CN109897107B

CN109897107B - 纳米抗体及其制备方法

Info

Publication number: CN109897107B
Application number: CN201711297553.8A
Authority: CN
Inventors: 王媚娘; 刘楚新; 杨乃波; 曹丽霞; 丁权; 黄谧; 马莹莹
Original assignee: BGI Shenzhen Co Ltd
Current assignee: BGI Shenzhen Co Ltd
Priority date: 2017-12-08
Filing date: 2017-12-08
Publication date: 2022-05-17
Anticipated expiration: 2037-12-08
Also published as: CN109897107A

Abstract

本发明提出了一种纳米抗体。该抗体：(1)具有SEQ ID NO：1所示氨基酸序列；或(2)与(1)相比具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％同一性。根据本发明实施例的纳米抗体是特异性靶向离子通道TRPV3的抗体，能够结合天然构象的TRPV3，并且所述纳米抗体具有高水溶性、高耐性、高稳定性，高抗原结合性、低免疫原性、较强的组织穿透力以及高表达性。

Description

纳米抗体及其制备方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体地，本发明涉及纳米抗体及其制备方法和应用，更具体地，本发明涉及纳米抗体、分离的核酸、核酸构建体、表达载体、宿主细胞、噬菌体、药物组合物、纳米抗体在制备药物中的用途以及制备纳米抗体的方法。

背景技术

哺乳动物的瞬时感受器电位香草素受体3(transient receptor potentialvanilloid，TRPV3)，作为瞬时感受器电位(transient receptor potential，TRP)家族的一员，是存在于细胞膜或胞内细胞器膜上的一类离子通道蛋白。研究发现，TRPV3在介导皮肤感觉、影响表皮角质细胞增殖分化、毛发生长、参与炎症反应及维持皮肤内稳态和正常功能过程中发挥重要作用。

2002年，TRPV3首次在角质细胞中被发现，与TRPV1和TRPV2的同源性仅有38％和32％。TRPV3的蛋白结构包含有6个跨膜结构域，蛋白的氨基端(N末端)和羧基端(C末端)均位于胞内，由第5和第6跨膜结构域共同构成非选择性阳离子通道，主要在人体皮肤角质细胞表达。研究表明，TRPV3蛋白属于第3种热敏通道，在33℃～37℃的温度范围被激活，同时也能被一系列非热性刺激物激活，如薄荷(Peppermint)、樟脑(Camphor)、麝香草酚(Thymol)、丁香酚(Eugenol)、2-氨基乙氧基联苯硼酸盐(2-APB)和联苯硼酐(DPBA)等，此外，低pH值可明显激活TRPV3离子通道，作为非选择性阳离子通道让Ca2+进入到细胞内部。Ca²⁺作为非常重要的细胞内第二信使，广泛地参与信号转导过程，在肌肉收缩、神经传递、酶和激素分泌、细胞周期调控、以及细胞分化、程序死亡等多种生物活动中发挥重要作用。因此，TRPV3可调节和影响表皮角质细胞增殖分化、毛发生长、导致敏感性皮炎和角化性皮肤病的发生。近年来的研究发现TRPV3功能异常会导致Olmsted综合征和局灶型掌跖角化病等皮肤角化性疾病，也会引起酒糟鼻的皮肤炎症反应。尤其是TRPV3在细胞增殖和凋亡以及瘙痒和疼痛等感觉传导方面的作用越来越受到关注，显示了其作为单独和联合药物作用靶点在相关领域将具有较广泛的应用前景。

然而TRPV3离子通道的结构复杂，由多个独立的跨膜亚基组成。结构的复杂性与多样性，使得其靶向药物的开发具有很强的挑战性。截止2015年，在预测的400多个离子通道中，只有少数几个靶点的药物被开发出来。目前，已上市或在研的离子通道药物主要为小分子化学药物和生物毒素等。然而，这些药物具有选择性较差的缺点，无法满足临床上的应用。相比较而言，抗体具有以下优势：1、特异性强，能够精准识别靶点，从而减少由于脱靶而产生的副作用；2、便于改造，通过蛋白工程的手段对抗体进行修饰，从而提高其亲和力或者优化其药代动力学特征。

然而，针对离子通道靶点，迄今尚无成熟的抗体药物问世。因此，开发和获得针对离子通道靶点的抗体药物是科学家拭待解决的关键问题。

发明内容

本申请是基于发明人对以下事实和问题的发现和认识作出的：

现有技术得到的TRPV3抗体多为鼠源传统抗体，抗体免疫原性强,，分子量大且结构复杂，导致抗原抗体亲和力较低，不利于靶向复杂的离子通道蛋白。其次，现有TRPV3抗体的获得多采用杂交瘤细胞技术，耗时长，成本高，且不易得到高亲和的抗体。本申请的发明人采用骆驼免疫与噬菌体展示技术相互结合，开发出了靶向TRPV3的高亲和纳米抗体，为治疗因TRPV3异常而导致的疾病奠定了良好的基础。

为此，在本发明的第一方面，本发明提出了一种纳米抗体。根据本发明的实施例，所述抗体包括：(1)具有SEQ ID NO：1或2所示氨基酸序列；或(2)与(1)相比具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％同一性。

ESGGGLVRPGGSLRLSCAASGSIFNFNNMAWYRQGPGKERELVAVSGRGGETYYADSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLKPEDTAMYYCAARSRPLGDYNYWGLGTQVTVS(SEQ ID NO：1)。

ESGGGLVRPGGSLRLSCAASGSIFNFNNMAWYRQGPGKERELVAVSGRGGETYYADSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLKPEDTAMYYCAARSRPLGDYNYWGLGTQVTVS(SEQ ID NO：2)。

根据本发明实施例的纳米抗体是特异性靶向离子通道TRPV3的抗体，能够结合天然构象的TRPV3，并且所述纳米抗体具有高水溶性、高耐性、高稳定性，高抗原结合性、低免疫原性、较强的组织穿透力以及高表达性。

在本发明的第二方面，本发明提出了一种分离的核酸。根据本发明的实施例，所述核酸为：编码前面所述抗体的核酸或其互补序列。根据本发明实施例的核酸特异性编码前面所述的抗体，所述抗体能够特异性靶向离子通道TRPV3，结合天然构象的TRPV3，具有高水溶性、高耐性、高稳定性，高抗原结合性、低免疫原性、较强的组织穿透力以及高表达性。

在本发明的第三方面，本发明提出了一种核酸构建体。根据本发明的实施例，所述核酸构建体包含：编码序列，所述编码序列为前面所述的核酸，以及可选的控制序列，所述控制序列与所述编码序列可操作地连接。根据本发明实施例的构建体能在宿主细胞高效表达，进而大量产生前面所述纳米抗体，有利于前面所述纳米抗体的大规模生产，易于普及和应用。

