CN115947869A

CN115947869A - 一种靶向人巨细胞病毒的嵌合抗原受体、car-nk细胞及用途

Info

Publication number: CN115947869A
Application number: CN202211513174.9A
Authority: CN
Inventors: 麦秋穗; 何柏林; 邓世楷; 王聪; 张玲; 黎诚耀
Original assignee: Guangzhou Bairuikang Biotechnology Co ltd
Current assignee: Guangzhou Bairuikang Biotechnology Co ltd
Priority date: 2022-11-28
Filing date: 2022-11-28
Publication date: 2023-04-11
Anticipated expiration: 2042-11-28
Also published as: CN115947869B

Abstract

本发明公开了一种靶向人巨细胞病毒的嵌合抗原受体、CAR‑NK细胞及用途。一种靶向人巨细胞病毒的嵌合抗原受体，其包含针对人巨细胞病毒的单链抗体和NKG2D胞外结构域、跨膜区、胞内信号转导区以及IL‑15/IL‑15Rα细胞因子。本发明涉及的CAR结构一方面可以结合HCMV感染细胞，杀伤病毒感染细胞，同时也能发挥诱饵作用，竞争性结合病毒颗粒，抑制其感染作用。本发明方法进行CAR基因转导，CAR在NK细胞中表达阳性率最高可达90%以上，分群明显，随着时间推移CAR表达比例稳定。

Description

一种靶向人巨细胞病毒的嵌合抗原受体、CAR-NK细胞及用途

技术领域

本发明涉及生物技术工程领域，具体涉及了一种靶向人巨细胞病毒的嵌合抗原受体、CAR-NK细胞及用途。

背景技术

人巨细胞病毒（HCMV）感染是造血干细胞移植（HSCT）或实体器官移植（SOT）术后的常见并发症，被称为移植的巨魔。移植术后HCMV感染可直接引发肺炎、肝炎、胃肠疾病、脑炎和CMV综合征等，还会间接增加急慢性排斥反应和其他机会感染的发生率，严重影响预后。移植后HCMV感染的治疗一直是医学界关注的热点，目前大部分移植中心使用更昔洛韦、膦甲酸钠等抗病毒药物防治移植后HCMV感染，存在着骨髓抑制、肾毒性和易产生耐药等问题。以HCMV抗原多肽和CD3单抗和IL-2等细胞因子体外诱导、扩增、制备细胞毒性T淋巴细胞（CMV-CTL），联合抗病毒药物治疗移植后HCMV感染效果良好，然而，存在异体CTL细胞需要HLA配型，自体T细胞活性弱及细胞来源不足等问题，难以规模化应用于临床。

发明内容

为解决现有技术的不足，本发明的目的在于提供了一种靶向人巨细胞病毒的嵌合抗原受体、CAR-NK细胞及用途。

本发明所要解决的技术问题通过以下技术方案予以实现：

第一方面，一种靶向人巨细胞病毒的嵌合抗原受体，其包含针对人巨细胞病毒的单链抗体和NKG2D胞外结构域、跨膜区、胞内信号转导区以及IL-15/IL-15Rα细胞因子。

在本发明中，靶向人巨细胞病毒的嵌合抗原受体还包含位于所述胞外抗原结合域和所述跨膜区之间的铰链域。

第二方面，一种核苷酸，其编码如上述的嵌合抗原受体。

第三方面，一种表达载体，其包括如上述的核苷酸。

在本发明中，所述载体是病毒载体。

在本发明中，所述病毒载体是慢病毒载体或逆转录病毒载体。

第四方面，一种靶向人巨细胞病毒的CAR-NK细胞，其用如上述的载体转导。

第五方面，一种靶向人巨细胞病毒的CAR-NK细胞的构建方法，其包括以下步骤：

（1）构建靶向人巨细胞病毒的嵌合抗原受体，其包含针对人巨细胞病毒的单链抗体和NKG2D胞外结构域、跨膜区、胞内信号转导区以及IL-15/IL-15Rα细胞因子；

（2）嵌合抗原受体转导NK细胞，步骤如下：

①构建包含嵌合抗原受体的逆转录病毒载体：

将步骤（1）的嵌合抗原受体通过NcoI和MluI酶切位点克隆到SFG.CNb30_opt.IRES.eGFP载体内；挑选单克隆进行酶切鉴定、测序鉴定，鉴定正确的质粒再转化感受态DH5α，扩增后提取质粒；质粒转染293A细胞，进行CAR蛋白表达鉴定；

