JP7289562B2 - 抗ｂｃｍａ単一ドメイン抗体及びその適用 - Google Patents

Description

本開示はバイオテクノロジーの分野に属する。特に、本開示は、Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）に対する一群の単一ドメイン抗体及びその使用に関する。

ＢＣＭＡ（Ｂ細胞成熟抗原、ＢＣＭＡ）は、Ｂ細胞活性化因子（ＢＡＦＦ）またはＢリンパ球刺激因子（ＢＬｙＳ）及び分裂増殖誘導リガンド（ＡＰＲＩＬ）へ結合し得る、腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）スーパーファミリーのメンバーである。正常な細胞において、ＢＣＭＡは主として形質細胞及びいくつかの成熟Ｂ細胞によって発現されるが、大部分のＢ細胞または他の器官において発現されないことが報告されている。多発性骨髄腫（ＭＭ）は、クローン性形質細胞の大規模な分裂増殖によって特徴づけられる悪性腫瘍である。ＢＣＭＡのＲＮＡは、概して、ＭＭ細胞において検出され、ＢＣＭＡタンパク質は、多発性骨髄腫に罹患した患者の形質細胞の表面上で検出され得る。したがって、ＭＭの免疫治療のための候補標的抗原は、ＢＣＭＡである。現在のところ、ＭＭ治療は寛解を誘導することができるが、ほとんどすべての患者は最終的には再発し死亡するだろう。いくつかのモノクローナル抗体候補薬物は、前臨床研究及び初期臨床試験においてＭＭを治療するのに有望であることを示したが、世界的なコンセンサスによって承認されず、モノクローナル抗体薬物は市販されていない。明らかに、ＭＭのための新たな免疫学的治療法の緊急の必要性があり、この疾患のために開発された有効な抗原特異的養子Ｔ細胞療法は、重要な研究進歩であるだろう。

ナノボディとして公知の単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）は、軽鎖が非存在である、アルパカ血液中で見出される重鎖抗体である。ナノ粒子科学と組み合わせて分子生物学技術を使用することによって、ベルギーの科学者は、抗原へ結合し得る新規の抗体の低分子量断片を開発した。それは、一群の利点（単純な構造、強い浸透性、容易な発現及び精製、高い親和性及び安定性、ならびに毒性及び副反応がない、または同種のもの等）を有する。様々な標的抗原のための単一ドメイン抗体は、単一ドメイン抗体プラットフォーム技術の使用によって研究され、次いで生物医学の分野において使用されている。

本開示は、ＢＣＭＡを標的化する治療抗体候補薬物及びキメラ抗原受容体Ｔ細胞における使用のために有望な一群の抗ＢＣＭＡ単一ドメイン抗体を開発することを目的とする。

本開示によって解決されるべき技術的問題は、良好な効果を有する新規の一群の抗ＢＣＭＡ単一ドメイン抗体を提供することである。

本開示によって解決されるべき別の技術的問題は、抗ＢＣＭＡ単一ドメイン抗体の様々な使用を開発することである。

上記の目的を達成するために、本開示は、以下の技術的解決を提供する。

本開示は、フレームワーク領域及び相補性決定領域からなる一群の抗ＢＣＭＡ単一ドメイン抗体を提供し、相補性決定領域は、配列番号：１～６６のものから選択されるアミノ酸配列（添付書類１：スクリーニングされたＢＣＭＡ－ｓｄＡｂの相補性決定領域のアミノ酸配列）を有する。

いくつかの実施形態において、相補性決定領域のアミノ酸配列は、配列番号：１～６６に記載されるアミノ酸配列に対して、８０％超、８５％超、９０％超、９５％超、または９９％超の同一性を有する。

好ましくは、アミノ酸中の差異は保存的置換である。

いくつかの実施形態において、群中の単一ドメイン抗体は、配列番号：６７～１３２から選択されるアミノ酸配列を有するか、または配列番号：６７～１３２から選択されるアミノ酸配列（添付書類２：スクリーニングされたＢＣＭＡ－ｓｄＡｂのアミノ酸配列）である。

いくつかの実施形態において、単一ドメイン抗体のアミノ酸配列は、配列番号：６７～１３２に記載されるアミノ酸配列に対して、８０％超、８５％超、９０％超、９５％超、または９９％超の同一性を有する。

好ましくは、アミノ酸中の差異は保存的置換、より好ましくは１つまたは複数の保存的置換である。

本開示は、配列番号：１３３～１９８のものから選択されるヌクレオチド配列（添付書類３：スクリーニングされたＢＣＭＡ－ｓｄＡｂのヌクレオチド配列）を有するか、もしくは配列番号：１３３～１９８のヌクレオチド配列であるか、または上記の単一ドメイン抗体をコードするヌクレオチド配列である、一群の抗ＢＣＭＡ単一ドメイン抗体の遺伝子を提供する。

いくつかの実施形態において、単一ドメイン抗体の核酸配列は、配列番号：１３３～１９８に記載される核酸配列に対して、８０％超、８５％超、９０％超、９５％超、または９９％超の同一性を有する。

好ましくは、塩基中の差異は保存的置換、より好ましくは１つまたは複数の保存的置換である。

本開示は、上記の一群の単一ドメイン抗体から選択される１つまたは複数の単一ドメイン抗体を有するポリペプチドを提供する。

好ましくは、複数の単一ドメイン抗体は同じかまたは異なる。

本開示は、上記の単一ドメイン抗体の遺伝子の群から選択される１つまたは複数の遺伝子を含む発現ベクターを提供する。

好ましくは、発現ベクターは、原核生物細胞発現ベクター、真核生物細胞発現ベクター、または他の細胞発現ベクター（複数可）である。

本開示は、上記の発現ベクターを含む宿主細胞を提供する。

好ましくは、宿主細胞は、原核生物発現細胞、真核生物発現細胞、真菌細胞、または酵母細胞であり、原核生物発現細胞は、好ましくはＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉである。

