CN113924315B

CN113924315B - 抗β-NGF纳米抗体及其应用

Info

Publication number: CN113924315B
Application number: CN202080000967.3A
Authority: CN
Inventors: 刘红; 宋德勇; 邢平平
Original assignee: Shandong Boan Biotechnology Co Ltd
Current assignee: Shandong Boan Biotechnology Co Ltd
Priority date: 2019-06-10
Filing date: 2020-06-08
Publication date: 2022-06-28
Anticipated expiration: 2040-06-08
Also published as: WO2020248942A1; CN113924315A

Abstract

提供一种结合β‑NGF抗原的纳米抗体或多价纳米抗体，可用于治疗、预防、检测或诊断与β‑NGF相关的疾病，如疼痛或炎症，尤其是手术后疼痛、类风湿性关节炎痛及骨关节炎疼痛中的用途。

Description

抗β-NGF纳米抗体及其应用

技术领域

本发明涉及生物医学或生物制药技术领域，更具体地涉及β-NGF的纳米抗体，编码序列及可用于治疗和/或预防与β-NGF相关的疾病。

背景技术

骆驼的血液中存在一种天然缺失轻链只含重链的抗体，称为重链抗体。克隆重链抗体的可变区可得到只由一个重链可变区组成，大小约为12-15KDa，只有传统IgG型抗体的十分之一的抗体片段，被称为纳米抗体(Nanobody)。纳米抗体具有组织穿透力强、理化性质稳定、来源容易、产量高、可通过微生物进行扩大培养等优点。

神经生长因子(NGF)在外周交感神经元及胚胎感觉神经元的发育以及基底前脑胆碱能神经元的发育中为关键存活及维持因子(Smeyne等人，Nature368：246-249(1994)和Crowley等人，Cell76：1001-1011(1994))。NGF上调感觉神经元中神经肽的表达(Lindsay和Harmer，Nature337：362-364(1989))并且它的活性通过两种不同的膜结合受体：TrkA受体及p75共同神经营养蛋白受体(有时分别称为“高亲和性”及“低亲和性”NGF受体)介导。在人患者以及在一些动物模型中观察到NGF水平增加与多种炎性疾病之间相关。这些疾病包括系统性红斑狼疮、多发性硬化症、牛皮癣、关节炎、间质性膀胱炎及气喘。同样，外周组织中NGF水平升高与痛觉过敏及炎症相关并在许多关节炎形式中观察到。患类风湿性关节炎患者的滑膜表达高水平的NGF(Aloe，等人，Arch.Rheum.35：351-355(1992))。在人骨关节炎软骨细胞中观察到表达增加的NGF及高亲和性的NGF受体(TrkA)(Iannone等人，Rheumatology41：1413-1418(2002))。

目前，针对NGF靶点的抗体Tanezumab(中国专利CN102746399B)是一种神经生长因子IgG2型抗体阻断剂，由辉瑞与礼来公司共同开展临床试验，用于治疗背部疼痛、癌症相关疼痛和肌肉骨骼疼痛等，目前美国FDA已接受其BLA申请，用于中度至重度骨关节炎(OA)患者的慢性疼痛。

然而，目前在研的NGF靶向抗体均为IgG型抗体，形式单一，尚不能满足广大病人对于NGF靶点相关疾病的多样治疗需求。

发明内容

本发明提供一种纳米抗体或其抗原结合片段。

所述纳米抗体或其抗原结合片段包含3个互补决定区CDR1、CDR2、CDR3，其中：

(1)CDR1的氨基酸序列为SEQ ID NO.3，CDR2的氨基酸序列为SEQ ID NO.4，CDR3的氨基酸序列为SEQ ID NO.5；或者

(2)CDR1的氨基酸序列为SEQ ID NO.6，CDR2的氨基酸序列为SEQ ID NO.7，CDR3的氨基酸序列为SEQ ID NO.8；或者

(3)CDR1的氨基酸序列为SEQ ID NO.9，CDR2的氨基酸序列为SEQ ID NO.10，CDR3的氨基酸序列为SEQ ID NO.11。

在本发明的一个方面中，所述纳米抗体的序列为SEQ ID NO.1，SEQ ID NO.2或SEQID NO.12。

在本发明的一个方面中，所述纳米抗体也叫做单域抗体(sdAb)，指仅含有重链可变的抗体，抗原结合片段指任意具有能够结合目标抗原的抗体片段。

在本发明的一个方面中，本发明提供的前述任一所述纳米抗体或其抗原结合片段可结合β-NGF抗原，优选结合人β-NGF抗原。

本发明提供的针对β-NGF抗原的纳米抗体，包括框架区(FR)和互补决定区(CDR)。

本发明还提供了一种包含前述任一所述纳米抗体或其抗原结合片段的多价纳米抗体。本发明所述多价纳米抗体指含有两个及两个以上纳米抗体。

本发明提供的多价纳米抗体中，包含以下任意一种纳米抗体或其抗原结合片段：

(1)CDR1的氨基酸序列为SEQ ID NO.3，CDR2的氨基酸序列为SEQ ID NO.4，CDR3的氨基酸序列为SEQ ID NO.5的纳米抗体或其抗原结合片段；或者