②逆转录病毒包装；

③NK细胞分选和激活；

用磁珠法分选得到NK细胞，与100Gy辐照后的CD48/4-1BBL/mbIL-21 K562细胞按照固定比例共培养激活，激活后第四天进行病毒感染；

④病毒感染：

感染前以PBS配制相应体积的RetroNectin溶液包被Non-treated TissueCulture 24孔板，500mL/孔，封口膜封口4℃包被过夜或37℃包被2小时，RetroNectin溶液回收后在-20℃冻存，可冻融2次；

包被后弃去RetroNectin，加入病毒液，Parafilm封闭孔板，离心2000g×9分钟，RT，收取激活后的NK细胞，以一定密度中烟，接种后再离心Parafilm封闭孔板，离心2000g×9分钟，RT。

第六方面，一种组合物，其包括如上述CAR-NK细胞或由上述构建方法构建的CAR-NK细胞，和药学上可接受的载体。

第七方面，上述细胞在制备治疗靶向人巨细胞病毒感染的药物中的用途。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

自然杀伤细胞（NK）具有广泛抗肿瘤与抗感染作用。本发明靶向人巨细胞病毒的嵌合抗原受体NK细胞（CAR-NK）可通过抗原-抗体和多种受体-配体作用，识别和杀伤HCMV感染细胞，而无需HLA配型，无细胞因子风暴，无移植物抗宿主病（GVHD）和神经毒性的问题。NKG2D 是NK 细胞的活化型受体，能识别表达在靶细胞表面的8 种不同配体。这些配体在正常细胞中不表达或者表达量极少，但当细胞受到感染或者发生癌变时，其表达量会大幅度上升，从而使其成为免疫治疗的通用靶点。另外，鉴于NK 细胞在体内存活时间短，引入IL-15 Rɑ-IL-15 融合蛋白基因，其结构包含IL-15ɑ受体及IL-15，能增强IL-15 活性20 倍，药代动力学特性持续改善，进而增强CAR-NK细胞的持久杀伤靶细胞能力。

本发明涉及的CAR结构一方面可以结合HCMV感染细胞，杀伤病毒感染细胞，同时也能发挥诱饵作用，竞争性结合病毒颗粒，抑制其感染作用。与CAR-T疗法相比，CAR-NK安全性更好，而且无需HLA配型，可开发作为货架型细胞治疗产品；CAR-NK可以通过固有性免疫和适应性免疫两个途径，增强机体的抗病毒免疫力；按照本发明方法进行CAR基因转导，CAR在NK细胞中表达阳性率最高可达90%以上，分群明显，随着时间推移CAR表达比例稳定。

附图说明

图1是HCMV CAR的核心结构，包括信号肽（SS）-NKG2D（和/或）-连接肽（linker）-铰链区（hinge）-跨膜区（TM）-胞内信号域41BB，CD3z-P2A剪接肽（P2A）和IL-15/IL-15Rα；

图2A. SFG.CNb30_opt.IRES.eGFP-HCMV CAR重组质粒图谱，图2B. 电泳鉴定结果，从左到右分别是DL10,000DNA marker，未酶切质粒（10363bp）和KpnI限制性内切酶切得的目的条带（4316bp、3371bp、1476bp和1200bp）图2C. 测序鉴定的结果；

图3 是逆转录病毒对NK细胞的感染效果（与pHAGE质粒包装的慢病毒感染效果平行对照）病毒感染后72小时流式细胞术检测感染效率，第一列是FSC-SSC散点图，逆转录病毒感染法比慢病毒感染法毒性更小，细胞碎片更少，淋巴细胞比例更高；第二列显示NK纯度均为90%左右；第三列显示CAR比例，逆转录病毒感染CAR比例约为80-90%，慢病毒感染比例约为40-50%，逆转录病毒感染分群更为明显；

