种抗新冠病毒S蛋白人源化抗体,所述抗新冠病毒S蛋白人源化抗体的互补决定区(CDR)来源于兔源单克隆抗体1H1,框架区(FR)来源于人类抗体,轻链框架区1、轻链框架区2、轻链框架区3和轻链框架区4的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14所示;重链框架区1、重链框架区2、重链框架区3和重链框架区4的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17和SEQID NO:18所示。
抗体CDR区是抗体识别和结合抗原的区域,其在四个FR区卷曲支持下形成稳定的空间构型,进而识别和结合抗原。本发明通过改造兔源单克隆抗体1H1的FR区,在最大限度人源化的基础上基本维持了1H1的CDR环构象,使其在保持与原有亲本抗体相当亲和力的情况下同时具有和人体内的抗体分子极其相似的轮廓,从而逃避人免疫系统的识别,大大降低或者基本消除抗体的免疫原性。经检测,本发明具有上述框架区的抗新冠病毒S蛋白人源化抗体对新冠病毒S蛋白(包括野生型、Delta和Omicron亚系BA.1、BA.2、BA.3以及BA.4/5毒株)的亲和常数在pM级别,中和新冠病毒S蛋白的半数有效浓度(EC50)在0.1μg/mL以下,且中和假病毒的半数抑制浓度(IC50)在0.05μg/mL以下,这表明本发明的人源化抗体在人源化降低异源性的同时具有与亲本抗体相当的亲和力和特异性,其结合新冠病毒的能力强,对野生型和多种变异株均具有高的中和活性,甚至相比于亲本抗体对部分变异株具有提高的中和活性,此外,其免疫原性弱,生物安全性高,有望作为中和抗体用于开发治疗新冠病毒的药物,具有广泛的临床应用前景和重要的医学意义。
具体地,兔源单克隆抗体1H1的轻链互补决定区1、轻链互补决定区2和轻链互补决定区3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7所示;重链互补决定区1、重链互补决定区2和重链互补决定区3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10所示。
在本发明中,人源化抗体的4个框架区与3个互补决定区按顺序交错排列,构成可变区(V),对应地,本发明的抗新冠病毒S蛋白人源化抗体的轻链可变区的氨基酸序列SEQID NO:3所示;重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。
为了更好地提高抗体的亲和性和降低免疫原性,人源化操作还包括将兔源单克隆抗体1H1的恒定区改造为人类抗体的编码基因,恒定区与可变区构成完整抗体的轻链和重链。可选地,本发明的抗新冠病毒S蛋白人源化抗体的轻链恒定区为人源κ链,重链恒定区为人源IgG1型。
具体地,本发明的抗新冠病毒S蛋白人源化抗体的轻链的氨基酸序列如SEQ IDNO:1所示;重链的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
对本发明上述所述的氨基酸序列信息汇总如下:
表1本发明的人源化抗体1H1的氨基酸序列信息汇总
本发明又一实施例提供了一种核苷酸分子,所述核苷酸分子用于编码如上所述的抗新冠病毒S蛋白人源化抗体。
核苷酸分子通常是RNA(例如mRNA)或DNA(例如cDNA或基因组DNA),核酸分子可以是单链或双链的,DNA可以是编码链或非编码链。所述种核苷酸分子的序列依据抗体的氨基酸序列通过常规手段如密码子编码规则推导即可得到。
核苷酸分子全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。
本发明另一实施例提供了一种重组载体,所述重组载体携带如上所述的核苷酸分子。
本发明的典型载体包括质粒、病毒、噬菌体、黏粒和微型染色体。载体可以是克隆载体(即用于将核苷酸分子转移到宿主中,并在宿主细胞中大量繁殖)或表达载体(即包含必要的遗传元件从而允许插入到载体的核苷酸分子在细胞中表达)。因此,克隆载体可以包含选择标记,以及与所述克隆载体所指定的细胞类型相匹配的复制起点,而表达载体则包含在指定宿主细胞中表达的调控元件(如启动子、增强子)。本发明的核苷酸分子或其片段可以插入到合适的载体中以形成携带本发明核苷酸分子的克隆载体或表达载体。此为本领域的公知技术,在此不再详细介绍。
