BR112021003410A2 - anticorpos de domínio único anti-bcma, grupo de genes dos ditos anticorpos, polipeptídeo, vetor de expressão, célula hospedeira, receptor de antígeno quimérico, célula t modificada pelo mesmo, composição farmacêutica e usos dos ditos anticorpos - Google Patents
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Abstract
ANTICORPOS DE DOMÍNIO ÚNICO ANTI-BCMA, GRUPO DE GENES DOS DITOS ANTICORPOS, POLIPEPTÍDEO, VETOR DE EXPRESSÃO, CÉLULA HOSPEDEIRA, RECEPTOR DE ANTÍGENO QUIMÉRICO, CÉLULA T MODIFICADA PELO MESMO, COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA E USOS DOS DITOS ANTICORPOS. A invenção refere-se a um grupo de anticorpos de domínio único anti-BCMA, bem como genes dos anticorpos de domínio único no grupo, um vetor contendo os anticorpos de domínio único no grupo, um receptor de antígeno quimérico e uma célula T modificada por um receptor de antígeno quimérico, e detecção e aplicação de tratamento dos anticorpos de domínio único no grupo. Os anticorpos de domínio único anti-BCMA têm alta atividade, alta estabilidade, alta especificidade e alta capacidade de ligação.
Description
[001] A presente divulgação pertence ao campo das biotecnologias. Em particular, a presente divulgação refere-se a um grupo de anticorpos de domínio único contra o antígeno de maturação de células B (BCMA) e uso dos mesmos.
[002] BCMA (antígeno de maturação de células B, BCMA) é um membro da superfamília do receptor de fator de necrose tumoral (TNFR), que pode se ligar a um fator de ativação de células B (BAFF) ou a um estimulador de linfócitos B (BLyS) e um ligando indutor de proliferação (APRIL). É relatado que em células normais, BCMA é expresso principalmente por plasmócitos e algumas células B maduras, mas não expresso na maioria das células B ou outros órgãos. O mieloma múltiplo (MM) é um tumor maligno caracterizado pela proliferação massiva de plasmócitos clonais. O RNA de BCMA é geralmente detectado em células MM, e a proteína BCMA pode ser detectada nas superfícies de plasmócitos de um paciente com mieloma múltiplo. Consequentemente, um antígeno alvo candidato para o tratamento imunológico de MM é BCMA. Atualmente, o tratamento com MM pode induzir a remissão, mas quase todos os pacientes eventualmente terão recaída e morrerão. Algumas drogas candidatas a anticorpos monoclonais mostraram uma promessa de tratar MM em estudos pré-clínicos e testes clínicos iniciais, mas não foram universalmente aprovados por consenso, e nenhuma droga com anticorpo monoclonal foi comercializada. Claramente, há uma necessidade urgente por uma nova terapia imunológica para MM, e uma terapia de células T adotiva específica para o antígeno nanocorpo, é um anticorpo de cadeia pesada encontrado no sangue de Alpaca em que uma cadeia leve está ausente. Usando a tecnologia de biologia molecular em combinação com a ciência de nanopartículas, os cientistas belgas desenvolveram um novo fragmento de anticorpo de baixo peso molecular que pode se ligar a um antígeno. Possui um grupo de vantagens, tais como estrutura simples, forte penetração, fácil expressão e purificação, alta afinidade e estabilidade, e não tem reações tóxicas e colaterais, ou semelhantes. Anticorpos de domínio único para vários antígenos alvo têm sido pesquisados pelo uso de uma tecnologia de plataforma de anticorpo de domínio único e, em seguida, usados no campo de biomedicina.
[004] A presente divulgação visa a desenvolver um grupo de anticorpos de domínio único anti-BCMA promissores para uso em drogas candidatas a anticorpos terapêuticos e células T de receptor de antígeno quimérico direcionadas a BCMA.
[005] O problema técnico a ser resolvido pela presente divulgação é fornecer um grupo de novos anticorpos de domínio único anti-BCMA com bons efeitos.
[006] Outro problema técnico a ser resolvido pela presente divulgação é desenvolver vários usos de anticorpos de domínio único anti-BCMA.
[007] A fim de alcançar os objetivos acima, a presente divulgação fornece as seguintes soluções técnicas:
[008] A presente divulgação fornece um grupo de anticorpos de domínio único anti-BCMA compostos por uma região estrutural e uma região determinante de complementaridade, em que a região determinante de complementaridade tem uma sequência de aminoácidos selecionada a partir daquelas de SEQ ID NOs: 1-66 (Anexo 1: Sequências de aminoácidos de regiões determinantes de complementaridade de BCMA-sdAbs rastreados).
[009] Em algumas modalidades, a sequência de aminoácidos da região determinante de complementaridade tem mais de 80%, mais de 85%, mais de 90%, mais de 95% ou mais de 99% de identidade com a sequência de aminoácidos como estabelecido em SEQ ID NOs: 1-66.
[010] Preferivelmente, a diferença nos aminoácidos é a substituição conservativa.
[011] Em algumas modalidades, o anticorpo de domínio único no grupo tem uma sequência de aminoácidos selecionada a partir de SEQ ID NOs: 67-132 ou é uma sequência de aminoácidos selecionada a partir de SEQ ID NOs: 67-132 (Anexo 2: Sequências de Aminoácidos de BCMA-sdAbs rastreados).
[012] Em algumas modalidades, a sequência de aminoácidos do anticorpo de domínio único tem mais de 80%, mais de 85%, mais de 90%, mais de 95% ou mais de 99% de identidade com a sequência de aminoácidos como estabelecido em SEQ ID NOs: 67-132.
[013] Preferivelmente, a diferença nos aminoácidos é a substituição conservativa, mais preferivelmente, uma ou mais substituições conservativas.
[014] A presente divulgação fornece um grupo de genes de anticorpos de domínio único anti-BCMA tendo uma sequência de nucleotídeos selecionada a partir de SEQ ID NOs: 133-198 (Anexo 3: Sequências de Nucleotídeos de BCMA-sdAbs rastreados), ou sendo uma sequência de nucleotídeos de SEQ ID NOs: 133-198, ou sendo uma sequência de nucleotídeos que codifica os anticorpos de domínio único acima.
[015] Em algumas modalidades, a sequência de nucleotídeos de anticorpo de domínio único tem mais de 80%, mais de 85%, mais de 90%, mais de 95% ou mais de 99% de identidade com a sequência de nucleotídeos como estabelecido em SEQ ID NOs: 133-198.