在本发明的第四方面，本发明提出了一种表达载体。根据本发明的实施例，所述载体包含前面所述的核酸构建体。根据本发明实施例的构建体在特定的转染条件下可高效导入宿主细胞，整合或不整合入宿主细胞基因组，进而高效表达前面所述的纳米抗体，有利于前面所述纳米抗体的大规模生产，易于普及和应用。

在本发明的第五方面，本发明提出了一种噬菌体。根据本发明的实施例，所述噬菌体包含前面所述的核酸、前面所述的核酸构建体或表达前面所述的纳米抗体。根据本发明实施例的噬菌体可将前面所述的纳米抗体在噬菌体表面融合表达出来，所述噬菌体具有与TRPV3高特异性的亲和活性。

在发明的第六方面，本发明提出了一种宿主细胞。根据本发明的实施例，所述细胞携带前面所述的核酸构建体或前面所述的表达载体。根据本发明实施例的宿主细胞能够高效表达前面所述的纳米抗体，有利于前面所述纳米抗体的大规模生产，易于普及和应用。

在本发明的第七方面，本发明提出了一种药物组合物。根据本发明的实施例，包括：前面所述的纳米抗体；以及药学上可接收的佐剂。根据本发明实施例的药物组合物能够特异性靶向离子通道TRPV3，结合天然构象的TRPV3，具有高水溶性、高耐性、高稳定性，高抗原结合性、低免疫原性、较强的组织穿透力以及高表达性。

在本发明的第八方面，本发明提出了前面所述的纳米抗体在制备药物中的用途，所述药物用于预防或治疗TRPV3相关性疾病。前面所述的纳米抗体能够特异性靶向离子通道TRPV3，结合天然构象的TRPV3，利用前面所述的纳米抗体制备的药物能够有效预防或治疗TRPV3相关性疾病。

根据本发明的实施例，所述TRPV3相关性疾病为手掌和足跖部位皮肤高度角化为特征的慢性皮肤病，在本发明的一个实施例中，所述TRPV3相关性疾病为残毁性皮肤角化病口周皮肤病(Olmsted Syndrome)或局灶型掌跖角化病。发明人发现，根据本发明实施例的药物对残毁性皮肤角化病口周皮肤病(Olmsted Syndrome)或局灶型掌跖角化病的治疗效果更佳。

在本发明的第九方面，本发明提出了一种制备前面所述纳米抗体的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：分别采集免疫前和免疫后澳洲羊驼的外周血单核细胞，并提取所述外周血单核细胞总RNA，所述免疫是通过注射TRPV3蛋白的膜外区多肽实现的；利用Nest-PCR技术克隆VHH区，并将克隆产物插入噬菌体，以便获得噬菌体展示库，所述噬菌体展示库表达TRPV3抗体VHH区；以及利用噬菌体展示技术筛选所述噬菌体展示库，以便获得所述纳米抗体。利用根据本发明实施例的上述方法解决了针对复杂抗原——TRPV3蛋白的抗体的制备难题，方法中将羊驼免疫与噬菌体展示技术相互结合，充分利用了噬菌体展示技术的优势——(1)容易对库容量较大的文库进行筛选，操作简单，通量高；(2)可获得一些自然界不存在，但能与抗原高亲和结合的抗体，这是因为噬菌体复制和增殖的过程中会产生一些体外突变，这些突变可能在羊驼体内不能天然存在，但可在筛选中获得；(3)抗体分子可以通过噬菌体的增殖而扩增，操作方便，实验成本低；(4)由生物体转录翻译产生的抗体具有生物活性，无需纯化可达到70％-94％的纯度。所获得纳米抗体，较传统抗体，具有明显的高水溶性、高耐性、高稳定性，高抗原结合性、低免疫原性、较强的组织穿透力以及高表达性的优势。

本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。

附图说明

本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：

图1是根据本发明实施例的免疫后羊驼血清中TRPV3抗体ELISA检测结果图；

图2是根据本发明实施例的Nest-PCR扩增TRPV3纳米抗体VHH区的结果图；

其中，A为第一轮扩增，B为第二轮扩增；

图3是根据本发明实施例的噬菌体淘洗不同批次抗体亲和力的ELISA法检测结果图；

图4是根据本发明实施例的亲和TRPV3纳米抗体克隆的ELISA筛选结果图；

图5是根据本发明实施例的SDS-PAGE电泳检测TRPV3纳米抗体纯化的结果图；以及

图6是根据本发明实施例的纯化的TRPV3纳米抗体亲和力的ELISA检测结果图。

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。

需要说明的是，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。进一步地，在本发明的描述中，除非另有说明，“多个”的含义是两个或两个以上。

纳米抗体

在本发明的第一方面，本发明提出了一种纳米抗体。根据本发明的实施例，所述抗体包括：(1)具有SEQ ID NO：1或2所示氨基酸序列；或(2)与(1)相比具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％同一性。根据本发明实施例的纳米抗体是特异性靶向离子通道TRPV3的抗体，能够结合天然构象的TRPV3，并且所述纳米抗体具有如下较普通抗体的独特性质，包括：(1)高水溶性、高耐性和稳定性。正常抗体VH结构域单独表达时通常形成包涵体，或者暴露的疏水域相互黏附；而纳米抗体VHH由于其FR2中的疏水残基被亲水残基所取代，使得纳米抗体的水溶性增加，聚合性减少；而且即使以包涵体形式表达，也很容易复性，这样可以大大提高作为药物的利用率。(2)高抗原结合性。纳米抗体能够识别独特的构造表位，比普通抗体有更广泛的抗原结合能力,可以达到常规抗体所不能达到的机体部位和分子位置，为我们打开了大型抗体无法到达的很多靶目标。(3)低免疫原性。纳米抗体因其相对分子质量很小且只有一个结构域，所以对人体的免疫原性较弱，与人的生物相容性较好。(4)较强的组织穿透力。纳米抗体具有强而快的组织穿透能力，可以进入致密的组织如实体瘤等发挥作用；并且多余未结合的纳米抗体能够很快的被清除，这相对于单克隆抗体组织穿透力差、不易被清除的不足，更有利于疾病的诊断。另外，纳米抗体能够有效的穿透血脑屏障，这样的特性为脑部给药提供了新方法，有望成为治疗老年痴呆症的新药。(5)高表达性。因纳米抗体相对分子质量小、结构简单，由单一基因编码，所以它很容易在微生物中合成，能在噬菌体、酵母等微生物中大量的表达，而且其相对价格低廉、可进行大规模生产，易于普及和应用。

