JP7236562B2 - インターロイキン－４受容体抗体及びその用途 - Google Patents

Description

本発明は、生体臨床医学又は生物薬剤学の技術分野に関し、より具体的には、ヒト抗ＩＬ－４Ｒ抗体、並びにそのコード配列、その調製方法、その組成物、及びその用途に関する。

様々な生物学的機能を有するサイトカインであるインターロイキン－４（ＩＬ－４）は、活性化された２型ヘルパーＴ（Ｔｈ２）細胞により産生され、１２９個のアミノ酸残基からなる疎水性の球状タンパク質である。ＩＬ－４は、多くの標的細胞（例えば、Ｔ細胞、Ｂ細胞、造血細胞、線維芽細胞、及び様々な腫瘍細胞）を有しており、これらは全て、ＩＬ－４受容体を有する。インターロイキン－４受容体（ＩＬ－４Ｒ）には、下記の２つのタイプが存在する：ＩＬ－４Ｒのα鎖及びγｃ鎖で主に構成されており且つ造血細胞の表面上で主に発現されているＩ型受容体、並びにＩＬ－４Ｒα鎖及びＩＬ－１３Ｒα１鎖で構成されており且つ非造血細胞及び腫瘍細胞の表面上で主に発現されているＩＩ型受容体（Ｌａ Ｐｏｒｔｅ ＳＬ，Ｊｕｏ ＺＳ，Ｖａｃｌａｖｉｋｏｖａ Ｊ，ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ，２００８，１３２（２）：２５９－２７２）。ＩＬ－４Ｒαは、ＩＩ型炎症経路におけるＩ型受容体及びＩＩ型受容体の重要な構成要素である。ＩＬ－４Ｒαをブロックすることにより、２型免疫反応の２種の強力な調節因子ＩＬ－４及びＩＬ－１３を同時にブロックし得る。ＩＩ型炎症経路では、Ｔｈ２細胞（Ｔヘルパー２、ＣＤ４＋Ｔ細胞に属する）が重要な役割を果たす。２型免疫は、自然免疫及び適応免疫を含み且つ病原体を除去するための粘膜表面上での免疫障壁の形成を促進する特殊な免疫反応である。ＩＩ型炎症経路は、アレルギー性疾患の発症に不可欠な役割を果たす。従って、ＩＬ－４Ｒαは、アレルギー性疾患（例えば、アトピー性皮膚炎、喘息、特発性蕁麻疹、慢性鼻ポリープ副鼻腔炎、食物アレルギー等）の標的型処置（ｔａｒｇｅｔｅｄ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）にとって重要な標的の内の１つである。

現在、インターロイキン４受容体（ＩＬ－４Ｒ）を標的とする抗体薬物デュピルマブ（Ｓａｎｏｆｉ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．）が、商品名ＤＵＰＩＸＥＮＴ（登録商標）でＵＳ ＦＤＡにより販売承認されている。この抗体は、インターロイキン４受容体（ＩＬ－４Ｒ）アンタゴニストであり、ＩＬ－４シグナル及びＩＬ－１３シグナルを阻害し得る。現在、この抗体の注射を使用して、アトピー性皮膚炎及び喘息の適応症が処置されている。

しかしながら、薬物（特に、疾患処置のための抗体薬物）に関する患者のニーズに直面しているために、免疫原性がより低く、半減期がより長く、且つ薬物効果がより良好なＩＬ－４Ｒ抗体薬物が依然として緊急に必要とされている。

本発明は、新規のアミノ酸配列を有する抗体又はその抗原結合断片を提供する。この抗体又はその抗原結合断片として、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、及びＦａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆｖ断片、ｓｃＦｖ断片、又はｄｓＦｖ断片等が挙げられる。

本発明により提供される抗体又はその抗原結合断片は、
１）３個の軽鎖相補性決定領域であって、ＬＣＤＲ１アミノ酸配列は、配列番号１１に示された通りであり、ＬＣＤＲ２アミノ酸配列は、配列番号１２に示された通りであり、且つＬＣＤＲ３アミノ酸配列は、配列番号１３に示された通りである、軽鎖相補性決定領域と、
３個の重鎖相補性決定領域であって、ＨＣＤＲ１アミノ酸配列は、配列番号１４に示された通りであり、ＨＣＤＲ２アミノ酸配列は、配列番号１５に示された通りであり、且つＨＣＤＲ３アミノ酸配列は、配列番号１６に示された通りである、重鎖相補性決定領域と
を含むか、又は
２）３個の軽鎖相補性決定領域であって、ＬＣＤＲ１アミノ酸配列は、配列番号３に示された通りであり、ＬＣＤＲ２アミノ酸配列は、配列番号４に示された通りであり、且つＬＣＤＲ３アミノ酸配列は、配列番号５に示された通りである、軽鎖相補性決定領域と、
３個の重鎖相補性決定領域であって、ＨＣＤＲ１アミノ酸配列は、配列番号６に示された通りであり、ＨＣＤＲ２アミノ酸配列は、配列番号７に示された通りであり、且つＨＣＤＲ３アミノ酸配列は、配列番号８に示された通りである、重鎖相補性決定領域と
を含む。

５０００倍の血清希釈でのトランスジェニックマウスの血清力価を示す。 ＩＬ４／ＩＬ４Ｒのタンパク質結合活性のブロッキングでの候補抗体の比較を示す。 ＢＡ１６７、ＢＡ１７３、ＢＡ０３０、デュピルマブ、及びＩＬ４Ｒタンパク質の結合活性の比較を示す。 ＩＬ４／ＩＬ４Ｒのタンパク質結合活性のブロッキングでのＢＡ１６７、ＢＡ１７３、ＢＡ０３０、及びデュピルマブの比較を示す。 ＩＬ１３＋ＩＬ１３ＲＡ１／ＩＬ４Ｒのタンパク質結合活性のブロッキングでのＢＡ１６７、ＢＡ１７３、ＢＡ０３０、及びデュピルマブの比較を示す。 ヒト／アカゲザル／マウスＩＬ４ＲとのＢＡ１６７、ＢＡ１７３、ＢＡ０３０、及びデュピルマブの結合差を示す。 ＩＬ４により誘導されるＴＦ－１細胞増殖の阻害に関する実験を示す。 ＩＬ１３により誘導されるＴＦ－１細胞増殖の阻害に関する実験を示す。 ＰＢＭＣ細胞の増殖への候補抗体の阻害効果を示す。 ２．５ｍｇ／ｋｇの処方されたＢＡ１６７、ＢＡ１７３、及びデュピルマブの皮下注射後のカニクイザルのインビボでの平均濃度－時間曲線を示す。 投与後のＢ－ｈＩＬ４／ｈＩＬ４Ｒα二重ヒト化喘息モデルマウスの血清中におけるＩｇＥレベルの変化を示す。 投与後のＢ－ｈＩＬ４／ｈＩＬ４Ｒα二重ヒト化喘息モデルマウスの血清中におけるＢＡＬＦ好酸球の変化を示す。 ＢＡ１７３抗体、ＢＡ１６７抗体、及びデュピルマブ抗体それぞれの免疫原性検出を経時的に示す。

