CN114907486A

CN114907486A - Egfr靶向性嵌合抗原受体及其制备方法及应用

Info

Publication number: CN114907486A
Application number: CN202110178997.XA
Authority: CN
Inventors: 戴朝辉; 吴海祥; 吕丹丹; 陈月华; J·韩; 杨达志; 陈颖; 陈嬿; 王威; 王贵兰; 张迎佳; 汤炜; 韩烨; 陈泓君
Original assignee: Shanghai Huaiyue Biotechnology Co ltd
Current assignee: Shanghai Huaiyue Biotechnology Co ltd
Priority date: 2021-02-09
Filing date: 2021-02-09
Publication date: 2022-08-16

Abstract

本发明提供一种EGFR靶向性嵌合抗原受体及其制备方法及应用。具体地，本发明提供的EGFR CAR‑NK细胞通过将EGFR抗体用于CAR‑NK细胞的构建，其以EGFR分子为靶抗原，利用EGFR CAR‑NK细胞特异性地杀伤肿瘤细胞。其可作为肿瘤类疾病的治疗药物，用于EGFR分子高表达的肿瘤的治疗，且无细胞因子风暴等不良现象，为对传统手术、化疗和放疗无效的肿瘤提供了新的治疗方法；且同时识别wtEGFR与EGFRvIII，针对GBM的治疗会更具有治疗前景。

Description

EGFR靶向性嵌合抗原受体及其制备方法及应用

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及一种EGFR靶向性的嵌合抗原受体、CAR-NK细胞及其制备方法及应用。

背景技术

脑胶质母细胞瘤(Glioblastoma multiforme，GBM)是颅内常见的恶性肿瘤，也是最难治疗的肿瘤。患者的五年生存率小于10％。手术切除是治疗胶质母细胞瘤的首选方案。但由于胶质母细胞瘤呈侵润性生长，手术后仍然有少量残余。手术后，须给予放疗和化疗。经过治疗，患者的平均生存期为15个月左右，而不经过治疗的患者的平均生存期只有4.5个月。

目前，嵌合抗原受体(Chimeric antigen receptor，CAR)T细胞在治疗耐药、复发、难治的B细胞肿瘤，如白血病和淋巴瘤，取得了突破性进展，但CAR T疗法在实体瘤中的治疗效果并不像治疗血液肿瘤那样显著。利用较成熟的CAR技术修饰其他效应细胞来治疗，同样是具有基础研究和临床意义。自然杀伤细胞(Natural killer cell，NK细胞)被认为更有潜力用CAR模式构建来治疗恶性肿瘤，相较于CAR T疗法，自然杀伤细胞(NK细胞)作为天然免疫系统中重要的效应淋巴细胞，是人体内抵挡病原入侵和恶性肿瘤第一道防线的重要组成之一，其可以自发的方式杀死靶细胞。NK细胞是抗原非特异性的，无主要组织相容性复合体(MHC)限制；异体NK细胞移植不会引起抗宿主反应；NK细胞的来源广泛：NK-92细胞系、外周血(PB)、脐带血(UCB)、诱导多能肝细胞(iPCS)。CAR-NK细胞的嵌合抗原受体一般由胞外抗原结合结构域、跨膜区域、胞内信号激活结构域组成。通过改变CAR-NK细胞胞外抗原结合结构域中单链可变区(Single-Chain Fragment Variable，scFv)序列，可以使其靶向不同抗原杀伤肿瘤细胞。

表皮生长因子受体(Epidermal Growth Factor Receptor，EGFR)是酪氨酸激酶亚家族的成员，通过与其配体结合可诱导EGFR同二聚化或异二聚化，促使其酪氨酸激酶结构域自磷酸化，进一步激活下游信号通路(如：PI3K/AKT信号通路，Ras/Raf/MEK/ERK信号通路)，行使其生物学功能。很多肿瘤中过度表达EGFR，包括膀胱癌、脑癌、头颈癌、胰腺癌、肺癌、乳腺癌、卵巢癌、结肠癌、前列腺癌和肾癌等，EGFR也表达于正常组织中，皮肤、肝脏和胃肠道的上皮组织中表达量较高，但表达水平远低于肿瘤组织；大概有30％的胶质母细胞瘤携带表皮生长因子受体突变(Epidermal growth factor receptor variant III，EGFRvIII)，这个突变不仅有非常好的免疫原性，易于激活免疫反应，而且正常的细胞和组织都不表达这个蛋白。

EGFRvIII是由野生型EGFR(Wildtype EGF，EGFR或wtEGFR)基因突变而产生的肿瘤特异性的突变，属于肿瘤新生抗原(neo-antigen)，正常的细胞不表达EGFRvIII，所以，针对EGFRvIII的CAR NK细胞只特异性杀伤表达突变基因的肿瘤细胞，而对正常的细胞没有任何毒性。因此，EGFRvIII是非常理想的CAR NK细胞治疗的靶点。据报道，50％的GBM过表达wtEGFR，少数GBM同时表达wtEGFR和EGFRvIII。单独靶向EGFRvIII，对于表达EGFRvIII和wtEGFR的GBM可能疗效不佳，构建同时识别wtEGFR和EGFRvIII的CAR NK针对GBM的治疗会更具有治疗前景，本领域需要开发新的针对GBM的治疗方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种EGFR靶向性的嵌合抗原受体、CAR-NK细胞及其制备方法及应用。

为了实现上述目的，本发明通过以下技术方案实现。

在本发明的第一方面，提供了一种嵌合抗原受体(CAR)构建物，所述嵌合抗原受体的抗原结合结构域包含重链可变区和轻链可变区，

其中，所述的重链可变区包括以下互补决定区CDR：

SEQ ID NO:6所示的CDR1，

SEQ ID NO:7所示的CDR2，和

SEQ ID NO:8所示的CDR3；

且所述的轻链可变区包括以下互补决定区CDR：

SEQ ID NO:9所示的CDR1’，

SEQ ID NO:10所示的CDR2’，和

SEQ ID NO:11所示的CDR3’。

在另一优选例中，所述的抗原结合结构域包括SEQ ID NO:3所示的抗体重链可变区，和SEQ ID NO:4所示的抗体轻链可变区。

在另一优选例中，所述抗体重链可变区和抗体轻链可变区通过连接肽相连。

在另一优选例中，所述的抗原结合结构域的结构如下式I或II所示：

V_L-V_H (I)；V_H-V_L (II)

其中，V_H为抗体重链可变区；V_L为抗体轻链可变区；“-”为连接肽或肽键。

在另一优选例中，所述的抗原结合结构域的结构如式I所示。

在另一优选例中，所述V_H的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示，V_L的氨基酸序列如SEQID NO:4所示。

在另一优选例中，所述连接肽为1-4个连续的SEQ ID NO:5(GGGGS)所示的序列，较佳地2-4个，更佳地为3个。

在另一优选例中，所述抗原结合结构域结合于EGFR，较佳地，结合于野生型EGFR和EGFRvIII。

在另一优选例中，所述的EGFR为人EGFR。

在另一优选例中，所述抗原结合结构域的重链可变区和轻链可变区来源于人源化抗体。

在另一优选例中，所述嵌合抗原受体的结构如下式III所示：

L-scFv-H-TM-C-CD3ζ (III)

其中，

L为无或信号肽序列；

scFv为靶向EGFR的scFv；

H为绞链区；

TM为跨膜结构域；

C为共刺激信号分子；

CD3ζ为源于CD3ζ的胞浆信号传导序列。

在另一优选例中，所述的靶向EGFR的scFv包括SEQ ID NO:3示的抗体重链可变区，和SEQ ID NO:4示的抗体轻链可变区。

在另一优选例中，所述的靶向EGFR的scFv结构如式I所示。

在另一优选例中，所述的L为选自下组的蛋白的信号肽：CD8、CD28、GM-CSF、CD4、CD137、或其组合。

在另一优选例中，所述的L为CD8来源的信号肽。

在另一优选例中，L的氨基酸序列如SEQ ID NO:1的第1-21位所示。

在另一优选例中，所述的H为选自下组的蛋白的铰链区：CD8、CD28、CD137、或其组合。

在另一优选例中，所述的H为CD8α来源的铰链区。

在另一优选例中，H的氨基酸序列如SEQ ID NO:1的第277-322位所示。

在另一优选例中，所述的TM为选自下组的蛋白的跨膜区：ICOS、CD28、CD3epsilon、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、GD2、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154、或其组合。

在另一优选例中，所述的TM为CD8来源的跨膜区。

在另一优选例中，TM的序列如SEQ ID NO:1的第323-345位所示。

在另一优选例中，所述的C为选自下组的蛋白的共刺激信号分子：ICOS、OX40、CD2、CD7、CD27、CD28、CD30、CD40、CD70、CD134、4-1BB(CD137)、PD1、Dap10、CDS、ICAM-1、LFA-1(CD11a/CD18)、ICOS(CD278)、NKG2D、GITR、TLR2、或其组合。

在另一优选例中，所述的C为4-1BB或CD28来源的共刺激信号分子，优选为4-1BB来源的共刺激信号分子。

在另一优选例中，C的氨基酸序列如SEQ ID NO:1的第346-387位所示。

在另一优选例中，CD3ζ的氨基酸序列如SEQ ID NO:1的第388-499位所示。

在另一优选例中，所述嵌合抗原受体的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

在本发明的第二方面，提供了一种核酸分子，所述核酸分子编码本发明第一方面所述的嵌合抗原受体(CAR)构建物。

在另一优选例中，所述核酸分子为分离的。

在另一优选例中，所述核酸分子如SEQ ID NO:2所示。

在本发明的另一方面，提供了一种编码嵌合抗原受体的核苷酸序列，所述嵌合抗原受体主要部分组成包括抗原结合结构域、跨膜结构域和共刺激信号传导区。将EGFR特异性抗体scFv编码基因连接到经改造的含有跨膜结构基因与共刺激信号基因的CAR骨架的克隆位点区中获得CAR基因。所述的抗原结合结构域能够特异性结合肿瘤特异性抗原EGFR，并通过跨膜结构域和共刺激信号传导区激活该NK细胞。

在另一优选例中，所述的抗原结合结构域为特异性结合EGFR的抗体或其抗原结合片段，所述抗原结合片段为Fab或scFv。

在另一优选例中，所述的跨膜结构域选自：CD28、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD134、CD137、ICOS和CD154中的一种或多种的跨膜结构域；优选地，所述的跨膜结构域为CD8跨膜结构域。