根据本发明的实施例，所述抗体具有SEQ ID NO：1所示氨基酸序列，所述抗体的框架区1具有SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列，所述抗体的框架区2具有SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列，所述抗体的框架区3具有SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列，所述抗体的框架区4具有SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列，所述抗体的互补决定区1具有SEQ ID NO：7所示的氨基酸序列，所述抗体的互补决定区2具有SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列，所述抗体的互补决定区3具有SEQ ID NO：9所示的氨基酸序列。

ESGGGLVRPGGSLRLSCAAS(SEQ ID NO:3)。

MAWYRQGPGKERELVAV(SEQ ID NO:4)。

YYADSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLKPEDTAMYYC(SEQ ID NO:5)。

WGLGTQVTVS(SEQ ID NO:6)。

GSIFNFNN(SEQ ID NO:7)。

SGRGGET(SEQ ID NO:8)。

AARSRPLGDYNY(SEQ ID NO:9)。

根据本发明的实施例，所述抗体具有SEQ ID NO：2所示氨基酸序列，所述抗体的框架区1具有SEQ ID NO：10所示的氨基酸序列，所述抗体的框架区2具有SEQ ID NO：11所示的氨基酸序列，所述抗体的框架区3具有SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列，所述抗体的框架区4具有SEQ ID NO：13所示的氨基酸序列，所述抗体的互补决定区1具有SEQ ID NO：14所示的氨基酸序列，所述抗体的互补决定区2具有SEQ ID NO：15所示的氨基酸序列，所述抗体的互补决定区3具有SEQ ID NO：16所示的氨基酸序列。

ESGGGLVRPGGSLRLSCAAS(SEQ ID NO:10)。

MAWYRQGPGKERELVAV(SEQ ID NO:11)。

YYADSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLKPEDTAMYYC(SEQ ID NO:12)。

WGLGTQVTVS(SEQ ID NO:13)。

GSIFNFNN(SEQ ID NO:14)。

SGRGGET(SEQ ID NO:15)。

AARSRPLGDYNY(SEQ ID NO:16)。

分离的核酸

根据本发明的实施例，所述核酸具有SEQ ID NO：17或18所示核苷酸序列。

GAGTCTGGAGGAGGCTTGGTGCGACCTGGGGGGTCTCTGAGACTCTCCTGCGCAGCCTCTGGAAGCATCTTCAACTTCAATAACATGGCCTGGTACCGCCAGGGTCCAGGGAAGGAGCGCGAGTTGGTCGCAGTTAGTGGACGTGGCGGTGAGACATACTACGCAGATTCTGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATGCCAAGAACACGTTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAAACCTGAGGACACGGCCATGTATTACTGTGCGGCACGCTCCCGCCCGTTGGGGGACTATAACTACTGGGGCCTGGGGACCCAGGTCACCGTCTCCA(SEQ ID NO:17)。

GAGTCTGGAGGAGGCTTGGTGCGACCTGGGGGGTCTCTGAGACTCTCCTGCGCAGCCTCTGGAAGCATCTTCAACTTCAATAACATGGCCTGGTACCGCCAGGGTCCAGGGAAGGAGCGCGAGTTGGTCGCAGTTAGTGGACGTGGCGGTGAGACATACTACGCAGATTCTGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATGCCAAGAACACGTTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAAACCTGAGGACACGGCCATGTATTACTGTGCGGCACGCTCCCGCCCGTTGGGGGACTATAACTACTGGGGCCTGGGGACCCAGGTCACCGTCTCCA(SEQ ID NO:18)。

根据本发明实施例的上述核酸所编码的多肽具有与TRPV3显著的高亲和活性，且该多肽具有典型的纳米抗体的结构，即由框架区(FR1，FR2，FR3和FR4)和互补决定区(CDR1，CDR2和CDR3)构成。

需要说明的是，对于本发明说明书和权利要求书中所提及的核酸，本领域技术人员应当理解，实际包括互补双链的任意一条，或者两条。为了方便，在本说明书和权利要求书中，虽然多数情况下只给出了一条链，但实际上也公开了与之互补的另一条链。另外，本申请中的基因序列包括DNA形式或RNA形式，公开其中一种，意味着另一种也被公开。核酸构建体

在本发明的第三方面，本发明提出了一种核酸构建体。根据本发明的实施例，所述核酸构建体包含：编码序列，所述编码序列为前面所述的核酸，以及可选的控制序列，所述控制序列与所述编码序列可操作地连接。其中，所述控制序列为可指导抗体在宿主中表达的一个或多个控制序列。根据本发明的实施例，控制序列包括但不限于U6，H1，CMV，EF-1，LTR或RSV启动子。本发明实施例所提出的核酸构建体可在适合条件下，与表达载体连接后，在适宜的宿主细胞中高效表达上述纳米抗体，进而可有效用于对TRPV3相关性疾病的特异性治疗或预防。根据本发明实施例的构建体能在宿主细胞高效表达，进而大量产生前面所述纳米抗体，有利于前面所述纳米抗体的大规模生产，易于普及和应用。

表达载体

在本发明的第四方面，本发明提出了一种表达载体。根据本发明的实施例，所述载体包含前面所述的核酸构建体。所述表达载体的类型不受特别限制，只要能够实现前面所述的核酸构建体在受体细胞中高效表达即可，表达载体包括但不限于反转录病毒载体、慢病毒载体和/或腺病毒相关病毒载体。本发明实施例所述提出的表达载体可在适合条件下，在表达宿主中高效表达上述纳米抗体，所述表达载体可有效用于对TRPV3相关性疾病的特异性治疗或预防。根据本发明实施例的构建体在特定的转染条件下可高效导入宿主细胞，整合或不整合入宿主细胞基因组，进而高效表达前面所述的纳米抗体，有利于前面所述纳米抗体的大规模生产，易于普及和应用。

噬菌体

在本发明的第五方面，本发明提出了一种噬菌体。根据本发明的实施例，所述噬菌体包含前面所述的核酸、前面所述的核酸构建体或表达前面所述的纳米抗体。根据本发明实施例的噬菌体衣壳蛋白基因中整合有前面所述的核酸、前面所述的核酸构建体，前面所述的纳米抗体在噬菌体表面融合表达出来，所述噬菌体具有与TRPV3高特异性的亲和活性，并且有利于前面所述纳米抗体的大规模生产，易于普及和应用。

宿主细胞

根据本发明的具体实施例，所述宿主细胞是通过转染或者转化所述核酸构建体或表达载体获得。采用何种转染或转化的方式是根据宿主细胞的性质以及待转核酸构建体或表达载体的性质所决定的，只要能够在所述宿主细胞中实现前面所述多肽的高效表达并对宿主细胞的良好的细胞状态不产生较大影响即可。根据本发明的实施例，所述宿主细胞在合适条件下可高效表达上述纳米抗体，所述宿主细胞可有效用于对TRPV3相关性疾病的特异性治疗或预防。