[016] Preferivelmente, a diferença nas bases é a substituição conservativa, mais preferivelmente, uma ou mais substituições conservativas.
[017] A presente divulgação fornece um polipeptídeo tendo um ou mais anticorpos de domínio único selecionados a partir do grupo de anticorpos de domínio único como descrito acima.
[018] Preferivelmente, a pluralidade de anticorpos de domínio único são iguais ou diferentes.
[019] A presente divulgação fornece um vetor de expressão incluindo um ou mais genes selecionados a partir do grupo de genes de anticorpos de domínio único, conforme descrito acima.
[020] Preferivelmente, o vetor de expressão é um vetor de expressão de células procarióticas, um vetor de expressão de células eucarióticas ou outro vetor (s) de expressão celular.
[021] A presente divulgação fornece uma célula hospedeira incluindo o vetor de expressão acima.
[022] Preferivelmente, a célula hospedeira é uma célula de expressão procariótica, uma célula de expressão eucariótica, uma célula de fungo ou uma célula de levedura, em que a célula de expressão procariótica é preferivelmente Escherichia coli.
[023] A presente divulgação fornece um receptor de antígeno quimérico, tendo um ou múltiplos anticorpos de domínio único selecionados a partir do grupo acima de anticorpos de domínio único.
[024] Preferivelmente, os múltiplos anticorpos de domínio único são iguais ou diferentes.
[025] A presente divulgação fornece uma célula T modificada por um receptor de antígeno quimérico, que é modificado pelo receptor de antígeno quimérico acima.
[026] A presente divulgação fornece uma composição farmacêutica incluindo um ou mais anticorpos de domínio único selecionados a partir do grupo acima de anticorpos de domínio único como ingredientes ativos.
[027] A presente divulgação fornece um anticorpo de domínio único anti- BCMA humanizado, que é obtido pela humanização do anticorpo de domínio único selecionado a partir do grupo acima de anticorpos de domínio único.
[028] A presente divulgação fornece o uso do anticorpo de domínio único no grupo acima de anticorpos de domínio único na detecção de BCMA.
[029] A presente divulgação fornece o uso do anticorpo de domínio único no grupo acima de anticorpos de domínio único para bloquear uma interação entre BAFF e BCMA.
[030] Em algumas modalidades, o anticorpo de domínio único está ligado a um ou mais de um agente citotóxico, uma enzima, um radioisótopo, um composto fluorescente ou um composto quimioluminescente.
[031] A presente divulgação fornece o uso do anticorpo de domínio único no grupo acima de anticorpos de domínio único na preparação de uma droga para o tratamento de uma doença associada à expressão anormal de BCMA.
[032] Preferivelmente, a doença associada à expressão anormal de BCMA é uma doença de mieloma múltiplo.
[033] A presente divulgação tem os seguintes efeitos técnicos benéficos:
[034] A divulgação rastreia um grupo de anticorpos de domínio único anti- BCMA. Em comparação com os anticorpos existentes, os respectivos anticorpos de domínio único anti-BCMA no grupo têm alta atividade e forte neutralização ou capacidade de ligação. O grupo de anticorpos de domínio único pode se ligar especificamente a antígenos BCMA humanos ou cepas de células tumorais que expressam BCMA nas superfícies celulares, bloquear efetivamente a ligação do antígeno BAFF a BCMA e gerar um efeito de cascata de sinal correspondente. O grupo de anticorpos de domínio único pode ser usado para detectar e/ou tratar uma pluralidade de doenças associadas à expressão anormal de BCMA.
[035] Daqui em diante, a presente divulgação será descrita em detalhes por referência aos desenhos e exemplos anexos, mas o escopo da presente divulgação não está limitado aos mesmos.
[036] A Fig. 1 mostra uma amplificação de anticorpos de cadeia pesada comum e genes de anticorpos de cadeia única por meio de uma primeira rodada de PCR. Com referência a (Marcador) (1500 BP, 1000 BP, 800 BP, 500 BP, 250 BP e 100 BP)1 produtos de amplificação por PCR, existem fragmentos de amplificação de genes de cadeia pesada comuns com mais de 800 BP e fragmentos de amplificação de genes de anticorpos de cadeia pesada tendo menos de 800 BP. 2 e 3 são produtos de amplificação por PCR, que são fragmentos de amplificação de genes de anticorpos de cadeia pesada tendo apenas cerca de 500 BP.
[037] A Fig. 2 mostra um fragmento do gene alvo VHH obtido na amplificação por PCR de segunda rodada. Marcador (1500 BP, 1200 BP, 1000 BP, 800 BP, 700 BP, 600 BP, 500 BP, 250 BP e 100 BP). 1 - 12 são produtos de amplificação por PCR, que são fragmentos de amplificação de gene VHH de anticorpo de cadeia pesada com cerca de 500 BP.
[038] A Fig. 3 é uma ilustração SDS-PAGE de BCMA-sdAbs expresso antes da purificação.
[039] A Fig. 4 mostra uma ilustração de SDS-PAGE de BCMA-sdAbs expresso após ser purificado por uma coluna de níquel.
[040] A Fig. 5 mostra um gradiente de concentração de uma ligação de anticorpo de domínio único de BCMA purificado à proteína BCMA (ELISA).
[041] A Fig. 6 mostra que um anticorpo de domínio único de BCMA pode inibir competitivamente a ligação da proteína BAFF à proteína BCMA.
[042] A Fig. 7 mostra uma eficiência de mortandade de BCMA CART em células tumorais.
[043] A divulgação rastreia um grupo de anticorpos de domínio único anti- BCMA por um grupo de etapas, que têm potenciais de alta atividade e alta neutralização ou capacidade de ligação. Estes anticorpos de domínio único têm estruturas semelhantes (compostas por uma região estrutural e uma região determinante de complementaridade), e efeitos funcionais semelhantes. Assim, eles podem ser considerados como um grupo de anticorpos anti-BCMA de domínio único tendo estrutura comum e efeitos de propriedade comuns.
[044] O termo "BCMA", tal como aqui utilizado, é um membro da superfamília do receptor do fator de necrose tumoral (TNFR), que pode se ligar a um fator de ativação de células B ou um estimulador de linfócitos B e um ligando indutor de proliferação (APRIL). O mieloma múltiplo (MM) é um tumor maligno caracterizado pela proliferação massiva de plasmócitos clonais. O RNA de BCMA é geralmente detectado em células MM, e a proteína BCMA pode ser detectada nas superfícies de plasmócitos em um paciente com mieloma múltiplo.