(2)CDR1的氨基酸序列为SEQ ID NO.6，CDR2的氨基酸序列为SEQ ID NO.7，CDR3的氨基酸序列为SEQ ID NO.8的纳米抗体或其抗原结合片段；或者

(3)CDR1的氨基酸序列为SEQ ID NO.9，CDR2的氨基酸序列为SEQ ID NO.10，CDR3的氨基酸序列为SEQ ID NO.11的纳米抗体或其抗原结合片段。

进一步地，本发明提供的多价纳米抗体中含有1个或多个氨基酸序列为SEQ IDNO.1，SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.12的纳米抗体或其抗原结合片段。

另一方面，前述任一所述的多价纳米抗体中还含有抗人血清白蛋白纳米抗体(anti-HSA sdAb)，优选抗人血清白蛋白纳米抗体的序列为SEQ ID NO.13。

在本发明的一个方面中，前述任一所述的多价纳米抗体中，纳米抗体之间可以通过接头(linker)连接或直接连接，所述直接连接包括但不限于共价连接。优选纳米抗体之间通过接头连接。

在本发明的一个方面中，前述任一所述多价纳米抗体中的接头为氨基酸序列，优选氨基酸序列为AAA、GGGGSGGGS或者GGGGSGGGGSGGGGS，更优选为GGGGSGGGS。

在某些实施方式中，本发明提供的多价纳米抗体可以具有以下结构：第一种抗β-NGF纳米抗体—接头—抗人血清白蛋白纳米抗体—接头—第二种抗β-NGF纳米抗体。优选所说的第一种和第二种抗β-NGF纳米抗体的氨基酸序列分别选自SEQ ID NO.1，SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.12；优选第一种和第二种抗β-NGF纳米抗体的氨基酸序列均为SEQ ID NO.1，SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.12；更优选第一种和第二种抗β-NGF纳米抗体的氨基酸序列均为SEQ ID NO.1。

在某些实施方式中，本发明所提供的多价纳米抗体，其结构为SEQ ID NO.1—GGGGSGGGS—SEQ ID NO.13—GGGGSGGGS—SEQ ID NO.1。

在本发明的一个方面中，本发明提供的前述任一所述多价纳米抗体可结合β-NGF抗原，优选结合人β-NGF抗原。

本发明还提供了编码前述任一所述纳米抗体或其抗原结合片段或多价纳米抗体的核酸，所述纳米抗体或其抗原结合片段或多价纳米抗体包含：

(3)CDR1的氨基酸序列为SEQ ID NO.9，CDR2的氨基酸序列为SEQ ID NO.10，CDR3的氨基酸序列为SEQ ID NO.11的纳米抗体或其抗原结合片段；或者

(4)氨基酸序列为SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.12的纳米抗体或其抗原结合片段。

术语编码的“核酸”可以是包括编码的核酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的核酸。本发明的核酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括但不限于cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。编码本发明所述纳米抗体或其抗原结合片段的核酸包括但不限于只编码成熟纳米抗体或其抗原结合片段结构的编码序列；编码成熟纳米抗体或其抗原结合片段的编码序列和各种附加编码序列；编码成熟纳米抗体或其抗原结合片段结构的编码序列(和任选的附加编码序列)以及非编码序列等。

本发明还涉及与上述的序列杂交且两个序列之间具有至少50％，较佳地至少70％，更佳地至少80％相同性的核酸。本发明特别涉及在严格条件下与本发明所述核酸可杂交的核酸。在本发明中，“严格条件”是指：(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2×SSC,0.1％SDS,60℃；或(2)杂交时加有变性剂,如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％Ficoll，42℃等；或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在90％以上,更好是95％以上时才发生杂交。并且,可杂交的核酸编码的多肽与成熟多肽有相同的生物学功能和活性。

本发明的抗体的核酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。本发明所涉及的生物分子(核酸、纳米抗体及其抗原结合片段、多价纳米抗体等)包括以分离的形式存在的生物分子。

目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明纳米抗体及其抗原结合片段、多价纳米抗体等的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明纳米抗体及其抗原结合片段、多价纳米抗体等序列中。

本发明还提供了一种载体，含有编码上述任一所述的纳米抗体或其抗原结合片段或多价纳米抗体的核酸。所述载体包括但不限于：病毒载体，如腺病毒载体、逆转录病毒载体、腺相关病毒载体；非病毒载体，如质粒、转座子载体。优选地，所述载体是表达载体。所述载体优选是质粒载体，进一步优选为pPICZαA载体。