图4 A. 是HCMV在MRC-5中的扩增曲线。HCMV感染MRC-5约14天后能得到较高滴度的HCMV病毒，PCR测得病毒拷贝数达10⁸数量级；图4B是HCMV感染MRC-5免疫荧光显示HCMVpp65抗原强表达；图4C是HCMV感染MRC-5第三天形态（96孔板，5000/孔）。收取病毒感染MRC-5约3天后测PCR拷贝数为106数量级，消化细胞，按照5000/孔，铺96孔板，细胞形态正常，台盼蓝染色显示细胞活率约为90%，用于后续检测杀伤效果和特异性细胞因子释放的靶细胞；

图5 HCMV CAR-NK对HCMV感染MRC-5杀伤效果 NK细胞和靶细胞按照效靶比10:1接种，共培养14小时后观察到CAR-NK对HCMV阴性的MRC-5无明显杀伤作用，对HCMV阳性组MRC-5杀伤作用明显；未转CAR的NK细胞对HCMV感染的MRC-5也有一定程度的杀伤作用，但是效果不如CAR-NK明显；

图6A-D分别示出流式胞内染色的方法检测CD107a，IFN-γ，TNF-α和Granzyme B的表达；HCMV CAR-NK免疫特异性细胞因子的释放普通NK（NT）、HCMV scFv CAR-NK（S）、NKG2D-HCMV scFv-CAR-NK（NS）和NKG2D-HCMV scFv-IL-15/IL-15Rα-CAR-NK（NS15）分别与HCMV感染的MRC-5共培养6小时后，流式检测CD107a，IFN-γ，TNF-α和Granzyme B胞内因子释放；结果显示在NK细胞亚群中（CD56⁺）CD107a，IFN-γ和TNF-α的表达：NS15＞NS＞S＞NT，其中NS15 IFN-γ和TNF-α与NT相比有统计学差异， Granzyme B无差异。

具体实施方式

以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。

实施例1构建SFG.CNb30_opt.IRES.eGFP-HCMV CAR重组质粒

①按照HCMVCAR结构（如图1所示），全基因合成HCMV CAR序列（Sequence No. 1），获得重组质粒pMV-HCMV CAR（如图2A所示），以NcoI和MluI为酶切位点；

②质粒扩增：将pMV-HCMV CAR质粒（氨苄西林抗性）和逆转录病毒载体质粒SFG.CNb30_opt.IRES.eGFP（氨苄西林抗性）分别转化感受态细胞DH5α，在LB培养基中扩增后用Tiangen无内毒素中提试剂盒提取质粒，经过酶切鉴定和测序鉴定正确及进行重组质粒构建；

③双酶切SFG.CNb30_opt.IRES.eGFP和pMV-HCMV CAR，酶切体系如表一：

表一双酶切质粒体系

试剂名称
		NcoI	0.5μL
MluI	0.5μL
		Cutsmart Buffer	1μL
质粒（SFG.CNb30_opt.IRES.eGFP or pMV-HCMV CAR）	2μg
		RNase Free H<sub>2</sub>O	Up to 10

金属浴37℃ 2小时。

酶切产物电泳鉴定并回收相应片段，然后进行连接和转化，挑取单克隆，提取质粒后进行酶切鉴定（如图2B所示）和Sanger测序鉴定（如图2C所示）获得重组质粒SFG.CNb30_opt.IRES.eGFP CAR。

实施例2 逆转录病毒包装

①293T/17复苏、传代和铺皿

以含10%胎牛血清，1%L-谷氨酰胺和青链霉素的DMEM培养基培养293T/17，第一天复苏一管293T/17，约含4x10⁶细胞，以8mL培养基接种到T25培养瓶中，第二天更换培养基，第三天传代至T75培养瓶中，第六天传代时铺10cm皿用于逆转录病毒包装，每10cm皿接种2-4×10⁶293T/17 （10mL），接种后12-16小时进行质粒转染；