[045] O termo "mieloma múltiplo (MM)", conforme usado aqui, é um tumor maligno caracterizado pela proliferação massiva de plasmócitos clonais. Atualmente, o tratamento de MM pode induzir a remissão, mas quase todos os pacientes eventualmente terão recaída e morrerão. Alguns anticorpos monoclonais mostraram- se promissores no tratamento de MM em estudos pré-clínicos e em estudos clínicos iniciais, mas não foram aprovados universalmente. Claramente, há uma necessidade urgente de novos anticorpos e nova terapia imunológica para MM.
[046] Novos anticorpos contra BCMA são o objetivo de desenvolvimento e, finalmente, o objeto de proteção da presente divulgação. O escopo da presente divulgação abrange os anticorpos anti-BCMA obtidos e várias formas dos mesmos (por exemplo, anticorpos de domínio único), bem como substâncias incluindo o anticorpo como componente (por exemplo, composições farmacêuticas, kits, vetores,
receptores de antígenos quiméricos, um receptor de antígeno quimérico de células T modificadas, ou semelhantes), usos (por exemplo, usos para diagnóstico, tratamento ou aplicação, etc.). No entanto, deve ser entendido por aqueles versados na técnica que os objetivos de proteção da presente divulgação não estão limitados a estes conteúdos exemplares.
[047] O termo "anticorpo de domínio único (sdAb)", tal como aqui utilizado, refere-se a um fragmento contendo um único domínio variável em um anticorpo, e também é conhecido como nanocorpo. Como um anticorpo completo, ele pode se ligar seletivamente a um antígeno específico. Em comparação com a massa do anticorpo completo (150-160kDa), o anticorpo de domínio único (apenas cerca de 12-15kDa) é muito menor. O primeiro anticorpo de domínio único foi feito de anticorpos de cadeia pesada de alpaca por engenharia artificial, e conhecido como “segmento VHH”. Em uma modalidade preferida, a presente divulgação usa o anticorpo de domínio único da alpaca, enquanto aqueles versados na técnica devem entender que a presente divulgação também pode abranger anticorpos de domínio único derivados de outras espécies. Sem limitação, o anticorpo de domínio único da presente divulgação é um anticorpo de domínio único anti-BCMA.
[048] O termo "região estrutural" também é conhecido como uma região de esqueleto. As sequências de cerca de 110 aminoácidos perto dos N-terminais da cadeia H e da cadeia L da imunoglobulina variam muito, enquanto as sequências de aminoácidos em outras posições são relativamente constantes. Por conseguinte, a cadeia leve e a cadeia pesada podem ser divididas em uma região variável 00 e uma região constante (C). A região variável contém uma HVR (região hipervariável), também conhecida como região determinante de complementaridade (CDR) e uma região de quadro (FR). A variabilidade de FR é menor que a de CDR. Existem quatro moléculas de FR no total, ou seja, FR1, FR2, FR3 e FR4, respectivamente. Durante o reconhecimento do anticorpo, quatro moléculas de FR crimpam de forma que as moléculas de CDR fiquem próximas umas das outras. Deve ser entendido que, a presente divulgação não está limitada à região (s) estrutural específica, e aqueles versados na técnica podem selecionar ou obter região (s) estrutural apropriada de acordo com os requisitos práticos sem se afastar do escopo de proteção da presente divulgação.
[049] O termo "região determinante de complementaridade (CDR)", toda a molécula de anticorpo pode ser dividida em uma região constante e uma região variável. Na região variável, alguns resíduos de aminoácidos são altamente variáveis, e as regiões nas quais as composições e as ordens de arranjo desses resíduos de aminoácidos são mais propensas a variar são chamadas de regiões hipervariáveis. Existem três regiões hipervariáveis (HVR) nas regiões V da cadeia L e da cadeia H, que podem formar uma complementação precisa com os determinantes do antígeno em termos de estrutura espacial e, portanto, as regiões hipervariáveis também são chamadas de regiões determinantes de complementaridade.
[050] O termo "identidade" de sequência, tal como aqui utilizado, é indistintamente usado com "homologia" e refere-se a um grau de similaridade entre sequências conforme medido por softwares de alinhamento de sequência, tal como BLAST. Os métodos e softwares de alinhamento de sequência são bem conhecidos pelos versados na técnica. As sequências de nucleotídeos modificadas podem ser obtidas por substituição, deleção e/ou adição de um ou mais (por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 ou mais) aminoácidos ou bases em uma sequência conhecida. Para exemplo, modificando a sequência de aminoácidos ou sequência de nucleotídeos como estabelecido em uma ou mais das sequências SEQ ID NOs: 1-198 da presente divulgação por meios convencionais (por exemplo, por substituição conservativa), é viável obter sequências com mais de 80%, mais de 85%, mais de 90%, mais de 95% ou mais de 99% de identidade de sequência com essas sequências, e tendo substancialmente as mesmas propriedades, que estão englobadas no escopo de proteção da presente divulgação. Preferivelmente, a presente divulgação obtém identidade de sequência por substituição conservativa, mas não está limitada à mesma.
[051] O termo "sequência de aminoácidos" refere-se a um arranjo no qual os aminoácidos estão ligados uns aos outros para formar uma cadeia de peptídeo (ou polipeptídeo), em que a sequência de aminoácidos só pode ser lida em uma direção. Existem mais de 100 tipos de aminoácidos diferentes, vinte dos quais são comumente usados. A presente divulgação não exclui o caso de outras substâncias (por exemplo, sacarídeos, lipídios e outras modificações) estarem ligadas às cadeias de aminoácidos e também não se limitam aos 20 aminoácidos que são comumente usados.
[052] O termo "sequência de nucleotídeos" refere-se a um arranjo de bases em DNAs ou RNAs, ou seja, um arranjo de A, T, G e C no DNA, ou um arranjo de A, U, G e C em mRNA. Também inclui arranjos de bases em rRNA, tRNA e mRNA. Deve ser entendido que o gene do anticorpo da presente divulgação também inclui RNA (rRNA, tRNA e mRNA) e suas sequências complementares, em adição às sequências de DNA. Será também entendido que os genes que codificam os anticorpos da presente divulgação não são equivalentes às sequências como estabelecidas em SEQ ID NOs: 133-198 da presente divulgação e os genes que codificam os anticorpos da presente divulgação, mas são diferentes das sequências de nucleotídeos, como estabelecido em SEQ ID NOs: 133-198, também estão dentro do escopo protetor da presente divulgação.