在另一优选例中，所述的共刺激信号传导区包含共刺激分子的细胞内结构域，所述的共刺激分子选自：CD3ζ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b、CD66d、CD2、CD4、CD5、CD28、CD134、CD137、ICOS、CD154、4-1BB和OX40中的一种或多种；优选地，所述的共刺激信号传导区包含4-1BB和CD3ζ胞内结构域。

在另一优选例中，EGFR CAR-NK细胞能够表达scFv-CD8αhinge-CD8-4-1BB-CD3ζ融合蛋白，该融合蛋白能够特异性识别肿瘤特异性的EGFR。

在本发明的一个具体实施方式中，所述scFv-CD8αhinge-CD8-4-1BB-CD3ζ融合蛋白的氨基酸的序列如SEQ ID NO：1所示或其同源序列等。

在本发明的一个具体实施方式中，所述scFv-CD8αhinge-CD8-4-1BB-CD3ζ融合蛋白的核苷酸的序列如SEQ ID NO：2所示或其简并序列等。

在本发明的第三方面，提供了一种载体，所述的载体含有本发明第二方面所述的核酸分子。

在另一优选例中，所述的载体选自下组：DNA、RNA、质粒、慢病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体(AAV)、逆转录病毒载体、转座子、或其组合。

在另一优选例中，所述的载体选自下组：质粒、病毒载体。

在另一优选例中，所述载体为病毒颗粒的形式。

在另一优选例中，所述载体为慢病毒载体。

在本发明的第四方面，提供了一种宿主细胞，所述的宿主细胞中含有本发明第三方面所述的载体或染色体中整合有外源的本发明第二方面所述的核酸分子或表达本发明第一方面所述的CAR构建物。

在另一优选例中，所述的宿主细胞包括真核细胞和原核细胞。

在另一优选例中，所述的宿主细胞包括大肠杆菌。

在本发明的第五方面，提供了一种工程化的免疫细胞，所述的免疫细胞表达有本发明第一方面所述的CAR构建物。

在另一优选例中，所述细胞为分离的细胞，和/或所述细胞为基因工程化的细胞。

在另一优选例中，所述的免疫细胞来自人或非人哺乳动物(如鼠)。

在另一优选例中，所述细胞包括T细胞、NK细胞。

在另一优选例中，所述细胞为CAR-T细胞或CAR-NK细胞，较佳地为CAR-NK细胞。

本发明的又一方面提供一种EGFR CAR-NK细胞，所述EGFR CAR-NK细胞能够表达嵌合抗原受休，其中，所述嵌合抗原受体包含抗原结合结构域、跨膜结构域和共剌激信号传导区，所述的抗原结合结构域能够特异性结合肿瘤特异性抗原EGFR，并通过跨膜结构域和共剌激信号传导区激活该NK细胞。

在本发明的一个具体实施方式中，所述EGFR CAR-NK细胞能够有效地杀伤和/或杀死胶质母细胞瘤细胞等。

在另一优选例中，所述脑胶质母细胞瘤细胞系为表达wtEGFR的U87-MG或过表达EGFRvIII的U87-MG。

在本发明的第六方面，提供了一种制剂，所述制剂含有本发明第一方面所述的CAR构建物、本发明第二方面所述的核酸分子、本发明第三方面所述的载体、或本发明第五方面所述的免疫细胞，以及药学上可接受的载体。

在另一优选例中，所述制剂为液态制剂。

在另一优选例中，所述制剂的剂型为注射剂。

在另一优选例中，所述制剂中所述CAR-NK细胞的浓度为1×10³-1×10⁸个细胞/ml，较佳地1×10⁴-1×10⁷个细胞/ml。

在另一优选例中，所述制剂可包括缓冲液诸如中性缓冲盐水、硫酸盐缓冲盐水等等；碳水化合物诸如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖、甘露醇；蛋白质；多肽或氨基酸诸如甘氨酸；抗氧化剂；螯合剂诸如EDTA或谷胱甘肽；佐剂(例如，氢氧化铝)；和防腐剂。本发明的制剂优选配制用于静脉内施用。

在另一优选例中，所述的制剂还包含抗肿瘤的第二活性成分，较佳地包括第二抗体、或化疗剂。

在另一优选例中，所述的化疗剂选自下组：多西他赛、卡铂、或其组合。

在另一优选例中，所述制剂为药物组合物。

在另一优选例中，所述药物组合物中EGFR CAR-NK细胞与肿瘤细胞的效靶比为(0.5-1)：2；优选地，所述效靶比为(0.5-1)：1。

在另一优选例中，所述的药学上可接受的载体优选为药学上可接受的注射剂载体，例如等渗的无菌盐溶液(磷酸二氢纳，磷酸氢二纳，氯化钠，氯化钾，氯化钙，氯化镁等，或上述盐的混合物)，或干燥的例如冷冻干燥的组合物，其适当的通过加入无菌水或生理盐水形成可注射溶质等。

在本发明的第七方面，提供了一种本发明第一方面所述的CAR构建物、本发明第二方面所述的核酸分子、本发明第三方面所述的载体、或本发明第五方面所述的免疫细胞、或本发明第六方面所述的制剂的用途，用于制备预防和/或治疗癌症或肿瘤的药物或制剂。

在另一优选例中，所述肿瘤选自下组：血液肿瘤、实体瘤、或其组合。

在另一优选例中，所述血液肿瘤选自下组：急性髓细胞白血病(AML)、多发性骨髓瘤(MM)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、急性淋巴白血病(ALL)、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、或其组合。

在另一优选例中，所述实体瘤选自下组：膀胱癌、脑癌、头颈癌、胰腺癌、肺癌、乳腺癌、卵巢癌、结肠癌、前列腺癌、肾癌、胃癌、胃癌腹膜转移、肝癌、小肠癌、骨癌、直肠癌、大肠癌、宫颈癌、淋巴癌、鼻咽癌、肾上腺肿瘤、脑胶质瘤、子宫内膜癌、或其组合。

在另一优选例中，所述的肿瘤为EGFR阳性肿瘤。

在另一优选例中，所述的肿瘤为脑胶质母细胞瘤。

在另一优选例中，所述的脑胶质母细胞瘤为wtEGFR阳性的脑胶质母细胞瘤或EGFRvIII阳性的脑胶质母细胞瘤。

在本发明的第八方面，提供了一种用于制备本发明第四方面所述的宿主细胞的试剂盒，所述试剂盒含有容器，以及位于容器内的本发明第二方面所述的核酸分子、或本发明第三方面所述的载体。

在本发明的第九方面，提供了一种制备工程化的免疫细胞的方法，所述的免疫细胞表达本发明第一方面所述的CAR构建物，所述方法包括以下步骤：

(a)提供待改造的免疫细胞；和

(b)将本发明第二方面所述的核酸分子或本发明第三方面所述的载体转导入所述免疫细胞内，从而获得所述工程化的免疫细胞。

在另一优选例中，所述工程化的免疫细胞为CAR-T细胞或CAR-NK细胞。

在另一优选例中，所述的方法还包括对获得的工程化免疫细胞进行功能和有效性检测的步骤。

本发明另一方面提供本发明EGFR CAR-NK细胞的制备方法，其包括如下步骤：

(1)合成和扩增上述核苷酸序列，将所述核苷酸序列克隆到慢病毒表达载体上；优选地，所述核苷酸序列为scFv-CD8αhinge-CD8-4-1BB-CD3ζ融合蛋白基因；

(2)利用慢病毒包装质粒和步骤(1)得到的慢病毒表达载体质粒感染293T细胞，包装和制备慢病毒；

(3)利用步骤(2)得到的慢病毒感染NK-92细胞，得到EGFR CAR-NK细胞。

在本发明的第十方面，提供了一种治疗疾病的方法，包括给需要治疗的对象施用适量的本发明第三方面所述的载体、本发明第五方面所述的免疫细胞、或本发明第六方面所述的制剂。

在另一优选例中，所述疾病为癌症或肿瘤。

在另一优选例中，所述EGFR CAR-NK细胞的摄入量为(0.5-5)×10⁹细胞/次。

在另一优选例中，所述含有EGFR CAR-NK细胞的药物的摄入方法为瘤内注射、静脉注射、胸腔内注射或局部介入。

在本发明的一个具体实施方式中，所述含有EGFR CAR-NK细胞的药物的摄入方法为瘤内注射。

在另一优选例中，所述癌症为高表达EGFR的肿瘤及相关疾病。

在另一优选例中，所述癌症为膀胱癌、脑癌、头颈癌、胰腺癌、肺癌、乳腺癌、卵巢癌、结肠癌、前列腺癌和肾癌；优选地，所述癌症为脑胶质母细胞瘤。

本发明提供的EGFR CAR-NK细胞至少具有如下优势之一：通过将EGFR抗体用于CAR-NK细胞的构建，其以EGFR分子为靶抗原，利用EGFR CAR-NK细胞特异性地杀伤肿瘤细胞；其可作为肿瘤类疾病的治疗药物，用于EGFR分子高表达的肿瘤的治疗，且无细胞因子风暴等不良现象，为对传统手术、化疗和放疗无效的肿瘤提供了新的治疗方法；并且通过对NK92细胞进行改造，表达CAR后，又大大增加了它的靶向性，并增加抗肿瘤靶点EGFR，在提高靶向性的同时，大大地提高其抗肿瘤性能；此外，该EGFR CAR-NK细胞能同时识别wtEGFR与EGFRvIII，可以更有效的杀伤具有EGFRvIII突变表达的肿瘤；也就是说本发明构建的EGFRCAR-NK细胞，通过对NK92细胞进行改造，装上CAR后不但增加了其靶向性，而且由于使用的是NK细胞，不需要自身白细胞抗原与肿瘤匹配，所以不会产生移植物抗宿主反应。并且，CAR-NK疗法不会引发细胞因子风暴，这使得CAR-NK技术比CAR-T技术更安全。而且，CAR-NK细胞来源广泛，如外周血单个核细胞、诱导多能干细胞、脐带血、人类胚胎干细胞和NK-92细胞系。这些都大大提高了其安全性，毒副作用小，成本低，并且由于NK细胞、CAR和抗EGFR靶点的共同作用，其对同时表达wtEGFR与EGFRvIII的脑胶质母细胞瘤的杀伤效果好。