可选地,所述重组载体包括原核载体(如大肠杆菌载体、枯草杆菌载体)、真核载体(如酵母载体)或病毒载体(如慢病毒、腺病毒)。
本发明再一实施例提供了一种宿主细胞,所述宿主细胞携带如上所述的核苷酸分子或包含如上所述的重组载体。
宿主细胞包括原核细胞和真核细胞,根据重组载体的类型选择,例如,当为原核载体时,宿主细胞选用原核细胞,常用的原核宿主细胞包括大肠杆菌、枯草杆菌等。当为真核载体时,宿主细胞选用真核细胞,常用的真核宿主细胞包括酵母等。
可选地,用于转染或转化本发明的上述所述的核苷酸分子或重组载体的宿主细胞包括但不限于大肠杆菌、枯草杆菌、酵母细胞、昆虫细胞等。
基于本发明提供的抗新冠病毒S蛋白人源化抗体具有高亲和力和优良的病毒中和活性,本发明实施例还提供了如上所述的抗新冠病毒S蛋白人源化抗体、如上所述的核苷酸分子、如上所述的重组载体或如上所述的宿主细胞在制备预防和/或治疗新冠病毒药物或检测新冠病毒试剂中的应用。
所述抗新冠病毒S蛋白人源化抗体、核苷酸分子、重组载体或宿主细胞在制备预防和/或治疗新冠病毒药物中的应用优势与如上所述的抗新冠病毒S蛋白人源化抗体相对于现有技术的优势相同,在此不再赘述。
基于与上述相同的发明构思,本发明实施例进一步提供了一种预防和/或治疗新冠病毒药物,其活性成分为以下A-D中的任一种或多种:
A、如上所述的抗新冠病毒S蛋白人源化抗体;
B、编码A中所述抗新冠病毒S蛋白人源化抗体的核苷酸分子;
C、携带B中所述核苷酸分子的表达载体;
D、携带B中所述核苷酸分子或C中所述表达载体的宿主细胞。
将本发明抗新冠病毒S蛋白人源化抗体或者能够产生抗新冠病毒S蛋白人源化抗体的核苷酸分子、表达载体和/或宿主细胞作为药物的活性成分,可以抑制新冠病毒SARS-CoV-2对细胞的感染,起到预防、缓解或治疗的作用。所述预防和/或治疗新冠病毒药物相对于现有技术的优势与如上所述的抗新冠病毒S蛋白人源化抗体相对于现有技术所具有的优势相同,在此不再赘述。
上述所述的新冠病毒包括野生型、Delta变异株和/或Omicron变异株。具体地,Omicron变异株包括Omicron亚系BA.1、BA.1.1、BA.2、BA.2.12.1、BA.2.75、BA.3以及BA.4/5变异株。
可选地,所述药物还含有药学上可接受的辅料。药学上可接受的辅料的目的是促进对生物体的给药,利于活性成分的吸收进而发挥预防和/或治疗作用。
药学上可接受的辅料包括溶剂、分散剂、稀释剂、填充剂、润湿剂、粘合剂、崩解剂、润滑剂、防腐剂、助悬剂、乳化剂、赋形剂、稳定剂、缓冲剂、等张剂、调味剂等和载体中的任意一种或至少两种的组合。将前述组分用于药学活性物质是本领域所熟知的。例如,分散剂、助悬剂、崩解剂、赋形剂、稳定剂、调味剂等常用于经口施用;缓冲剂、防腐剂、等张剂、稳定剂等常用于注射用混合物;以及赋形剂、润滑剂、防腐剂等常用于表面施用。
本发明所提供的药物可以适应于任何形式的给药方式,包括但不仅限于口服、鼻腔、经皮、静脉内及肠胃外给药,优选通过口服途径给药。本领域技术人员可根据给药方式,选择合适的制剂形式,例如,用于口服给药时,可制成常规的固体制剂及液体制剂,包括但不限于丸剂、片剂、咀嚼剂、胶囊剂、颗粒剂、混悬剂、滴剂或糖浆等,再例如,用于胃肠外给药时,可制成但不限于悬浮液、注射剂或喷雾剂等。
需要说明的是,除非另外定义,在本发明的上下文中,使用的科学和技术术语应具有本领域普通技术人员通常理解的含义。
术语“抗新冠病毒S蛋白人源化抗体”、“抗新冠病毒人源化抗体”、“S蛋白人源化抗体”或“人源化抗体”等词语具有相同的含义并可互换使用,指特异性结合新冠病毒Spike蛋白(S蛋白)的单克隆形式的人源化抗体。
术语“特异性结合”是本领域众所周知的术语,如果分子与特定目标抗原或表位的反应比与其他目标抗原或表位的反应更频繁、更快速、持续时间更长和/或具有更大的亲和力,则其表现出“特异性结合”,“特异性结合”或称为“优先结合”,并不一定需要(尽管可以包括)排他结合。