②质粒转染

先于冰上解冻质粒RDF( env )、PegPam3 ( gag-pol )和SFG.CNb30_opt.IRES.eGFP-HCMV CAR，复温无血清DMEM培养基；按照表二体系，配制质粒混合物DNAmix；配制转染试剂470μL DMEM+30μL Genejuice转染试剂，Genejuice加入前先震荡混匀，配置后室温孵育5分钟；将孵育后的转染试剂逐滴加入DNA mix中，轻弹约20次混匀后室温孵育15分钟，最后再均匀逐滴加入前一天铺好的293T/17中，轻轻十字混匀，继续于37℃，5%CO2中培养。

表二 DNA mix

质粒	质量	浓度	体积
				RDF( env )	2.50	X	2.5×1000/X
PegPam3 ( gag-pol )	3.75	Y	3.75×1000/Y
				SFG.CNb30_opt.IRES.eGFP-HCMV CAR	3.75	Z	3.75×1000/Z

③收病毒和病毒保存培养至48小时和72小时观察GFP表达，收取病毒液，用0.45μm针式过滤器过滤后分装保存与-80℃。

实施例3 NK细胞激活和逆转录病毒感染NK细胞

A.饲养细胞 CD48/4-1BBL/mbIL-21 K562 辐照

从液氮罐中取出细胞，37℃水浴2分钟，加入18mL IMDM全培至50毫升离心管中，逐滴加入细胞悬液，离心400g×5分钟，去除上清，弹震松解细胞团，再加入20mL全培，离心400g×5分钟，离心前取出细胞计数（以台盼蓝稀释1:1）；取出相应数量的饲养细胞，重悬至相应浓度后置于25cm²/75cm²细胞培养瓶中辐照，辐照的条件是100Gy，1.5Gy/min。

B.PBMC获取（新鲜分离/冻存后复苏）

（1）新鲜PBMC分离和冻存

取白膜层/动员后干细胞产品来源PBMC（约3mL），吸取血液样本小心加到分离液的液面上，离心600g×30分钟；离心后，此时离心管中从上而下分为4层，第一层为血浆层，第二层为环状乳白色淋巴细胞层，第三层为透明分离液层，第四层为红细胞层；取白环层，加入3倍以上体积PBS洗涤两次，离心60-100g×10分钟，弃上清；用70μm筛网过滤后细胞计数（台盼蓝稀释1:1），以FBS-DMSO冻存液（9:1）冻存，2-8×10e7/管；新鲜PBMC需留取样本，流式检测CD3/CD56比例；

（2）冻存PBMC复苏

从液氮罐中取出PBMC，37℃水浴2分钟；加入18mL IMDM全培至50毫升离心管中，逐滴加入PBMC，离心400g×5分钟；3.去除上清，弹震松解细胞团，再加入20mL全培，离心400g×5分钟，离心前取出细胞计数，计数前用70μm筛网过滤（以台盼蓝稀释1:1）。

C. NK细胞分选

（1）磁珠孵育

取出相应数量PBMC，按照细胞计数每10e7 PBMC加入40μLMACS buffer；每10e7PBMC加入5μL NK Cell Biotin-Antibody Cocktail，混匀后2-8℃冰箱孵育15分钟；每10e7PBMC加入30μL MACS buffer，混匀；每10e7 PBMC加入10μL NK Cell MicrobeadsCocktail，混匀后2-8℃冰箱孵育15分钟；注：1. 快速操作，尽量使细胞和液体保持在2-8℃；2.为保证分选效率，避免混入细胞团块；3.分选前补足液体至500μL；

（2）分选

用75%酒精擦拭MACS分选器，安装好LS分选柱，分选前过滤器（30μm）和15mL离心管；用3mL MACS buffer润洗分选柱；加入细胞悬液，经过分选前过滤器通过分选柱，用15mL离心管收集未标记的细胞，为所得的NK细胞；用3mL MACS buffer润洗分选柱2次，留取样品流式检测CD3CD56比例。注：每次进行到下一步前需等待分选柱的液体流尽。

D．K562与NK按照固定比例种板

获取的K562细胞和分选后的NK细胞（0.5×10e6/孔）按照相应比例混合，以SCGM全培重悬，加入100IU/mL IL-2和10ng/mL IL-15，种至24孔板（Tissue-Treated），2mL/孔。