本发明还提供了用于表达含有前述任一所述纳米抗体或其抗原结合片段或多价纳米抗体的细胞，该细胞含有编码前述任一所述纳米抗体或其抗原结合片段或多价纳米抗体的核酸或载体，优选地，所述细胞是含有上述表达载体或核酸的宿主细胞。在本发明的一个方面中，所述宿主细胞包括但不限于哺乳动物细胞、昆虫细胞、植物细胞、真菌细胞、原核细胞等。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌属；鼠伤寒沙门氏菌的细菌细胞；真菌细胞如酵母；果蝇S2或Sf9的昆虫细胞；CHO、COS7、293细胞的动物细胞等。优选地，本发明提供用于表达结合NGF抗原的抗体或其抗原结合片段的宿主细胞为毕赤酵母细胞。

用DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl₂法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl₂。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔,脂质体包装等。

在表达本发明的基因所编码的多肽过程中，可以用常规培养方法。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。

在上面的方法中的纳米抗体及其抗原结合片段、多价纳米抗体等可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化纳米抗体及其抗原结合片段、多价纳米抗体等。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。

根据本发明的另一方面，还提供一种药物组合物，其包含前述任一方面所述的纳米抗体或其抗原结合片段、多价纳米抗体、核酸、载体或细胞，优选地，所述药物组合物还包含药学上可接受的赋形剂，优选地，所述药学上可接受的赋形剂包括以下中的一种或多种：药学上可接受的溶剂、分散剂、附加剂、塑形剂等。通常，可将这些物质配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的载体介质中。配制好的药物组合物可以通过常规途径进行给药，其中包括但并不限于：瘤内、腹膜内、静脉内、或局部给药。

本发明还涉及一种试剂盒，其包含上文任一所述的纳米抗体或其抗体片段或多价纳米抗体或核酸。

在本发明的一个方面中,所述试剂盒还包括用于对β-NGF抗体反应进行检测的检测试剂、阴性对照、阳性对照。

本发明的纳米抗体有广泛生物应用价值和临床应用价值，其应用涉及到与β-NGF相关的疾病的诊断和治疗、基础医学研究、生物学研究等多个领域。一个优选的应用是用于针对β-NGF的临床诊断和靶向治疗。

根据本发明的另一方面，本发明涉及前述任一方面所述的纳米抗体或其抗原结合片段、多价纳米抗体、核酸、载体或细胞在制备预防或治疗疾病的药物中的应用。

根据本发明的另一方面，本发明涉及前述任一方面所述的纳米抗体或其抗原结合片段、多价纳米抗体、核酸在制备诊断或检查试剂盒中的应用。

根据本发明的另一方面，本发明提供一种预防或治疗疾病的方法，包括将前述任一方面的本发明的纳米抗体或其抗原结合片段、多价纳米抗体、核酸、载体、细胞或药物组合物给予有需要的受试者。

根据本发明的另一方面，本发明提供一种诊断或检测疾病的方法，包括将本发明的纳米抗体或其抗原结合片段、多价纳米抗体、核酸或试剂盒给予有需要的受试者或样本。

根据本发明的另一方面，本发明提供前述任一方面所述的纳米抗体或其抗原结合片段、多价纳米抗体、核酸、载体、细胞或药物组合物用于治疗、预防疾病的用途。

根据本发明的另一方面，本发明提供前述任一方面所述的纳米抗体或其抗原结合片段、多价纳米抗体、核酸或试剂盒用于检测或诊断疾病的用途。

其中，所述疾病优选是β-NGF相关疾病；进一步优选为疼痛或炎症；更优选为手术后疼痛、类风湿性关节炎疼痛及骨关节炎疼痛。

根据本发明的一方面，本发明提供的纳米抗体或抗原结合片段或多价纳米抗体有以下一种或多种优势：阻断β-NGF与TrkA结合的效果更好，免疫原性低，体内半衰期长，且疼痛缓解/抑制作用显著。

附图说明

图1A示出了8TTT和2389羊驼四免后血清滴度(2500倍稀释)

图1B示出了4520羊驼三免后血清滴度(1000倍稀释)

图2示出了Elisa检测候选抗体与β-NGF蛋白的活性

图3A示出了候选抗体阻断β-NGF与TrkA的结合(方法1)

图3B示出了候选抗体阻断β-NGF与TrkA的结合(方法2)

图4示出了候选抗体阻断β-NGF促进TF-1细胞生长

图5示出了Elisa检测人源化抗体与β-NGF蛋白的结合

图6示出了候选抗体阻断β-NGF与TrkA的结合

图7示出了多价纳米抗体结构示意图

图8示出了毕赤酵母表达多价纳米抗体电泳

图9示出了各组食蟹猴给予不同抗体后平均药时曲线

图10示出了不同时间各组动物右后肢承重

具体实施方式

参照以下实施例可以更好地理解本发明。但是，应理解，以下实施例仅用于举例说明目的，而不应被理解为以任何方式限制本发明的保护范围。

实施例1.抗人神经生长因子(β-NGF)纳米抗体的产生

1.1免疫

用重组β-NGF蛋白(义翘神州，11050-HNAC)与佐剂一起免疫羊驼，首免为完全弗氏佐剂，从二免开始用非完全弗氏佐剂。本次免疫3只羊驼，免疫3-5次。从第二次免疫后开始取血测滴度，选取血清滴度较高的羊驼进行颈部取血，分离淋巴细胞用于后续实验。Elisa法检测血滴度如图1A-B所示。