根据本发明的具体实施例，所述宿主细胞为原核细胞，如HB2151。进而实现上述纳米抗体的大规模制备和纯化。

需要说明的是，本申请说明书中所述的“适合条件”，是指适合本申请所述多肽表达的条件。本领域技术人员容易理解的是，适合多肽表达的条件包括但不限于合适的转化或转染方式、合适的转化或转条件、健康的宿主细胞状态、合适的宿主细胞密度、适宜的细胞培养环境、适宜的细胞培养时间。“适合条件”不受特别限制，本领域技术人员可根据实验室的具体环境，优化最适的所述抗体表达的条件。

药物组合物

用途

更进一步，本发明提出了一种治疗方法。根据本发明的实施例，该治疗方法包括：对患者给予治疗有效量的前面所述的纳米抗体、前面所述的核酸、前面所述的核酸构建体、前面所述的表达载体、前面所述的噬菌体、前面所述的宿主细胞、前面所述的药物组合物。如前所述，本发明实施例所提出的治疗方法，包括给予任一种有效量的前面所述的纳米抗体等，均可有效治疗或预防TRPV3相关性疾病。

在本文中所使用的术语“给予”指将预定量的物质通过某种适合的方式引入病人。本发明实施例中的多肽、核酸、核酸构建体、表达载体、宿主细胞、药物组合物可以通过任何常见的途径给药，只要它可以到达预期的组织。给药的各种方式是可以预期的，包括腹膜，静脉，肌肉，皮下，皮层，口服，局部，鼻腔，肺部和直肠，但是本发明不限于这些已举例的给药方式。然而，由于口服给药时，口服给药的组合物的活性成分应该被包被或被配制以防止其在胃部被降解。优选地，本发明的组合物可以注射制剂给药。此外，本发明的药物组合物可以使用将活性成分传送到靶细胞的特定器械来给药。

本发明实施例中的纳米抗体、核酸、核酸构建体、表达载体、宿主细胞、噬菌体、药物组合物的给药频率和剂量可以通过多个相关因素被确定，该因素包括要被治疗的疾病类型，给药途径，病人年龄，性别，体重和疾病的严重程度以及作为活性成分的药物类型。根据本发明的一些实施例，日剂量可分为适宜形式的1剂、2剂或多剂，以在整个时间段内以1次、2次或多次给药，只要达到治疗有效量即可。

术语“治疗有效量”是指足以显著改善某些与疾病或病症相关的症状的量，也即为给定病症和给药方案提供治疗效果的量。术语“治疗”用于指获得期望的药理学和/或生理学效果。本文使用的“治疗”涵盖将发明实施例中的纳米抗体、核酸、核酸构建体、表达载体、宿主细胞、药物组合物给予个体以治疗，包括但不限于将含本文所述的给予有需要的个体。

制备前面所述纳米抗体的方法

在本发明的第九方面，本发明提出了一种制备前面所述纳米抗体的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：

S100:分别采集免疫前和免疫后澳洲羊驼的外周血单核细胞，并提取所述外周血单核细胞总RNA，所述免疫是通过注射TRPV3蛋白的膜外区多肽实现的；

根据本发明的实施例，所述人TRPV3蛋白的膜外区具有SEQ ID NO:19或20所示的氨基酸序列。

CSYYRPREEEAIPHP(SEQ ID NO:19)。

SYGSFSDAVLELFKLTIC(SEQ ID NO:20)。

进而作为动物免疫的抗原，从而获得了针对TRPV3的VHH(羊驼重链抗体的V区)文库，删除多余的背景干扰，大大的提高了有效抗体的获得率。

根据本发明的再一具体实施例，所述免疫的次数为4。在4次免疫结束后，采用ELISA法，检测血清中有针对TRPV3的抗体的富集，且经过4次免疫后，TRPV3有效刺激羊驼产生了特异性的抗体。

S200:利用Nest-PCR技术克隆VHH区，并将克隆产物插入噬菌体，以便获得噬菌体展示库，所述噬菌体展示库表达TRPV3抗体VHH区；

根据本发明的实施例，所述利用Nest-PCR技术克隆VHH区是通过如下方式实现的：

(1)对所述外周血单核细胞总RNA进行反转录，以便获得cDNA；

(2)以所述cDNA为模板，以具有SEQ ID NO:21～24所示核苷酸序列的引物为第一轮引物，进行第一轮Nest-PCR，以具有SEQ ID NO:25～26所示核苷酸序列的引物为第二轮引物，进行第二轮Nest-PCR；以及

(3)对Nest-PCR产物进回收纯化处理，以便获得所述克隆产物。

GTCCTGGCTGCTCTTCTACAAGG(SEQ ID NO:21)。

GGTACGTGCTGTTGAACTGTTCC(SEQ ID NO:22)。

TGGTGGCAGGTCCCCAAGGT(SEQ ID NO:23)。

TTCTTGGTGGCAGTAGCCGCAGT(SEQ ID NO:24)。

GATGTGCAGCTGCAGGAGTCTGGRGGAGG(SEQ ID NO:25)。

CTAGTGCGGCCGCTGGAGACGGTGACCTGGGT(SEQ ID NO:26)。

进而有效获得了TRPV3纳米抗体的VHH文库，用于噬菌体展示库的构建。

S300:利用噬菌体展示技术筛选所述噬菌体展示库，以便获得所述纳米抗体。

根据本发明的实施例，所述利用噬菌体展示技术筛选所述噬菌体展示库是通过如下方式实现的：将所述噬菌体展示库与TRPV3抗原进行孵育、洗涤处理，以便获得TRPV3纳米抗体噬菌体库；以及对所述TRPV3纳米抗体噬菌体库进行序列分析，以便获得所述纳米抗体的编码基因，其中，所述TRPV3抗原具有SEQ ID NO:19或20所示的氨基酸序列。进而通过生物淘选(bio-panning)，即将插入噬菌体衣壳蛋白基因中TRPV3纳米抗体的VHH文库，在噬菌体表面融合表达出来，再利用抗原抗体的特异性亲和作用来筛选具有结合活性的噬菌体株。上述方法将TRPV3纳米抗体的表型和基因型统一起来，通过表型的筛选就能获得相应TRPV3纳米抗体的编码基因信息。

根据本发明的实施例，所述序列分析是通过sanger测序实现的。进而序列分析的准确率和效率进一步提高。

根据本发明的实施例，进一步包括将携带有纳米抗体的编码基因的构建体导入原核细胞进行诱导表达的步骤，以便获得所述纳米抗体。进而可将筛选获得的高亲和抗体在原核细胞进行大量的表达和纯化，并可对所获得的纳米抗体的亲和力进行进一步验证。