本発明の一態様では、抗体又はその抗原結合断片の軽鎖は、軽鎖可変領域（ＶＬ）を含み、この軽鎖可変領域は、配列番号１若しくは配列番号９に示される任意のアミノ酸配列を含むか、又は上述した軽鎖可変領域のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、８５％、若しくは９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。抗体又はその抗原結合断片の重鎖は、重鎖可変領域（ＶＨ）を含み、この重鎖可変領域は、配列番号２若しくは配列番号１０に示される任意のアミノ酸配列を含むか、又は上述した重鎖可変領域のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、８５％、若しくは９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。好ましくは、抗体又はその抗原結合断片は、
１）配列番号１に示されるアミノ酸配列の軽鎖可変領域、及び／若しくは配列番号２に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、又は
２）配列番号９に示されるアミノ酸配列の軽鎖可変領域、及び／若しくは配列番号１０に示されるアミノ酸配列の重鎖可変領域
を含む軽鎖可変領域配列及び重鎖可変領域配列を含む。

一態様では、抗体又はその抗原結合断片は、重鎖定常領域を含み、この重鎖定常領域は、γ－１ヒト重鎖定常領域、γ－２ヒト重鎖定常領域、γ－３ヒト重鎖定常領域、若しくはγ－４ヒト重鎖定常領域を含むか、又はこのヒト重鎖定常領域のバリアントを含み、好ましくは、この重鎖定常領域の配列は、

である。一態様では、抗体は、軽鎖定常領域をさらに含み、この軽鎖定常領域は、λヒト軽鎖定常領域又はκヒト軽鎖定常領域を含み、好ましくは、この軽鎖定常領域の配列は、

である。

本発明の一態様では、上述した抗体又はその抗原結合断片の結合抗原は、ＩＬ－４Ｒ抗原に結合し、好ましくは、このＩＬ－４Ｒは、ヒトＩＬ－４Ｒである。

本発明はまた、ヒトＩＬ－４Ｒに結合する抗体又はその抗原結合断片をコードする核酸配列を提供する。

本発明の一態様では、核酸は、下記の軽鎖相補性決定領域及び重鎖相補性決定領域のアミノ酸配列を含む抗体又はその抗原結合断片をコードする：
１）配列番号１１に示されるＬＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号１２に示されるＬＣＤＲ２アミノ酸配列、及び配列番号１３に示されるＬＣＤＲ３アミノ酸配列、並びに配列番号１４に示されるＨＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号１５に示されるＨＣＤＲ２アミノ酸配列、及び配列番号１６に示されるＨＣＤＲ３アミノ酸配列、又は
２）配列番号３に示されるＬＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号４に示されるＬＣＤＲ２アミノ酸配列、及び配列番号５に示されるＬＣＤＲ３アミノ酸配列、並びに配列番号６に示されるＨＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号７に示されるＨＣＤＲ２アミノ酸配列、及び配列番号８に示されるＨＣＤＲ３アミノ酸配列、
３）配列番号１に示されるアミノ酸配列の軽鎖可変領域、及び／若しくは配列番号２に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、又は
４）配列番号９に示されるアミノ酸配列の軽鎖可変領域、及び／若しくは配列番号１０に示されるアミノ酸配列の重鎖可変領域。

本発明は、上述した配列とハイブリダイズし且つ２つの配列の間に少なくとも５０％の、好ましくは少なくとも７０％の、より好ましくは少なくとも８０％の同一性を有する核酸に関する。本発明は、特に、ストリンジェントな条件下で本発明の核酸にハイブリダイズし得る核酸に関する。本発明では、「ストリンジェントな条件」は、下記を指す：（１）０．２×ＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳ、及び６０℃等の比較的低いイオン強度及び比較的高い温度でのハイブリダイゼーション及び溶出、又は（２）ハイブリダイゼーション中での及び４２℃での変性剤（例えば、５０％（ｖ／ｖ）ホルムアミド、０．１％仔ウシ血清／０．１％ Ｆｉｃｏｌｌ）の添加、又は（３）２つの配列の間の同一性が少なくとも９０％であり、より好ましくは少なくとも９５％である場合にのみ起こるハイブリダイゼーション。ハイブリダイズ可能な核酸によりコードされるポリペプチドは、成熟ポリペプチドと同一の生物学的機能及び活性を有する。

関連する配列が得られると、組換え法を使用して、この関連する配列を大量に得ることができる。このことは、通常、この関連する配列をベクターにクローニングし、次いで、このクローニングベクターを細胞に導入し、次いで、従来の方法により、増殖した宿主細胞から関連する配列を単離することにより行なわれる。本発明に関与する生体分子（核酸、タンパク質等）として、単離形態で存在する生体分子が挙げられる。

現在のところ、本発明のタンパク質（又はその断片若しくは誘導体）をコードするＤＮＡ配列を、化学合成により完全に得ることができる。次いで、このＤＮＡ配列を、当該技術分野で既知の様々な既存のＤＮＡ分子（又は例えばベクター）及び細胞に導入し得る。加えて、化学合成により、本発明のタンパク質配列に変異も導入し得る。

本発明はまた、ＩＬ－４Ｒに結合する抗体又はその抗原結合断片をコードするヌクレオチド配列を含むベクターも提供し、好ましくは、このベクターは、発現ベクターである。本発明のベクターとして、ウイルスベクター、例えば、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター、及びアデノ随伴ウイルスベクター、並びに非ウイルスベクター、例えば、プラスミドベクター及びトランスポゾンベクターが挙げられるが、これらに限定されず、このプラスミドベクターは、好ましくはｐＣＤＮＡ３．４（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）ベクターである。これらのベクターを使用して適切な宿主細胞を形質転換し得、その結果、この宿主細胞はタンパク質を発現し得る。

本発明はまた、ヒトＩＬ－４Ｒに結合する抗体又はその抗原結合断片の発現用の宿主細胞であって、ヒトＩＬ－４Ｒに結合する抗体若しくはその抗原結合断片をコードする発現ベクター、又はヒトＩＬ－４Ｒに結合する抗体若しくはその抗原結合断片をコードする核酸を含む宿主細胞も提供する。

本発明はまた、ＩＬ－４Ｒに結合する抗体又はその抗原結合断片の発現用の細胞であって、この細胞は、ＩＬ－４Ｒに結合する抗体若しくはその抗原結合断片をコードする発現ベクター、又はＩＬ－４Ｒに結合する抗体若しくはその抗原結合断片をコードする核酸を含み、好ましくは、この細胞は、上述した発現ベクターを含む宿主細胞である、細胞も提供する。本発明の一態様では、ＩＬ－４Ｒに結合する抗体又はその抗原結合断片を発現する宿主細胞として、哺乳類細胞、昆虫細胞、植物細胞、真菌細胞、及び原核細胞が挙げられるが、これらに限定されない。代表例として、下記が挙げられる：大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）及びストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、サルモネラ・チフィリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）の細菌細胞、真菌細胞、例えば酵母、ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）Ｓ２又はＳｆ９の昆虫細胞、並びに動物細胞、例えば、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ７細胞、及び２９３細胞。好ましくは、ＩＬ－４Ｒに結合する抗体又はその抗原結合断片を発現させるために本発明により提供される宿主細胞は、ＨＥＫ２９３である。