1.2噬菌体库的建立

取冻存的淋巴细胞，加入Trizol(Thermo Scientific，15596-026)，待裂解充分后加入1/5体积的氯仿，充分混匀，室温放置20min后4℃12000rpm离心20min，取上层水溶液，并加入等体积的异丙醇，室温放置20min，4℃12000rpm离心20min，弃去上清水溶液，加入75％乙醇洗涤两次，4℃12000rpm离心5min，弃去水溶液，保留沉淀，室温风干后加入DEPC水重悬沉淀获得RNA，获得的RNA使用罗氏反转录试剂盒Transcriptor First Strand cDNASynthesis Kit(Roche Applied Science，4897030001)按照其说明书将RNA反转录成cDNA。

纳米抗体免疫文库构建参考Els Pardon等(nature protocols,VOL 9NO.3,2014)方法。以编号为8TTT/4520/2389的羊驼建立的噬菌体库分别为NGF-8TTT、NGF-4520、NGF-2389，库容分别为5*10⁸、1.4*10⁹、3.2*10⁸。

1.3噬菌体筛选

通过以下两种方法筛选与β-NGF特异性结合的克隆：

1.平板筛选：用β-NGF-His蛋白(义翘神州，11050-HNAC)以0.2μg/孔包被平板，4℃放置过夜，第二天通过2％BSA封闭平板1h，加入噬菌体库(2*10¹²)孵育2h，洗涤4-10次后用Elution Buffer(pH 2.2)洗脱与β-NGF特异性结合的噬菌体。

2.磁珠筛选：将β-NGF蛋白(义翘神州，11050-HNAC)按照常规步骤进行生物素化，再与Thermo的磁珠(Invitrogen Dynabeads M-280Streptavidin，00355871)结合后与噬菌体库孵育，从而获得与β-NGF特异性结合的克隆。

采用ELISA方法检测结合活性和阻断活性确定测序克隆。

ELISA检测结合方法如下：

将通过噬菌体酶联免疫(Elisa)法检测阳性的库涂布平板，挑取单克隆直接进行IPTG诱导表达，提取周质检测，方法如下：用pH 9.6CBS包被浓度为0.2μg/mL的抗原β-NGF(义翘神州，11050-HNAC)，100μl/孔4℃过夜；用3％脱脂奶粉37℃封闭1h；每孔加入PBST(PBS+0.05％Tween20)稀释的1μg/ml候选抗体各100μl，37℃孵育1h；然后加入Goat pAb toLlama HRP(abcam，ab112786)，37℃孵育1h，显色10min后，酶标仪上读取OD450。

ELISA阻断采用两种方法，其中,来自于NGF-4520的抗体用方法一进行筛选，NGF-8TTT、NGF-4520、NGF-2389的抗体用方法二进行筛选，具体方法如下：

方法一：pH 9.6CBS包被浓度为5μg/mL的β-NGF(义翘神州，11050-HNAC)，100μl/孔4℃过夜；用3％脱脂奶粉封闭1h，每孔加入50μl 2.5μg/ml TrkA-Fc(abcam，ab83562)和PBST(PBS+0.05％Tween20)稀释的不同浓度(200μg/mL、50μg/mL、12.5μg/mL、0μg/mL)的候选抗体37℃共孵育1h，继而加入HRP标记的山羊抗人IgG-Fc(义翘神州，SSA001)，37℃孵育1h；显色10min后，酶标仪上读取OD450。

方法二：pH 9.6CBS包被浓度为0.5μg/mL的TRKA(义翘神州，11073-H03H)，100μl/孔4℃过夜；用3％脱脂奶粉封闭1h；同时NGF-Fc-biotin(0.2μg/mL)和PBST(PBS+0.05％Tween20)稀释的不同浓度(4μg/mL、1μg/mL、0.25μg/mL、0.0625μg/mL、0.015625μg/mL、0.0039063μg/mL)候选抗体37℃共孵育1h，然后加入到封闭过的ELISA板上，37℃再孵育1h；继而加入链霉素/HRP，37℃孵育1h；显色10min后，酶标仪上读取OD450。