本開示は、単一ドメイン抗体の上記の群から選択される１つまたは複数の単一ドメイン抗体を有する、キメラ抗原受容体を提供する。

好ましくは、複数の単一ドメイン抗体は同じかまたは異なる。

本開示は、上記のキメラ抗原受容体によって修飾された、キメラ抗原受容体によって修飾されたＴ細胞を提供する。

本開示は、活性成分として、単一ドメイン抗体の上記の群から選択される１つまたは複数の単一ドメイン抗体を含む、医薬組成物を提供する。

本開示は、単一ドメイン抗体の上記の群から選択される単一ドメイン抗体のヒト化によって得られる、ヒト化抗ＢＣＭＡ単一ドメイン抗体を提供する。

本開示は、ＢＣＭＡの検出における、単一ドメイン抗体の上記の群中の単一ドメイン抗体の使用を提供する。

本開示は、ＢＡＦＦとＢＣＭＡとの間の相互作用をブロッキングするための、単一ドメイン抗体の上記の群中の単一ドメイン抗体の使用を提供する。

いくつかの実施形態において、単一ドメイン抗体は、細胞傷害剤、酵素、放射性同位体、蛍光化合物、または化学発光化合物のうちの１つまたは複数へ連結される。

本開示は、異常なＢＣＭＡ発現と関連する疾患の治療のための薬物の調製における、単一ドメイン抗体の上記の群中の単一ドメイン抗体の使用を提供する。

好ましくは、異常なＢＣＭＡ発現と関連する疾患は、多発性骨髄腫疾患である。

本開示は、以下の有益な技術的効果を有する。

本開示は、一群の抗ＢＣＭＡ単一ドメイン抗体をスクリーニングする。既存の抗体と比較して、この群中のそれぞれの抗ＢＣＭＡ単一ドメイン抗体は高い活性及び強い中和能力または結合能力を有する。この群の単一ドメイン抗体は、ヒトＢＣＭＡ抗原、または細胞表面上でＢＣＭＡを発現する腫瘍細胞株へ特異的に結合し、ＢＡＦＦ抗原のＢＣＭＡへの結合を有効にブロッキングし、対応するシグナルカスケード効果を生成し得る。一群の単一ドメイン抗体は、異常なＢＣＭＡ発現と関連する複数の疾患を検出及び／または治療するために使用され得る。

以下に、本開示は添付の図面及び実施例への参照によって詳細に記載されるだろうが、本開示の範囲はそれに限定されない。

第１ラウンドのＰＣＲによる通常の重鎖抗体の増幅及び一本鎖抗体の遺伝子を示す。（マーカー）（１５００ＢＰ、１０００ＢＰ、８００ＢＰ、５００ＢＰ、２５０ＢＰ、及び１００ＢＰ）を参照して、１はＰＣＲ増幅生成物であり、８００ＢＰ超を有する通常の重鎖遺伝子増幅断片と、８００ＢＰ未満を有する重鎖抗体遺伝子増幅断片がある。２及び３はＰＣＲ増幅生成物であり、約５００ＢＰのみを有する重鎖抗体遺伝子増幅断片である。 第２ラウンドのＰＣＲ増幅において得られたＶＨＨ標的遺伝子断片を示す。マーカー（１５００ＢＰ、１２００ＢＰ、１０００ＢＰ、８００ＢＰ、７００ＢＰ、６００ＢＰ、５００ＢＰ、２５０ＢＰ、及び１００ＢＰ）。１～１２はＰＣＲ増幅生成物であり、約５００ＢＰを有する重鎖抗体ＶＨＨ遺伝子増幅断片である。 精製前の発現されたＢＣＭＡ－ｓｄＡｂのＳＤＳ－ＰＡＧＥの実例である。 ニッケルカラムによって精製した後の発現されたＢＣＭＡ－ｓｄＡｂのＳＤＳ－ＰＡＧＥの実例を示す。 ＢＣＭＡタンパク質へ結合する精製ＢＣＭＡ単一ドメイン抗体の濃度勾配を示す（ＥＬＩＳＡ）。 ＢＣＭＡ単一ドメイン抗体が、ＢＡＦＦタンパク質のＢＣＭＡタンパク質への結合を競合的に阻害できることを示す。 腫瘍細胞に対するＢＣＭＡ ＣＡＲＴの殺傷効率を示す。

本開示は、高い活性及び高い中和性または結合能力の可能性を有する一群の抗ＢＣＭＡ単一ドメイン抗体を、一群のステップによってスクリーニングする。これらの単一ドメイン抗体は、類似構造（フレームワーク領域及び相補性決定領域からなる）及び類似する機能効果を有する。したがって、それらは、通常の構造及び通常の特性効果を有する一群の抗ＢＣＭＡ単一ドメイン抗体として判断され得る。

「ＢＣＭＡ」という用語は、本明細書において使用される時、Ｂ細胞活性化因子またはＢリンパ球刺激物質及び分裂増殖誘導リガンド（ＡＰＲＩＬ）へ結合し得る、腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）スーパーファミリーのメンバーである。多発性骨髄腫（ＭＭ）は、クローン性形質細胞の大規模な分裂増殖によって特徴づけられる悪性腫瘍である。ＢＣＭＡのＲＮＡは、概して、ＭＭ細胞において検出され、ＢＣＭＡタンパク質は、多発性骨髄腫に罹患した患者において形質細胞の表面上で検出され得る。