組換えＤＮＡによる宿主細胞の形質転換を、当業者に公知の従来の技術により実行し得る。宿主が大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）等の原核生物である場合には、ＤＮＡを吸収し得るコンピテント細胞を、指数増殖期後に採取してＣａＣｌ_２法で処理し得る。使用される工程は、当該技術分野で公知である。別の方法では、ＭｇＣｌ_２を使用する。必要に応じて、形質転換を、エレクトロポレーション法によっても実行し得る。宿主が真核生物である場合には、下記のＤＮＡトランスフェクション法を使用し得る：リン酸カルシウム共沈殿法、及び従来の機械的方法（例えば、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、及びリポソームパッケージング（ｌｉｐｏｓｏｍｅ ｐａｃｋａｇｉｎｇ））。

得られた形質転換体を従来の方法により培養して、本発明の遺伝子によりコードされている抗体を発現させ得る。使用する宿主細胞に応じて、培養に使用する培養培地を、様々な従来の培養培地から選択し得る。この培養を、宿主細胞の増殖に適した条件下で実施する。宿主細胞が適切な密度まで増殖した場合には、選択したプロモーターを、適切な方法（例えば、温度変化又は化学的誘導）を使用して誘導し得、この細胞を、さらなる期間にわたり培養する。

上述した方法では、組換え抗体を、細胞内か若しくは細胞膜上で発現させ得るか、又は細胞外に分泌させ得る。必要に応じて、物理的な、化学的な、及び他の特性を使用して、様々な分離方法により組換えタンパク質を分離して精製し得る。これらの方法は、当業者に公知である。これらの方法の例として下記が挙げられるが、これらに限定されない：従来の再生処理、タンパク質沈殿剤による処理（塩析）、遠心分離、浸透による細胞溶解、超音波処理、超遠心分離、分子篩クロマトグラフィー（ゲルろ過）、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、及び任意の他の液体クロマトグラフィー、並びにこれらの組み合わせ。

本発明の別の態様によれば、さらに提供されるのは、ヒトＩＬ－４Ｒに結合する上述した抗体又はその抗原結合断片と、薬学的に許容される担体とを含む組成物である。この薬学的に許容される担体として、下記の内の１つ又は複数が挙げられる：薬学的に許容される溶媒、分散剤、添加剤、可塑剤、及び薬学的賦形剤。一般的に、これらの物質は、非毒性の、不活性な、且つ薬学的に許容される担体媒体である。製剤化された医薬組成物を、腫瘍内、腹腔内、静脈内、又は注射投与等の局所投与が挙げられる（但し、これらに限定されない）従来のルーチンで投与し得る。

本発明はまた、ＩＬ－４Ｒ抗原に結合する上述した抗体又は抗体断片の内のいずれか又は核酸を含むキットにも関する。本発明の一態様では、このキットは、下記のＣＤＲアミノ酸配列の群の内のいずれか１つの抗体又はその抗原結合断片を含む：
１）配列番号１１に示されるＬＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号１２に示されるＬＣＤＲ２アミノ酸配列、及び配列番号１３に示されるＬＣＤＲ３アミノ酸配列、並びに配列番号１４に示されるＨＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号１５に示されるＨＣＤＲ２アミノ酸配列、及び配列番号１６に示されるＨＣＤＲ３アミノ酸配列、又は
２）配列番号３に示されるＬＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号４に示されるＬＣＤＲ２アミノ酸配列、及び配列番号５に示されるＬＣＤＲ３アミノ酸配列、並びに配列番号６に示されるＨＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号７に示されるＨＣＤＲ２アミノ酸配列、及び配列番号８に示されるＨＣＤＲ３アミノ酸配列。

本発明の一態様では、キットは、検出試薬、陰性コントロール、及びＩＬ－４Ｒ抗原－抗体反応の検出用の陽性コントロールをさらに含む。

別の態様では、本発明は、疾患を処置するための及び／又は予防するための医薬組成物の調製での、上述の態様の内のいずれか１つの抗体若しくはその抗原結合断片、核酸、ベクター、又は細胞の使用に関する。

別の態様では、本発明は、診断及び検出キットの調製での、上述の態様の内のいずれか１つの抗体又はその抗原結合断片、及び核酸の使用に関する。

別の態様では、疾患を処置するか又は予防する方法が提供される。この方法は、必要な対象に、本発明の抗体若しくは抗原結合断片、核酸、ベクター、細胞、又は医薬組成物を投与することを含む。

別の態様では、診断して検出する方法が提供される。この方法は、必要な対象又はサンプルに、本発明の抗体若しくは抗原結合断片、核酸、又はキットを投与することを含む。

別の態様では、疾患を処置するための及び予防するための、上述の態様の内のいずれか１つの抗体若しくはその抗原結合断片、核酸、ベクター、細胞、又は医薬組成物の使用が提供される。

別の態様では、検出するための及び診断するための、上述の態様の内のいずれか１つの抗体若しくはその抗原結合断片、核酸、又はキットの使用が提供される。

本発明の別の態様によれば、疾患は、好ましくはＩＬ－４Ｒ関連疾患であり、さらに好ましくは、このＩＬ－４Ｒ関連状態は、炎症又はアレルギー性（例えば、喘息、アトピー性皮膚炎、そう痒、好中球減少症、アレルギー反応、鼻ポリープ、好酸球性食道炎、皮膚感染症、慢性副鼻腔炎等）であり、好ましくは、炎症又はアレルギー性疾患は、喘息であり、さらに好ましくは、喘息の処置及び／又は予防として、喘息増悪の発生率の低下、１つ又は複数の喘息パラメータの改善、吸入コルチコステロイド及び／又は長時間作用型βアゴニストへの患者の依存性の改善等である。

広範囲に及ぶ緻密な研究、及びマススクリーニングにより、本発明者らは、一群の抗ＩＬ－４Ｒ抗体を得ることに成功している。実験結果から、本発明で得られたＩＬ－４Ｒ抗体は、ＩＬ－４Ｒとそのリガンドとの相互作用を効果的にブロックし得ることが示された。驚くべきことに、得られた候補抗体は、デュピルマブとは異なるエピトープ結合特性を有しており、且つ低い免疫原性、インビボでの長い半減期、及び喘息等の疾患の動物モデルでの顕著なインビボ効果を有することが確認された。本発明は、上記に基づいて達成されている。

実施形態の詳細な説明
下記の実施例の参照により、本発明をより理解し得る。しかしながら、下記の実施例は、例示のみを目的として提示されていること、及びいかなる形でも本発明の保護範囲を限定しないと理解すべきである。