最终筛选到具有结合活性的单克隆个数为500个，具有阻断活性的克隆180个，并将180个克隆进行序列测定。

1.4候选抗体的序列确定及抗体表达

对具有阻断活性的180个克隆经序列分析后，共获得19个序列差异性较大的克隆(CA代表平板筛选，BA代表磁珠筛选)：

表1.具有阻断活性初筛克隆氨基酸序列

将上述克隆质粒转化BL21感受态细胞(TAKARA，9126)，选择单克隆培养并进行IPTG诱导表达，利用渗透法，获得抗体粗提液，经镍柱离子亲和层析制备纯度达90％以上的纳米抗体，并通过UV280结合消光系数确定抗体浓度。

对照抗体生产：通过IMGT数据及专利CN 102746399B确定辉瑞抗体Tanezumab的轻、重链氨基酸序列如下。全基因合成后构建至pCDNA-3.4通过HEK293细胞表达。

Tanezumab重链序列：

QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGFSLIGYDLNWIRQPPGKGLEWIGIIWGDGTTDYNSAVKSRVTISKDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARGGYWYATSYYFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

Tanezumab轻链序列：

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISNNLNWYQQKPGKAPKLLIYYTSRFHSGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQEHTLPYTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

实施例2.候选抗体的表征

2.1 Elisa检测候选抗体与β-NGF蛋白的结合活性

对纯化后的候选抗体进行结合活性检测，以确定候选抗体与β-NGF蛋白的结合灵敏度。本次检测主要针对候选抗体NGF-8TTT-BA22\BA81\BA85\BA91\BA94(以下简称BA22\BA81\BA85\BA91\BA94)，NGF-2389-CA27\CA56\BA15\BA20\BA42\BA176\BA177(以下简称CA27\CA56\BA15\BA20\BA42\BA176\BA177)，其中8TTT/2389分别代表羊驼编号为8TTT、2389建立的库，CA代表平板筛选，BA代表磁珠筛选。

Elisa检测候选抗体与β-NGF蛋白的结合活性方法参照实施例1.3。结果见图2，12株抗体具有相似的结合活性。

2.2候选抗体阻断β-NGF与TrkA的结合

对纯化后的候选抗体进行阻断β-NGF与TrkA结合的活性检测，方法参照实施例1.3。

方法1检测候选抗体NGF-4520-CA1\CA9\CA19\CA28\CA29\CA30\CA66(以下简称CA1\CA9\CA19\CA28\CA29\CA30\CA66)，其中4520代表羊驼编号为4520建立的库，CA代表平板筛选)。结果参见图3A，7株抗体都能够有效阻断β-NGF与TrkA的结合，且具有相似的阻断活性。

方法2检测候选抗体BA22\BA81\BA85\BA91\BA94\CA27\CA56\BA15\BA20\BA42\BA176\BA177，为了更直观的展现候选抗体的阻断效果，在方法2中我们采用多点浓度检测，对待测抗体浓度、吸光值作四参数拟合，得到反“S”形曲线，以曲线的IC50值来评价抗体的阻断能力。结果参见图3B和表2，结果显示：12株抗体都能够有效阻断β-NGF与TrkA的结合。

表2

样品	IC50(μg/mL)	样品	IC50(μg/mL)
				BA15	0.03262	BA81	0.02124
BA20	0.03356	BA85	0.0346
				CA27	0.02199	BA91	0.03771
BA42	0.01241	BA94	0.04528
				CA56	0.08369	BA176	0.02009
BA22	0.02729	BA177	0.02092

2.3候选抗体阻断β-NGF促进TF-1细胞生长

TF-1细胞系是人前骨髓样(premyeloid)细胞系，其能被外源生长因子和细胞因子刺激而增殖。TF-1细胞能够表达人TrkA受体，而且响应通过NGF的活化而增殖。因此我们用TF-1细胞增殖测试进一步检测候选抗体的体外功能。

方法如下：用检测培养基(90％RPMI 1640，10％FBS)稀释抗体，共4～6个浓度。用检测培养基把NGF(义翘神州，11050-HNAC)稀释至50ng/mL。把稀释的抗体和稀释的NGF进行1:1混合后，37℃静置30min。用检测培养基把细胞稀释至2×10⁵cells/mL，加入到96孔白板中，50μl/孔，然后加入上述混合物，50μl/孔，把96孔白板在CO2培养箱中培养3天后用CellTiter-Glo(Promega，G7571)试剂盒检测活细胞数，计算各抗体在1000nM、200nM、10nM、0.5nM时对TF-1细胞增长的抑制率，检测结果如图4。

结果显示CA66、CA30、BA22、BA81、BA176、BA177可以明显阻断β-NGF，从而抑制TF-1细胞的生长，其阻断能力与对照抗体Tanezumab相近。

实施例3.BA22、BA81、BA176、CA66、CA30序列人源化改造

综合分析抗体序列、阻断数据、细胞活性数据等，我们选择CA66、CA30、BA22、BA81、BA176进行人源化，对抗体序列两端的非胚系氨基酸继续进行优化，从而降低免疫原性风险。