上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以一些实施例来详细说明。本发明的具体实施方式由以下实施例详细给出。

附图说明

图1a-1c所示为本发明实施例1提供的检测EGFR scFv抗体片段与EGFR在蛋白和细胞水平上的结合能力的结果图。

图2所示为本发明实施例2提供的慢病毒质粒载体pCP-scFv(anti EGFR)的结构模式图。

图3所示为本发明实施例2提供的EGFR-CAR质粒结构图。

图4a-4b所示为本发明实施例4提供的EGFR CAR-NK流式检测CAR细胞阳性率的结果图。

图5a-5b所示为本发明实施例4提供的EGFR CAR-NK流式检测CD56分子表达的结果图。

图6a所示为本发明实施例5提供的EGFR CAR-NK92细胞杀伤U87-MG EGFRvIII细胞的实验结果图。

图6b所示为本发明实施例5提供的EGFR CAR-NK92细胞杀伤U87-MG细胞的实验结果图。

图7a-7b所示为本发明实施例6提供的EGFR CAR-NK92细胞被γ射线辐照后2小时与24小时杀伤U87-MG EGFRvIII细胞的实验结果图。

图8a-8b所示为本发明实施例6提供的EGFR CAR-NK92细胞被γ射线辐照后的生长活率图。

图9a-9c所示为本发明实施例6提供的EGFR CAR-NK92细胞抑制小鼠脑原位异种移植模型的肿瘤生长实验结果图。

图10所示为本发明实施例6提供的EGFR CAR-NK92细胞延长小鼠脑原位异种移植模型的生存率实验结果图。

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入地研究，首次意外地发现一种靶向识别EGFR的嵌合抗原受体、其编码核苷酸，以及表达该CAR的EGFR CAR-NK细胞及其制备方法及应用。本发明的CAR-NK细胞对EGFR具有特异性，且能够同时识别wtEGFR与EGFRvIII，对EGFRvIII具有更强的亲和力，能够特异性识别和杀伤肿瘤，具有更高效的肿瘤杀伤活性，并且性状稳定，可大批量生产和制备。

除非另有定义，本发明中使用的所有技术和科学术语具有与本发明所述技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

具体而言，本发明所述的编码scFv-CD8αhinge-CD8-4-1BB-CD3ζ融合蛋白的核苷酸的序列是任何能够编码该融合蛋白的任何DNA序列，优选地，该序列为SEQ ID NO:2或其互补序列。另一方面，本发明所述的编码scFv-CD8αhinge-CD8-4-1BB-CD3ζ融合蛋白的核苷酸的序列可为在严紧条件下与由SEQ ID NO:2的核苷酸序列进行杂交、且编码该融合蛋白的多核苷酸或其互补序列。

本文所述的“严紧条件”，可以为低严紧条件、中严紧条件、高严紧条件中的任一种，优选为高严紧条件。示例性地，“低严紧条件”可为300℃、5×SSC、5×Denhardt液、0.5％SDS、52％甲酰胺的条件；“中严紧条件”可为40℃、5×SSC、5×Denhardt液、0.5％SDS、52％甲酰胺的条件；“高严紧条件”可为50℃、5×SSC、5×Denhardt液、0.5％SDS、52％甲酰胺的条件。本领域技术人员应当理解温度越高越能得到高同源性的多核苷酸。另外，本领域技术人员可以选择影响杂交的严紧度的温度、探针浓度、探针长度、离子强度、时间、盐浓度等多个因素形成的综合结果来实现相应的严紧度。

除此之外可杂交的多核苷酸还可以为，通过FASTA、BLAST等同源性检索软件用系统设定的默认参数进行计算时，与编码序列号6的多核苷酸具有约60％或以上、约70％或以上、71％或以上、72％或以上、73％或以上、74％或以上、75％或以上、76％或以上、77％或以上、78％或以上、79％或以上、80％或以上、81％或以上、82％或以上、83％或以上、84％或以上、85％或以上、86％或以上、87％或以上、88％或以上、89％或以上、90％或以上、91％或以上、92％或以上、93％或以上、94％或以上、95％或以上、96％或以上、97％或以上、98％或以上、99％或以上、99.1％或以上、99.2％或以上、99.3％或以上、99.4％或以上、99.5％或以上、99.6％或以上、99.7％或以上、99.8％或以上、或99.9％或以上同一性的多核苷酸。

核苷酸序列的同一性，可以使用Karlin及Altschul的算法规则BLAST(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:2264-2268,1990；Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:5873,1993)来确定。基于BLAST算法规则的程序BLASTN、BLASTX已被开发(Altschul SF,et al:JMol Biol 215:403,1990)。使用BLASTN分析碱基序列时，如使参数为score＝100、wordlength＝12；此外，使用BLASTX分析氨基酸序列时，如使参数为score＝50、wordlength＝3；使用BLAST和Gapped BLAST程序时，采用各程序的系统可设定默认参数值。

嵌合抗原受体(CAR)

CARs的设计经历了以下过程：第一代CAR只有一个胞内信号组份CD3ζ或者FcγRI分子，由于胞内只有一个活化结构域，因此它只能引起短暂的T细胞增殖和较少的细胞因子分泌，而并不能提供长时间的T细胞增殖信号和持续的体内抗肿瘤效应，所以并没有取得很好地临床疗效。第二代CARs在原有结构基础上引入一个共刺激分子，如CD28、4-1BB、OX40、ICOS，与一代CARs相比功能有很大提高，进一步加强CAR-T细胞的持续性和对肿瘤细胞的杀伤能力。在二代CARs基础上串联一些新的免疫共刺激分子如CD27、CD134，发展成为三代和四代CARs。

本发明的嵌合抗原受体(CAR)为二代CAR，包括细胞外结构域、跨膜结构域、和细胞内结构域。胞外结构域包括靶-特异性结合元件(也称为抗原结合结构域)。细胞内结构域包括共刺激信号传导区和ζ链部分。共刺激信号传导区指包括共刺激分子的细胞内结构域的一部分。共刺激分子为淋巴细胞对抗原的有效应答所需要的细胞表面分子，而不是抗原受体或它们的配体。

在CAR的胞外结构域和跨膜结构域之间，或在CAR的胞浆结构域和跨膜结构域之间，可并入接头。如本文所用的，术语“接头”通常指起到将跨膜结构域连接至多肽链的胞外结构域或胞浆结构域作用的任何寡肽或多肽。接头可包括0-300个氨基酸，优选地2至100个氨基酸和最优选地3至50个氨基酸。

在本发明的一个较佳的实施方式中，本发明提供的CAR的胞外结构域包括靶向EGFR的抗原结合结构域。本发明的CAR当在NK细胞中表达时，能够基于抗原结合特异性进行抗原识别。当其结合其关联抗原时，影响肿瘤细胞，导致肿瘤细胞不生长、被促使死亡或以其他方式被影响，并导致患者的肿瘤负荷缩小或消除。抗原结合结构域优选与来自共刺激分子和ζ链中的一个或多个的细胞内结构域融合。

如本文所用，“抗原结合结构域”“单链抗体片段”均指具有抗原结合活性的Fab片段，Fab’片段，F(ab’)₂片段，或单一Fv片段。Fv抗体含有抗体重链可变区、轻链可变区，但没有恒定区，并具有全部抗原结合位点的最小抗体片段。一般的，Fv抗体还包含VH和VL结构域之间的多肽接头，且能够形成抗原结合所需的结构。抗原结合结构域通常是scFv(single-chain variable fragment)。scFv的大小一般是一个完整抗体的1/6。单链抗体优选是由一条核苷酸链编码的一条氨基酸链序列。作为本发明的优选方式，所述scFv包含特异性识别EGFR的抗体，较佳地为人源化的单链抗体。

对于绞链区和跨膜区(跨膜结构域)，CAR可被设计以包括融合至CAR的胞外结构域的跨膜结构域。在一个实施方式中，使用天然与CAR中的结构域之一相关联的跨膜结构域。在一些例子中，可选择跨膜结构域，或通过氨基酸置换进行修饰，以避免将这样的结构域结合至相同或不同的表面膜蛋白的跨膜结构域，从而最小化与受体复合物的其他成员的相互作用。

本发明中，术语“抗体”指的是与抗原特异性结合的免疫球蛋白分子。抗体可为源于自然源或源于重组源的完整的免疫球蛋白，并可为完整免疫球蛋白的免疫反应部分。抗体通常为免疫球蛋白分子的四聚物。本发明中的抗体可以以多种形式存在，包括例如，多克隆抗体、单克隆抗体、Fv、Fab和F(ab)2，以及单链抗体和人源化抗体等(Harlow等，1999,In:Using Antibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,NY；Harlow等，1989,In:Antibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor,New York；Houston等，1988,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879-5883；Bird等，1988,Science 242:423-426)。

术语“抗体片段”指的是完整抗体的一部分，并指的是完整抗体的抗原决定可变区。抗体片段的例子包括但不限于Fab、Fab'、F(ab')2和Fv片段，由抗体片段形成的线性抗体、scFv抗体和多特异性抗体。

除非另有规定，“编码核苷酸”包括为彼此简并版本并编码相同的氨基酸序列的所有核苷酸序列。编码蛋白质的核苷酸序列可包括内含子。

术语“慢病毒”指的是逆转录病毒科的属，其能够有效感染非周期性和有丝分裂后的细胞；它们可传递显著量的遗传信息进入宿主细胞的DNA，以便它们是基因传递载体的最有效的方法之一。

术语“启动子”被定义为开始多核苷酸序列的特异性转录需要的，由细胞的合成机器识别或引导合成机器的DNA序列。

术语“特异性结合”指识别特异性抗原但基本上不识别或结合样本中的其他分子。

术语“载体”为物质组合物，其包括分离的核酸，并且其可用于传递分离的核酸至细胞内部。很多载体在本领域中是已知的，包括但不限于线性多核苷酸、与离子或两性分子化合物相关的多核苷酸、质粒和病毒。因此，术语“载体”包括自主复制的质粒或病毒。该术语也应被解释为包括便于将核酸转移入细胞的非质粒和非病毒化合物，诸如例如聚赖氨酸化合物、脂质体等等。病毒载体的例子包括但不限于，腺病毒载体、腺伴随病毒载体、逆转录病毒载体等等。