术语“单克隆抗体”是指同质抗体群,即除了可能以少量存在的可能的天然出现的突变和/或翻译后修饰(例如异构化、酰胺化)之外,构成群体的各个抗体是相同的。单克隆抗体是高度特异性的,针对单个抗原或表位。“单克隆”表明抗体从基本上同质的抗体群获得的特征,不应解释为限制抗体的来源或制备方式。
术语”治疗”及其类似语涵盖对人类或人以外的动物的任何疗法,治疗可以针对已有的病症,或者可以是预防性的(预防性治疗),其包括治愈、减轻或预防效果。治疗还可以包括治愈、减轻或预防与疾病有关的症状而不是作用于疾病的潜在起因。术语“预防”及其类似语包括使病患减少疾病或病症的发生或恶化的可能性。
下面结合具体实施例,进一步阐述本发明。下列实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件,例如冷泉港实验室出版的《分子克隆实验指南(第四版)》中所述的条件,或者通常按照制造厂商所建议的条件。
实施例1兔源单克隆抗体1H1的人源化改造
基于兔源单克隆抗体1H1(亲本抗体)可变区的氨基酸序列作为探针在NCBI-Blastp工具上进行序列比对,首先在Genbank上找到与轻链可变区(VL)和重链可变区(VH)相似性最高的人类抗体序列,之后将其作为人源化框架区(FR)改造的参考模板,得到候选可变区序列。加上人类抗体恒定区序列之后,委托通用生物公司全基因合成人源化抗体重链、轻链基因序列,将其分别构建在pCDN3.4表达载体上,具体操作如下:
以基因合成的表达载体做模板,通过PCR扩增抗体重、轻链基因序列,扩增体系如下:
表2候选抗体轻链PCR扩增体系
2×Gloria HiFi | 12.5μL |
5'引物_IgG_L | 1μL |
3'引物_IgG_L | 1μL |
dd H2O | 9.5μL |
质粒模板 | 5ng |
总体积 | 25μL |
表3候选抗体重链PCR扩增体系
表2-3中所用引物的DNA序列如下所示:
轻链>5'引物_IgG_L:agagaattcccgccgccaccatggagaccgacaccctgct(见SEQ IDNO:19);
轻链>3'引物_IgG_L:gaaccaaggtggagatcaagaggacagtggccgccccaag(见SEQ IDNO:20);
重链>5'引物_IgG_H:agagaattcccgccgccaccatggagaccgataccctgct(见SEQ IDNO:21);
重链>3'引物_IgG_H:ccctggtgaccgtgtcctccgcttccacaaagggcccctc(见SEQ IDNO:22)。PCR扩增程序为:98℃30s,98℃10s,64℃30s,72℃1min,72℃5min,16℃∞,30个循环,扩增结束后使用1%的琼脂糖凝胶进行电泳,轻链约750bp,重链约1500bp。之后使用DNA纯化回收试剂盒回收目的片段。
将线性化的pCDN3.4表达载体与目的基因片段混合之后加入到融化的Trelief 5α感受态中,冰浴30min。42℃水浴热激1min,热激结束后立即冰浴2min。加入400μL预热的LB培养基,置于37℃振荡培养箱中培养1min。1000g离心3min,留100μL培养基重悬菌体沉淀。将菌液涂布在的Amp抗性平板上,室温下静置5-10min。37℃培养过夜。每个平板挑取2-3个单菌落,37℃振荡培养箱中培养过夜。之后进行菌液PCR鉴定阳性克隆,反应体系如下:
表4菌液PCR反应体系
2×Taq | 6.25μL |
5’primer | 0.25μL |
3’primer | 0.25μL |
dd H2O | 5.25μL |
菌液 | 1μL |
总体积 | 13μL |
PCR扩增程序为:98℃30s,98℃10s,64℃30s,72℃1min,72℃5min,16℃∞,25个循环。对PCR产物进行电泳检测,根据电泳结果,选择PCR阳性的菌液进行质粒提取,对所提质粒进行测序,所得的测序正确的质粒即为人源化抗体1H1表达质粒。