実施例１．抗ＩＬ４Ｒ抗体の産生
１．１ 免疫化
ＩＬ４Ｒ（Ｓｉｎｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ、カタログ番号１０４０２－Ｈ０８Ｈ）及びフロイントアジュバントにより乳化した後、Ｓｈａｎｄｏｎｇ Ｂｏａｎ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．の完全ヒト抗体トランスジェニックマウスＢｏＡｎ－ｈＭａｂを免疫化した。１回目の免疫化には、完全フロイントアジュバントを使用し、２回目の免疫化及び３回目の免疫化には、フロイント不完全アジュバントを使用した。今回は、合計で９匹のマウスを免疫化した。血清力価が比較的高いマウスを選択し、ブースター免疫化した。３日後、マウスを屠殺し、その脾臓を、後続の実験用に摘出した。血清力価を、主にＥＬＩＳＡで検出した。ＣＢＳコーティング溶液（ｐＨ９．６炭酸溶液）を使用し、一晩４℃にて、１００μＬ／ウェル中の１μｇ／ｍＬの濃度で、ＩＬ４Ｒタンパク質（１０４０２－Ｈ０８Ｈ、Ｓｉｎｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．）をコーティングし、３％の脱脂粉乳を使用して、３７℃、１時間でブロッキングし、血清を、ＰＢＳＴで２００×、１０００×、５０００×、及び２５０００×まで希釈し、１つのウェル当たり１００μＬ添加した。プレートを、１時間にわたり３７℃でインキュベートし、次いで、ＨＲＰヤギ抗ヒトＨ＋Ｌ（４７４－１００６、ＫＰＬ）を添加し、１時間にわたり３７℃でインキュベートした。１０分間の発色後に、２Ｍの濃硫酸で発色を停止させ、ＯＤ４５０をマイクロプレートリーダーで測定した。検出された血清力価を、図１に示した。

１．２ ファージライブラリの構築
この免疫化マウスの脾臓細胞を採取し、Ｔｒｉｚｏｌ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号１５５９６－０２６）を添加した。細胞を完全に溶解させた後、１／５体積のクロロホルムを添加した。この混合物を十分に混合し、室温で２０分間置き、次いで、２０分にわたり１２０００ｒｐｍで４℃にて遠心分離した。上部の水溶液を採取し、等量のイソプロパノールを添加した。この混合物を、室温で２０分間置き、２０分にわたり１２０００ｒｐｍで４℃にて遠心分離した。上清の水溶液を廃棄し、７５％のエタノールで２回洗浄した。５分にわたる４℃及び１２０００ｒｐｍでの遠心分離後、水溶液を廃棄して沈殿物を残留させた。室温での風乾後、ＤＥＰＣ水を添加して沈殿物を再懸濁させて、ＲＮＡを得た。得られたＲＮＡを、Ｒｏｃｈｅ逆転写キットＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｒ Ｆｉｒｓｔ Ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ、カタログ番号４８９７０３０００１）をその説明書に従って使用して、ｃＤＮＡに逆転写させた。ファージライブラリを構築する工程を、Ｃａｒｌｏｓ Ｆ．Ｂａｒｂａｓ ＩＩＩ，Ｐｈａｇｅ ｄｉｓｐｌａｙ：Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌで説明されている方法に従って実行した。ファージライブラリＩＬ４Ｒ Ｑ１４を、ＩＬ４Ｒ Ｑ１４と番号付けされたマウスで構築し、ライブラリ容量は、９．２８×１０^８であり、ファージライブラリＩＬ４Ｒ Ｑ６を、ＩＬ４Ｒ Ｑ６と番号付けされたマウスで構築し、ライブラリ容量は、２．８×１０^８であり、ファージライブラリＩＬ４Ｒ Ｑ２９を、ＩＬ４Ｒ Ｑ２９と番号付けされたマウスで構築し、ライブラリ容量は、６．４×１０^８であった。

１．３ スクリーニング
１．プレートスクリーニング：プレートを、１μｇ／ウェルにてＩＬ４Ｒ－Ｈｉｓタンパク質（Ｓｉｎｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．、１０４０２－Ｈ０８Ｈ）でコーティングし、４℃で一晩放置し、翌日に１時間にわたり２％のＢＳＡでブロックした。ファージライブラリ（２×１０^１２）を添加し、２時間にわたりインキュベートした。４～１０回の洗浄後、ＩＬ４Ｒ結合ファージを、溶出緩衝液（ｐＨ２．２）で溶出させた。

２．磁気ビーズスクリーニング：ＩＬ４Ｒ－Ｆｃタンパク質（Ｓｉｎｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．、１０４０２－Ｈ０２Ｈ）を、従来の工程に従ってビオチン化（インプットＩＬ４Ｒタンパク質対ビオチンのモル比は、１：２であった）した後、磁気ビーズ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｄｙｎａｂｅａｄｓ Ｍ－２８０ Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ、００３５５８７１）に結合させ、次いでファージライブラリと共にインキュベートした。４～１０回の洗浄後、ＩＬ４Ｒに特異的に結合したファージを、溶出緩衝液（ｐＨ２．２）で溶出させた。

クローンＩＬ４ＲＱ１４－ＢＡ０３０＼ＢＡ０３４、ＩＬ４ＲＱ６－ＢＡ１６７＼ＢＡ１７３、ＩＬ４ＲＱ２４－ＢＡ４２０、及びＩＬ４ＲＱ２９－ＢＡ１３０１を、プレートスクリーニングにより得た。ＩＬ４ＲＱ１４は、１４番目の免疫化野生型マウスを表し、ＢＡは、磁気ビーズスクリーニングを表す。

ファージ酵素結合免疫アッセイ（Ｅｌｉｓａ）により検出された陽性ライブラリを、プレートにコーティングした。クローンを直接選び出し、自律培地（ａｕｔｏｎｏｍｏｕｓ ｍｅｄｉｕｍ）を使用することにより発現を誘導した。上清を、結合活性に関して検出し、選択したクローンを、ＥＬＩＳＡによりＩＬ４発現のブロッキングを検出し続けた。ＩＬ４遮断活性を有するクローンを選択して別のＥＬＩＳＡ検出を行ない、ＩＬ１３／ＩＬ１３ＲＡ１をブロックし得る陽性クローンを選択した。この陽性クローンの分子構築及び産生を実施した。

実施例２．ブロッキング抗体の分子構築及び産生
クローンＩＬ４ＲＱ１４－ＢＡ０３０、ＢＡ０３４（本発明ではＢＡ０３０及びＢＡ０３４と略される）、ＩＬ４ＲＱ６－ＢＡ１６７、ＢＡ１７３（本発明ではＢＡ１６７及びＢＡ１７３と略される）、ＩＬ４ＲＱ２４－ＢＡ４２０（本発明ではＢＡ１３０１と略される）、並びにＩＬ４ＲＱ２９－ＢＡ１３０１（本発明ではＢＡ１３０１と略される）を、配列決定のためにＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏ．，Ｌｔｄに送付した。各クローンのアミノ酸配列を、表１に示した。