术语“癌症”被定义为以畸变细胞的快速和失控生长为特征的疾病。癌症细胞可局部蔓延或通过血流和淋巴系统蔓延至身体的其他部分。各种癌症的例子包括但不限于乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、子宫颈癌、皮肤癌、胰腺癌、结肠直肠癌、肾癌、肝癌、脑癌、淋巴瘤、白血病、肺癌等等。

如本文所使用的，“包含”与“包括”、“含有”或“特征在于”同义，并且是包括在内的或开放性的，并且不排除另外的未陈述的元件或方法步骤。术语“包含”在本文中的任何表述，特别是在描述本发明的方法、用途或产品时，应理解为包括基本上由所述组分或元件或步骤组成和由所述组分或元件或步骤组成的那些产品、方法和用途。本文示例性描述的本发明适当地可以在不存在本文未具体公开的任何一种或多种元件、一种或多种限制的情况下进行实践。

本文已采用的术语和表述用作描述性而不是限制性术语，并且在此种术语和表述的使用中不预期排除所示和所述特征或其部分的任何等价物，但应认识到各种修饰在请求保护的本发明的范围内是可能的。因此，应当理解尽管本发明已通过优选实施方案和任选特征具体公开，但本领域技术人员可以采用本文公开的概念的修饰和变化，并且此类修饰和变化被视为在如由附加权利要求定义的本发明的范围内。

本文中出现的英文名称不区分大小写，如EGFRVIII、EGFRvIII等表示的含义相同；scFv、ScFv、SCFV等表示的含义相同；EGFR CAR-NK与Anti EGFR-CAR NK表示相同的含义，均表示抗EGFR分子的CAR-NK细胞；U87MG、U87-MG均表示U87-MG细胞；NK-92、NK92均表示NK92细胞；CAR-NK、CAR NK均表示CAR NK细胞。

本发明所述的“NK”为人体正常NK细胞或NKT细胞或NK细胞系，其包括NK-92细胞，YT细胞，NKL细胞，HANK-1细胞，NK-YS细胞，KHYG-1细胞，SNK-6细胞和IMC-1细胞等。本发明的具体实施例中以NK-92细胞为例进行说明。

载体

编码期望分子的核酸序列可利用在本领域中已知的重组方法获得，诸如例如通过从表达基因的细胞中筛选文库，通过从已知包括该基因的载体中得到该基因，或通过利用标准的技术，从包含该基因的细胞和组织中直接分离。可选地，感兴趣的基因可被合成生产。

本发明也提供了其中插入本发明的表达盒的载体。源于逆转录病毒诸如慢病毒的载体是实现长期基因转移的合适工具，因为它们允许转基因长期、稳定的整合并且其在子细胞中增殖。慢病毒载体具有超过源自致癌逆转录病毒诸如鼠科白血病病毒的载体的优点，因为它们可转导非增殖的细胞，诸如肝细胞。它们也具有低免疫原性的优点。

简单概括，通常可操作地连接本发明的表达盒或核酸序列至启动子，并将其并入表达载体。该载体适合于复制和整合真核细胞。典型的克隆载体包含可用于调节期望核酸序列表达的转录和翻译终止子、初始序列和启动子。

本发明的表达构建体也可利用标准的基因传递方案，用于核酸免疫和基因疗法。基因传递的方法在本领域中是已知的。见例如美国专利号5,399,346、5,580,859、5,589,466，在此通过引用全文并入。在另一个实施方式中，本发明提供了基因疗法载体。

该核酸可被克隆入许多类型的载体。例如，该核酸可被克隆入如此载体，其包括但不限于质粒、噬菌粒、噬菌体衍生物、动物病毒和粘粒。特定的感兴趣载体包括表达载体、复制载体、探针产生载体和测序载体。

进一步地，表达载体可以以病毒载体形式提供给细胞。病毒载体技术在本领域中是公知的并在例如Sambrook等(2001,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,ColdSpring Harbor Laboratory,New York)和其他病毒学和分子生物学手册中进行了描述。可用作载体的病毒包括但不限于逆转录病毒、腺病毒、腺伴随病毒、疱疹病毒和慢病毒。通常，合适的载体包含在至少一种有机体中起作用的复制起点、启动子序列、方便的限制酶位点和一个或多个可选择的标记(例如，WO01/96584；WO01/29058；和美国专利号6,326,193)。

已经开发许多基于病毒的系统，用于将基因转移入哺乳动物细胞。例如，逆转录病毒提供了用于基因传递系统的方便的平台。可利用在本领域中已知的技术将选择的基因插入载体并包装入逆转录病毒颗粒。该重组病毒可随后被分离和传递至体内或离体的对象细胞。许多逆转录病毒系统在本领域中是已知的。在一些实施方式中，使用腺病毒载体。许多腺病毒载体在本领域中是已知的。在一个实施方式中，使用慢病毒载体。

额外的启动子元件，例如增强子，可以调节转录开始的频率。通常地，这些位于起始位点上游的30-110bp区域中，尽管最近已经显示许多启动子也包含起始位点下游的功能元件。启动子元件之间的间隔经常是柔性的，以便当元件相对于另一个被倒置或移动时，保持启动子功能。在胸苷激酶(tk)启动子中，启动子元件之间的间隔可被增加隔开50bp，活性才开始下降。取决于启动子，表现出单个元件可合作或独立地起作用，以起动转录。

合适的启动子的一个例子为即时早期巨细胞病毒(CMV)启动子序列。该启动子序列为能够驱动可操作地连接至其上的任何多核苷酸序列高水平表达的强组成型启动子序列。合适的启动子的另一个例子为延伸生长因子-1α(EF-1α)。然而，也可使用其他组成型启动子序列，包括但不限于类人猿病毒40(SV40)早期启动子、小鼠乳癌病毒(MMTV)、人免疫缺陷病毒(HIV)长末端重复(LTR)启动子、MoMuLV启动子、鸟类白血病病毒启动子、艾伯斯坦-巴尔(Epstein-Barr)病毒即时早期启动子、鲁斯氏肉瘤病毒启动子、以及人基因启动子，诸如但不限于肌动蛋白启动子、肌球蛋白启动子、血红素启动子和肌酸激酶启动子。进一步地，本发明不应被限于组成型启动子的应用。诱导型启动子也被考虑为本发明的一部分。诱导型启动子的使用提供了分子开关，其能够当这样的表达是期望的时，打开可操作地连接诱导型启动子的多核苷酸序列的表达，或当表达是不期望的时关闭表达。诱导型启动子的例子包括但不限于金属硫蛋白启动子、糖皮质激素启动子、孕酮启动子和四环素启动子。

为了评估CAR多肽或其部分的表达，被引入细胞的表达载体也可包含可选择的标记基因或报道基因中的任一个或两者，以便于从通过病毒载体寻求被转染或感染的细胞群中鉴定和选择表达细胞。在其他方面，可选择的标记可被携带在单独一段DNA上并用于共转染程序。可选择的标记和报道基因两者的侧翼都可具有适当的调节序列，以便能够在宿主细胞中表达。有用的可选择标记包括例如抗生素抗性基因，诸如neo等等。

报道基因用于鉴定潜在转染的细胞并用于评价调节序列的功能性。通常地，报道基因为以下基因：其不存在于受体有机体或组织或由受体有机体或组织进行表达，并且其编码多肽，该多肽的表达由一些可容易检测的性质例如酶活性清楚表示。在DNA已经被引入受体细胞后，报道基因的表达在合适的时间下进行测定。合适的报道基因可包括编码荧光素酶、β-半乳糖苷酶、氯霉素乙酰转移酶、分泌型碱性磷酸酶或绿色萤光蛋白的基因(例如，Ui-Tei等，2000FEBS Letters479:79-82)。合适的表达系统是公知的并可利用已知技术制备或从商业上获得。通常，显示最高水平的报道基因表达的具有最少5个侧翼区的构建体被鉴定为启动子。这样的启动子区可被连接至报道基因并用于评价试剂调节启动子-驱动转录的能力。

将基因引入细胞和将基因表达入细胞的方法在本领域中是已知的。在表达载体的内容中，载体可通过在本领域中的任何方法容易地引入宿主细胞，例如，哺乳动物、细菌、酵母或昆虫细胞。例如，表达载体可通过物理、化学或生物学手段转移入宿主细胞。

将多核苷酸引入宿主细胞的物理方法包括磷酸钙沉淀、脂质转染法、粒子轰击、微注射、电穿孔等等。生产包括载体和/或外源核酸的细胞的方法在本领域中是公知的。见例如Sambrook等(2001,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring HarborLaboratory,New York)。将多核苷酸引入宿主细胞的优选方法为磷酸钙转染。

将感兴趣的多核苷酸引入宿主细胞的生物学方法包括使用DNA和RNA载体。病毒载体，特别是逆转录病毒载体，已经成为最广泛使用的将基因插入哺乳动物例如人细胞的方法。其他病毒载体可源自慢病毒、痘病毒、单纯疱疹病毒I、腺病毒和腺伴随病毒等等。见例如美国专利号5,350,674和5,585,362。

将多核苷酸引入宿主细胞的化学手段包括胶体分散系统，诸如大分子复合物、纳米胶囊、微球、珠；和基于脂质的系统，包括水包油乳剂、胶束、混合胶束和脂质体。用作体外和体内传递工具(delivery vehicle)的示例性胶体系统为脂质体(例如，人造膜囊)。

在使用非病毒传递系统的情况下，示例性传递工具为脂质体。考虑使用脂质制剂，以将核酸引入宿主细胞(体外、离体(ex vivo)或体内)。在另一方面，该核酸可与脂质相关联。与脂质相关联的核酸可被封装入脂质体的水性内部中，散布在脂质体的脂双层内，经与脂质体和寡核苷酸两者都相关联的连接分子附接至脂质体，陷入脂质体，与脂质体复合，分散在包含脂质的溶液中，与脂质混合，与脂质联合，作为悬浮液包含在脂质中，包含在胶束中或与胶束复合，或以其他方式与脂质相关联。与组合物相关联的脂质、脂质/DNA或脂质/表达载体不限于溶液中的任何具体结构。例如，它们可存在于双分子层结构中，作为胶束或具有“坍缩的(collapsed)”结构。它们也可简单地被散布在溶液中，可能形成大小或形状不均一的聚集体。脂质为脂肪物质，其可为天然发生或合成的脂质。例如，脂质包括脂肪小滴，其天然发生在细胞质以及包含长链脂肪族烃和它们的衍生物诸如脂肪酸、醇类、胺类、氨基醇类和醛类的该类化合物中。