表3.人源化氨基酸序列

实施例4.人源化抗体的表征

4.1 Elisa检测人源化抗体与β-NGF蛋白的结合

根据人源化序列在大肠杆菌中的表达量我们选取BA22.20、BA22.23、BA81.7、BA176.6.4、BA176.6.6、BA176.10.9、CA30.1、CA66.20、BA176.6、BA176.10抗体进行再评价。方法如下：

pH 9.6CBS包被不同浓度(0.2μg/mL、0.05μg/mL、0.0125μg/mL、0.003125μg/mL)的抗原β-NGF(义翘神州，11050-HNAC)，100μl/孔4度过夜；用3％脱脂奶粉37℃封闭1h；每孔加入PBST(PBS+0.05％Tween20)稀释的1ug/ml候选抗体各100μl，37℃孵育1h；然后加入GoatpAb to LlamaHRP(abcam，ab112786)，37℃孵育1h，显色10min后，酶标仪上读取OD450。结果见表4和图5，候选抗体中BA81.7灵敏度较差，其他抗体具有相似的对β-NGF蛋白的结合活性。

表4.Elisa检测人源化抗体与β-NGF蛋白的结合活性

4.2人源化抗体阻断β-NGF与TrkA的结合

为了评估人源化对阻断活性的影响，对人源化后纯化的抗体进行ELISA阻断检测。包被浓度为0.5μg/mL的TrkA(义翘神州，11073-H03H)，100μl/孔4度过夜；用3％脱脂奶粉封闭1h；同时NGF-Fc-biotin(0.2μg/mL)和不同浓度(110nM、27.5nM、6.875nM、1.71875nM)人源化抗体37℃共孵育1h，然后加入到封闭过的ELISA板上，37℃再孵育1h；继而加入链霉素/HRP，37℃孵育1h；显色10min后，酶标仪上读取OD450。结果参见表5和图6，候选抗体都能够有效阻断β-NGF与TrkA的结合。并且在低浓度(1.71875nM)时候选纳米抗体的阻断效果均明显高于tanezumab。

表5.候选抗体阻断β-NGF与TrkA的结合

实施例5.人源化多价纳米抗体在毕赤酵母中的表达

本实施例多价纳米抗体的结构如附图7，其中，anti-HSA sdAb序列如下所示：

EVQLVESGGGLVQPGNSLRLSCAASGFTFSSFGMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNAKTTLYLQMNSLRPEDTAVYYCTIGGSLSRSSQGTLVTVSS(SEQ ID NO.13)

接头序列如下所示：GGGGSGGGS

分别选取NGF-BA22.20、NGF-BA176.10.9、NGF-CA66.20序列构建多价纳米抗体，分别简称为N22.20(结构为BA22.20-接头-anti-HSA sdAb-接头-BA22.20)、N176.10.9(结构为BA176.10.9-接头-anti-HSA sdAb-接头-BA176.10.9)、N66.20(结构为CA66.20-接头-anti-HSA sdAb-接头-CA66.20)。全基因合成构建至pPICZαA载体上，质粒用SalI限制性内切酶线性化后电转进入毕赤酵母细胞，YPD培养基中培养22h，加甲醇诱导表达3～5天。表达上清通过Protein A亲和层析，并通过UV280结合消光系数确定抗体浓度。表达上清进行SDS-PAGE蛋白电泳检测纯度，方法如下：吸取1mL发酵菌液于1.5mL离心管，12000rpm离心2min；取上清20μL加入20μL10×非还原Loading buffer，80℃加热5min，用8％～16％的聚丙烯酰胺凝胶对样品进行电泳。电泳结果如图8，结果显示N22.20、N176.10.9、N66.20抗体在酵母上清在纯度较高，方便后续大规模纯化。

实施例6β-NGF抗体与同家族蛋白交叉反应

为了确定多价纳米抗体的结合特异性，我们进行了多价纳米抗体与β-NGF同家族蛋白的交叉反应，具体方法如下：

用pH 9.6CBS包被不同浓度(10μg/ml、2.5μg/ml、0.625μg/ml、0.15625μg/ml、0.039625μg/ml、0.0097656μg/ml、0.0024414μg/ml、0.0006104μg/ml l)的抗原NT3(义翘神州，10286-HANE)、NT4(Pepro.Tech，450-04-10UG)、BDNF(北京义翘神州生物技术有限公司，50240-MNAS)、proNGF(义翘神州，定制)100μl/孔4度过夜；用3％脱脂奶粉37℃封闭1h；每孔加入PBST(PBS+0.05％Tween20)稀释的10μg/ml候选抗体各100μl，37℃孵育1h；然后N176.10.9、N66.20、N22.20组加入兔多抗anti-ALB8/HRP(KPL，5450-0009)，Tanezumab组加入山羊抗人IgG/HRP(KPL，5450-0009)37℃孵育1h，显色10min后，酶标仪上读取OD450。多价纳米抗体与β-NGF同家族蛋白交叉反应程度如下表6所示。