可変領域遺伝子の増幅（２＊ＥａｓｙＰｆｕ ＰＣＲ ＳｕｐｅｒＭｉｘ、製造業者：Ｔｒａｎｓｇｅｎ、カタログ番号：ＡＳ２１１、バッチ番号：＃Ｌ１１２２８）、並びにシグナルペプチド及び可変領域のオーバーラップ伸長を、従来の分子生物学的技術により実施した。重鎖及びシグナルペプチドの遺伝子を有する可変領域を、相同組換え（ＣｌｏｎＥｘｐｒｅｓｓ ＩＩ Ｏｎｅ Ｓｔｅｐ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ、製造業者：Ｖａｚｙｍｅ、カタログ番号：Ｃ１１２－０１、バッチ番号：ＴＥ２２２Ｂ８）により、抗体重鎖定常領域（ＩｇＧ４）の配列を有するベクターｐＣＤＮＡ３．４（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）に連結し、軽鎖及びシグナルペプチドの遺伝子を有する可変領域を、相同組換え（ＣｌｏｎＥｘｐｒｅｓｓ ＩＩ Ｏｎｅ Ｓｔｅｐ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ、製造業者：Ｖａｚｙｍｅ、カタログ番号：Ｃ１１２－０１、バッチ番号：ＴＥ２２２Ｂ８）により、抗体軽鎖定常領域の配列を有するベクターｐＣＤＮＡ３．４（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）に連結した。配列を、下記のように示した。
重鎖定常領域（ＩｇＧ４）の配列：

軽鎖定量領域の配列：

次いで、得られたベクターをＨＥＫ２９３細胞に共トランスフェクトし、３７℃、８％ ＣＯ_２、１２５ｒｐｍにてシェーカー上で培養した。６～７日後、一過性発現上清をプロテインＡ親和性クロマトグラフィーにより精製してＩＬ４Ｒ抗体を得、抗体濃度を、ＵＶ２８０複合減衰係数（ＵＶ２８０ ｃｏｍｂｉｎｅｄ ｅｘｔｉｎｃｔｉｏｎ ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ）により決定した。

コントロール抗体の産生：Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．のＩＬ４Ｒ抗体であるデュピルマブのアミノ酸配列を、ＩＭＧＲＴデータ及び米国特許出願公開第２００８１６００３５Ａ１号明細書から決定した。遺伝子合成の完了後、この遺伝子をベクターｐＣＤＮＡ３．４に挿入し、ＨＥＫ２９３細胞により発現させた。デュピルマブのアミノ酸配列を、下記のように示した：
デュピルマブの軽鎖アミノ酸配列：

デュピルマブの重鎖アミノ酸配列：

実施例３ ＢＡ０３０、ＢＡ１６７、ＢＡ１７３、及びデュピルマブの比較
３．１ スクリーニング抗体及びＩＬ４Ｒタンパク質の遮断活性の比較
ＩＬ４（１１８４６－ＨＡＮＥ、Ｓｉｎｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．）を、一晩４℃にて、１００μＬ／ウェル中の０．２μｇ／ｍｌの濃度でコーティングし、３％の脱脂粉乳を使用して１時間ブロッキングし、同時に、ＩＬ－４Ｒ－Ｆｃ－ビオチン（０．４μｇ／ｍｌ）５０μＬ、並びに様々な濃度（１６μｇ／ｍＬ、４μｇ／ｍＬ、１μｇ／ｍＬ、０．２５μｇ／ｍＬ、０．０６２５μｇ／ｍＬ、０．０１５６２５μｇ／ｍＬ、及び０．００３９０６２５μｇ／ｍＬ）での候補抗体５０μＬの合計１００μＬを、ブロックされたＥＬＩＳＡプレートに添加し、１時間にわたり３７℃で共インキュベートし、ＰＢＳＴによる３回の洗浄後、ストレプトマイシン／ＨＲＰ（Ｒ＆Ｄ、カタログ番号：８９０８０３）を添加して１時間にわたり３７℃でインキュベートし、各ウェルに、ＴＭＢ発色溶液（Ｂｅｉｊｉｎｇ Ｍｅｉｋｅ Ｗａｎｄｅ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．、カタログ番号：１００１）１００μＬを添加した。１０分間の発色後に、２Ｍの濃硫酸５０μＬの添加により発色を停止させ、ＯＤ４５０をマイクロプレートリーダーで測定した。結果を、図２及び表２に示した。

抗体の配列、ブロッキングデータ等を包括的に分析した後、本発明者らは、比較実験用に、ＩＬ４Ｒ－ＢＡ１６７－ＩｇＧ４（これ以降、又はＢＡ１６７と略される）、ＩＬ４Ｒ－ＢＡ１７３－ＩｇＧ４（これ以降、又はＢＡ１７３と略される）、ＩＬ４Ｒ－ＢＡ０３０－ＩｇＧ４（これ以降、又はＢＡ０３０と略される）、及びデュピルマブ抗体を選択した。

３．２ ＩＬ４Ｒタンパク質によるＢＡ１６７、ＢＡ１７３、ＢＡ０３０、及びデュピルマブの結合活性の比較
ＣＢＳコーティング溶液（ｐＨ９．６炭酸溶液）を使用し、一晩４℃にて、１００μＬ／ウェル中の様々な濃度（０．４μｇ／ｍｌ、０．２μｇ／ｍｌ、０．１μｇ／ｍｌ、０．０５μｇ／ｍｌ、０．０２５μｇ／ｍｌ、０．０１２５μｇ／ｍｌ、０．００６２５μｇ／ｍｌ、及び０μｇ／ｍｌ）で、タンパク質ＩＬ４Ｒ（１０４０２－Ｈ０８Ｈ、Ｓｉｎｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．）をコーティングし、３％の脱脂粉乳を使用して、３７℃にて１時間ブロッキングし、各ウェルに２μｇ／ｍｌの候補抗体１００μＬを添加して１時間にわたり３７℃でインキュベートし、次いで、ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）／ＨＲＰ（ＫＰＬ、カタログ番号：４７４－１００６）を添加し、１時間にわたり３７℃でインキュベートした。１０分間の発色後に、各ウェルへの２ＭのＨ_２ＳＯ_４ ５０μＬの添加により発色を停止させ、ＯＤ４５０をマイクロプレートリーダーで測定した。結果を、図３及び表３に示した。コントロール抗体と比較して、３種の抗体は、ＩＬ４Ｒタンパク質に近い結合感度を有した。