[053] Em algumas modalidades, o polipeptídeo, a composição farmacêutica, o receptor de anticorpo quimérico ou o CART da presente divulgação compreende um anticorpo de domínio único, deve ser entendido que a presente divulgação não está limitada aos mesmos. As substâncias acima da presente divulgação podem conter dois, três ou múltiplos anticorpos de domínio único, em que os múltiplos anticorpos de domínio único são iguais ou diferentes. Além disso, além dos anticorpos de domínio único da presente divulgação, outros anticorpos ou anticorpos de domínio único que não estão contidos na presente divulgação também podem ser incluídos sem ir além do escopo da presente divulgação.
[054] O termo "vetores de expressão" refere-se a um vetor que incorpora elementos de expressão (tais como, promotor, RBS ou terminador) com base na estrutura principal básica de um vetor de clonagem de modo que um gene alvo possa ser expresso. O vetor de expressão compreende quatro partes: um gene alvo, um promotor, um terminador e um gene marcador. A presente divulgação inclui, mas não está limitada a, um vetor de expressão de células procarióticas, um vetor de expressão de células eucarióticas ou outros vetores de expressão de células.
[055] "Receptor de antígeno quimérico (CAR)" é um componente núcleo da "célula T do receptor de antígeno quimérico (CART)", que confere a uma célula T a capacidade de reconhecer antígenos tumorais de maneira independente, de modo que a célula T modificada por CAR é capaz de reconhecer uma gama mais ampla de alvos em comparação com um receptor de superfície de célula T natural. O projeto básico de CAR compreende uma região de ligação ao antígeno associada ao tumor, uma região de dobradiça extracelular, uma região transmembranar e uma região de sinal intracelular.
[056] Em uma modalidade da presente divulgação, o receptor de antígeno quimérico ou célula T do receptor de antígeno quimérico da presente divulgação podem conter um, dois ou mais anticorpos de domínio único da presente divulgação, que podem ser iguais ou diferentes.
[057] Em uma modalidade da presente divulgação, a "composição farmacêutica" da presente divulgação pode conter um, dois ou mais anticorpos de domínio único da presente divulgação, que podem ser iguais ou diferentes.
[058] O termo anticorpo "humanizado" refere-se a um anticorpo no qual as regiões constantes (nomeadamente as regiões CH e CL) dos anticorpos ou os anticorpos inteiros são codificados por genes de anticorpos humanos. O anticorpo humanizado pode reduzir significativamente a reação lateral imunológica de um anticorpo heterólogo em um organismo humano. O anticorpo humanizado inclui vários tipos, incluindo anticorpos quiméricos, anticorpos modificados e anticorpos humanos completos. Será apreciado que aqueles versados na técnica podem preparar formas humanizadas adequadas dos anticorpos de domínio único da presente divulgação de acordo com os requisitos práticos, que estão dentro do escopo da presente divulgação.
[059] O termo "lentivírus", tal como aqui utilizado, é um gênero de Retroviridae, incluindo oito vírus que podem infectar humanos e vertebrados, em que as células de infecção primária são principalmente linfócitos e macrófagos, e os indivíduos infectados desenvolverão as doenças. Os tipos de lentivírus incluem, por exemplo, vírus da imunodeficiência humana (HIV), vírus da imunodeficiência símia (SIV), anemia infecciosa equina (EIA) e vírus da imunodeficiência felina (FIV). O progresso da pesquisa do vetor lentiviral é rápido e intenso. Este vetor pode efetivamente integrar genes estranhos nos cromossomos do hospedeiro, de modo a atingir a expressão persistente. Em termos de infectabilidade, ele pode infectar efetivamente neurônios, hepatócitos, cardiomiócitos, células tumorais, células endoteliais, células-tronco e outros tipos de células, de modo a alcançar um bom efeito terapêutico gênico. Além disso, aqueles versados na técnica também podem selecionar outros vetores adequados diferentes de lentivírus, que estejam dentro do escopo protetor da presente divulgação.
[060] A seguir, a presente divulgação será descrita em detalhes por referência aos exemplos a seguir. No entanto, a presente divulgação não está limitada aos detalhes específicos desses exemplos, porque para pessoas versadas na técnica, outras variações estão bem estabelecidas ou são óbvias de acordo com a divulgação direta e as reivindicações anexas. Portanto, todas as tecnologias alcançadas com base na descrição acima da presente divulgação devem cair dentro do escopo da presente divulgação.
[061] A menos que especificado de outra forma, todos os métodos experimentais descritos nos exemplos a seguir são métodos convencionais; e todos os reagentes e biomateriais estão disponíveis comercialmente, a menos que especificado de outra forma.
[062] Exemplo 1: Construção de biblioteca de anticorpo de domínio único específica de antígeno anti-BCMA
[063] 1) Imunização de Alpaca com antígeno BCMA
[064] É realizada de acordo com o método de imunização convencional. Resumidamente, alpacas adultas saudáveis foram submetidas a injeções subcutâneas multiponto em seus pescoços e costas com antígeno BCMA (proteína humana TNFRSF17/BCMA/CD269, adquirida em Beijing Yiqiao Shenzhou, Produto No. 10620-H15H) com um peso total de cerca de 2 mg, em que o antígeno e um volume igual de adjuvante de Freund foram adicionados. As imunizações foram realizadas por 4-6 vezes. A absorção de massa nos sítios de injeção foi seguida para confirmar a imunização correta. O intervalo de imunização foi de 7-15 dias. Após a quarta imunização, o soro foi coletado para determinar a titulação imunológica do antígeno. Quando a titulação atingiu 10.000 vezes ou mais (método ELISA), foram coletados cerca de 100 ml de sangue total e os linfócitos foram separados e armazenados a -80 ºC para posterior uso.