在本发明的一个优选地实施方式中，所述载体为慢病毒载体。

治疗性应用

本发明包括用编码本发明表达盒的慢病毒载体(LV)转导的细胞(例如，NK细胞)进行的治疗性应用。转导的NK细胞可靶向肿瘤细胞的标志物EGFR，协同激活NK细胞，引起NK细胞免疫应答，从而显著提高其对肿瘤细胞的杀伤效率。

因此，本发明也提供了刺激对哺乳动物的靶细胞群或组织的NK细胞-介导的免疫应答的方法，其包括以下步骤：给哺乳动物施用本发明的CAR-NK细胞。

在一个实施方式中，本发明包括一类细胞疗法，分离病人自体NK细胞(或者异源供体)，激活并进行基因改造产生CAR-NK细胞，随后注入同一病人体内。这种方式患移植物抗宿主病概率极低，抗原被NK细胞以无MHC限制方式识别。此外，一种CAR-NK就可以治疗表达该抗原的所有癌症。不像抗体疗法，CAR-NK细胞能够体内复制，产生可导致持续肿瘤控制的长期持久性。

在一个实施方式中，本发明的CAR-NK细胞可经历稳固的体内NK细胞扩展并可持续延长的时间量。另外，CAR介导的免疫应答可为过继免疫疗法步骤的一部分，其中CAR-修饰NK细胞诱导对CAR中的抗原结合结构域特异性的免疫应答。例如，抗EGFR的CAR-NK细胞引起抗EGFR阳性的细胞的特异性免疫应答。

尽管本文公开的数据具体公开了包括抗-EGFR scFv、Fc铰链和ICOS跨膜区和胞内区、4-1BB胞内区和CD3ζ信号传导结构域的慢病毒载体，但本发明应被解释为包括对构建体组成部分中的每一个的任何数量的变化。

可治疗的癌症包括没有被血管化或基本上还没有被血管化的肿瘤，以及血管化的肿瘤。癌症可包括非实体瘤(诸如血液学肿瘤，例如白血病和淋巴瘤)或可包括实体瘤。用本发明的CAR治疗的癌症类型包括但不限于癌、胚细胞瘤和肉瘤，和某些白血病或淋巴恶性肿瘤、良性和恶性肿瘤、和恶性瘤，例如肉瘤、癌和黑素瘤。也包括成人肿瘤/癌症和儿童肿瘤/癌症。

血液学癌症为血液或骨髓的癌症。血液学(或血原性)癌症的例子包括白血病，包括急性白血病(诸如急性淋巴细胞白血病、急性髓细胞白血病、急性骨髓性白血病和成髓细胞性、前髓细胞性、粒-单核细胞型、单核细胞性和红白血病)、慢性白血病(诸如慢性髓细胞(粒细胞性)白血病、慢性骨髓性白血病和慢性淋巴细胞白血病)、真性红细胞增多症、淋巴瘤、霍奇金氏疾病、非霍奇金氏淋巴瘤(无痛和高等级形式)、多发性骨髓瘤、瓦尔登斯特伦氏巨球蛋白血症、重链疾病、骨髓增生异常综合征、多毛细胞白血病和脊髓发育不良。

实体瘤为通常不包含囊肿或液体区的组织的异常肿块。实体瘤可为良性或恶性的。不同类型的实体瘤以形成它们的细胞类型命名(诸如肉瘤、癌和淋巴瘤)。实体瘤诸如肉瘤和癌的例子包括膀胱癌、脑癌、头颈癌、胰腺癌、肺癌、乳腺癌、卵巢癌、结肠癌、前列腺癌和肾癌。

在优选的实施方式中，可治疗的癌症为EGFR阳性肿瘤，如脑胶质母细胞瘤等。

本发明的CAR-修饰NK细胞也可用作对哺乳动物离体免疫和/或体内疗法的疫苗类型。优选地，哺乳动物为人。

对于离体免疫，以下中的至少一项在将细胞施用进入哺乳动物前在体外发生：i)扩增细胞，ii)将编码CAR的核酸引入细胞，和/或iii)冷冻保存细胞。

离体程序在本领域中是公知的，并在以下更完全地进行讨论。简单地说，细胞从哺乳动物(优选人)中分离并用表达本文公开的CAR的载体进行基因修饰(即，体外转导或转染)。CAR-修饰的细胞可被施用给哺乳动物接受者，以提供治疗益处。哺乳动物接受者可为人，和CAR-修饰的细胞可相对于接受者为自体的。可选地，细胞可相对于接受者为同种异基因的、同基因的(syngeneic)或异种的。

除了就离体免疫而言使用基于细胞的疫苗之外，本发明也提供了体内免疫以引起针对患者中抗原的免疫应答的组合物和方法。

本发明提供了治疗肿瘤的方法，其包括施用给需要其的对象治疗有效量的本发明的CAR-修饰的NK细胞。

本发明的CAR-修饰的NK细胞可被单独施用或作为药物组合物与稀释剂和/或与其他组分诸如IL-2、IL-17或其他细胞因子或细胞群结合施用。简单地说，本发明的药物组合物可包括如本文所述的靶细胞群，与一种或多种药学或生理学上可接受载体、稀释剂或赋形剂结合。这样的组合物可包括缓冲液诸如中性缓冲盐水、硫酸盐缓冲盐水等等；碳水化合物诸如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖、甘露醇；蛋白质；多肽或氨基酸诸如甘氨酸；抗氧化剂；螯合剂诸如EDTA或谷胱甘肽；佐剂(例如，氢氧化铝)；和防腐剂。本发明的组合物优选配制用于静脉内施用。

本发明的药物组合物可以以适于待治疗(或预防)的疾病的方式施用。施用的数量和频率将由这样的因素确定，如患者的病症、和患者疾病的类型和严重度——尽管适当的剂量可由临床试验确定。

当指出“免疫学上有效量”、“抗肿瘤有效量”、“肿瘤-抑制有效量”或“治疗量”时，待施用的本发明组合物的精确量可由医师确定，其考虑患者(对象)的年龄、重量、肿瘤大小、感染或转移程度和病症的个体差异。可通常指出：包括本文描述的NK细胞的药物组合物可以以10⁴至10⁹个细胞/kg体重的剂量，优选10⁵至10⁶个细胞/kg体重的剂量(包括那些范围内的所有整数值)施用。NK细胞组合物也可以以这些剂量多次施用。细胞可通过使用免疫疗法中公知的注入技术(见例如Rosenberg等，NewEng.J.of Med.319:1676，1988)施用。对于具体患者的最佳剂量和治疗方案可通过监测患者的疾病迹象并因此调节治疗由医学领域技术人员容易地确定。

对象组合物的施用可以以任何方便的方式进行，包括通过喷雾法、注射、吞咽、输液、植入或移植。本文描述的组合物可被皮下、皮内、瘤内、结内、脊髓内、肌肉内、通过静脉内(i.v.)注射或腹膜内施用给患者。在一个实施方式中，本发明的NK细胞组合物通过皮内或皮下注射被施用给患者。在另一个实施方式中，本发明的NK细胞组合物优选通过i.v.注射施用。NK细胞的组合物可被直接注入肿瘤，淋巴结或感染位置。

在本发明的某些实施方式中，利用本文描述的方法或本领域已知的其他将NK细胞扩展至治疗性水平的方法活化和扩展的细胞，与任何数量的有关治疗形式结合(例如，之前、同时或之后)施用给患者，所述治疗形式包括但不限于用以下试剂进行治疗：所述试剂诸如抗病毒疗法、西多福韦和白细胞介素-2、阿糖胞苷(也已知为ARA-C)或对MS患者的那他珠单抗治疗或对牛皮癣患者的厄法珠单抗治疗或对PML患者的其他治疗。在进一步的实施方式中，本发明的NK细胞可与以下结合使用：化疗、辐射、免疫抑制剂，诸如，环孢菌素、硫唑嘌呤、甲氨喋呤、麦考酚酯和FK506，抗体或其他免疫治疗剂。在进一步的实施方式中，本发明的细胞组合物与骨髓移植、利用化疗剂诸如氟达拉滨、外部光束放射疗法(XRT)、环磷酰胺结合(例如，之前、同时或之后)而施用给患者。例如，在一个实施方式中，对象可经历高剂量化疗的标准治疗，之后进行外周血干细胞移植。在一些实施方式中，在移植后，对象接受本发明的扩展的免疫细胞的注入。在一个额外的实施方式中，扩展的细胞在外科手术前或外科手术后施用。

施用给患者的以上治疗的剂量将随着治疗病症的精确属性和治疗的接受者而变化。人施用的剂量比例可根据本领域接受的实践实施。通常，每次治疗或每个疗程，可将1×10⁶个至1×10¹⁰个本发明经修饰的NK细胞(如，CAR-NK细胞)，通过例如静脉回输的方式，施用于患者。

根据本发明，本发明的药学产品(药物、药剂)或药物组合物可以以任意有效剂量数施用给药受试者。优选地，本发明的药学产品(药物、药剂)或药物组合物可以以多次剂量给药，例如从约2至约20次剂量，更优选从约4-10次剂量。在特别优选的实施方案，在给药过程中，以每三周给药约一次的频率将本发明的药学产品(药物、药剂)或药物组合物给药至受试者，例如注射、输注或口服。在特别优选的实施方案，给药为通过注射施用至荷瘤部位。

应当理解本发明的药学产品(药物、药剂)或药物组合物可以按用于通过任意适宜的途径给药的任意适宜的方式配制。

本发明的药学产品(药物、药剂)或药物组合物的剂量单位是基于常规进行给药受试者。例如，剂量单位可以给药多于每日一次、每周一次、每月一次等。剂量单位可以是以两次/周为基础给药，即每周两次，例如每三天一次。

本发明的药学产品中所包含的涉及该药学产品的说明书可以含有如下内容：适应症(例如脑胶质母细胞瘤)、施用剂量(例如上述所示例性说明的)以及可能产生的副作用等等。

本发明的主要优点包括：

(a)通过将EGFR抗体用于CAR-NK细胞的构建，其以EGFR分子为靶抗原，利用EGFRCAR-NK细胞特异性地杀伤肿瘤细胞；其可作为肿瘤类疾病的治疗药物，用于EGFR分子高表达的肿瘤的治疗，且无细胞因子风暴等不良现象，为对传统手术、化疗和放疗无效的肿瘤提供了新的治疗方法；并且通过对NK92细胞进行改造，表达CAR后，又大大增加了它的靶向性，并增加抗肿瘤靶点EGFR，在提高靶向性的同时，大大地提高其抗肿瘤性能。