「多発性骨髄腫（ＭＭ）」という用語は、本明細書において使用される時、クローン性形質細胞の大規模な分裂増殖によって特徴づけられる悪性腫瘍である。現在のところ、ＭＭ治療は寛解を誘導することができるが、ほとんどすべての患者は最終的には再発し死亡するだろう。いくつかのモノクローナル抗体は、前臨床研究及び初期臨床試験においてＭＭを治療するのに有望であることを示したが、世界的に承認されなかった。明らかに、ＭＭのための新たな抗体及び新たな免疫学的療法についての緊急の必要性がある。

ＢＣＭＡに対する新たな抗体は、開発対象物及び最終的に本開示の保護対象物である。本開示の範囲は、得られた抗ＢＣＭＡ抗体及びその様々な形態（例えば単一ドメイン抗体）、そして、構成成分として抗体を含む物質（例えば医薬組成物、キット、ベクター、キメラ抗原受容体、キメラ抗原受容体修飾Ｔ細胞、または同種のもの）、使用（例えば診断、治療または適用のための使用など）を網羅する。しかしながら、本開示の保護対象物がこれらの例示的な内容に限定されないことは、当業者によって理解されよう。

「単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）」という用語は、本明細書において使用される時、抗体中に単一可変ドメインを含有する断片を指し、ナノボディとして公知である。完全な抗体と同様に、それは、特異的な抗原へ選択的に結合し得る。完全な抗体の質量（１５０～１６０ｋＤａ）と比較して、単一ドメイン抗体（約１２～１５ｋＤａにすぎない）は、はるかに小さい。最初の単一ドメイン抗体は、人工的操作によってアルパカ重鎖抗体から作製され、「ＶＨＨセグメント」として公知であった。好ましい実施形態において、本開示はアルパカの単一ドメイン抗体を使用するが、当業者は、本開示が他の種に由来する単一ドメイン抗体も網羅し得ることを理解されたい。限定されずに、本開示の単一ドメイン抗体は、抗ＢＣＭＡ単一ドメイン抗体である。

「フレームワーク領域」という用語は、骨格領域としても公知である。免疫グロブリンのＨ鎖及びＬ鎖のＮ末端付近の約１１０アミノ酸の配列は、大幅に変動する一方で、他の位置におけるアミノ酸配列は相対的に一定である。したがって、軽鎖及び重鎖は、可変領域００及び定常領域（Ｃ）へ分割され得る。可変領域は、ＨＶＲ（超可変領域）（相補性決定領域（ＣＤＲ）としても公知）及びフレーム領域（ＦＲ）を含有する。ＦＲの変動は、ＣＤＲのものより少ない。合計で４つのＦＲ分子（すなわちそれぞれＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及びＦＲ４）がある。抗体の認識の間に、４つのＦＲ分子をひだを寄せるようにして、その結果、ＣＤＲ分子は互いに接近する。本開示は具体的なフレームワーク領域（複数可）へ限定されないことが理解され、当業者は、本開示の保護範囲から逸脱せずに、実践的な要求に従って適切なフレームワーク領域（複数可）を選択するかまたは得ることができる。

「相補性決定領域」（ＣＤＲ）という用語について、抗体全体の分子は、定常領域及び可変領域へと分割され得る。可変領域において、いくつかのアミノ酸残基は高度に可変であり、これらのアミノ酸残基の構成及び配置順が変動する傾向のある領域は、超可変領域と呼ばれる。Ｌ鎖及びＨ鎖のＶ領域中に３つの超可変領域（ＨＶＲ）があり、それは空間的な構造の点から抗原決定基との正確な相補性を形成することができ、したがって超可変領域は相補性決定領域とも呼ばれる。

配列の「同一性」という用語は、本明細書において使用される時、「相同性」と互換的に使用され、配列アライメントソフトウェア（ＢＬＡＳＴ等）によって測定されるような配列間の類似度を指す。配列アライメント方法及びソフトウェアは当業者に周知である。修飾されたヌクレオチド配列は、既知の配列中の、１つまたは複数（例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８またはそれ以上）のアミノ酸または塩基の置換、欠失及び／または添加によって得られ得る。例えば、従来の手段（例えば保存的置換によって）による本開示の配列の配列番号：１～１９８のうちの１つまたは複数に記載されるアミノ酸配列またはヌクレオチド配列の修飾によって、これらの配列へ８０％超、８５％超、９０％超、９５％超、または９９％超の配列同一性を有し、実質的に同じ特性を有し、本開示の保護範囲内に網羅される、配列を得ることは実現可能である。好ましくは、本開示は保存的置換によって配列同一性を得るが、それに限定されない。

「アミノ酸配列」という用語は、アミノ酸が互いへ連結されてペプチド鎖（またはポリペプチド）を形成し、アミノ酸配列が１つの方向においてのみを読まれ得る、アレンジを指す。１００タイプを超える異なるアミノ酸があり、そのうちの２０が通常は使用される。本開示は、他の物質（例えば糖類、脂質、及び他の修飾）がアミノ酸鎖へ結合される事例を除外せず、通常使用される２０のアミノ酸に限定されない。