[065] 2) Separação e extração de RNA de linfócitos de sangue periférico de alpaca
[066] Linfócitos de sangue periférico de alpacas foram separados usando um kit QIAGEN (KQIAamp RNA Blood Mini Kit (50), Produto No. 52304) seguindo as instruções. Resumidamente, a 1 ml de sangue total foram adicionados 5-10 ml de lisado de glóbulos vermelhos. A mistura foi uniformemente misturada e colocada em um banho de gelo durante 30 min. Ela foi centrifugada por 10 min a 2.000 rpm após os glóbulos vermelhos terem sido lisados. O sobrenadante foi eliminado e foram adicionados 1-2 ml adicionais de lisado de glóbulos vermelhos e misturados uniformemente. A mistura foi colocada em um banho de gelo por 10 min para lisar os glóbulos vermelhos residuais e, em seguida, centrifugada a 2.000 rpm por 10 min. O sobrenadante foi descartado e 0,3 mL de lisado foi adicionado para misturar com os leucócitos uniformemente. A mistura resultante foi armazenada a -80ºC para uso posterior.
[067] A purificação de RNA foi realizada usando um kit QIAGEN (QIAamp RNA Blood Mini Kit (50), Produto No. 52304) seguindo as instruções. Resumidamente, a 0,3 ml dos linfócitos de alpaca separados foi adicionado 0,3 ml de tampão RLT e a mistura foi bem misturada com agitação. O líquido misturado da última etapa foi transferido para um tubo de coleta equipado com uma coluna de adsorção (QIAshredderSpinColumn) e centrifugado a 14.000 rpm por 2 min. O filtrado no tubo de coleta foi transferido para um novo tubo de centrífuga. 0,5 ml de etanol a 70% foi adicionado ao filtrado e uniformemente misturado de cabeça para baixo. A mistura foi centrifugada a 10.000 rmp por 15s, o líquido residual do tubo de coleta foi descartado e a coluna de adsorção recolocada no tubo de coleta. A coluna de adsorção foi transferida para um novo tubo de coleta de 2 ml, 0,7 ml de tampão RW1 foi adicionado, e a mistura foi centrifugada a 10.000 rmp por 15s. A coluna de adsorção foi transferida para um novo tubo de coleta de 2 ml, 0,5 ml de tampão RPE foi adicionado e a mistura foi centrifugada por 15s a 10.000 rmp. 0,5 ml de tampão RPE foi adicionado e a mistura foi centrifugada a 14000 rmp durante 3 min. A coluna de adsorção foi transferida para um novo tubo de centrífuga de 1,5 ml e 30-50 μl de água livre de RNase foram adicionados gota a gota no meio de uma membrana de adsorção no ar. A mistura foi colocada à temperatura ambiente durante 2-5 min e centrifugada a 12.000 rpm durante 1 min. A solução de plasmídeo foi coletada no tubo de centrifugação e medida para r a concentração de RNA.
[068] 3) Região variável-VHH do anticorpo de cadeia pesada
[069] Síntese de uma primeira cadeia de cDNA: Um kit de síntese de cDNA (Kit de Extração de DNA Gel MiniBESTAgarose ver.4.0, Companhia TAKARA) foi usado seguindo as instruções. Com este modelo, dois conjuntos de iniciadores foram usados para realizar a amplificação por PCR do fragmento do gene VHH do anticorpo de cadeia pesada. Ao usar um método de PCR Aninhada, os fragmentos de mais de 800 pb na primeira amplificação por PCR são fragmentos de genes de cadeia pesada comuns e os fragmentos entre 800 pb e 500 pb são fragmentos de genes de anticorpos de cadeia pesada com deleção de cadeias leves (vide Fig. 1). Os fragmentos de genes de anticorpos de cadeia pesada com deleção de cadeia leve foram recuperados por corte em gel e usados como molde para obter o gene alvo VHH (～ 500 pb) por amplificação por PCR com iniciadores específicos de VHH (vide Fig. 2).
[070] Síntese de iniciadores:
[071] Iniciador PCRFd5' de primeira rodada:
[072] YF-1: CGC CAT CAA GGT ACC AGT TGA (SEQ ID NO: 199)
[073] YF-2: GGG GTA CCT GTC ATC CAC GGA CCA GCT GA (SEQ ID NO: 200)
[074] Iniciador de PCR Bd3' de primeira rodada:
[075] YBN: CAG CCG GCC ATG GCC SMK GTR CAG CTG GTG GAK TCT GGG GGA G (SEQ ID NO: 201)
[076] Iniciador de PCR de segunda rodada:
[077] YV-BACK: CAT GTG CATGGCCTA GAC TCG CGG CCCAGC CGG CCA TGG CC (SEQ ID NO: 202)
[078] YV-FOR: CAT GTG TAG ATT CCT GGC CGG CCT GGC CTG AGG AGA CGG TGA CCT GG (SEQ ID NO: 203)
[079] 4) Ligação de fragmento VHH e vetor de exibição de fago e transformação elétrica de células competentes TG1
[080] Após o fragmento VHH e o plasmídeo de vetor pHEN6 serem submetidos a digestão única com SfI, o fragmento VHH e o vetor pHEN6 (Conrath, KEM outro. Antimicrob Agents Chemother (Antimicrobial Chemotherapy) 2001,45: (10) 2807-12 , Patente chinesa ZL20111028003.1)) foram ligados por uma ligase e, em seguida, eletricamente transformados em células competentes TG1, que foram usadas para revestir uma placa, e detectadas por PCR de colônia para verificação da taxa de inserção do anticorpo. Detecção da eficiência de clonagem do gene recombinante: uma placa LB/Amp foi revestida com solução bacteriana eletricamente transformada, cultivada durante a noite a 32ºC e detectada por PCR de colônia para verificação da eficiência da ligação dos anticorpos no dia seguinte. A eficiência de ligação da biblioteca de fago-anticorpo foi superior a 90%. A placa LB/Amp foi revestida com a solução bacteriana eletricamente transformada e cultivada durante a noite a 32ºC. A cultura foi lavada com meio de cultura 2YT e glicerol a 15% foi adicionado. A mistura foi armazenada a -80 ºC.
[081] 5) Preparação da biblioteca de anticorpos de fago VHH
[082] O fago auxiliar M13K07 (Invitrogen) foi adicionado à biblioteca de anticorpos para resgate: a biblioteca de anticorpos de fago foi preparada de acordo com um método convencional e armazenada a -80ºC para uso subsequente.
[083] Exemplo 2: Preparação de anticorpo de domínio único de BCMA
[084] Rastreio de anticorpo de domínio único específico de BCMA
[085] Primeira rodada: concentração de proteína BCMA 150μg/ml, 150μl/poço, 1 micropore, incubar durante a noite a 4ºC.