(b)本发明构建的EGFR CAR-NK细胞，通过对NK92细胞进行改造，装上CAR后不但增加了其靶向性，而且由于使用的是NK细胞，不需要自身白细胞抗原与肿瘤匹配，所以不会产生移植物抗宿主反应。并且，CAR-NK疗法不会引发细胞因子风暴，这使得CAR-NK技术比CAR-T技术更安全。而且，CAR-NK细胞来源广泛，如外周血单个核细胞、诱导多能干细胞、脐带血、人类胚胎干细胞和NK-92细胞系。这些都大大提高了其安全性，毒副作用小，成本低。

(c)该EGFR CAR-NK细胞能同时识别wtEGFR与EGFRvIII，可以更有效的杀伤具有EGFRvIII突变表达的肿瘤。NK细胞、CAR和抗EGFR靶点的共同作用，其对同时表达wtEGFR与EGFRvIII的脑胶质母细胞瘤的杀伤效果好。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。

实施例中所用EGFR scFv抗体是通过杂交瘤技术筛选得到的EGFR 043抗体，经轻链和重链可变区测序后，对序列进行人源化改造，将人源化后的序列构建载体，并在哺乳动物细胞中表达生产纯化所得。其中，重链可变区如SEQ ID NO:3所示，轻链可变区如SEQ IDNO:4所示，轻链可变区和重链可变区之间由linker连接,linker为3个重复的GGGGS序列。

实施例中所用NK-92细胞、U87MG、CHO-K1细胞均获自ATCC。RetroNectin试剂来源于TaKaRa。

实施例1EGFR scFv抗体片段与EGFR在蛋白和细胞水平上的结合能力检测

(1)将EGFRvIII ECD蛋白质用PBS稀释到1ug/ml，在96孔ELISA板子中每孔加入100ul稀释好的EGFRvIII ECD蛋白质溶液，并4℃中包被过夜。将板子用洗涤剂PBST清洗3次，PBST为含有0.05％Tween-20,pH 7.4的PBS。每孔加入200ul的封闭液，封闭液成分为含有1％BSA的PBST，在37℃培养箱中孵育2小时后弃去封闭液后备用。用封闭液稀释不同结构的EFGR scFv抗体，在ELISA板子中每孔加入100ul的抗体稀释液，在37℃培养箱中孵育1小时后用洗涤剂清洗3次，每孔加入100ul稀释1000倍的anti-his-HRP，并在室温下孵育50分钟，用洗涤剂清洗3次，每孔加入50ul TMB底物溶液，室温孵育10分钟，再每孔加入50ul 1N的HCl终止液，立即在酶标仪上读取450nm的吸光值。

(2)稳定转导的CHO-K1/人EGFR和EGFRvIII细胞用Versene消化后，铺于96孔板中，每孔100ul/5×10⁵个细胞，在封闭液中孵育10-20分钟，封闭液为含有2％FBS的PBS，300×g，4℃离心5分钟，弃去液体后备用。用封闭液稀释不同浓度的EFGR scFv抗体，在板子中每孔加入100ul的抗体稀释液，在4℃冰箱中孵育1小时后用封闭液清洗2次，加入用封闭液稀释1000倍的Alexa

488 anti-hFc/his的二抗，每孔100ul，在4℃冰箱中避光孵育1小时后用封闭液清洗3次，300×g，4℃离心5分钟，弃去液体后，用200ul重悬细胞，利用BDFACSCanto II进行流式分析。

图1a-1c的实验结果证实，两种不同形式的scFv抗体VH-VL与VL-VH，在EGFR蛋白和细胞水平上具有不同的结合能力，其中VL-VH的结合能力强于VH-VL。图中043VH-VL-hfc表示EGFR CAR-NK0013的scFv的重链和轻链片段，并且轻链部分连接了hFc标签。043VL-VH-hfc表示EGFR CAR-NK0013的scFv的轻链和重链片段，并且重链部分连接了hFc标签。043VH-VL-his表示EGFR CAR-NK0013的scFv的重链和轻链片段，并且轻链部分连接了His标签。043VL-VH-his表示EGFR CAR-NK0013的scFv的轻链和重链片段，并且重链部分连接了hFc标签。Tab02为AbbVie的ABT-414抗体，在本实施例中作为阳性对照抗体，hIgG为阴性对照抗体。基于此实施例的scFv抗体结合情况，VL-VH将作为EGFR-CAR载体的使用形式。

实施例2慢病毒载体的制备

分别合成scFv(Anti EGFR)-CD8αhinge-CD8-4-1BB-CD3ζ融合基因序列(其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，基因序列如SEQ ID NO：2所示，即下文的CAR0013)。以scFv(AntiEGFR)-CD8αhinge-CD8-4-1BB-CD3ζ融合基因为例说明EGFR CAR-NK细胞的制备过程。

通过酶切，将scFv(Anti EGFR)-CD8αhinge-CD8-4-1BB-CD3ζ融合基因序列转化连接到pCP载体中，基因上游为CMV启动子。载体转化Stbl3大肠杆菌菌株，氨苄青霉素筛选，获得阳性克隆，提取质粒，酶切鉴定克隆，获得pCP-scFv(anti EGFR)慢病毒转染载体，图2展示了pCP-scFv(anti EGFR)的结构模式图。图3所示为EGFR-CAR质粒的结构图。

实施例3慢病毒的制备

(1)用PBS把Poly-d-lysine溶液稀释到20ug/ml，每个T175瓶中放入15ml Poly-d-lysine稀释液，37度培养箱孵育至少6小时。孵育后用PBS洗两遍，PBS完全移除干净，放置培养箱备用，包被好的瓶子可以在37度培养箱存放一周。

(2)转染前24小时，以每瓶约2×10⁷将293T细胞接种至包被好Poly-d-lysine的T175培养瓶中。确保转染时293T细胞在80％左右的汇合度且均匀分布于培养瓶中。

(3)配制病毒包装体系(以一个T175瓶为例，质粒总量是48ug，包装体系总体积是3ml/瓶)：

准备2个15ml无菌离心管。一个离心管里加入1.5ml Opti-MEM，同时加入96ulPOLOdeliverer3000转染试剂，混匀，室温静置5min。同时，另一个离心管中加入1.5mlOpti-MEM，加入48ug的质粒，混匀。病毒包装质粒和目的质粒的比例分配为：18ug pAX2质粒；6ug pVSVG质粒；24ug pCP-scFv(anti EGFR)质粒。将两个15ml离心管的试剂混合在一起，总体积3ml。室温静置15min。孵育完成后将3ml转染体系逐滴加入含293T细胞的培养瓶中，轻摇瓶身，混匀。再将该培养瓶放置于培养箱中培养6小时。6h后将培养基换5％血清培养基培养。

(4)48h后第一次收集病毒上清，4度冰箱存放。同时再补30ml 5％血清培养基继续培养。72h后第二次收集病毒上清，将两次的收集的病毒上清3750rmp，4度离心机离心15min再用250ml,0.45um过滤器过滤。然后根据上清总量选择相对应规格的病毒浓缩柱浓缩病毒。分装浓缩后的病毒，置于-80℃保存。

实施例4EGFR CAR-NK细胞的制备

(1)用PBS把RetroNectin溶液稀释到20ug/ml，在未经组织培养处理过的24孔板中以每孔加入500ul RetroNectin稀释液，4℃过夜包被板子。弃去RetroNectin稀释液，PBS洗一遍，加入含有10％血清的培养基，常温下孵育30分钟。弃去培养基，每孔按照MOI＝2-3添加实施例2制得的浓缩病毒。培养箱中孵育4小时后，30℃、1400rpm条件下，离心90分钟。弃去病毒上清。

(2)将NK-92细胞密度调整至5×10⁵/ml，加入100ng/ml的IL-12，培养箱中孵育4小时以预先激活NK-92细胞。

(3)在步骤(1)中的24孔板子中每孔加入1ml步骤(2)所得的细胞，同时添加聚凝胺8ug/ml。培养箱中培养48小时后将所有的细胞离心进行CAR抗体染色，并扩大培养EGFR CARNK-92阳性细胞。观察培养基的颜色变化、细胞密度、细胞形态并作相应记录。本实施例中，以EGFR CAR-NK0013细胞为例，说明EGFR CAR-NK细胞的制备结果。

利用流式检测CAR NK-92细胞阳性率，流式检测结果如图4a和图4b所示。图4a和图4b中，所采用的抗体为Alexa Fluor 488荧光标记，在横坐标上进行表示，NK92细胞若成功表达CAR分子，该信号值将显著升高。图4a为对照组亲本NK92细胞，图4b为实验组EGFR CAR-NK92 0013细胞。从图4a和图4b中可以看出，Alexa Fluor 488荧光标记的信号值显著升高，表明NK-92细胞成功表达出CAR分子，CAR-NK92阳性率为95.5％。

图5a和图5b为EGFR CAR-NK流式检测CD56分子阳性率的结果图。图5a为对照组，图5b为实验组。从图5a和5b中可以看出，CD56分子为阳性，说明制备的CAR-NK92细胞未丢失CD56分子，未发生其它形式的分化，保存NK细胞的基本特性。

实施例5EGFR CAR-NK细胞对脑胶质母细胞瘤细胞系的杀伤效果的评估

利用荧光素酶报告基因方法检测EGFR CAR-NK细胞对脑胶质母细胞瘤细胞系的杀伤效果，肿瘤细胞系包括：U87MG和高表达EGFRvIII的U87MG细胞。实验操作方法如下：

(1)在96孔板中加入100ul肿瘤细胞悬液(5×10³个/孔)。将培养板在培养箱预培养12h。

(2)弃去96孔板的培养上清，每孔加入150ul效应细胞，效应细胞与靶细胞数目的比例分别为0.3:1、1:1、3:1和10:1。培养基对照孔只加150ul培养基，每个实验置三个复孔。效应细胞与靶细胞共孵育4小时。