３．３ ＩＬ４／ＩＬ４Ｒのタンパク質結合のブロッキングにおける候補抗体
ＩＬ４（１１８４６－ＨＡＮＥ、Ｓｉｎｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．）を、一晩４℃にて、１００μＬ／ウェル中の０．２μｇ／ｍｌの濃度でコーティングし、３％の脱脂粉乳を使用して、１時間にわたりブロッキングし、同時に、ＩＬ４Ｒ－Ｆｃ－ビオチン（０．４μｇ／ｍｌ）、並びに様々な濃度（３０μｇ／ｍＬ、７．５μｇ／ｍＬ、１．８７５μｇ／ｍＬ、０．４６８７５μｇ／ｍＬ、０．１１７１８７５μｇ／ｍＬ、及び０μｇ／ｍＬ）での候補抗体を、１時間にわたり３７℃で共インキュベートし、次いで、ブロックされたＥＬＩＳＡプレートに添加して、さらに１時間にわたり３７℃で共インキュベートし、次いで、ストレプトマイシン／ＨＲＰ（Ｒ＆Ｄ、カタログ番号：８９０８０３）を添加し、１時間にわたり３７℃でインキュベートし、１０分間の発色後に、各ウェルへの２ＭのＨ_２ＳＯ_４ ５０μＬの添加により発色を停止させた。ＯＤ４５０を、マイクロプレートリーダーで測定した。結果を、図４及び表４に示した。コントロール抗体と比較して、３種の抗体は、ＩＬ４及びＩＬ４Ｒの結合を効果的にブロックし得、且つ同様の遮断活性を有した。

３．４ ＩＬ１３＋ＩＬ１３ＲＡ１／ＩＬ４Ｒのタンパク質結合のブロッキングにおける候補抗体
ＩＬ１３ＲＡ１（１０９４３－Ｈ０８Ｈ、Ｓｉｎｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．）を、一晩４℃にて、１００μＬ／ウェル中の０．８μｇ／ｍｌの濃度でコーティングし、３％の脱脂粉乳を使用して、１時間にわたりブロッキングし、同時に、ＩＬ４Ｒ－Ｆｃ－ビオチン（０．２４μｇ／ｍｌ）及びＩＬ１３（１μｇ／ｍｌ、１０３６９－ＨＡＮＥ、Ｓｉｎｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．）、並びに様々な濃度（３０μｇ／ｍＬ、７．５μｇ／ｍＬ、１．８７５μｇ／ｍＬ、０．４６８７５μｇ／ｍＬ、０．１１７１８７５μｇ／ｍＬ、及び０μｇ／ｍＬ）での候補抗体を、１時間にわたり３７℃で共インキュベートし、次いで、ブロックされたＥＬＩＳＡプレートに添加して、さらに１時間にわたり３７℃で共インキュベートし、ＰＢＳＴによる３回の洗浄後、ストレプトマイシン／ＨＲＰ（Ｒ＆Ｄ、カタログ番号：８９０８０３）を添加して１時間にわたり３７℃でインキュベートし、ＰＢＳＴによる４回の洗浄後、ＴＭＢを使用して１０分にわたり発色させた。各ウェルに２ＭのＨ_２ＳＯ_４ ５０μＬを添加して、発色を停止させた。ＯＤ４５０を、マイクロプレートリーダーで測定した。結果を、図５及び表５に示した。コントロール抗体と比較して、３種の抗体は、ＩＬ１３＋ＩＬ１３ＲＡ１及びＩＬ４Ｒの結合を効果的にブロックし得、且つ同様の遮断活性を有した。

３．５ 様々な種におけるＢＡ１６７、ＢＡ１７３、ＢＡ０３０、及びデュピルマブの結合
Ｅｌｉｓａ法を使用して、ヒト、マウス、及びカニクイザルそれぞれのＩＬ４Ｒに対するＢＡ１６７、ＢＡ１７３、ＢＡ０３０、及びデュピルマブの結合を検出した。

ＣＢＳコーティング溶液（ｐＨ９．６炭酸溶液）を使用し、一晩４℃にて、１００μＬ／ウェル中の様々な濃度（５μｇ／ｍｌ、１．２５μｇ／ｍｌ、０．３１２５μｇ／ｍｌ、及び０．０７８１２５μｇ／ｍｌ）で、ヒトＩＬ４Ｒ（１０４０２－Ｈ０８Ｈ、Ｓｉｎｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．）、アカゲザルＩＬ４Ｒ（ＩＬＲ－Ｃ５２Ｈ８、ＡＣＲＯ）、及びマウスＩＬ４Ｒ（ＩＬＲ－Ｍ５２Ｈ１、ＡＣＲＯ）をコーティングし、３％の脱脂粉乳を使用して、３７℃にて１時間ブロッキングし、各ウェルに５μｇ／ｍｌの候補抗体１００μＬを添加して１時間にわたり３７℃でインキュベートし、次いで、ヤギ抗ヒトＩｇＧ／ＨＲＰ（ＫＰＬ、カタログ番号：４７４－１００６）を添加して１時間にわたり３７℃でインキュベートした。ＰＢＳＴによる４回の洗浄後、ＴＭＢを使用して１０分にわたり発色させた。各ウェルに２ＭのＨ_２ＳＯ_４ ５０μＬを添加して、発色を停止させた。ＯＤ４５０を、マイクロプレートリーダーで測定した。

結果から、図６に示すように、４群の抗体は、ヒトＩＬ－４Ｒタンパク質に対して同様の結合を有しているが、カニクイザルＩＬ４Ｒタンパク質に対しては結合性能が異なることが示された。この結果から、ＢＡ１６７抗体、ＢＡ１７３抗体、及びＢＡ０３０抗体、並びにデュピルマブは、ＩＬ４Ｒに対するエピトープが異なることが示された。

３．６ インビトロでの細胞機能におけるＢＡ０３０、ＢＡ１６７、ＢＡ１７３、及びデュピルマブ抗体の比較
３．６．１ ＩＬ４により誘導されるＴＦ－１細胞増殖の阻害に関する実験
ＴＦ－１細胞、ＩＬ４（Ｓｉｎｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ、カタログ番号：１１８４６－ＨＮＡＥ）、及び抗体を全て、完全培地（９０％ ＲＰＭＩ １６４０、１０％ ＦＢＳ）で希釈した。ＴＦ－１細胞を、４×１０^５個の細胞／ｍＬまで希釈し、５０μＬ／ウェル（即ち２００００個の細胞／ウェル）で白色９６ウェルプレートに播種した。ＩＬ４を、２ｎｇ／ｍＬまで希釈した。抗体を、５μｇ／ｍＬまで希釈し、次いで順次４倍希釈した（合計で６種の濃度）。希釈された抗体及びＩＬ４を等量で混合し、次いで、この混合物を、５０μＬ／ウェルで細胞ウェルに添加した。１ｎｇ／ｍＬのＩＬ４を、陰性コントロールとして細胞ウェルに添加した。完全培地を、陽性コントロールとして細胞ウェルに添加した。全てのサンプルに関して、反復ウェルを設定した。９６時間にわたる培養後、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ、カタログ番号：Ｇ７５７２）キットを使用して細胞量を検出した。実験結果を、図７及び表６に示す。