[086] Segunda rodada: concentração de proteína BCMA 10-100μg/ml,
150μl/poço, 5 microporos, incubar durante a noite a 4ºC.
[087] Terceira rodada: concentração de proteína BCMA 10-50μg/ml, 150μl/poço, 5 microporos, incubar durante a noite a 4ºC.
[088] Bloqueio: 1% CPBS, 300μl/poço, 37ºC, incubar por 2 h. Quantidade total de Solução de No da Rodada biblioteca de Número de Titulação de eluição + Tris- de Rastreio. anticorpo de colônia única eluição HCl fago adicionada Primeira
5.6 x 1011 300 μl+200 μl 10 50/μl rodada Segunda 150 μl/poço x 5+ 1/4=600
2.4 x 104/μl rodada 5.25 x 1011 350 μl about 2400 Terceira 150 μl/poço x 5+ 1/4=750 3 x 104/μl rodada 5.32 x 1011 350 μl about 3000
[089] 2. Coleta de clones positivos via ELISA de fago
[090] Uma única colônia foi escolhida aleatoriamente a partir de uma placa de ágar rastreada para colônias cultivadas na terceira rodada, inoculadas e cultivadas em uma placa de cultura de 96 poços contendo um meio de cultura líquido Amp 2YT e sujeitas a superinfecção de fagos auxiliares para induzir a expressão do anticorpo de fago. O sobrenadante de expressão foi colhido e, em seguida, um ensaio ELISA foi realizado com BCMA como antígeno. Os poços positivos para BCMA foram selecionados e sujeitos a sequenciamento de DNA para identificar a sequência do gene dos clones de anticorpo de domínio único anti- BCMA. Uma série de sequências de genes de anticorpo de domínio único, incluindo aquelas no Anexo 3, foram obtidas e usadas para expressão adicional e rastreio dos anticorpos de domínio único com alta especificidade e alta atividade.
[091] Exemplo 3: Construção de plasmídeo de expressão de anticorpo de domínio único de BCMA específico
[092] O gene específico do anticorpo de domínio único de BCMA obtido no Exemplo 3 foi amplificado por PCR para obter produtos de PCR com sítios de enzimas de restrição BbsI e BamHI. Os produtos e vetores de PCR (vetor pSJF2) (kim ls. Biosic Biochem. 2002, 66 (5): 1148-51, Patente chinesa ZL 201110280031) foram tratados com as enzimas de restrição BbsI e BamHI respectivamente, e recombinados por ligação com ligase T4 para obter o plasmídeo sdAb-pSJF2 que pode ser eficientemente expresso em Escherichia coli, que foi submetida ao sequenciamento gênico para determinar a exatidão de sua sequência.
[093] 1) Condições de amplificação por PCR necessárias para a obtenção de genes alvo VHH e composições de sistema de PCR de 50μl:
[094] MIX 25μl
[095] Clone de colônia positiva 1μl
[096] 5’iniciador 1μl (lmol/1)
[097] 3’iniciador 1μl (lmol/1)
[098] ddH2O tratado com DEPC 22μl Volume total 50 μl Condições de Reação PCR: 94 ºC 3min 94 ºC 30s 55℃ 30s 30 rodadas 72 ºC 1min
[099] 5' iniciador - GAA GAAGAA GAC AA CAG GCC SVK GTG MAG CTG GWG GAK TCT (SEQ ID NO: 204)
[0100] 3’ iniciador ——gaagatctccggatccTGAGGAGACGGTGACCTGGGT (SEQ ID NO: 205)
[0101] 2) O gene alvo e o vetor foram digeridos, ligados e transformados em células TG1. Os produtos foram submetidos à PCR para identificação dos clones contendo o fragmento alvo, os quais foram submetidos ao sequenciamento gênico para obtenção do plasmídeo de expressão do anticorpo BCMA de domínio único com a sequência gênica correta.
[0102] Exemplo 4: Expressão e purificação de anticorpo de domínio único anti-BCMA
[0103] As cepas contendo o plasmídeo BCMAsdAb-pSJF2 no exemplo 3 foram inoculadas em uma placa de cultura LB contendo ampicilina a 37 ºC durante a noite. Uma única colônia foi colhida e inoculada em 15 ml de solução de meio LB contendo ampicilina, e foi cultivada em um agitador a 37 ºC durante a noite. 10 ml da cultura foram transferidos para 1 L de solução de cultura 2YT contendo ampicilina e cultivadas em agitador a 37 ºC a 240 rpm/min. Após o valor de OD atingir 0,4-0,6, 0,5-1,0 mM de IPTG foi adicionado e adicionalmente incubado durante a noite. A solução acima foi centrifugada para coleta de bactérias. As bactérias foram lisadas pela adição de lisozima e centrifugadas, e a proteína solúvel de anticorpo de domínio único no sobrenadante foi coletada. Uma proteína com pureza de mais de 95% foi obtida por cromatografia de afinidade com íons Ni+. A Fig. 3 mostra a proteína de anticorpo de domínio único anti-BCMA expressa e a Fig. 4 mostra os resultados da eletroforese SDS-PAGE de BCMA-sdAbs expresso purificado por uma coluna de níquel.
[0104] Exemplo 5: Teste de ensaio de afinidade de anticorpo de domínio único de BCMA
[0105] 1) Preparação da amostra
[0106] Antígeno: Bio-BCMA foi diluído para 10 μg/ml com 1X tampão dinâmico (1X PBS, contendo 0,05% de Tween 20, 0,1% de BSA, pH 7,2);
[0107] O anticorpo de domínio único foi gradualmente diluído em 400 nM, 200 nM, 100 nM, 50 nM, 25 nM, 12,5 nM e 6,25 nM com tampão cinético 1X;
[0108] 2) Teste de amostra
[0109] O antígeno a ser testado foi carregado por meio de um sensor SA. O antígeno foi diluído em 5 gradientes, e todos os anticorpos de domínio único de BCMA tinham uma afinidade de 50nm, 20nm, 10nm, 1nm, 0,1nm e 0,01nm.