「ヌクレオチド配列」という用語は、ＤＮＡまたはＲＮＡ中の塩基のアレンジ（すなわちＤＮＡ中のＡ、Ｔ、Ｇ及びＣのアレンジ、またはｍＲＮＡ中のＡ、Ｕ、Ｇ及びＣのアレンジ）を指す。それは、リボソームＲＮＡ、ｔＲＮＡ、及びｍＲＮＡ中の塩基のアレンジも包含する。本開示の抗体遺伝子に加えて、ＤＮＡ配列、ＲＮＡ（リボソームＲＮＡ、ｔＲＮＡ、及びｍＲＮＡ）及びそれらの相補的な配列も網羅されることを理解されたい。本開示の抗体をコードする遺伝子が、本開示の配列番号：１３３～１９８において記載される配列に同等ではないこと、及び、本開示の抗体をコードするが、配列番号：１３３～１９８において記載されるヌクレオチド配列とは異なる遺伝子も、本開示の保護範囲内であることも、理解されたい。

いくつかの実施形態において、本開示のポリペプチド、医薬組成物、キメラ抗体受容体、またはＣＡＲＴは、１つの単一ドメイン抗体を含み、本開示はそれに限定されていないことを理解されたい。本開示の上記の物質は、２、３、または複数の単一ドメイン抗体を含有し、複数の単一ドメイン抗体は同じかまたは異なり得る。さらに、本開示の単一ドメイン抗体に加えて、他の抗体、または本開示中に含有されない単一ドメイン抗体も、本開示の範囲を越えずに包含され得る。

「発現ベクター」という用語は、標的遺伝子が発現され得るように、クローニングベクターの基本的な骨格上に発現エレメント（プロモーター、ＲＢＳ、またはターミナー（ｔｅｒｍｉｎｏｒ）等）を取り込む、ベクターを指す。発現ベクターは、４つの部分：標的遺伝子、プロモーター、ターミネーター、及びマーカー遺伝子を含む。本開示は、原核生物細胞発現ベクター、真核生物細胞発現ベクター、または他の細胞発現ベクターを包含するがこれらに限定されない。

「キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）」は、「キメラ抗原受容体Ｔ細胞（ＣＡＲＴ）」のコアの構成要素であり、天然のＴ細胞表面受容体と比較して、ＣＡＲによって修飾されたＴ細胞が広範囲の標的を認識することができるように、非依存的様式で腫瘍抗原を認識する能力をＴ細胞に付与する。ＣＡＲの基本的なデザインは、腫瘍関連抗原結合領域、細胞外ヒンジ領域、膜貫通領域、及び細胞内シグナル領域を含む。

本開示の一実施形態において、本開示のキメラ抗原受容体またはキメラ抗原受容体Ｔ細胞は、本開示の１つ、２つ、またはそれ以上の単一ドメイン抗体を含有し、それは同じかまたは異なり得る。

本開示の一実施形態において、本開示の「医薬組成物」は、本開示の１つ、２つ、またはそれ以上の単一ドメイン抗体を含有し、それは同じかまたは異なり得る。

「ヒト化」抗体という用語は、抗体の定常領域（すなわちＣＨ領域及びＣＬ領域）、または抗体全体が、ヒト抗体遺伝子によってコードされる抗体を指す。ヒト化抗体は、人体における異種抗体の免疫副反応を大幅に低減させ得る。ヒト化抗体としては、キメラ抗体、修飾された抗体、及び完全なヒト抗体を包含する複数のタイプが挙げられる。当業者は、本開示の範囲内である本開示の単一ドメイン抗体の好適なヒト化された形態を、実践的な要求に従って調製し得ることが認識されよう。

「レンチウイルス」という用語は、本明細書において使用される時、ヒト及び脊椎動物に感染し得る８つのウイルスを包含するＲｅｔｒｏｖｉｒｉｄａｅの１つの属であり、一次感染細胞は主としてリンパ球及びマクロファージであり、感染した個体は最終的には疾患を発症するだろう。レンチウイルスのタイプとしては、例えばヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）、ウマ伝染性貧血（ＥＩＡ）、及びネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）が挙げられる。レンチウイルスベクター研究の進歩は、急速且つ集中的である。このベクターは、持続的発現を達成するように宿主染色体の中へ外来遺伝子を有効に組み込むことができる。感染力の点から、それはニューロン、肝細胞、心筋細胞、腫瘍細胞、内皮細胞、幹細胞、及び他のタイプの細胞に有効に感染することができ、その結果、良好な遺伝子治療有効性を達成する。加えて、当業者は、レンチウイルス以外の他の好適なベクターも選択することができ、それは本開示の保護範囲内である。

以後で、本開示は、以下の実施例への参照によって詳細に記載されるだろう。しかしながら、当業者に対して、他の変動が、十分に確立されているか、または直接的な開示及び添付の請求項に従って自明であるので、本開示はこれらの実施例の具体的な細部に限定されない。したがって、本開示の上の記載に基づいて達成されるすべての技術は、本開示の範囲以内にあるものとする。

別段の定めのない限り、以下の実施例において記載されるすべての実験方法は従来の方法であり、すべての試薬及び生体材料は別段の定めのない限り市販で入手可能である。

実施例１：抗ＢＣＭＡ抗原特異的単一ドメイン抗体ライブラリーの構築
１）ＢＣＭＡ抗原によるアルパカの免疫
従来の免疫方法に従って遂行される。簡潔には、成体の健康なアルパカに、ＢＣＭＡ抗原（Ｂｅｉｊｉｎｇ Ｙｉｑｉａｏ Ｓｈｅｎｚｈｏｕから購入したヒトＴＮＦＲＳＦ１７／ＢＣＭＡ／ＣＤ２６９タンパク質、製品番号１０６２０－Ｈ１５Ｈ）を、約２ｍｇの全重量（その中で等体積の抗原及びフロイントアジュバントを添加した）で首及び背中の複数点で皮下注射した。免疫を４～６回実行した。注射部位での質量の吸収を追跡して、正確な免疫を確認した。免疫の時間的間隔は７～１５日であった。第４の免疫後に、血清を収集して、抗原の免疫力価を決定した。力価が１００００倍（ＥＬＩＳＡ法）以上に到達した場合に、約１００ｍｌの全血液を収集し、リンパ球を分離し、後続の使用のために－８０℃で保存した。