本实施例中抗新冠病毒S蛋白人源化抗体轻链可变区中替换的氨基酸为:FR1区中的氨基酸改造为DLQSTQSPSSLSASVGDRLTISC(见SEQ ID NO:11),FR2区中的氨基酸改造为NQKDGKVDK(见SEQ ID NO:12),FR3区中的氨基酸改造为AVDSRWSGSGSGTDFTLTISSLQDEDLATWYC(见SEQ ID NO:13),FR4区中的氨基酸改造为FAGLTKIELK(见SEQ ID NO:14)。重链可变区替换的氨基酸为:FR1区中的氨基酸改造为QLQVVESGGGVVQPGRSLRISSAVS(见SEQ ID NO:15),FR2区中的氨基酸改造为FVKQAPGHGVE(见SEQ ID NO:16),FR3区中的氨基酸改造为KFSISHDNSTNTLFLQMNSLRAEDTGVWYT(见SEQ ID NO:17),FR4区中的氨基酸改造为YGKGTLVTVSA(见SEQ ID NO:18)。
实施例2人源化单克隆抗体1H1的生产和纯化
将测序正确的人源化单克隆抗体抗体1H1的表达质粒转染细胞,进行人源化抗体1H1的生产和纯化,具体操作包括:
1、转染前一天以1.2×106-1.6×106/mL的密度将细胞传代,转染前,将细胞密度调节到2.2106/mL。使用PEI试剂进行转染,重链质粒和轻链质粒的比例为1:2,转染体积为30ml;
2、转染72-96h后,将培养上清转移至50mL离心管中,以1000×g低速离心,4℃下离心10min,收集上清液,上清液中含有重组的识别新冠病毒S蛋白的人源化抗体1H1;
3、使用protein A树脂从上清液中纯化出重组的人源化单克隆抗体1H1:取150μLProtein A树脂悬浮液于1.5mL的EP管中,400g离心2min,弃上清,加入500μL洗涤液洗涤树脂2次。将树脂加入到上一步中收获的培养上清液中,振荡孵育过夜。1000g离心10min,留下450μL液体重悬Protein A树脂。加入10倍Protein A树脂体积的洗涤液洗涤Protein A树脂2次。之后向树脂中加入6倍Protein A树脂体积的洗脱液并转移至空的离心柱,1000g离心2min,收集抗体。之后向洗脱液中加入36%洗脱体积的平衡液,以中和洗脱液的酸度。4℃下1×PBS中透析过夜,更换1×PBS后继续透析3h。收获抗体溶液后使用Nanodrop测量浓度。并通过SDS-PAGE法和ELISA法进行鉴定。抗体鉴定后分装,于-20℃低温保存备用。
进一步通过HPLC方法纯度鉴定抗体纯度。将人源化抗体或兔源亲本抗体用流动相(pH6.4,50mM PB和500mM NaCl)稀释到200μg/mL后用0.2μm滤膜过滤,使用TSKgelSuperSW3000层析柱(4μm,4.6×300mm column)在安捷伦1100HPLC仪器上进样10μL跑样30min,流速0.3mL/min。结果如图1所示,其中图A-B分别为兔源亲本抗体和人源化抗体的HPLC色谱图。数据显示人源化抗体纯度为95%,兔源亲本抗体纯度为96%,二者纯度接近。
实施例3人源化单克隆抗体1H1的亲和力检测
利用GE公司的Biacore 3000生物分子相互作用分析仪对本发明的抗新冠病毒Spike蛋白(S蛋白)人源化抗体和兔源亲本抗体的亲和力进行精确测定;其中使用所选定抗体的浓度为333nM,并将其固定在CM5芯片上;然后用80、40、20、10和5nM五个浓度的重组新冠病毒S蛋白(野生型S蛋白(WT Spike,Cat:40592-V08H121)、Delta变异株S蛋白(Delta-Spike,Cat:40592-V08H134)、Omicron变异株S蛋白(Omicron BA.1Spike,Cat:40589-V08H30;Omicron BA.2Spike,Cat:40588-V07E36;Omicron BA.3Spike,Cat:40592-V08H138;Omicron BA.4/5Spike,Cat:40592-V08H130;均购自义翘神州)去结合,获得亲和力曲线;最终通过曲线拟合和计算,人源化抗体和兔源亲本抗体的亲和力曲线分别如图2-3所示,其中,从左至右、从上之下依次表示野生型S蛋白(WT Spike)、Delta变异株S蛋白(Delta-Spike)、Omicron变异株S蛋白(Omicron BA.1Spike、Omicron BA.2Spike、OmicronBA.3Spike、Omicron BA.4/5Spike),横坐标为时间,纵坐标为抗原与抗体结合后芯片上共振角变化,拟合结果如表5所示。