[0110] Exemplo 6: Teste de ligação de anticorpo de domínio único de BCMA purificado e antígeno BCMA (ELISA)
[0111] O antígeno BCMA-FC foi diluído para 1 μg/ml com 0,05 M de NaHCO3 (pH 9,5). Uma placa de 96 poços foi revestida com 100μl de antígeno durante a noite a 4 ºC. A placa de 96 poços foi bloqueada com 300μl de BSA-PBS a 0,5% por 2 h a 37 ºC. Os anticorpos de domínio único de BCMA purificados com diferentes concentrações de diluição foram adicionados em 100μl/poço a 37 ºC por 1 h. A placa foi lavada três vezes com PBST a 0,05%. O anti-His-HRP de camundongo diluído em 1:5000 vez foi adicionado em 100 μl/poço a 37 ºC por 1 hora. A placa foi lavada três vezes com PBST a 0,05%. 100 μl de TMB foram adicionados e mantidos em local escuro à temperatura ambiente por 20 min. 100 μl de 1 mol/L de HCl foram adicionados para arrefecer a reação. O valor de DO da amostra a 450 nm foi medido por um leitor de microplaca. A Fig. 5 mostra o gradiente de concentração de ligação do anticorpo de domínio único de BCMA purificado à proteína BCMA (ELISA). Exceto que a capacidade de ligação dos dois anticorpos de B35 (13) e B92 (6-1) ao antígeno BCMA era relativamente baixa, a capacidade de ligação dos 11 anticorpos restantes ao antígeno BCMA era muito alta.
[0112] Exemplo 7: Teste de inibição competitiva de ligação de anticorpo de domínio único de BCMA em BAFF e BCMA
[0113] Como BCMA pode se ligar a BAFF, o anticorpo de domínio único de BCMA funcional deve ser capaz de competitivamente inibir a ligação de BAFF a BCMA. A proteína BAFF revestiu uma placa ELISA destacável de acordo com 1μg/ml, 100μl/poço e foi incubada durante a noite a 4ºC. BSA a 2% foi adicionado para bloqueio, 300μl/poço, incubado a 37 ºC por 2 horas. O anticorpo de domínio único de BCMA foi diluído para uma concentração final de 10μg/ml. 100 μl de anticorpo de domínio único de BCMA (10 μg/ml) foram adicionados, 2 μl de proteína BAFF (5 μg/ml) foram adicionados em cada poço para serem misturados uniformemente. IgG HRP de cabra anticoelho (1:5000) foi diluído, 100μl/poço, incubado por 1h a 37 ºC. Solução cromogênica TMB foi adicionada, 100μl/poço, e reagida no escuro por 10 min. A reação foi arrefecida pela adição de H2SO4 a 2M a 50μl/poço. O valor de DO foi medido a 450 nm. A Fig. 6 mostra que o anticorpo de domínio único de BCMA pode inibir competitivamente a ligação da proteína BAFF à proteína BCMA. Diferentes anticorpos de domínio único de BCMA podem inibir competitivamente a ligação de proteínas de BAFF à proteína BCMA, e a taxa de inibição variou de 34% a 92%.
[0114] Exemplo 8: O estudo sobre o anticorpo de domínio único de BCMA como anticorpo de reconhecimento direcionado ao antígeno BCMA específico na célula CART
[0115] 1) Construção do vetor
[0116] Um gene de anticorpo de domínio único de BCMA e um gene de estrutura CAR de segunda geração foram sintetizados. Os dois genes foram combinados por PCR de sobreposição para obter um gene BCMA CAR. Após a obtenção do gene sintético, foi realizada a clonagem molecular. Primeiro, os produtos de PCR de dois fragmentos de genes foram obtidos. Em seguida, a PCR sobreposta foi realizada para obter o gene BCMA CAR com a estrutura CAR de segunda geração na qual dois fragmentos estão ligados. Por meio da digestão enzimática do pré-vetor e do gene BCMA CAR, ligação, transformação, clonagem, atualização e sequenciamento de plasmídeos, o vetor lentiviral expresso por CAR de BCMA Pre-Lenti-EF1 BCMA com uma sequência correta foi obtido.
[0117] 2) Empacotamento de lentivírus
[0118] No dia anterior ao empacotamento do vírus, as células 293T foram digeridas por tripsina e espalhadas em placas de cultura de 150 cm. As células foram incubadas em caixa de cultura de CO2 a 5% por 8-24 h. Quando as células aderentes atingiram 80% da área total da placa de cultura, as células 293T foram transfectadas. Pré-Lenti-EF1 BCMA CAR: psPAX2: pMD2G = 4:3:1 foi cotransfectado com lipofectamina 2000. O sobrenadante do vírus foi recolhido após 48 horas e centrifugado a 4ºC a 1250 rpm durante 5 min para remover as células 293T mortas e detritos celulares. Em seguida, o sobrenadante do vírus foi filtrado, concentrado, subempacotado e armazenado em refrigerador a -80 ºC.
[0119] 3) Preparação de células CART
[0120] 10 ml de sangue fresco foram retirados de voluntários saudáveis. As células mononucleares do sangue periférico (PBMC) foram isoladas com solução de isolamento de linfócitos e, em seguida, as células T foram isoladas e purificadas por esferas magnéticas. 2 x 106 células T/poço foram semeadas em uma placa de 6 poços, cultivadas em um meio de cultura x-vivo 15 contendo IL-2 (1000 U/ml) e estimuladas com anti-CD3 por 24 h. Após 24 horas de estimulação, uma solução de vírus BCMA foi adicionada e infectada durante a noite. 2 ml de meio de cultura foram adicionados no segundo dia. Após 6-7 dias de infecção, a expressão do CAR foi avaliada por citometria de fluxo. A taxa positiva de expressão de anti-BCMA-CAR por células T transfectadas foi analisada usando BCMA biotinilado por meio de citometria de fluxo.
[0121] 4) Determinação da vitalidade mortal
[0122] Em um teste de morte celular, um kit de detecção de LDH (Promega) foi usado para detecção. Células CART/células T: células alvo foram definidas com quatro gradientes, que foram 0,5:1, 1:1, 2:1 e 4:1, respectivamente. As células Daudi 3 x 104/poço e os poços restantes foram suplementados a 200 μL com um meio de cultura contendo X-VIVO/meio de cultura 1640. A placa de 96 poços foi cultivada em uma incubadora de 5% de CO2 a 37 ºC. Após 17 h, 20 μl de lisado foram adicionados ao poço de liberação máxima, e as células foram uniformemente misturadas para se romperem completamente.