E.逆转录病毒感染NK细胞

NK激活后第三天以PBS配制相应体积的RetroNectin溶液包被Non-treatedTissue Culture 24孔板，7μg/mL，500mL/孔，封口膜封口4℃包被过夜或37℃包被2小时，RetroNectin溶液回收后在-20℃冻存，可用两次；

NK激活第四天进行转病毒，实验过程如下：

（1）包被病毒液

提前半小时取出病毒液，常温解冻；回收RetroNectin溶液，每孔加入1mL病毒液，贴壁轻轻加入，防止吹起底部的RetroNectin，每次加两孔，防止孔变干；Parafilm封闭孔板，离心2000g×9分钟，RT；

（2）收取激活的NK细胞

收取+4d激活的NK，计数，离心400g×5分钟，RT；以SCGM全培（含100IU/mL IL-2和10μg/mL IL-15）重悬为0.25×10e6/mL；

（3）接种NK

轻轻吸去病毒液，再轻轻在每孔中加入2mL NK细胞，每次操作两孔，防止孔变干；离心400g×5分钟，RT；留取0.5-1×10e6进行流式检测，必须设置non-transduced 组。

病毒感染72h后收取细胞检测CAR表达，逆转录病毒感染、慢病毒感染和non-transduced 组比较（如图3所示）。

实施例4 HCMV病毒扩增、PCR测拷贝数以及HCMV感染MRC-5细胞模型的建立

A. HCMV病毒扩增

在病毒接种前一天准备MRC-5细胞，铺好6孔板，1×10⁶/2mL DMEM培养基（含10%FBS，1%双抗和L谷氨酰胺），5%CO₂，37℃培养至单层后，接种病毒；

接种病毒时，取出6孔板，弃掉培养基，用PBS清洗一次；病毒液稀释10倍，每孔加入1mL的病毒稀释液，保留空白对照，空白对照孔加无血清的DMEM，34℃孵育2h；

配制维持液：含2%FBS和1%双抗的DMEM；孵育后，每孔加1mL的维持液，34℃培养3-5d，每天观察CPE；若无明显CPE，可3-4天后收取上清进行PCR检测，如果要扩增病毒的滴度较高，建议每天观察CPE，3-4天后每孔收取100ul上清再加入新的维持液培养，PCR监测病毒滴度，达到所需滴度时再收毒（CPE达到80%后就可以收毒）；收毒：用枪头将细胞刮落，收取病毒液，离心800rpm/5min，取上清500ul/管-80℃保存；用人巨细胞病毒（HCMV)核酸扩增（PCR）荧光定量检测试剂盒检测HCMV拷贝数，扩增约14天，HCMV拷贝数达10⁸（如图4A所示）；免疫荧光显示CMVpp65抗原阳性（如图4B所示）；

B. HCMV感染MRC-5细胞模型的建立

在检测中所用到的细胞模型需表达HCMV抗原同时细胞活性较好，经过摸索，发明人使用HCMV感染3-4天的MRC-5作为靶细胞，此时细胞活性较好，而且HCMV抗原强表达；

相对定量的方法是PCR测拷贝数约为10⁶时消化细胞，按照1×10⁵/孔铺96孔板，此时细胞活率为90%左右，作为HCMV模型应用于后续实验杀伤和机制实验（如图4C所示）；

实施例5 HCMV CAR-NK杀伤HCMV感染MRC-5细胞实验

NK细胞和MRC-5的效靶比设置为10:1，共培养14小时后观察到CAR-NK对HCMV阴性的MRC-5无明显杀伤作用对HCMV阳性组MRC-5杀伤作用明显（如图5所示）。