(3)每孔加入150ul Steady-Glo溶液，将培养板在水平振荡仪上振荡5分钟。

(4)用Enspire仪器测定冷光的相对光强度(RLU)。

(5)杀伤率＝(1-(sample-control))/(Tumor cell-control)*100％

Sample：试验孔(含有肿瘤细胞和CAR-NK)；

Tumor cell：对照孔(含有肿瘤细胞，不含有CAR-NK)；

Control：空白对照(含有CAR-NK的培养基，不含有细胞)；

EGFR CAR-NK细胞体外肿瘤杀伤效果评估的实验结果如图6a-6b所示。图中WT为亲本NK92细胞，NK CAR0009是表达CAR-2G-EGFRvIII 029scFv的NK细胞；NK CAR0013即为EGFRCAR-NK92 0013，是表达CAR-2G-EGFRvIII 043scFv-4-1BB的NK细胞；NK CAR0029即为EGFRCAR-NK92 0029，是表达CAR-2G-EGFRvIII 043scFv-CD28的NK细胞；NK CAR0027是表达CAR-2G-EGFRvIII 029scFv-CD28的NK细胞。029scFv是区别于043scFv的EGFRvIII抗体。

图6a-6b的实验结果证实，EGFR CAR-NK对脑胶质母细胞瘤细胞系U87MG和高表达EGFRvIII的U87MG细胞均有很强的杀伤效果，其效果均优于普通的NK-92细胞。

另外，从图6a-6b中可以看出，EGFR CAR-NK细胞对高表达EGFRvIII的U87MG细胞的杀伤效果优于U87MG细胞，可以更有效的杀伤表达EGFRvIII的肿瘤。鉴于此，后续动物实验，利用高表达EGFRvIII的U87MG细胞进行。

实施例6EGFR CAR-NK细胞治疗小鼠EGFR脑原位异种移植的应用

研究经过γ射线辐照处理后的EGFR CAR-NK细胞对脑胶质母细胞瘤细胞系的杀伤效力的影响的评估，以及辐照对EGFR CAR-NK本身细胞活率和生长的影响。

利用不同剂量的γ射线对EGFR CAR-NK细胞进行辐照处理，照射剂量分别为0,5,10Gy，靶细胞为U87MG-EGFRvIII。本实施例中，以EGFR CAR-NK0013细胞为例进行辐照处理。实验操作方法如下：

(1)实验前一天，在96孔板中加入100ul肿瘤细胞悬液(5×10³个/孔)。将培养板在培养箱预培养18h。

(2)实验当天，在15毫升无菌离心管里装入密度为1.3×10⁶个/毫升的EGFRvIIICAR-NK细胞，总量约1×10⁷个，一式三份。

(3)将三份相同的细胞样品进行γ射线辐照处理，辐照强度为1.83Gy/分钟，照射剂量分别为0,5,10Gy。

(4)评估辐照后EGFR CAR-NK细胞活率和生长：在96孔板中加入100ul不同剂量辐照后的EGFR CAR-NK细胞(2×10⁴个/孔)，经过0小时、24小时、48小时和72小时培养后，分别用台盼蓝计数法和CellTiter-Glo发光法检测辐照后细胞活率和生长速度的变化。

(5)进一步评估辐照后EGFR CAR-NK细胞对脑胶质母细胞瘤细胞系的杀伤效力：弃去步骤(1)96孔板中的上清，每孔加入150ul效应细胞，效应细胞与靶细胞数目的比例分别为0.3:1、1:1、3:1和10:1。培养基对照孔只加150ul培养基，每个实验设置三个复孔。效应细胞与靶细胞共孵育4小时。4小时后，每孔加入150ul Steady-Glo溶液，将培养板在水平振荡仪上振荡5分钟。用Enspire仪器测定冷光的相对光强度(RLU)。

杀伤率＝(1-(sample-control))/(Tumor cell-control)*100％

Sample：试验孔(含有肿瘤细胞和不同剂量γ射线辐照后的CAR-NK)；

Tumor cell：对照孔(含有肿瘤细胞，不含有不同剂量γ射线辐照后的CAR-NK)；

Control：空白对照(含有CAR-NK的培养基，不含有细胞)；

不同剂量γ射线辐照后的EGFR CAR-NK细胞体外肿瘤杀伤效果评估的实验结果如图7a-7b所示。

图7a-7b的实验结果证实，不同剂量γ射线辐照前后，EGFR CAR-NK对高表达EGFRvIII的U87MG细胞的杀伤效果并无显著差异。

不同剂量γ射线辐照后的EGFR CAR-NK细胞生长存活率评估的实验结果如图8a-8b所示。

图8a-8b的实验结果证实，经过5和10Gyγ射线辐照后的EGFR CAR-NK，其增殖受到显著抑制。

鉴于此，γ射线辐照后的EGFR CAR-NK细胞对高表达EGFRvIII的U87MG细胞仍然具有良好的杀伤活性，同时其自身增殖活性明显降低，可作为胶质母细胞瘤免疫治疗的理想效应细胞。

本实验集中评价连续3次颅内注射EGFR CAR-NK细胞，对人脑胶质母瘤细胞U87MG-EGFRvIII-Luc小鼠脑原位肿瘤模型中的体内抗肿瘤效果。同时对比对照组与亲本NK92(WT)，EGFR CAR-NK92 0013(CAR-2G-EGFRvIII 043scFv-4-1BB)和EGFR CAR-NK92 0029(CAR-2G-EGFRvIII 043scFv-CD28)的抗肿瘤药效比较。

U87MG-EGFRvIII-Luc细胞脑原位肿瘤模型建立：将2.5μl含有5×10⁴个U87-MG-EGFRvIII-Luc细胞的细胞悬液接种到8-10周龄的雌性NCG小鼠的右尾状核来建立异种移植瘤模型。用Xenogen IVIS小动物成像仪监测肿瘤大小，并使用Total Flux(photons/s/10⁶)计算肿瘤大小。细胞脑原位接种2天后，小鼠用IVIS小动物成像仪进行成像，将荷瘤小鼠随机分为4组并按照实验设计开始颅内注射溶剂，亲本NK92,或待测EGFR CAR-NK92细胞。小鼠荧光信号值和体重每周测量两次，原始数据按照其试验编号和测量日期记录于体内试验数据库。通过比较治疗组和对照组的Total Flux(photons/s/10⁶)平均值变化来评价从治疗日开始的肿瘤生长抑制率(％TGI)。

实验数据表明，第一次颅内注射细胞后，EGFR CAR-NK92 0013和EGFR CAR-NK920029细胞治疗组对U87MG-EGFRvIII-Luc肿瘤生长有一定抑制作用，之后分别在第3天和第6天颅内注射细胞进行治疗。在分组后第14天，亲本NK92，EGFR CAR-NK920013和EGFRCAR-NK92 0029组％TGI分别为17.11％、83.41％和88.76％,两组EGFR CAR-NK92组均表现出明显的治疗效果(图9a,9c)。在分组后第17天，EGFR CAR-NK92组仍然表现出明显的治疗效果(图9b)。对照组和亲本NK92组小鼠于17天开始体重下降迅速，对于体重降低超过20％的小鼠，按照动物福利要求予以安乐死处理。EGFR CAR-NK92 0013和EGFR CAR-NK92 0029在第17天仅EGFR CAR-NK92 0029组31#小鼠体重下降明显为19.37％，其他小鼠体重良好。在结束治疗后持续观察小鼠生存率。生存曲线结果显示，对照组，亲本NK92，EGFR CAR-NK920013和EGFR CAR-NK92 0029组中位生存期(MST)分别为18天，18天，57天和48天。与对照组和亲本NK92组相比EGFR CAR-NK92 0013和EGFR CAR-NK92 0029组明显的延长了小鼠的生存期(图10)。

综上所述，与对照组和亲本NK92组相比，EGFR CAR-NK92 0013和EGFR CAR-NK920029组对U87MG-EGFRvIII-Luc细胞异种移植瘤模型均有明显的抑瘤效果表现出良好的抗肿瘤活性，整个治疗期间小鼠表现出良好的耐受性，治疗结束后EGFR CAR-NK92 0013和EGFR CAR-NK92 0029组小鼠的生存期是对照组和亲本NK92组2-3倍。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

本申请中涉及的序列如下：

SEQ ID NO:1

CAR-pCP0013氨基酸序列

MALPVTALLLPLALLLHAARPEIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASSSVSSSYLHWYQQKPGQAPRLLIYSTSNLAAGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQYSGYPLTFGGGTKVEIKGGGGSGGGGSGGGGSQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYNMDWVRQAPGQGLEWMGDINPNNADTIYNQKFKGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARGDYDGYYPVYYAMDYWGQGTTVTVSSDYKDDDDKTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR*

SEQ ID NO:2

CAR-pCP0013核苷酸序列

ATGGCTCTGCCAGTGACAGCTCTGCTGCTGCCTCTGGCTCTGCTGCTGCACGCAGCTAGACCCGAGATCGTGCTGACCCAGTCCCCCGCTACACTGTCTTTATCCCCCGGTGAGAGAGCCACTTTAAGCTGCAGAGCCAGCAGCAGCGTGAGCAGCAGCTATTTACACTGGTACCAGCAGAAGCCCGGACAAGCTCCCAGACTGCTGATCTACAGCACCAGCAATTTAGCTGCCGGCATCCCCGCTCGTTTCAGCGGAAGCGGAAGCGGCACCGACTTCACTTTAACCATCTCCTCTTTAGAGCCCGAGGACTTCGCCGTGTACTACTGCCAGCAGTACAGCGGCTACCCTCTGACCTTCGGCGGAGGCACCAAGGTGGAGATTAAGGGTGGAGGCGGTTCAGGCGGAGGTGGCTCTGGCGGTGGCGGATCGCAAGTTCAGCTGGTGCAGTCCGGAGCCGAGGTGAAGAAACCCGGCGCCAGCGTGAAGGTGAGCTGCAAGGCCAGCGGCTACACCTTCACCGACTACAACATGGACTGGGTGAGACAAGCTCCCGGTCAAGGTTTAGAGTGGATGGGCGACATCAACCCCAACAACGCCGACACCATCTACAACCAGAAGTTCAAAGGTCGTGTGACCATGACTCGTGACACCAGCACCTCCACCGTGTACATGGAGCTGAGCTCTTTAAGGTCCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGCGCTCGTGGCGACTACGACGGCTACTACCCCGTGTACTACGCCATGGACTACTGGGGCCAAGGTACCACAGTGACCGTGAGCTCCGACTACAAGGACGACGACGACAAGACCACCACCCCAGCTCCTAGACCTCCTACACCAGCCCCTACAATCGCCTCTCAGCCTCTGTCTCTGAGACCCGAGGCCTGCAGACCAGCCGCAGGAGGAGCAGTGCATACAAGGGGCCTGGACTTCGCTTGCGACATCTACATTTGGGCTCCCCTGGCCGGAACTTGCGGAGTGCTGCTGCTGTCTCTGGTCATCACCCTGTATTGCAAGCGGGGCCGGAAGAAGCTGCTGTACATCTTCAAGCAGCCCTTCATGCGGCCAGTGCAGACAACCCAGGAGGAAGACGGCTGCTCTTGCAGATTCCCCGAGGAAGAAGAGGGCGGTTGCGAGCTGAGAGTGAAGTTCAGCAGAAGCGCCGACGCTCCAGCCTATAAGCAGGGCCAGAACCAGCTGTACAACGAGCTGAACCTGGGCAGGAGAGAGGAGTACGACGTGCTGGACAAGAGGAGAGGCAGAGACCCAGAGATGGGCGGCAAGCCTAGACGGAAGAACCCTCAGGAGGGCCTGTACAACGAACTGCAGAAGGACAAGATGGCCGAGGCCTACAGCGAGATCGGCATGAAGGGCGAGAGGAGAAGAGGCAAGGGACACGACGGACTGTACCAGGGACTGAGCACAGCCACCAAGGACACATACGACGCCCTGCACATGCAGGCTCTGCCTCCTAGATGA