３．６．２ ＩＬ１３により誘導されるＴＦ－１細胞増殖の阻害に関する実験
ＴＦ細胞、ＩＬ１３（Ｓｉｎｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ、カタログ番号：１０３６９－ＨＮＡＣ）、及び抗体を全て、完全培地（９０％ ＲＰＭＩ １６４０、１０％ ＦＢＳ）で希釈した。ＴＦ－１細胞を、４×１０^５個の細胞／ｍＬまで希釈し、５０μＬ／ウェル（即ち２００００個の細胞／ウェル）で白色９６ウェルプレートに播種した。ＩＬ１３を、４ｎｇ／ｍＬまで希釈した。抗体を、７．５μｇ／ｍＬまで希釈し、次いで順次８倍希釈した（合計で６種の濃度）。希釈された抗体及びＩＬ１３を等量で混合し、次いで、この混合物を、５０μＬ／ウェルで細胞ウェルに添加した。２ｎｇ／ｍＬのＩＬ１３を、陰性コントロールとして細胞ウェルに添加した。完全培地を、陽性コントロールとして細胞ウェルに添加した。全てのサンプルに関して、反復ウェルを設定した。９６時間にわたる培養後、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ、カタログ番号：Ｇ７５７２）キットを使用して細胞量を検出した。実験結果を、図８及び表６に示した。

３．６．３ ＰＢＭＣ細胞の増殖への阻害効果
ＩＬ４は、ＰＢＭＣ細胞の増殖を促進し得る。抗体を添加した後、抗体は、ＩＬ４の受容体に結合してＰＢＭＣ細胞の増殖を阻害した。細胞、ＩＬ４（Ｓｉｎｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ、カタログ番号：１１８４６－ＨＮＡＥ）、及び抗体を全て、完全培地（９０％ ＲＰＭＩ １６４０、１０％ ＦＢＳ）で希釈した。ＰＢＭＣを回収し、ＰＨＡ（Ｔｈｅｒｍｏ、カタログ番号：１０５７６０１５）を１：１００の比で添加して、４日間培養した。抗体を１６０μｇ／ｍＬまで希釈し、順次１０倍希釈した（合計で９種の濃度）。ＩＬ４を、４００ｎｇ／ｍＬまで希釈した。抗体及びＩＬ４を等量で混合し、この混合物を、５０μＬ／ウェルで９６ウェルプレートに添加した。ＰＨＡ処理ＰＢＭＣを、５０μＬ／ウェルで添加した。各ウェルに、ＣＣＫ８（Ｄｏｊｉｎｄｏ、カタログ番号：ＣＫ０８）１０μＬを添加した。４時間にわたる発色後、ＯＤ４５０ｎｍを測定した。実験結果を、図９及び表６に示した。

ＴＦ－１は、ヒト血液学的白血病細胞（ｈｕｍａｎ ｈｅｍａｔｏｌｏｇｉｃａｌ ｌｅｕｋｅｍｉａ ｃｅｌｌ）である。ＩＬ４及びＩＬ１３は、細胞表面受容体への結合により、ＴＦ－１細胞の増殖を誘導し得る。抗体を添加した後、抗体は、ＩＬ４／ＩＬ１３の受容体に結合し、それによりＴＦ－１細胞の増殖が阻害された。上述した３．６．１～３．６．２の実験から、ＴＦ－１の細胞増殖の阻害に関する実験では、ＩＬ－４により誘導されるＴＦ－１細胞増殖へのＢＡ１７３抗体の阻害効果は、他の候補抗体と比べて良好であったこと、及びＢＡ１７３はデュピルマブと類似の遮断活性を有していたことを見出し得る。３．６．３の実験では、ＢＡ１７３及びＢＡ１６７は、デュピルマブと比べて良好な作用効果を有しており、このことから、これら２種の抗体は、ＩＬ４受容体により良好に結合し得、それによりＰＢＭＣの増殖が阻害されることが示される。

実施例４ カニクイザルのＰＫに対するＢＡ１６７、ＢＡ１７３、及びデュピルマブの研究
各抗体に関して３匹のカニクイザルを、２．５ｍｇ／ｋｇの用量での皮下注射投与用に選択し、２回投与した。２回目の投与は、１４日（ｄは日を意味する）、投与前０時間、及び投与後１時間、４時間、１０時間、１ｄ、２ｄ、３ｄ、４ｄ、５ｄ、７ｄ、１０ｄ、１４ｄであった。２回目の投与後１時間、４時間、１０時間、１ｄ、２ｄ、３ｄ、４ｄ、５ｄ、７ｄ、１０ｄ、１４ｄ、２１ｄ、及び２８ｄで、血清を採取して抗体濃度を検出した。血清を検出する方法は、Ｅｌｉｓａ法であった。具体的な検出結果を、下記の図１０及び表７に示す。

カニクイザルへのデュピルマブ、ＢＡ１７３、及びＢＡ１６７の２回目の皮下投与後、２に近いＣｍａｘ２／Ｃｍａｘ１値及び≧２のＡＵＣ２ｓｔ／ＡＵＣ１ｓｔ値の様々な蓄積度が現れた。２回目の投与後の排出段階に基づいて算出されたＴ１／２値はそれぞれ、４．２±３．０ｄ、１５．７±１．９ｄ、及び２２．２±８．１ｄであった。上述したデータから、ＢＡ１６７及びＢＡ１７３は、投与後にカニクイザルの血清中で比較的長く持続したことを見出し得る。デュピルマブの週１回の投与と比較して、投与期間を有意に延長させ得る。

実施例５ Ｂ－ｈＩＬ－４／ｈＩＬ－４ＲＡ二重ヒト化マウス喘息モデルに基づくＢＡ１６７、ＢＡ１７３、及びデュピルマブの薬効実験
ＯＶＡ（卵白アルブミン）４０μｇを製剤化し、腹腔内注射（２００μＬ／マウス）でマウスを感作させた。感作時間は、０日目、７日目、及び１４日目であった。２１～２５日目に、２％のＯＶＡを、噴霧により吸入させて抗原投与した（連続した５日にわたり各回３０分）。試験マウスに、２０日目及び２３日目、並びに最後の抗原投与の操作後２４時間で投与し、サンプルを採取して分析した。最後の噴霧及び抗原投与の操作後２４時間で、マウスの末梢血を採取し、血清を、ＯＶＡ特異的ＩｇＥ抗体に関して検出した。肺胞洗浄液を採取し、ＯＶＡ特異的ＩｇＥ抗体を検出した。最後の噴霧及び抗原投与の操作後２４時間で、マウスの肺胞洗浄液を採取し、フローサイトメトリーにより好酸球浸潤を検出した。実験結果を、図１１及び図１２に示す（Ｇ１：１×緩衝液、Ｇ２：デュピルマブ、Ｇ３：ＢＡ１７３、Ｇ４：ＢＡ１６７）。