实施例6 HCMV CAR-NK与HCMV感染MRC-5共培养特异性细胞因子的释放

NK细胞和MRC-5的效靶比设置为4:1，流式胞内染色的方法检测CD107a，IFN-γ，TNF-α和Granzyme B的表达（如图6所示A-D所示）。

步骤如下：

【效靶细胞共培养】

1.计数效应细胞，以X-VIVO全培重悬至4×106/mL；

2.以0.2 x10⁶(50 uL)每孔种至U型底96孔板，同时设置相应的阴性对照；

3.计数靶细胞（如果是贴壁细胞，用平底96孔板，提前一天铺板），重悬至1 x106/mL；

4.以0.8 x106 (40 uL)每孔种至U型底96孔板，同时设置相应的阴性对照；

5.每孔加入5μL CD107a PE-cy7，CD107a-FMO组除外；

6.例如，对于20个样本：

BFA solution: 2μL 1000×Monensin (Biolegend)+ 2μL 1000×Brefeldin A(Biolegend)+16μL X-VIVO全培，混匀后每孔加1μL

7.37℃孵育5小时；

8.孵育后孔板可在2-8℃保存过夜（但不能超过13小时）。

【抗体孵育和流式检测】

1. 将孔板中的细胞转移至流式管，每个孔再加入100μL FACS buffer洗涤一次将细胞吸尽，离心400g×5分钟；

2. 每孔加入2.5μL protein L，4℃孵育15分钟；

3.离心400g×5分钟，用100uLFACS buffer洗涤一次；

4. 加5μL Fc block (Biolegend)，室温孵育10分钟；

5. 表面抗体染色：Anti-CD3，Anti-CD56（2μl/Ab），室温孵育10分钟；

6. 4℃孵育15分钟；

7. FACS buffer洗涤一次；

8. 加入fixable live dead stain (Thermofisher#L34992)（1μL稀释到1mLFACS buffer，每孔加200μL）；

9. 4℃孵育20分钟，FACS buffer洗两次；

10.每孔加入100 uL BD Fixation/Permeabilization solution重悬，4℃孵育20分钟；

11.每个样品加入250 uL1×BD Perm/Wash buffer（用双蒸水稀释10×BD Perm/Wash buffer）洗涤两次；

12. 每个样品用50uL of BD Perm/Wash + 50uL of Brilliant Stain Buffer重悬固定/破膜细胞（包含相应浓度的细胞因子抗体，每个抗体约5-10uL），4℃孵育30分钟；

13.用250 uL 1× BD Perm/Wash buffer洗涤两次，上机前用FACS buffer重悬。

以上所述实施例仅表达了本发明的实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制，但凡采用等同替换或等效变换的形式所获得的技术方案，均应落在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种靶向人巨细胞病毒的嵌合抗原受体，其特征在于，其包含针对人巨细胞病毒的单链抗体和NKG2D胞外结构域、跨膜区、胞内信号转导区以及IL-15/IL-15Rα细胞因子。

2.根据权利要求1所述的靶向人巨细胞病毒的嵌合抗原受体，其特征在于，还包含位于所述胞外抗原结合域和所述跨膜区之间的铰链域。

3.一种核苷酸，其特征在于，其编码如权利要求1或2所述的嵌合抗原受体。

4.一种表达载体，其特征在于，其包括权利要求3所述的核苷酸。

5.根据权利要求4所述的表达载体，其特征在于，所述载体是病毒载体。

6.根据权利要求5所述的表达载体，其特征在于，所述病毒载体是慢病毒载体或逆转录病毒载体。

7.一种靶向人巨细胞病毒的CAR-NK细胞，其特征在于，其用权利要求4-6任一项所述的载体转导。

8.一种靶向人巨细胞病毒的CAR-NK细胞的构建方法，其特征在于，其包括以下步骤：

（2）嵌合抗原受体转导NK细胞，步骤如下：

①构建包含嵌合抗原受体的逆转录病毒载体：

②逆转录病毒包装；

③NK细胞分选和激活；

④病毒感染：

感染前以PBS配制相应体积的RetroNectin溶液包被Non-treated Tissue Culture 24孔板，500mL/孔，封口膜封口4℃包被过夜或37℃包被2小时，RetroNectin溶液回收后在-20℃冻存，可冻融2次；

9.一种组合物，其包括如权利要求7的CAR-NK细胞或由权利要求8构建方法构建的CAR-NK细胞，和药学上可接受的载体。

10.如权利要求7所述的细胞在制备治疗靶向人巨细胞病毒感染的药物中的用途。