２）アルパカの末梢血リンパ球の分離及びＲＮＡ抽出
アルパカの末梢血リンパ球を、ＱＩＡＧＥＮキット（ＱＩＡａｍｐ ＲＮＡ Ｂｌｏｏｄ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（５０）、製品番号５２３０４）の指示書に従った使用によって分離した。簡潔には、１ｍｌの全血液へ５～１０ｍｌの赤血球溶解液を添加した。混合物を均一に混合し、３０分間氷浴中に置いた。赤血球を溶解した後に、２０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。上清を廃棄し、追加の１～２ｍｌの赤血球溶解液を添加し、均一に混合した。混合物を１０分間氷浴中に置いて残存する赤血球を溶解し、次いで２０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。上清を廃棄し、０．３ｍｌの溶解液を添加して白血球と均一に混合した。もたらされた混合物を後続の使用のために－８０℃で保存した。

ＲＮＡ精製を、ＱＩＡＧＥＮキット（ＱＩＡａｍｐ ＲＮＡ Ｂｌｏｏｄ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（５０）、製品番号５２３０４）の指示書に従った使用によって実行した。簡潔には、０．３ｍｌの分離したアルパカリンパ球へ０．３ｍｌの緩衝液ＲＬＴを添加し、混合物を振盪により良く混合した。最後のステップからの混合液を、吸着カラム（ＱＩＡｓｈｒｅｄｄｅｒＳｐｉｎＣｏｌｕｍｎ）を装備した収集チューブへ移し、１４，０００ｒｐｍで２分間遠心分離した。収集チューブ中の濾液を新たな遠心分離チューブへ移した。０．５ｍｌの７０％のエタノールを濾液の中へ添加し、上下逆さまにして均一に混合した。混合物を１００００ｒｍｐで１５秒間遠心分離し、収集チューブ中の廃液を廃棄し、吸着カラムを収集チューブの中へ再度置いた。吸着カラムを新たな２ｍｌの収集チューブへ移し、０．７ｍｌの緩衝液ＲＷ１を添加し、混合物を１００００ｒｍｐで１５秒間遠心分離した。吸着カラムを新たな２ｍｌの収集チューブへ移し、０．５ｍｌの緩衝液ＲＰＥを添加し、混合物を１００００ｒｍｐで１５秒間遠心分離した。０．５ｍｌの緩衝液ＲＰＥを添加し、混合物を１４０００ｒｍｐで３分間遠心分離した。吸着カラムを新たな１．５ｍｌの遠心チューブへ移し、３０～５０μｌのＲＮａｓｅ不含水を、大気中の吸着膜の真中へ滴加した。混合物を室温で２～５分間置き、１２，０００ｒｐｍで１分間遠心分離した。プラスミド溶液を遠心チューブの中へ収集し、ＲＮＡ濃度について測定した。

３）重鎖抗体の可変領域－ＶＨＨ
ｃＤＮＡの第１鎖の合成：ｃＤＮＡ合成キット（ＭｉｎｉＢＥＳＴＡｇａｒｏｓｅ Ｇｅｌ ＤＮＡ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔバージョン４．０、ＴＡＫＡＲＡ Ｃｏｍｐａｎｙ）を、指示書に従って使用した。この鋳型により、２セットのプライマーを使用して、重鎖抗体のＶＨＨ遺伝子断片のＰＣＲ増幅を遂行した。ネステッドＰＣＲ法の使用によって、第１のＰＣＲ増幅における８００ｂｐ超の断片は通常の重鎖遺伝子断片であり、８００ｂｐ～５００ｂｐの間の断片は軽鎖を欠失した重鎖抗体遺伝子断片である（図１を参照）。軽鎖を欠失した重鎖抗体の遺伝子断片をゲル切断によって回収し、鋳型として使用して、ＶＨＨ特異的プライマーによるＰＣＲ増幅によって、ＶＨＨ標的遺伝子（～５００ｂｐ）を得た（図２を参照）。

プライマーの合成：
第１ラウンドのＰＣＲＦｄ５’プライマー：
ＹＦ－１：ＣＧＣ ＣＡＴ ＣＡＡ ＧＧＴ ＡＣＣ ＡＧＴ ＴＧＡ（配列番号：１９９）
ＹＦ－２：ＧＧＧ ＧＴＡ ＣＣＴ ＧＴＣ ＡＴＣ ＣＡＣ ＧＧＡ ＣＣＡ ＧＣＴ ＧＡ（配列番号：２００）
第１ラウンドのＰＣＲ Ｂｄ３’プライマー：
ＹＢＮ：ＣＡＧ ＣＣＧ ＧＣＣ ＡＴＧ ＧＣＣ ＳＭＫ ＧＴＲ ＣＡＧ ＣＴＧ ＧＴＧ ＧＡＫ ＴＣＴ ＧＧＧ ＧＧＡ Ｇ（配列番号：２０１）
第２ラウンドのＰＣＲプライマー：
ＹＶ－ＢＡＣＫ：ＣＡＴ ＧＴＧ ＣＡＴＧＧＣＣＴＡ ＧＡＣ ＴＣＧ ＣＧＧ ＣＣＣＡＧＣ ＣＧＧ ＣＣＡ ＴＧＧ ＣＣ（配列番号：２０２）
ＹＶ－ＦＯＲ：ＣＡＴ ＧＴＧ ＴＡＧ ＡＴＴ ＣＣＴ ＧＧＣ ＣＧＧ ＣＣＴ ＧＧＣ ＣＴＧ ＡＧＧ ＡＧＡ ＣＧＧ ＴＧＡ ＣＣＴ ＧＧ（配列番号：２０３）