SEQ ID NO:3

EGFR抗体043抗体重链可变区氨基酸序列

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYNMDWVRQAPGQGLEWMGDINPNNADTIYNQKFKGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARGDYDGYYPVYYAMDYWGQGTTVTVSS

SEQ ID NO:4

EGFR抗体043抗体轻链可变区氨基酸序列

EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASSSVSSSYLHWYQQKPGQAPRLLIYSTSNLAAGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQYSGYPLTFGGGTKVEIK

SEQ ID NO:5

连接肽

GGGGS

SEQ ID NO:6

重链可变区的互补决定区CDR1

DYNMD

SEQ ID NO:7

重链可变区的互补决定区CDR2

DINPNNADTIYNQKFKG

SEQ ID NO:8

重链可变区的互补决定区CDR3

GDYDGYYPVYYAMDY

SEQ ID NO:9

轻链可变区的互补决定区CDR1’

RASSSVSSSYLH

SEQ ID NO:10

轻链可变区的互补决定区CDR2’

STSNLAA

SEQ ID NO:11

轻链可变区的互补决定区CDR3’

QQYSGYPLT

序列表

<110> 上海怀越生物科技有限公司

<120> EGFR靶向性嵌合抗原受体及其制备方法及应用

<130> P2020-2472

<160> 11

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 499

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu

1 5 10 15

His Ala Ala Arg Pro Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu

20 25 30

Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Ser

35 40 45

Ser Val Ser Ser Ser Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln

50 55 60

Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ala Gly Ile

65 70 75 80

Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr

85 90 95

Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln

100 105 110

Tyr Ser Gly Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile

115 120 125

Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

130 135 140

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

145 150 155 160

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr

165 170 175

Asn Met Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

180 185 190

Gly Asp Ile Asn Pro Asn Asn Ala Asp Thr Ile Tyr Asn Gln Lys Phe

195 200 205

Lys Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr

210 215 220

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

225 230 235 240

Ala Arg Gly Asp Tyr Asp Gly Tyr Tyr Pro Val Tyr Tyr Ala Met Asp

245 250 255

Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Asp Tyr Lys Asp

260 265 270

Asp Asp Asp Lys Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala

275 280 285

Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg

290 295 300

Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys

305 310 315 320

Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu

325 330 335

Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu

340 345 350

Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln

355 360 365

Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly

370 375 380

Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr

385 390 395 400

Lys Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg

405 410 415

Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met

420 425 430

Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu

435 440 445

Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys

450 455 460

Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu

465 470 475 480

Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu

485 490 495

Pro Pro Arg

<210> 2

<211> 1500

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atggctctgc cagtgacagc tctgctgctg cctctggctc tgctgctgca cgcagctaga 60

cccgagatcg tgctgaccca gtcccccgct acactgtctt tatcccccgg tgagagagcc 120

actttaagct gcagagccag cagcagcgtg agcagcagct atttacactg gtaccagcag 180

aagcccggac aagctcccag actgctgatc tacagcacca gcaatttagc tgccggcatc 240

cccgctcgtt tcagcggaag cggaagcggc accgacttca ctttaaccat ctcctcttta 300

gagcccgagg acttcgccgt gtactactgc cagcagtaca gcggctaccc tctgaccttc 360

ggcggaggca ccaaggtgga gattaagggt ggaggcggtt caggcggagg tggctctggc 420

ggtggcggat cgcaagttca gctggtgcag tccggagccg aggtgaagaa acccggcgcc 480

agcgtgaagg tgagctgcaa ggccagcggc tacaccttca ccgactacaa catggactgg 540

gtgagacaag ctcccggtca aggtttagag tggatgggcg acatcaaccc caacaacgcc 600

gacaccatct acaaccagaa gttcaaaggt cgtgtgacca tgactcgtga caccagcacc 660

tccaccgtgt acatggagct gagctcttta aggtccgagg acaccgccgt gtactactgc 720

gctcgtggcg actacgacgg ctactacccc gtgtactacg ccatggacta ctggggccaa 780

ggtaccacag tgaccgtgag ctccgactac aaggacgacg acgacaagac caccacccca 840

gctcctagac ctcctacacc agcccctaca atcgcctctc agcctctgtc tctgagaccc 900

gaggcctgca gaccagccgc aggaggagca gtgcatacaa ggggcctgga cttcgcttgc 960

gacatctaca tttgggctcc cctggccgga acttgcggag tgctgctgct gtctctggtc 1020

atcaccctgt attgcaagcg gggccggaag aagctgctgt acatcttcaa gcagcccttc 1080

atgcggccag tgcagacaac ccaggaggaa gacggctgct cttgcagatt ccccgaggaa 1140

gaagagggcg gttgcgagct gagagtgaag ttcagcagaa gcgccgacgc tccagcctat 1200

aagcagggcc agaaccagct gtacaacgag ctgaacctgg gcaggagaga ggagtacgac 1260

gtgctggaca agaggagagg cagagaccca gagatgggcg gcaagcctag acggaagaac 1320

cctcaggagg gcctgtacaa cgaactgcag aaggacaaga tggccgaggc ctacagcgag 1380

atcggcatga agggcgagag gagaagaggc aagggacacg acggactgta ccagggactg 1440

agcacagcca ccaaggacac atacgacgcc ctgcacatgc aggctctgcc tcctagatga 1500

<210> 3

<211> 124

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr

20 25 30

Asn Met Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Asp Ile Asn Pro Asn Asn Ala Asp Thr Ile Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Asp Tyr Asp Gly Tyr Tyr Pro Val Tyr Tyr Ala Met Asp

100 105 110

Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 4

<211> 108

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Ser Ser

20 25 30

Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu

35 40 45

Ile Tyr Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ala Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu

65 70 75 80

Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Gly Tyr Pro

85 90 95

Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 5

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

Gly Gly Gly Gly Ser

1 5

<210> 6

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

Asp Tyr Asn Met Asp

1 5

<210> 7

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

Asp Ile Asn Pro Asn Asn Ala Asp Thr Ile Tyr Asn Gln Lys Phe Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 8

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

Gly Asp Tyr Asp Gly Tyr Tyr Pro Val Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr

1 5 10 15

<210> 9

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Ser Ser Tyr Leu His

1 5 10

<210> 10

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ala

1 5

<210> 11

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

Gln Gln Tyr Ser Gly Tyr Pro Leu Thr

1 5

Claims

1.一种嵌合抗原受体(CAR)构建物，其特征在于，所述嵌合抗原受体的抗原结合结构域包含重链可变区和轻链可变区，

所述的重链可变区包括以下互补决定区CDR：

SEQ ID NO:6所示的CDR1，

SEQ ID NO:7所示的CDR2，和

SEQ ID NO:8所示的CDR3；

且所述的轻链可变区包括以下互补决定区CDR：

SEQ ID NO:9所示的CDR1’，

SEQ ID NO:10所示的CDR2’，和

SEQ ID NO:11所示的CDR3’；

较佳地，所述的抗原结合结构域包括SEQ ID NO:3所示的抗体重链可变区，和SEQ IDNO:4所示的抗体轻链可变区。

2.如权利要求1所述的CAR，其特征在于，所述的抗原结合结构域的结构如下式I或II所示：

V_L-V_H (I)；V_H-V_L (II)

其中，V_H为抗体重链可变区；V_L为抗体轻链可变区；“-”为连接肽或肽键；

较佳地，所述的抗原结合结构域的结构如式I(V_H-V_L)所示。

3.如权利要求1所述的CAR，其特征在于，所述嵌合抗原受体的结构如下式III所示：

L-scFv-H-TM-C-CD3ζ (III)

其中，

L为无或信号肽序列；

scFv为靶向EGFR的scFv；

H为绞链区；

TM为跨膜结构域；

C为共刺激信号分子；

CD3ζ为源于CD3ζ的胞浆信号传导序列。

4.如权利要求1所述的CAR，其特征在于，所述的抗原结合结构域结合于EGFR，较佳地，结合于野生型EGFR和EGFRvIII。

5.如权利要求1所述的CAR，其特征在于，所述嵌合抗原受体的氨基酸序列如SEQ IDNO:1所示。

6.一种核酸分子，其特征在于，所述核酸分子编码权利要求1所述的CAR构建物。

7.一种载体，其特征在于，所述的载体含有权利要求6所述的核酸分子。

8.一种宿主细胞，其特征在于，所述的宿主细胞中含有权利要求7所述的载体或染色体中整合有外源的权利要求6所述的核酸分子或表达权利要求1所述的CAR构建物。

9.一种制剂，其特征在于，所述制剂含有权利要求1所述的CAR构建物、权利要求6所述的核酸分子、权利要求7所述的载体、或权利要求8所述的宿主细胞，以及药学上可接受的载体。

10.一种权利要求1所述的CAR构建物、权利要求6所述的核酸分子、权利要求7所述的载体、或权利要求8所述的宿主细胞、或权利要求9所述的制剂的用途，其特征在于，用于制备预防和/或治疗癌症或肿瘤的药物或制剂。