根据本发明的再一具体实施例，所述原核细胞为HB2151。

根据本发明的再一具体实施例，所述构建体的载体为pMECS。根据本发明的具体实施例，pMECS-VHH转化入表达菌HB2151感受态细胞，可实现前面所述纳米抗体的大量表达和纯化。

利用根据本发明实施例的上述方法解决了针对复杂抗原——TRPV3蛋白的抗体的制备难题，方法中将羊驼免疫与噬菌体展示技术相互结合，充分利用了噬菌体展示技术的优势——(1)容易对库容量较大的文库进行筛选，操作简单，通量高；(2)可获得一些自然界不存在，但能与抗原高亲和结合的抗体；(3)抗体分子可以通过噬菌体的增殖而扩增，操作方便，实验成本低；(4)由生物体转录翻译产生的抗体具有生物活性，无需纯化可达到70％-94％的纯度。所获得纳米抗体，较传统抗体，具有明显的高水溶性、高耐性、高稳定性，高抗原结合性、低免疫原性、较强的组织穿透力以及高表达性的优势。

根据本发明的实施例，发明人用合成的TRPV3蛋白膜外区的两个多肽分别免疫羊驼，采集血液，分离出其中的外周血淋巴细胞，通过PCR获得高质量的靶向TRPV3纳米抗体文库。再结合噬菌体展示技术进行多轮淘选，结合ELISA监控，在较短时间获得了靶向TRPV3的高亲和纳米抗体单克隆，最后在优化的大肠杆菌表达系统中对TRPV3纳米抗体进行大量表达和亲和纯化，获得TRPV3纳米抗体，经验证具有非常好的亲和力，因此，可作为治疗因TRPV3异常引发皮肤病的候选抗体药物，开展进一步的开发研制研究。

需要说明的是，根据本发明实施例的纳米抗体及其用途和制备方法、编码所述纳米堕胎的核酸、核酸构建体、表达载体、宿主细胞、噬菌体、药物组合物是本申请的发明人经过艰苦的创造性劳动和优化工作才发现和完成的。

下面将结合实施例进一步对本发明的方案进行解释。如前所述，本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件(例如参考J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译的《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社)或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品，例如可以采购自Illumina公司。

以下实施例的方法可概括如下：合成TRPV3蛋白膜外区片段，作为抗原，免疫澳洲羊驼，连续免疫4次。每次免疫结束后，采集羊驼外周血，分离外周血淋巴细胞(PBMC)。提取其总RNA，用Nest-PCR技术克隆骆驼重链抗体的V区(VHH)，酶切连接将其插入到噬菌粒中，从而构建出体现羊驼免疫库的体外纳米抗体的噬菌体展示库，接着将噬菌体从宿主中拯救出来后，通过噬菌体展示技术对TRPV3抗原进行多轮筛选，最后将筛选获得的高亲和抗体在原核细胞进行大量表达纯化，并对所获得的纳米抗体的亲和力进行验证。

下面详细描述本发明TRPV3纳米抗体的制备过程：

实施例1TRPV3抗原制备和动物免疫

(1)抗原合成。通过化学合成的方法，合成了两段人TRPV3蛋白的膜外区，分别为CSYYRPREEEAIPHP(SEQ ID NO:19)和SYGSFSDAVLELFKLTIC(SEQ ID NO:20)，作为动物免疫的抗原。

(2)羊驼免疫。取800ug的多肽与等体积的弗氏佐剂混合，注射到羊驼的后腿肌肉中。免疫之前从羊驼的耳缘静脉采集血液10mL。每隔两周免疫一次，一共进行4次免疫，同时采集羊驼外周血，置于冰上，运回实验室。

(3)ELISA检测TRPV3的抗体的产生。在4次免疫结束后，采用ELISA法，检测血清中是否含有针对TRPV3的抗体的富集(图1)，结果显示，经过4次免疫后，TRPV3有效刺激羊驼产生了特异性的抗体。

实施例2TRPV3纳米抗体的噬菌体展示库构建

(1)PBMC分离。分别取免疫前和免疫后的羊驼血液样本，用Percoll密度梯度离心分离纯化羊驼外周血中的淋巴细胞，将细胞用PBS洗两到三次后，加入RNA later，用于RNA提取。

(2)TRPV3纳米抗体文库构建。

总RNA提取。取(1)中分离的淋巴细胞，加入1ml Trizol，室温静置10min后，加入0.2ml氯仿，剧烈震荡，室温静置，待溶液分层(约10min)，12,000rpm离心后，收集上层水相，加入等体积的异丙醇，混匀，室温静置15min，待核酸沉淀，高速离心去上清，RNA沉淀加入1ml的75％乙醇(DEPC水配制)进行洗涤，高速离心去上清，控干水分后，RNA用无核酸酶的水溶解，分别取1μl用于浓度和纯度测定。

cDNA合成。取1μg RNA，采用SuperScript^TM III First-Strand SynthesisSuperMix(Invitrogen)试剂盒合成cDNA，引物用Oligo dT，合成cDNA在-20℃冻存。

PCR扩增。以反转录产物cDNA为模板，采用Nest-PCR方法扩增获得骆驼重链抗体的可变区(VHH)，表1为扩增所用引物的名称及序列。

表1：骆驼VHH片段扩增使用的引物信息

扩增产物回收。PCR反应结束后，用1.5％的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，图2为扩增结果，第一轮PCR的目的基因片段在700bp处，第二轮PCR，目的基因片段在450bp处，切胶回收目的条带，即TRPV3纳米抗体VHH文库。回收产物经Nanodrop 2000测定浓度和纯度后，-80℃冻存。

(3)噬菌体展示库构建。

酶切和连接。用限制性内切酶NotI和PstI(NEB)分别对(2)获得的VHH片段和噬菌粒pMECs进行双酶切。之后用琼脂糖凝胶分别回收HH片段和pMECs的酶切产物酶，加入连接酶(NEC)在16℃连接过夜。

转化。连接产物经PCR Purification Kit(QIAGEN)纯化后，取1μl转化TG感受态细胞，37℃复苏1h，涂布平板，37℃，过夜培养，次日计算克隆数，达到约10⁶个克隆/平板。采用上述相同的转化方法，重复转化，直到文库的克隆数达到10⁷以上。将所单克隆用LB洗脱下，5,000g，离心5min，沉淀用2ml LB悬浮，加入等体积的30％甘油，-80℃冻存。

(4)噬菌体展示库纳米抗体的多样性检测。随机挑取(3)的克隆30个，进行clonePCR验证插入的片段，用1.5％琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，结果表明构建的TRPV3纳米抗体文库的阳性重组率为96％。