表5人源化抗体和兔源亲本抗体的亲和力测定结果
注:E表示10;解离系数Koff用于表征抗体与抗原解离速度的常数,结合系数Kon用于表征抗体与其靶标结合速度的常数,亲和力常数Kd为Koff/Kon的比,表示抗体与其抗原之间的平衡解离常数。
从图2-3和表5可知,本发明获得的抗新冠S蛋白的人源化抗体的亲和力相比兔源亲本抗体虽略有降低,但亲和力仍然维持在pM级别,能满足临床应用。
实施例4人源化单克隆抗体1H1与新冠病毒S蛋白结合能力测定
采用ELISA法检测人源化抗体和兔源亲本抗体与新冠病毒S蛋白结合能力,野生型S蛋白(WT Spike)、Delta变异株S蛋白(Delta-Spike)、Omicron变异株S蛋白(OmicronBA.1Spike、Omicron BA.2Spike、Omicron BA.3Spike、Omicron BA.4/5Spike)。具体操作如下:
1、将新冠病毒S蛋白用包被液(pH7.2 PBS)稀释到一定浓度(1μg/mL)后按25μL孔包被于384孔板上,于2-8℃放置过夜;
2、弃去孔中液体,用PBST洗5次,甩干后按50μL孔加入封闭液(含1%BSA和5%脱脂奶粉的PBST),室温1h,再用PBST洗5次,甩干;
3、用稀释液(含1%BSA的PBST)从1μg/mL开始3倍梯度稀释人源化抗体或和兔源亲本抗体,以25μL/孔加样至384孔板中,37℃孵育1h,弃液,洗板5次,甩干;
4、用稀释液稀释酶联抗体(HRP-羊抗人IgG(H+L))至一定浓度(1:5000),以25μL/孔加样至384孔板中,室温下反应1h,弃液,洗板5次,甩干;
5、配制底物混合液,以25μL/孔加入到384孔板中,室温孵育4min;
6、加入终止液10μL/孔,终止反应。
在450nm处读取吸收值OD,绘制结合曲线,兔源亲本抗体(RabMAb 1H1)结果见图4,人源化抗体(Humanized antibody 1H1)结果见图5,其中,横坐标为浓度,纵坐标为OD值,根据结合曲线计算得到抗体结合新冠病毒S蛋白的半数有效浓度(EC50,单位:μg/mL),相应数据汇总在表6中。
表6人源化抗体和兔源亲本抗体结合S蛋白的半数有效浓度(EC50)
从图4-5和表6中可以看出,人源化抗体的EC50相较于兔源亲本抗体略为升高,结合能力略微下降(大部分处于1倍以内),但仍维持在0.1μg/mL以下,均在可接受范围内。
实施例5人源化单克隆抗体1H的中和新冠病毒活性测定
将HEK293T-hACE2细胞以1.75×104的密度接种在96孔细胞培养板中过夜培养。SARS-CoV-2假病毒(G*ΔG-VSV)是用VSV-G假型病毒制备的,VSV-G假病毒基因组中的VSV基因被替换成荧光素酶表达模块,用VSV的假病毒表达新冠病毒S蛋白,共制备7种假病毒,共制备5种假病毒,分别为BA.1型、BA.1(R346K)型、BA.2型、BA.2.75型、BA.4型。将表达新冠病毒S蛋白的假病毒和人源化抗体以及兔源亲本抗体分别混合,抗体起始浓度20μg/mL,接下来按1:3进行梯度稀释,稀释8个梯度,同时稀释热灭活血浆样品作为对照。取稀释后的抗体和热灭活血浆样品50μL分别与50μL的BA.1型、BA.1(R346K)型、BA.2型、BA.2.75型、BA.4型假病毒进行混合。将混合物在37℃下孵育1h后,加入到过夜培养的HEK293T-hACE2细胞中,感染48h,加入荧光素底物,测量荧光值。
抗体对假病毒的中和滴度(IC50)定义为实验孔相对光单位(RLU)相对于对照孔的RLU平均值减少50%时的抗体样品浓度。结果见图6-7,其中,横坐标为不同毒株,纵坐标为中和率,中和率=(对照组发光强度均值-样品组发光强度均值)/对照组发光强度均值×100%。根据中和滴度曲线计算得到抗体对新冠病毒假病毒的中和滴度(IC50,单位:μg/mL),相应数据汇总在表7中。