４）ＶＨＨ断片とファージディスプレイベクターのライゲーション及びＴＧ１コンピテントセルの電気形質転換
ＶＨＨ断片及びｐＨＥＮ６ベクタープラスミドのＳｆＩによる単一消化を行った後に、ＶＨＨ断片及びｐＨＥＮ６ベクター（Ｃｏｎｒａｔｈ，ＫＥＭ ｏｔｈｅｒ．Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ（Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ）２００１，４５：（１０）２８０７－１２、中国特許ＺＬ２０１１１０２８００３．１）を、リガーゼによってライゲーションし、次いでＴＧ１コンピテントセルに電気的に形質転換しそれを使用してプレートをコートし、抗体挿入率の確認についてコロニーＰＣＲによって検出した。組換え遺伝子クローニング効率の検出：ＬＢ／アンピシリンプレートを電気的に形質転換した細菌溶液によりコートし、３２℃で一晩培養し、翌日に抗体のライゲーション効率の確認についてコロニーＰＣＲによって検出した。ファージ抗体ライブラリーのライゲーション効率は９０％超であった。ＬＢ／アンピシリンプレートを電気的に形質転換した細菌溶液によりコーティングし、３２℃で一晩培養した。培養を２ＹＴ培養培地により洗浄し、１５％のグリセロールを添加した。混合物を－８０℃で保存した。

５）ＶＨＨファージ抗体ライブラリーの調製
ヘルパーファージＭ１３Ｋ０７（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）をレスキューのために抗体ライブラリーの中へ添加した。ファージ抗体ライブラリーを従来の方法に従って調製し、後続の使用のために－８０℃で保存した。

実施例２：ＢＣＭＡの単一ドメイン抗体の調製
ＢＣＭＡ特異的単一ドメイン抗体のスクリーニング
第１ラウンド：ＢＣＭＡタンパク質濃度１５０μｇ／ｍｌで１５０μｌ／ウェル（１つのマイクロポア）を、４℃で一晩インキュベーションする。

第２ラウンド：ＢＣＭＡタンパク質濃度１０～１００μｇ／ｍｌで１５０μｌ／ウェル（５つのマイクロポア）を、４℃で一晩インキュベーションする。

第３ラウンド：ＢＣＭＡタンパク質濃度１０～５０μｇ／ｍｌで１５０μｌ／ウェル（５つのマイクロポア）を、４℃で一晩インキュベーションする。

ブロッキング：１％のＣＰＢＳで３００μｌ／ウェルを、３７℃で２時間インキュベーションする。

２．ファージＥＬＩＳＡによる陽性クローンの拾い上げ
単一コロニーを、第３ラウンドにおいて増殖させたコロニーについてスクリーニングした寒天プレートからランダムに拾い上げ、アンピシリン２ＹＴ液体培地を含有する９６ウェル培養プレート中に接種及び培養し、ヘルパーファージの重複感染を行ってファージ抗体の発現を誘導した。発現上清を収穫し、次いでＥＬＩＳＡアッセイを、抗原としてＢＣＭＡにより実行した。ＢＣＭＡ陽性ウェルを選択し、ＤＮＡシーケンシングを行って、抗ＢＣＭＡ単一ドメイン抗体クローンの遺伝子配列を同定した。添付書類３中のものを包含する一連の単一ドメイン抗体遺伝子配列を得て、高特異性及び高活性を備えた単一ドメイン抗体のさらなる発現及びスクリーニングのために使用した。

実施例３：特異的ＢＣＭＡ単一ドメイン抗体の発現プラスミドの構築
実施例３において得られた特異的ＢＣＭＡ単一ドメイン抗体遺伝子を、ＰＣＲによって増幅して、制限酵素ＢｂｓＩ部位及びＢａｍＨＩ部位を備えたＰＣＲ産物を得た。ＰＣＲ産物及びベクター（ｐＳＪＦ２ベクター）（ｋｉｍ ｌｓ．Ｂｉｏｓｉｃ Ｂｉｏｃｈｅｍ．２００２，６６（５）：１１４８－５１、中国特許ＺＬ２０１１１０２８００３１）を、制限酵素ＢｂｓＩ及びＢａｍＨＩによりそれぞれ処理し、Ｔ４リガーゼによるライゲーションによって組換えて、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉにおいて効率的に発現することができるプラスミドｓｄＡｂ－ｐＳＪＦ２を得て、遺伝子シーケンシングを行って配列の正確さを決定した。

１）ＶＨＨ標的遺伝子を得るために要求されるＰＣＲ増幅条件、及び５０μｌのＰＣＲ系の組成物。
混合物 ２５μｌ
陽性コロニークローン １μｌ
５‘プライマー １μｌ（ｌｍｏｌ／ｌ）
３‘プライマー １μｌ（ｌｍｏｌ／ｌ）
ＤＥＰＣ処理脱イオン蒸留水 ２２μｌ

５’プライマー － ＧＡＡ ＧＡＡＧＡＡ ＧＡＣ ＡＡ ＣＡＧ ＧＣＣ ＳＶＫ ＧＴＧ ＭＡＧ ＣＴＧ ＧＷＧ ＧＡＫ ＴＣＴ（配列番号：２０４）
３’プライマー － ｇａａｇａｔｃｔｃｃｇｇａｔｃｃＴＧＡＧＧＡＧＡＣＧＧＴＧＡＣＣＴＧＧＧＴ（配列番号：２０５）