(5)噬菌体扩增和拯救。对上述得到的文库进行扩增，并加入用辅助噬菌体拯救带有TRPV3纳米抗体的噬菌体株。将(3)保存的噬菌体库接入100ml培养基中培养至对数生长期，加入MOI为20的辅助噬菌体，室温，静置30min，低速离心后，沉淀用培养基悬起，接入300ml培养基中，培养过夜。次日，3,000离心30min，收集上清，加入PEG沉淀噬菌体，冰上静置30min，3,000离心30min，沉淀携带TRPV3纳米抗体的噬菌体库，用PBS悬浮沉淀后，测定其滴度为3.6X 10¹²pfu/ml。

实施例3用噬菌体展示技术获得高亲和TRPV3纳米抗体

(1)亲和TRPV3纳米抗体噬菌体库淘洗。取100ng抗原包被ELISA板，4℃，过夜孵育。次日，加入上述获得的TRPV3纳米抗体噬菌体库，室温，孵育2h；PBST洗孔10次，加入100μl三乙胺，室温，孵育30min，收集的噬菌体即亲和淘洗获得的TRPV3纳米抗体噬菌体库；取10μl感染TG细胞涂布平板，用于测定筛选后的克隆数测定，剩余筛选出的噬菌体库用于进一步扩增和拯救。

(2)筛选后噬菌体库的扩增和拯救。扩增和拯救方法同实施例2(4)，获得的第一轮筛选后的噬菌体库，置于4℃保存，并用于第二轮的筛选；按上述相同筛选步骤，逐次递减抗原量，筛选3-4轮。

(3)ELISA评价特异性抗体的富集程度。ELISA板分别包被100ng的TRPV3蛋白的两个肽段作为抗原，4℃，过夜；次日加2％的BSA室温封闭1h；实验组分别加入每轮淘洗后扩增的噬菌体库，对照组加入等量野生型的噬菌体库，室温，孵育2h；PBST洗10次，以去除没有结合的噬菌体；加入HRP标记的抗M13抗体，室温孵育1h；加入显色液，避光反应10-30min，测吸光值。结果如图3所示，吸光值随着淘洗次数逐渐上升，并在第三轮到第四轮淘洗时趋于稳定，表明特异性的抗体得到了富集。

(4)TRPV3高亲和纳米抗体单克隆挑选。同上，用100ng的TRPV3抗原包被ELISA板，4℃孵育过夜；从最后一轮筛选的平板中，随机挑取单克隆于1ml培养基中，37℃，培养至对数期，加入1mM IPTG诱导过夜；次日，离心收集菌沉，破碎后，5,000g离心15min，收集上清；同时在ELISA板中加2％的BSA，室温封闭1h；实验组每孔加入单克隆破碎上清，对照组加入空菌的破碎上清，室温，孵育2h；PBST洗10次，加入鼠抗HA标签的抗体，室温1h；PBST洗3-5次，加入AP标记的抗鼠IgG抗体，室温1h；加入底物，反应10-20min，在酶标仪上读取吸光值；当吸光值与对照孔比值大于2.1(Base line)时，判定为阳性克隆；ELISA结果显示，TRPV3-1#多肽获得27个具有显著亲和纳米抗体克隆，TRPV3-2#多肽获得38个具有显著亲和力的纳米抗体克隆(图4)；

(5)阳性纳米抗体单克隆的序列分析。提取(4)中获得的纳米抗体阳性克隆的质粒，对VHH片段进行PCR验证，挑其中阳性的纳米抗体克隆进行Sanger测序。测序结果表明，获得9种纳米抗体的核苷酸序列，对其氨基酸序列进行分析，其中两株纳米抗体的序列具有典型的纳米抗体的结构，即由框架区(FR1，FR2，FR3和FR4)和互补决定区(CDR1，CDR2和CDR3)构成。这两株纳米抗体单克隆的核苷酸和氨基酸序列如下：

TRPV3 VHH1的核苷酸序列：GAGTCTGGAGGAGGCTTGGTGCGACCTGGGGGGTCTCTGAGACTCTCCTGCGCAGCCTCTGGAAGCATCTTCAACTTCAATAACATGGCCTGGTACCGCCAGGGTCCAGGGAAGGAGCGCGAGTTGGTCGCAGTTAGTGGACGTGGCGGTGAGACATACTACGCAGATTCTGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATGCCAAGAACACGTTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAAACCTGAGGACACGGCCATGTATTACTGTGCGGCACGCTCCCGCCCGTTGGGGGACTATAACTACTGGGGCCTGGGGACCCAGGTCACCGTCTCCA(SEQ ID NO:17)。

TRPV3 VHH1的氨基酸序列：ESGGGLVRPGGSLRLSCAASGSIFNFNNMAWYRQGPGKERELVAVSGRGGETYYADSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLKPEDTAMYYCAARSRPLGDYNYWGLGTQVTVS(SEQ IDNO:1)。

TRPV3VHH1的框架区(FR1-FR4)和互补决定区(CDR1-CDR3)氨基酸序列：

FR1：ESGGGLVRPGGSLRLSCAAS(SEQ ID NO:3)。

CDR1：GSIFNFNN(SEQ ID NO:7)。

FR2：MAWYRQGPGKERELVAV(SEQ ID NO:4)。

CDR2：SGRGGET(SEQ ID NO:8)。

FR3：YYADSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLKPEDTAMYYC(SEQ ID NO:5)。

CDR3：AARSRPLGDYNY(SEQ ID NO:9)。

FR4：WGLGTQVTVS(SEQ ID NO:6)。

TRPV3 VHH2的核苷酸序列：GAGTCTGGAGGAGGCTTGGTGCGACCTGGGGGGTCTCTGAGACTCTCCTGCGCAGCCTCTGGAAGCATCTTCAACTTCAATAACATGGCCTGGTACCGCCAGGGTCCAGGGAAGGAGCGCGAGTTGGTCGCAGTTAGTGGACGTGGCGGTGAGACATACTACGCAGATTCTGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATGCCAAGAACACGTTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAAACCTGAGGACACGGCCATGTATTACTGTGCGGCACGCTCCCGCCCGTTGGGGGACTATAACTACTGGGGCCTGGGGACCCAGGTCACCGTCTCCA(SEQ ID NO:18)。

TRPV3 VHH2的氨基酸序列：ESGGGLVRPGGSLRLSCAASGSIFNFNNMAWYRQGPGKERELVAVSGRGGETYYADSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLKPEDTAMYYCAARSRPLGDYNYWGLGTQVTVS(SEQ IDNO:2)。

TRPV3 VHH2的框架区(FR1-FR4)和互补决定区(CDR1-CDR3)氨基酸序列：

FR1：ESGGGLVRPGGSLRLSCAAS(SEQ ID NO:10)。

CDR1：GSIFNFNN(SEQ ID NO:14)。

FR2：MAWYRQGPGKERELVAV(SEQ ID NO:11)。

CDR2：SGRGGET(SEQ ID NO:15)。

FR3：YYADSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLKPEDTAMYYC(SEQ ID NO:12)。