実験の終了時に、Ｇ１コントロール群の血清中における平均ＩｇＥレベルは、２８．８５ｎｇ／ｍＬであり、デュピルマブ群、ＢＡ１７３群、及びＢＡ１６７群でのＩｇＥレベルはそれぞれ、２．０ｎｇ／ｍＬ、３．４ｎｇ／ｍＬ、及び２．１ｎｇ／ｍＬであり、コントロール群での好酸球の平均数は、３８４．５０×１０^２（細胞／ｍＬ）であり、デュピルマブ群、ＢＡ１７３群、及びＢＡ１６７群での好酸球の数はそれぞれ、３１．１×１０^２（細胞／ｍＬ）、１２．８×１０^２（細胞／ｍＬ）、及び１４．０×１０^２（細胞／ｍＬ）であった。実験の薬効モデルでは、ＢＡ１６７群及びＢＡ１７３群は、２５ｍｇ／ｋｇの用量で、喘息モデルマウスの血清中におけるＩｇＥレベル及び肺胞洗浄液中における好酸球の数を有意に減少させ得る。ＢＡ１６７群及びＢＡ１７３群は、喘息を効果的に緩和し、喘息増悪の発生率の低下、喘息関連の評価パラメータの改善、並びに吸入コルチコステロイド及び／又は長時間作用型βアゴニストへの患者の依存性の改善に寄与した。

同時に、アトピー性皮膚炎、そう痒、好中球減少症、アレルギー反応、鼻ポリープ、好酸球性食道炎、皮膚感染症、及び慢性副鼻腔炎の動物モデルでは、各群の動物それぞれに投与した。結果から、候補抗体ＢＡ１７３及びＢＡ１６７の両方が、上述した動物モデルにおいて、喘息モデルと同様の効果を示し、アトピー性皮膚炎、そう痒、好中球減少症、アレルギー反応、鼻ポリープ、好酸球性食道炎、皮膚感染症、及び慢性副鼻腔炎に対する良好な緩和効果又は処置効果を示すことが示された。

実施例６ カニクイザルでのＢＡ１６７、ＢＡ１７３、及びデュピルマブの免疫原性
ＣＢＳコーティング溶液（ｐＨ９．６炭酸溶液）を使用して、一晩４℃にて、１００μＬ／ウェル中の０．１２５μｇ／ｍｌで、ＢＡ１６７、ＢＡ１７３、及びデュピルマブをコーティングし、３％の脱脂粉乳を使用して、３７℃で１時間ブロッキングし、ＰＢＳＴで希釈された１００×血清１００μＬを各ウェルに添加して１時間にわたり３７℃でインキュベートし、ＰＢＳＴによる２回の洗浄後、ＢＡ１６７－ビオチン、ＢＡ１７３－ビオチン、及びデュピルマブ－ビオチンを０．１２５μｇ／ｍｌ（ウェル当たり１００μＬ）で添加して１時間にわたり３７℃でインキュベートした。ＰＢＳＴによる２回の洗浄後、ストレプトマイシン／ＨＲＰを添加して１時間にわたり３７℃でインキュベートし、ＰＢＳＴによる４回の洗浄後、ＴＭＢを使用して１０分にわたり発色させた。各ウェルに２ＭのＨ_２ＳＯ４ ５０μＬを添加して、発色を停止させた。ＯＤ４５０を、マイクロプレートリーダーで測定した。

結果を、図１３に示した（１０１～３０３は、カニクイザルの数を表した）。デュピルマブ実験群での１匹のカニクイザルは、２１日目に強い免疫原性を示し、ＯＤ値は、２８日目に２に近かった。ＢＡ１７３及びＢＡ１６７のＯＤ値は０．３を超えず、カニクイザルでは免疫原性がなかった。このことは、本発明者らの抗体が、将来的に比較的高い有効性及び比較的高い安全性を有し、投与後での身体中での副作用が比較的少なく、且つ肝臓毒性が比較的低いであろうこと示した。

Claims (9)

1. 抗体又はその抗原結合断片であって、前記抗体又はその抗原結合断片がＩＬ－４Ｒ抗原に結合し、前記抗体又はその抗原結合断片が、
   １）３個の軽鎖相補性決定領域であり、ＬＣＤＲ１アミノ酸配列は、配列番号１１に示された通りであり、ＬＣＤＲ２アミノ酸配列は、配列番号１２に示された通りであり、且つＬＣＤＲ３アミノ酸配列は、配列番号１３に示された通りである、軽鎖相補性決定領域と、
   ３個の重鎖相補性決定領域であり、ＨＣＤＲ１アミノ酸配列は、配列番号１４に示された通りであり、ＨＣＤＲ２アミノ酸配列は、配列番号１５に示された通りであり、且つＨＣＤＲ３アミノ酸配列は、配列番号１６に示された通りである、重鎖相補性決定領域と
   を含むか、又は
   ２）３個の軽鎖相補性決定領域であり、ＬＣＤＲ１アミノ酸配列は、配列番号３に示された通りであり、ＬＣＤＲ２アミノ酸配列は、配列番号４に示された通りであり、且つＬＣＤＲ３アミノ酸配列は、配列番号５に示された通りである、軽鎖相補性決定領域と、
   ３個の重鎖相補性決定領域であり、ＨＣＤＲ１アミノ酸配列は、配列番号６に示された通りであり、ＨＣＤＲ２アミノ酸配列は、配列番号７に示された通りであり、且つＨＣＤＲ３アミノ酸配列は、配列番号８に示された通りである、重鎖相補性決定領域と
   を含む
   ことを特徴とする抗体又はその抗原結合断片。
2. 前記抗体又はその抗原結合断片が、配列番号１のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域と、配列番号２のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域とを含むか、又は配列番号９のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域と、配列番号１０のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域とを含むことを特徴とする請求項１に記載の抗体又はその抗原結合断片。
3. 請求項１又は２に記載の抗体又はその抗原結合断片をコードする核酸。
4. 請求項３に記載の核酸を含むベクターであって、好ましくは発現ベクターであるベクター。
5. 請求項３に記載の核酸又は請求項４に記載のベクターを含む細胞。
6. 請求項１又は２に記載の抗体若しくはその抗原結合断片、又は請求項３に記載の核酸、又は請求項４に記載のベクター、又は請求項５に記載の細胞と、薬学的に許容される担体とを含むことを特徴とする医薬組成物。
7. 請求項１又は２に記載の抗体若しくはその抗原結合断片、又は請求項３に記載の核酸を含むキット。
8. ＩＬ－４Ｒ関連疾患を予防、処置、検出、又は診断するための薬剤であって、請求項１又は２に記載の抗体若しくはその抗原結合断片又は請求項３に記載の核酸を含み、前記ＩＬ－４Ｒ関連疾患は、好ましくは炎症又はアレルギー性疾患である、薬剤。
9. 前記炎症又はアレルギー性疾患は、喘息、アトピー性皮膚炎、そう痒、好中球減少症、アレルギー反応、鼻ポリープ、好酸球性食道炎、皮膚感染症、慢性副鼻腔炎を含み、好ましくは、前記炎症又はアレルギー性疾患は、喘息である、請求項８に記載の薬剤。

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