２）標的遺伝子及びベクターを消化し、ライゲーションし、ＴＧ１細胞の中へ形質転換した。標的断片を含有するクローンの同定のために、生成物にＰＣＲを行い、遺伝子シーケンシングを行い、その結果、正確な遺伝子配列を備えたＢＣＭＡ単一ドメイン抗体発現プラスミドを得た。

実施例４：抗ＢＣＭＡ単一ドメイン抗体の発現及び精製
実施例３におけるプラスミドＢＣＭＡｓｄＡｂ－ｐＳＪＦ２を含有する株を、アンピシリンを含有しているＬＢ培養プレート上で３７℃で一晩接種した。単一コロニーを拾い上げ、アンピシリンを含有する１５ｍｌのＬＢ培地溶液中に接種し、３７℃の振盪機中で一晩培養した。１０ｍｌの培養物をアンピシリンを含有する１Ｌの２ＹＴ培養液へ移し２４０ｒｐｍ／分で３７℃で振盪機中で培養した。ＯＤ値が０．４～０．６に到達した後に、０．５～１．０ｍＭのＩＰＴＧを添加し、追加で一晩インキュベーションした。上記の溶液を細菌の収集のために遠心分離した。細菌をリゾチーム（ｌｙｓｏｚｙｍ）の添加によって溶解し、遠心分離し、上清中の可溶性の単一ドメイン抗体タンパク質を収集した。９５％超の純度のタンパク質を、Ｎｉ^＋イオン親和性クロマトグラフィーによって得た。図３は、発現された抗ＢＣＭＡ単一ドメイン抗体タンパク質を示し、図４は、ニッケルカラムによって精製した、発現されたＢＣＭＡ－ｓｄＡｂのＳＤＳ－ＰＡＧＥ電気泳動結果を示す。

実施例５：ＢＣＭＡ単一ドメイン抗体の親和性アッセイ試験
１）サンプルの調製
抗原：Ｂｉｏ－ＢＣＭＡを、１×ダイナミック緩衝液（０．０５％のＴｗｅｅｎ ２０、０．１％のＢＳＡ、ｐＨ７．２を含有する、１×ＰＢＳ）により１０μｇ／ｍｌへ希釈した。

単一ドメイン抗体を、１×キネティック緩衝液により、４００ｎＭ、２００ｎＭ、１００ｎＭ、５０ｎＭ、２５ｎＭ、１２．５ｎＭ、及び６．２５ｎＭへ段階的に希釈した。

２）サンプルの試験
試験する抗原をＳＡセンサーを介してロードした。抗原を５つの勾配によって希釈し、すべてのＢＣＭＡ単一ドメイン抗体は、５０ｎｍ、２０ｎｍ、１０ｎｍ、１ｎｍ、０．１ｎｍ、及び０．０１ｎｍの親和性を有していた。

実施例６：精製ＢＣＭＡ単一ドメイン抗体とＢＣＭＡ抗原の結合試験（ＥＬＩＳＡ）
ＢＣＭＡ－ＦＣ抗原を、０．０５ＭのＮａＨＣＯ_３（ｐＨ９．５）により１μｇ／ｍｌへ希釈した。９６ウェルの位置を、１００μｌの抗原により４℃で一晩コーティングした。９６ウェルプレートを、３００μｌの０．５％のＢＳＡ－ＰＢＳにより３７℃で２時間ブロッキングした。異なる希釈濃度の精製ＢＣＭＡ単一ドメイン抗体を、１００μｌ／ウェルで３７℃で１時間添加した。プレートを、０．０５％のＰＢＳＴにより３回洗浄した。１：５０００倍で希釈したマウス抗Ｈｉｓ－ＨＲＰを、１００μｌ／ウェルで３７℃で１時間添加した。プレートを、０．０５％のＰＢＳＴにより３回洗浄した。１００μｌのＴＭＢを添加し、室温で２０分間暗所で維持した。１００μｌの１ｍｏｌ／ＬのＨＣｌを添加し、反応をクエンチした。４５０ｎｍのサンプルのＯＤ値を、マイクロプレートリーダーによって測定した。図５は、ＢＣＭＡタンパク質へ結合する精製ＢＣＭＡ単一ドメイン抗体の濃度勾配を示す（ＥＬＩＳＡ）。Ｂ３５（１３）及びＢ９２（６－１）の２つの抗体のＢＣＭＡ抗原へ結合する能力が、比較的低かったとことを除いて、残りの１１の抗体のＢＣＭＡ抗原へ結合する能力は、非常に高かった。

実施例７：ＢＡＦＦ及びＢＣＭＡに対するＢＣＭＡ単一ドメイン抗体の結合競合阻害試験
ＢＣＭＡがＢＡＦＦへ結合することができるので、機能的なＢＣＭＡ単一ドメイン抗体は、ＢＡＦＦのＢＣＭＡへの結合を競合的に阻害することができるに違いない。ＢＡＦＦタンパク質を１μｇ／ｍｌ（１００μｌ／ウェル）で脱着可能なＥＬＩＳＡプレートにコートし、４℃で一晩インキュベーションした。２％のＢＳＡを３００μｌ／ウェルでブロッキングのために添加し、３７℃で２時間インキュベーションした。ＢＣＭＡ単一ドメイン抗体を１０μｇ／ｍｌの最終的な濃度へ希釈した。１００μｌのＢＣＭＡ（１０μｇ／ｍｌ）単一ドメイン抗体を添加し、２μｌのＢＡＦＦ（５μｇ／ｍｌ）タンパク質を各々のウェル中に添加して、均一に混合した。ヤギ抗ウサギＩｇＧ ＨＲＰ（１：５０００）を希釈し、１００μｌ／ウェルにし、３７℃で１時間インキュベーションした。ＴＭＢ発色溶液を１００μｌ／ウェルで添加し、１０分間暗所で反応させた。反応を２ＭのＨ_２ＳＯ_４を、５０μｌ／ウェルで添加することによってクエンチした。ＯＤ値を４５０ｎｍで測定した。図６は、ＢＣＭＡ単一ドメイン抗体が、ＢＡＦＦタンパク質のＢＣＭＡタンパク質への結合を競合的に阻害できることを示す。異なるＢＣＭＡ単一ドメイン抗体は、ＢＡＦＦタンパク質のＢＣＭＡタンパク質への結合を競合的に阻害することができ、阻害率は３４％～９２％の範囲であった。