结果表明，N176.10.9、N66.20、N22.20与四个同家族蛋白均无交叉或仅有弱交叉反应，但是Tanezumab与BDNF有弱交叉反应，与NT3、NT4、proNGF存在比较强的交叉反应，这也说明多价纳米抗体比Tanezumab具有更高的结合特异性。

表6抗体的交叉反应

实施例7药代动力学研究

新药的研发过程中，药代动力学的研究具有极其重要的意义，指导药物的筛选和开发,并支持其安全性的评估和临床给药方案的设计。

开展β-NGF抗体N66.20、N176.10.9、N22.20、Tanezumab在食蟹猴体内药代动力学研究，进行药物的药代行为一致性评价。每个抗体选3只食蟹猴静脉注射给药，剂量为5mg/kg，分别在首次给药的给药前(0h)、给药后5min、0.5h、1h、6h、1d、2d、4d、7d、10d、14d、17d、21d、24d、28d采血清通过Elisa法检测抗体浓度。各组食蟹猴给予不同抗体后平均药时曲线见图9。

Tanezumab在食蟹猴体内的半衰期为8.6天，N176.10.9的半衰期为8.4天，N22.20的半衰期为6.2天，而N66.20的半衰期为10天。因此，N66.20具有更长的半衰期，可延长给药周期，具有更持久的治疗效果。

实施例8免疫原性研究

考察β-NGF抗体在食蟹猴体内的免疫原性，旨在评估抗体进入体内后有可能因免疫原性产生的毒副作用。具体实验方法如下：以CBS包被液(pH9.6碳酸溶液)包被Tanezumab、N22.20、N66.20、N176.10.9分别为0.125μg/ml、0.25μg/ml，100μl/孔4度过夜；用3％脱脂奶粉37℃封闭1h；每孔加入100×血清，100μl，37度孵育1h；然后加入Tanezumab-biotin、N66.20-biotin、N22.20-biotin、N176.10.9-biotin分别为0.125μg/ml、0.25μg/ml、0.25μg/ml，37℃孵育1h。洗掉，继而加入链霉素/HRP，37℃孵育1h；显色10min后，酶标仪上读取OD450。实验结果显示三个候选抗体均具有较低的免疫原性，其中N22.20、N176.10.9免疫原性低于对照抗体Tanezumab，N66.20的免疫原性与Tanezumab相近。

实施例9食蟹猴模型药效学研究

为了进一步确定多价纳米抗体的药效学，继续开展β-NGF抗体N66.20在碘乙酸(MIA)诱导的食蟹猴骨关节炎模型中的药效，并进行疼痛行为学评估。为了评估MIA注射到左后膝关节引起的负重不足程度，使用了Tekscan触觉压力测量系统。负重测试前猴子先在测试平台上连续适应3天(第-3，-2和-1天)，第0天让猴子站在测试平台测试动物的后肢接触垫子施加的压力分布，以总体重的百分比显示。全部猴子测试完后根据基线值进行分组，每组3只，分组后给药。在实验第3天，第7天，第14天，第21天和第28天进行测试，实验第7天，第14天测试完后给药，给药剂量N66.20抗体为4mg/kg，Tanezumab为5mg/kg。药效结果如图10。

实验结果表明N66.20抗体经皮下注射4mg/kg对MIA(40mg/400μl)诱导的猴膝关节炎模型第14、21、28天后足重有显著改善作用，这也进一步确证了N66.20抗体的有效性。

序列表

<110> 山东博安生物有限公司

<120> 抗β-NGF纳米抗体及其应用

<130> 1

<150> CN 20190497627.5

<151> 2019-06-10

<150> CN 201910498443.0

<151> 2019-06-10

<160> 13

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 135

<212> PRT

<213> Vicugna vicugna

<400> 1

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Gly Ser Ala

20 25 30

Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Arg Glu Phe Val

35 40 45

Ala Ala Ile Ser Trp Ile Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Gly Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Ala His His Pro Gly Ser Ala Gly Arg Glu Ala Tyr Ser Gly Ser

100 105 110

Tyr Tyr Tyr Leu Ser Asp Gln Tyr Glu Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

115 120 125

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

130 135

<210> 2

<211> 115

<212> PRT

<213> Vicugna vicugna

<400> 2

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Arg Asn Ile Tyr Ser Ile Val

20 25 30

Asp Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Leu Val

35 40 45

Ala Glu Phe Thr Ile Gly Val Pro Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly

50 55 60

Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Ile Tyr Leu Gln

65 70 75 80

Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Asn Ala

85 90 95

His Asp Thr Thr Tyr Ser His Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr

100 105 110

Val Ser Ser

115

<210> 3

<211> 8

<212> PRT

<213> Vicugna vicugna

<400> 3

Gly Arg Thr Phe Gly Ser Ala Ala

1 5

<210> 4

<211> 8

<212> PRT

<213> Vicugna vicugna

<400> 4

Ile Ser Trp Ile Gly Gly Ser Thr

1 5

<210> 5

<211> 28

<212> PRT

<213> Vicugna vicugna

<400> 5

Ala Ala His His Pro Gly Ser Ala Gly Arg Glu Ala Tyr Ser Gly Ser

1 5 10 15

Tyr Tyr Tyr Leu Ser Asp Gln Tyr Glu Tyr Asp Tyr

20 25

<210> 6

<211> 8

<212> PRT

<213> Vicugna vicugna

<400> 6

Arg Asn Ile Tyr Ser Ile Val Asp

1 5

<210> 7

<211> 8

<212> PRT

<213> Vicugna vicugna

<400> 7

Phe Thr Ile Gly Val Pro Asn Tyr

1 5

<210> 8

<211> 8

<212> PRT

<213> Vicugna vicugna

<400> 8

His Asp Thr Thr Tyr Ser His Tyr

1 5

<210> 9

<211> 8

<212> PRT

<213> Vicugna vicugna

<400> 9

Gly Leu Phe Pro Ser Thr Tyr Ala

1 5

<210> 10

<211> 8

<212> PRT

<213> Vicugna vicugna

<400> 10

Ile Asn Trp Ser Gly Ser Arg Thr

1 5

<210> 11

<211> 18

<212> PRT

<213> Vicugna vicugna

<400> 11

Ala Ala Val Leu Ser Ala Ile Ser Asn Leu Val Pro Arg Ala Gly Tyr

1 5 10 15

Thr Ser

<210> 12

<211> 125

<212> PRT

<213> Vicugna vicugna

<400> 12

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Leu Phe Pro Ser Thr Tyr

20 25 30

Ala Met Ser Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Asp Phe Val

35 40 45

Ala Gly Ile Asn Trp Ser Gly Ser Arg Thr Asp Tyr Gly Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Asp Glu Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Ala Val Leu Ser Ala Ile Ser Asn Leu Val Pro Arg Ala Gly Tyr

100 105 110

Thr Ser Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser

115 120 125

<210> 13

<211> 115

<212> PRT

<213> Vicugna vicugna

<400> 13

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Asn

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe

20 25 30

Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Thr Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser Gln Gly Thr Leu Val Thr

100 105 110

Val Ser Ser

115

Claims

1.一种抗β-NGF纳米抗体或其抗原结合片段，所述纳米抗体或其抗原结合片段包含3个互补决定区CDR1、CDR2、CDR3，其中：

2.根据权利要求1所述的纳米抗体或其抗原结合片段，其特征在于，其中所述纳米抗体的序列为SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.12。

3.一种多价纳米抗体，包含权利要求1至2任一所述的纳米抗体或其抗原结合片段。

4.根据权利要求3所述的多价纳米抗体，其特征在于，还包含抗人血清白蛋白纳米抗体。

5.根据权利要求4所述的多价纳米抗体，其特征在于，所述抗人血清白蛋白纳米抗体的序列为SEQ ID NO.13。

6.根据权利要求5所述的多价纳米抗体，其特征在于，所述纳米抗体之间通过接头连接。

7.根据权利要求3-6任一所述的多价纳米抗体，其特征在于，所述多价纳米抗体的结构为第一种抗β-NGF纳米抗体—接头—抗人血清白蛋白纳米抗体—接头—第二种抗β-NGF纳米抗体。

8.根据权利要求7所述的多价纳米抗体，其特征在于，所述第一种和第二种抗β-NGF纳米抗体的序列分别选自SEQ ID NO.1，SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.12。

9.根据权利要求7所述的多价纳米抗体，其特征在于，所述第一种和第二种抗β-NGF纳米抗体的序列均为SEQ ID NO.1，SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.12。

10.根据权利要求7所述的多价纳米抗体，其特征在于，所述第一种和第二种抗β-NGF纳米抗体均为SEQ ID NO.1。

11.一种核酸，其核酸序列编码权利要求1至2任一项所述的纳米抗体或其抗原结合片段，或编码权利要求3至10任一所述的多价纳米抗体。

12.一种载体，其包含权利要求11所述的核酸。

13.一种细胞，其特征在于所述细胞包含权利要求11所述的核酸或权利要求12所述的载体。

14.权利要求1至2任一项所述的纳米抗体或其抗原结合片段，或权利要求3至10任一所述的多价纳米抗体，或权利要求11所述的核酸用于制备治疗、预防、检测或诊断疾病的药物的应用，所述疾病是与β-NGF相关的疾病。

15.根据权利要求14所述的应用，其特征在于，所述β-NGF相关的疾病为疼痛或炎症。

16.根据权利要求15所述的应用，其特征在于，所述疼痛为手术后疼痛、类风湿性关节炎疼痛或骨关节炎疼痛。

17.一种试剂盒或药物组合物，其特征在于，包含权利要求1至2任一所述的纳米抗体或其抗原结合片段，或权利要求3至10任一所述的多价纳米抗体，或权利要求11所述的核酸。