A placa de 96 poços foi incubada na incubadora de CO2 por 2 h.
Duas horas depois, o poço de liberação máxima foi observado.
Depois que as células alvo foram completamente lisadas, 50 μL de sobrenadante foram sugados de cada poço para a placa de 96 poços com fundo plano e, em seguida, 50 μL de solução de substrato foram adicionados a cada poço, o desenvolvimento foi realizado por 30 min no escuro.
Após 30 min, a mistura foi observada para a mudança de cor, onde as cores do poço MM.1S de liberação máxima e do poço da célula CART deveriam ser mais escuras.
Um leitor de microplacas foi usado para medição em um comprimento de onda de 490 nm.
Os resultados de morte foram observados na Fig. 7. Células T modificadas com receptor de antígeno quimérico de BCMA podem matar especificamente células positivas para BCMA com uma atividade de morte muito alta de mais de 20%, e não têm efeito de morte em células negativas para BCMA.
Claims (19)
1. Anticorpo de domínio único anti-BCMA, CARACTERIZADO pelo fato de que o referido anticorpo de domínio único é composto por regiões estruturais e regiões determinantes de complementaridade, as referidas regiões determinantes de complementaridade compreendem as sequências de aminoácidos de CDR1, CDR2 e CDR3 selecionadas a partir das SEQ ID NOs: 1 a 66.
2. Anticorpo de domínio único anti-BCMA, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que a referida sequência de aminoácidos da região determinante de complementaridade tem mais de 80%, mais de 85%, mais de 90%, mais de 95% ou mais de 99% de identidade para as sequências de aminoácidos de CDR1, CDR2 e CDR3 como apresentadas em qualquer uma das SEQ ID NOs: 1 a 66, preferivelmente, a diferença nos aminoácidos é a substituição conservativa.
3. Anticorpo de domínio único anti-BCMA, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o referido anticorpo de domínio único compreende as sequências de aminoácidos de CDR1, CDR2 e CDR3 selecionadas a partir das SEQ ID NOs: 67 a 132.
4. Anticorpo de domínio único anti-BCMA, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o referido anticorpo de domínio único tem uma sequência de aminoácidos selecionada a partir de qualquer uma das SEQ ID NOs: 67 a 132 ou é uma sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NOs: 67 a
132.
5. Anticorpo de domínio único anti-BCMA, de acordo com a reivindicação 4, CARACTERIZADO pelo fato de que a sequência de aminoácidos do anticorpo de domínio único tem mais de 80%, mais de 85%, mais de 90%, mais de 95% ou mais de 99% de identidade para a sequência de aminoácidos como apresentada em qualquer uma das SEQ ID NOs: 67 a 132, preferivelmente, a diferença nos aminoácidos é a substituição conservativa.
6. Grupo de genes de anticorpos de domínio único anti-BCMA, CARACTERIZADO pelo fato de que os referidos genes de anticorpo de domínio único no grupo possuem uma sequência de nucleotídeos selecionada a partir de qualquer uma das SEQ ID NOs: 133 a 198, ou sendo uma sequência de nucleotídeos de qualquer uma das SEQ ID NOs: 133 a 198, ou sendo uma sequência de nucleotídeos que codifica o anticorpo de domínio único, como definido na reivindicação 4 ou 5.
7. Grupo de genes de anticorpos de domínio único anti-BCMA, de acordo com a reivindicação 6, CARACTERIZADO pelo fato de que possui uma sequência de nucleotídeos com mais de 80%, mais de 85%, mais de 90%, mais de 95% ou mais de 99% de identidade para a sequência de nucleotídeos como apresentada em qualquer uma das SEQ ID NOs: 133 a 198, em que a diferença nas bases é preferivelmente uma substituição conservativa.
8. Polipeptídeo CARACTERIZADO pelo fato de que possui um ou múltiplos anticorpos de domínio único, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 5, em que os referidos múltiplos anticorpos de domínio único são preferivelmente iguais ou diferentes.
9. Vetor de expressão CARACTERIZADO pelo fato de que compreende um ou mais genes selecionados a partir do referido grupo de genes de anticorpos de domínio único, como definido na reivindicação 6 ou 7, em que o referido vetor de expressão é preferivelmente um vetor de expressão de células procarióticas, um vetor de expressão de células eucarióticas ou outros vetores de expressão de células, mais preferivelmente, um vetor lentiviral.
10. Célula hospedeira CARACTERIZADA pelo fato de que compreende o referido vetor de expressão, como definido na reivindicação 9, em que a referida célula hospedeira é preferivelmente uma célula de expressão procariótica, uma célula de expressão eucariótica, uma célula de fungo ou uma célula de levedura, e a referida célula de expressão procariótica é preferivelmente Escherichia coli.
11. Receptor de antígeno quimérico CARACTERIZADO pelo fato de que possui um ou múltiplos anticorpos de domínio único, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 5, em que os ditos múltiplos anticorpos de domínio único são preferivelmente iguais ou diferentes.
12. Célula T modificada por um receptor de antígeno quimérico, CARACTERIZADA pelo fato de que é modificada pelo referido receptor de antígeno quimérico, como definido na reivindicação 11.
13. Composição farmacêutica CARACTERIZADA pelo fato de que compreende um ou mais anticorpos de domínio único, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 5, como ingredientes ativos.
14. Anticorpo humanizado de domínio único anti-BCMA, CARACTERIZADO pelo fato de que é obtido pela humanização do anticorpo de domínio único, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 5.
15. Uso do referido anticorpo de domínio único, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 5, CARACTERIZADO pelo fato de que é na detecção de BCMA.
16. Uso do referido anticorpo de domínio único, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 5, CARACTERIZADO pelo fato de que é para bloquear uma interação entre BAFF e BCMA.
17. Uso, de acordo com a reivindicação 16, CARACTERIZADO pelo fato de que o referido anticorpo de domínio único está ligado a um ou mais de um agente de citotoxicidade, uma fase de enzima, um radioisótopo, um composto fluorescente ou um composto quimioluminescente.
18. Uso do referido anticorpo de domínio único, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 5, CARACTERIZADO pelo fato de que é na preparação de um medicamento para prevenir ou tratar uma doença associada com a expressão anormal de BCMA.
19. Uso, de acordo com a reivindicação 18, CARACTERIZADO pelo fato de que a referida doença associada com a expressão anormal de BCMA é uma doença de mieloma múltiplo.
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