表7人源化抗体和兔源亲本抗体对假病毒的中和滴度(IC50)
上述结果表明人源化抗体1H1针对5种假病毒中的4种亚型(omicron BA.1型、omicron BA.2型、omicron BA.2.75型、omicron BA.4型)的IC50相较于兔源亲本抗体1H1有降低,中和能力得到大幅提高,仅针对omicron BA.1(R346K)型假病毒,人源化抗体1H1的IC50相较于兔源亲本抗体1H1升高约0.5倍,中和能力降低约0.5倍。但总体而言,人源化改造后的抗体保留了广谱抗病毒活性,且对大部分的假病毒的中和能力有所升高,临床应用价值得到提升。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已,并不用以限制本发明,凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (9)
1.一种抗新冠病毒S蛋白人源化抗体,其特征在于,所述抗新冠病毒S蛋白人源化抗体互补决定区来源于兔源单克隆抗体1H1,框架区来源于人类抗体;
其中,轻链框架区1、轻链框架区2、轻链框架区3和轻链框架区4的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:11-14所示;重链框架区1、重链框架区2、重链框架区3和重链框架区4的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:15-18所示;
所述兔源单克隆抗体1H1的轻链互补决定区1、轻链互补决定区2和轻链互补决定区3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:5-7所示,重链互补决定区1、重链互补决定区2和重链互补决定区3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:8-10所示。
2. 根据权利要求1所述的抗新冠病毒S蛋白人源化抗体,其特征在于,所述新冠病毒S蛋白人源化抗体的轻链可变区的氨基酸序列SEQ ID NO:3所示,重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。
3. 根据权利要求2所述的抗新冠病毒S蛋白人源化抗体,其特征在于,所述抗新冠病毒S蛋白人源化抗体的轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示,重链的氨基酸序列如SEQ IDNO:2所示。
4.一种核苷酸分子,其特征在于,用于编码如权利要求1-3任一项所述的新冠病毒S蛋白人源化抗体。
5.一种重组载体,其特征在于,携带如权利要求4所述的核苷酸分子。
6.一种宿主细胞,其特征在于,携带如权利要求4所述的核苷酸分子或如权利要求5所述的重组载体。
7.如权利要求1-3任一项所述的抗新冠病毒S蛋白人源化抗体、如权利要求4所述的核苷酸分子、如权利要求5所述的重组载体或如权利要求6所述的宿主细胞在制备预防和/或治疗新冠病毒肺炎药物或检测新冠病毒试剂中的应用。
8.一种预防和/或治疗新冠病毒肺炎药物,其特征在于,活性成分为以下A-D中的任一种或多种:
A、如权利要求1-3任一项所述的抗新冠病毒S蛋白人源化抗体;
B、编码A中所述抗新冠病毒S蛋白人源化抗体的核苷酸分子;
C、携带B中所述核苷酸分子的表达载体;
D、携带B中所述核苷酸分子或C中所述表达载体的宿主细胞。
9.根据权利要求8所述的预防和/或治疗新冠病毒肺炎药物,其特征在于,所述新冠病毒包括野生型、Delta变异株和/或Omicron变异株,所述Omicron变异株包括Omicron亚系BA.1、BA.1.1、BA.2、BA.2.12.1、BA.2.75、BA.3和BA.4/5中的一种或多种。
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