CDR3：AARSRPLGDYNY(SEQ ID NO:16)。

FR4：WGLGTQVTVS(SEQ ID NO:13)。

实施例4TRPV3纳米抗体的诱导表达和纯化

(1)TRPV3纳米抗体表达菌构建。首先挑TRPV3纳米抗体单克隆转接LB培养基，37℃，过夜培养；次日，用

Plasmid Mini Kit I(OMEGA)提取质粒，琼脂糖凝胶电泳并测定浓度后，将含有TRPV3纳米抗体序列的质粒pMECS-VHH是转化入表达菌HB2151感受态细胞中，涂布平板，37℃，培养过夜。

(2)TRPV3纳米抗体的诱导表达。次日，从平板随机挑取5个克隆用clone PCR验证质粒是否转入表达菌株；将阳性克隆在37℃培养至OD600为0.6-0.8，加入IPTG进行过夜诱导纳米抗体表达。次日，收集菌体沉淀，裂解缓冲液重悬沉淀，超声破碎菌体后，高速离心收集菌体破碎上清。

(3)TRPV3纳米抗体的纯化。采用亲和纯化柱(His-Trap，GE)获得纯化的TRPV3纳米抗体。Ni柱先用超纯水清洗，然后用裂解液清洗；将上述破碎上清以1ml/min的流速加入Ni柱；用5倍柱体积的亲和A液(20mM咪唑)洗去杂蛋白，再用等体积的亲和B液(500mM咪唑)洗脱目的蛋白，收集洗脱液；最后15％的SDS-PAGE检测TRPV3纳米抗体的表达和纯化情况(图5)。

实施例5 TRPV3纳米抗体的亲和力测定

ELISA法分析TRPV3纳米抗体的亲和力。实验组以100ng的TRPV3蛋白，对照组用未诱导的质粒表达的蛋白和BSA包被酶标板，4℃孵育过夜；次日加2％的BSA室温封闭1h；取纯化的TRPV3纳米抗体分别加入对照组和实验组，空白组加入PBS，室温，孵育2h；PBST洗10次，加入鼠抗HA标签的抗体，室温1h；PBST洗3-5次，加入AP标记的抗鼠IgG抗体，室温1h；加入底物，反应10-20min，在酶标仪上读取吸光值。ELISA检测结果(图6)显示，TRPV3纳米抗体对TRPV3具有非常好的亲和活性，结合活性远远高于对照组。

由以上数据表明，通过羊驼免疫，结合噬菌体展示技术，能够有效的获得靶向TPPV3的高亲和力的纳米抗体。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

SEQUENCE LISTING

<110> 深圳华大生命科学研究院

<120> 纳米抗体及其制备方法

<130> PIDC3173844

<160> 26

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 112

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> 纳米抗体的氨基酸序列

<400> 1

Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Arg Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser

1 5 10 15

Cys Ala Ala Ser Gly Ser Ile Phe Asn Phe Asn Asn Met Ala Trp Tyr

20 25 30

Arg Gln Gly Pro Gly Lys Glu Arg Glu Leu Val Ala Val Ser Gly Arg

35 40 45

Gly Gly Glu Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile

50 55 60

Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu

65 70 75 80

Lys Pro Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Ala Arg Ser Arg Pro

85 90 95

Leu Gly Asp Tyr Asn Tyr Trp Gly Leu Gly Thr Gln Val Thr Val Ser

100 105 110

<210> 2

<211> 112

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> 纳米抗体的氨基酸序列

<400> 2

Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Arg Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser

1 5 10 15

Cys Ala Ala Ser Gly Ser Ile Phe Asn Phe Asn Asn Met Ala Trp Tyr

20 25 30

Arg Gln Gly Pro Gly Lys Glu Arg Glu Leu Val Ala Val Ser Gly Arg

35 40 45

Gly Gly Glu Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile

50 55 60

Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu

65 70 75 80

Lys Pro Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Ala Arg Ser Arg Pro

85 90 95

Leu Gly Asp Tyr Asn Tyr Trp Gly Leu Gly Thr Gln Val Thr Val Ser

100 105 110

<210> 3

<211> 20

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> 框架区1的氨基酸序列

<400> 3

Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Arg Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser

1 5 10 15

Cys Ala Ala Ser

20

<210> 4

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> 框架区2的氨基酸序列

<400> 4

Met Ala Trp Tyr Arg Gln Gly Pro Gly Lys Glu Arg Glu Leu Val Ala

1 5 10 15

Val

<210> 5

<211> 38

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> 框架区3的氨基酸序列

<400> 5

Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn

1 5 10 15

Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp

20 25 30

Thr Ala Met Tyr Tyr Cys

35

<210> 6

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> 框架区4的氨基酸序列

<400> 6

Trp Gly Leu Gly Thr Gln Val Thr Val Ser

1 5 10

<210> 7

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> 互补决定区1的氨基酸序列

<400> 7

Gly Ser Ile Phe Asn Phe Asn Asn

1 5

<210> 8

<211> 7

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> 互补决定区2的氨基酸序列

<400> 8

Ser Gly Arg Gly Gly Glu Thr

1 5

<210> 9

<211> 12

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> 互补决定区3的氨基序列

<400> 9

Ala Ala Arg Ser Arg Pro Leu Gly Asp Tyr Asn Tyr

1 5 10

<210> 10

<211> 20

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> 框架区1的氨基酸序列

<400> 10

Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Arg Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser

1 5 10 15

Cys Ala Ala Ser

20

<210> 11

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> 框架区2的氨基酸序列

<400> 11

Met Ala Trp Tyr Arg Gln Gly Pro Gly Lys Glu Arg Glu Leu Val Ala

1 5 10 15

Val

<210> 12

<211> 38

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> 框架区3的氨基酸序列

<400> 12

Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn

1 5 10 15

Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp

20 25 30

Thr Ala Met Tyr Tyr Cys

35

<210> 13

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> 框架区4的氨基酸序列

<400> 13

Trp Gly Leu Gly Thr Gln Val Thr Val Ser

1 5 10

<210> 14

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> 互补决定区1的氨基酸序列

<400> 14

Gly Ser Ile Phe Asn Phe Asn Asn

1 5

<210> 15

<211> 7

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> 互补决定区2的氨基酸序列

<400> 15

Ser Gly Arg Gly Gly Glu Thr

1 5

<210> 16

<211> 12

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> 互补决定区3的氨基酸序列

<400> 16

Ala Ala Arg Ser Arg Pro Leu Gly Asp Tyr Asn Tyr

1 5 10

<210> 17

<211> 337

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> 编码抗体的核酸的核苷酸序列

<400> 17

Gly Ala Gly Thr Cys Thr Gly Gly Ala Gly Gly Ala Gly Gly Cys Thr

1 5 10 15

Thr Gly Gly Thr Gly Cys Gly Ala Cys Cys Thr Gly Gly Gly Gly Gly

20 25 30

Gly Thr Cys Thr Cys Thr Gly Ala Gly Ala Cys Thr Cys Thr Cys Cys

35 40 45

Thr Gly Cys Gly Cys Ala Gly Cys Cys Thr Cys Thr Gly Gly Ala Ala

50 55 60

Gly Cys Ala Thr Cys Thr Thr Cys Ala Ala Cys Thr Thr Cys Ala Ala

65 70 75 80

Thr Ala Ala Cys Ala Thr Gly Gly Cys Cys Thr Gly Gly Thr Ala Cys

85 90 95

Cys Gly Cys Cys Ala Gly Gly Gly Thr Cys Cys Ala Gly Gly Gly Ala

100 105 110

Ala Gly Gly Ala Gly Cys Gly Cys Gly Ala Gly Thr Thr Gly Gly Thr

115 120 125

Cys Gly Cys Ala Gly Thr Thr Ala Gly Thr Gly Gly Ala Cys Gly Thr

130 135 140

Gly Gly Cys Gly Gly Thr Gly Ala Gly Ala Cys Ala Thr Ala Cys Thr

145 150 155 160

Ala Cys Gly Cys Ala Gly Ala Thr Thr Cys Thr Gly Thr Gly Ala Ala

165 170 175

Gly Gly Gly Cys Cys Gly Ala Thr Thr Cys Ala Cys Cys Ala Thr Cys

180 185 190

Thr Cys Cys Ala Gly Ala Gly Ala Cys Ala Ala Thr Gly Cys Cys Ala

195 200 205

Ala Gly Ala Ala Cys Ala Cys Gly Thr Thr Gly Thr Ala Thr Cys Thr

210 215 220

Gly Cys Ala Ala Ala Thr Gly Ala Ala Cys Ala Gly Cys Cys Thr Gly

225 230 235 240

Ala Ala Ala Cys Cys Thr Gly Ala Gly Gly Ala Cys Ala Cys Gly Gly

245 250 255

Cys Cys Ala Thr Gly Thr Ala Thr Thr Ala Cys Thr Gly Thr Gly Cys

260 265 270

Gly Gly Cys Ala Cys Gly Cys Thr Cys Cys Cys Gly Cys Cys Cys Gly

275 280 285

Thr Thr Gly Gly Gly Gly Gly Ala Cys Thr Ala Thr Ala Ala Cys Thr

290 295 300

Ala Cys Thr Gly Gly Gly Gly Cys Cys Thr Gly Gly Gly Gly Ala Cys

305 310 315 320

Cys Cys Ala Gly Gly Thr Cys Ala Cys Cys Gly Thr Cys Thr Cys Cys

325 330 335

Ala

<210> 18

<211> 337

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 编码抗体的核酸的核苷酸序列

<400> 18

gagtctggag gaggcttggt gcgacctggg gggtctctga gactctcctg cgcagcctct 60

ggaagcatct tcaacttcaa taacatggcc tggtaccgcc agggtccagg gaaggagcgc 120

gagttggtcg cagttagtgg acgtggcggt gagacatact acgcagattc tgtgaagggc 180

cgattcacca tctccagaga caatgccaag aacacgttgt atctgcaaat gaacagcctg 240

aaacctgagg acacggccat gtattactgt gcggcacgct cccgcccgtt gggggactat 300

aactactggg gcctggggac ccaggtcacc gtctcca 337

<210> 19

<211> 15

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> 人TRPV3蛋白的膜外区的氨基酸序列

<400> 19

Cys Ser Tyr Tyr Arg Pro Arg Glu Glu Glu Ala Ile Pro His Pro

1 5 10 15

<210> 20

<211> 18

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> 人TRPV3蛋白的膜外区的氨基酸序列

<400> 20

Ser Tyr Gly Ser Phe Ser Asp Ala Val Leu Glu Leu Phe Lys Leu Thr

1 5 10 15

Ile Cys

<210> 21

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 第一轮Nest-PCR引物

<400> 21

gtcctggctg ctcttctaca agg 23

<210> 22

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 第一轮Nest-PCR引物

<400> 22

ggtacgtgct gttgaactgt tcc 23

<210> 23

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 第一轮Nest-PCR引物

<400> 23

tggtggcagg tccccaaggt 20

<210> 24

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 第一轮Nest-PCR引物

<400> 24

ttcttggtgg cagtagccgc agt 23

<210> 25

<211> 29

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 第二轮Nest-PCR引物

<400> 25

gatgtgcagc tgcaggagtc tggrggagg 29

<210> 26

<211> 32

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 第二轮Nest-PCR引物

<400> 26

ctagtgcggc cgctggagac ggtgacctgg gt 32

Claims

1.一种纳米抗体，其特征在于，所述抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。

2.根据权利要求1所述的纳米抗体，其特征在于，所述抗体的框架区1的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示，所述抗体的框架区2的氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示，所述抗体的框架区3的氨基酸序列如SEQ ID NO：5所示，所述抗体的框架区4的氨基酸序列如SEQ ID NO：6所示，所述抗体的互补决定区1的氨基酸序列如SEQ ID NO：7所示，所述抗体的互补决定区2的氨基酸序列如SEQ ID NO：8所示，所述抗体的互补决定区3的氨基酸序列如SEQ ID NO：9所示。

3.一种分离的核酸，其特征在于，所述核酸为：

编码权利要求1或2所述抗体的核酸或其互补序列。

4.根据权利要求3所述的分离的核酸，其特征在于，所述核酸的核苷酸序列如SEQ IDNO：17所示。

5.一种核酸构建体，其特征在于，包含：

编码序列，所述编码序列为权利要求3或4所述的核酸，以及

控制序列，所述控制序列与所述编码序列可操作地连接。

6.一种表达载体，其特征在于，所述载体包含权利要求5所述的核酸构建体。

7.一种噬菌体，其特征在于，所述噬菌体包含权利要求3或4所述的核酸、权利要求5所述的核酸构建体或表达权利要求1或2所述的纳米抗体。

8.一种宿主细胞，其特征在于，所述细胞携带权利要求5所述的核酸构建体或权利要求6所述的表达载体。

9.根据权利要求8所述的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞是通过转染或者转化所述核酸构建体或表达载体获得。

10.根据权利要求8所述的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞为原核细胞。

11.根据权利要求10所述的宿主细胞，其特征在于，所述原核细胞为HB2151。

12.一种药物组合物，其特征在于，包括：

权利要求1或2所述的纳米抗体；以及

药学上可接受的佐剂。