実施例８：特異的ＢＣＭＡ抗原をＣＡＲＴ細胞に対して標的化する認識抗体としてのＢＣＭＡ単一ドメイン抗体についての研究
１）ベクターの構築
ＢＣＭＡ単一ドメイン抗体遺伝子及び第二世代ＣＡＲ構造遺伝子を合成した。２つの遺伝子をオーバーラップＰＣＲによってスプライスして、ＢＣＭＡ ＣＡＲ遺伝子を得た。合成遺伝子を得た後に、分子クローニングを実行した。最初に、２つの遺伝子断片のＰＣＲ産物を得た。次いでオーバーラップＰＣＲを実行して、２つの断片が連結された、第２世代ＣＡＲ構造を備えたＢＣＭＡ ＣＡＲ遺伝子を得た。プレベクター及びＢＣＭＡ ＣＡＲ遺伝子の酵素消化、ライゲーション、形質転換、クローニング、プラスミドアップグレード、及びシーケンシングを介して、正確な配列を備えたＢＣＭＡ ＣＡＲ発現レンチウイルスベクターのプレ－レンチ－ＥＦ１ＢＣＭＡを得た。

２）レンチウイルスのパッケージング
ウイルスパッケージングの前日に、２９３Ｔ細胞をトリプシンによって消化し、１５０ｃｍの培養ディッシュ中で伸展させた。細胞を、５％のＣＯ_２培養ボックス中で８～２４時間インキュベーションした。接着細胞が培養ディッシュの全面積の８０％に達した時に、２９３Ｔ細胞をトランスフェクションした。プレ－レンチ－ＥＦ１ＢＣＭＡＣＡＲ：ｐｓＰＡＸ２：ｐＭＤ２Ｇ＝４：３：１を、リポフェクタミン２０００によりコトランスフェクションした。ウイルス上清を４８時間後に収集し、１２５０ｒｐｍで４℃で５分間遠心分離して死んだ２９３Ｔ細胞及び細胞残屑を除去した。次いで、ウイルス上清を濾過し、濃縮し、サブパッケージングし、－８０℃の冷蔵庫中で保存した。

３）ＣＡＲＴ細胞の調製
１０ｍｌの新鮮血液を健康なボランティアから採取した。末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、リンパ球単離溶液により単離し、次いでＴ細胞を磁気ビーズによって単離及び精製した。２×１０^６のＴ細胞／ウェルを６ウェルプレートの中へ播種し、ＩＬ－２（１０００Ｕ／ｍｌ）を含有するｘ－ｖｉｖｏ １５培養培地中で培養し、抗ＣＤ３により２４時間刺激した。２４時間の刺激後に、ＢＣＭＡウイルス溶液を添加し、一晩感染させた。２ｍｌの培養培地を２日目に添加した。感染の６～７日後に、ＣＡＲの発現をフローサイトメトリーによって評価した。トランスフェクションしたＴ細胞が抗ＢＣＭＡ－ＣＡＲを発現する陽性率を、フローサイトメトリーにより、ビオチン化ＢＣＭＡを使用して分析した。

４）殺傷存続性の決定
細胞殺傷性試験において、ＬＤＨ検出キット（Ｐｒｏｍｅｇａ）を検出のために使用した。ＣＡＲＴ細胞／Ｔ細胞：標的細胞を、４つの勾配（それは０．５：１、１：１、２：１及び４：１であった）によりそれぞれ設定した。Ｄａｕｄｉ細胞は３×１０^４／ウェルであり、残りのウェルを、Ｘ－ＶＩＶＯ含有培養培地／１６４０培養培地により２００μＬまで補足した。９６ウェルプレートを、５％のＣＯ_２インキュベーター中で３７℃で培養した。１７時間後に、２０μｌの溶解液を最大放出ウェルの中へ添加し、細胞を均一に混合して完全に破裂させた。９６ウェルプレートを、ＣＯ_２インキュベーター中で２時間インキュベーションした。２時間後に、最大放出ウェルが観察された。標的細胞が完全に溶解された後に、５０μＬの上清を平底の各々のウェルから９６ウェルプレートへ吸引し、次いでの５０μＬの基質溶液を各々のウェルへ添加し、顕色を暗所で３０分間実行した。３０分後に、混合物を色変化について観察し、そこで、ＭＭ．１Ｓのウェル最大放出であり、ＣＡＲＴ細胞ウェルの色はより暗い色であるだろう。マイクロプレートリーダーを、４９０ｎｍの波長での測定のために使用した。殺傷結果を図７中に示した。ＢＣＭＡキメラ抗原受容体修飾Ｔ細胞は、２０％超の非常に高い殺傷活性によりＢＣＭＡ陽性細胞を特異的に殺傷することができ、ＢＣＭＡ陰性細胞に対する殺傷効果を有していない。
添付書類１：

添付書類２

添付書類３

Claims (15)

1. 配列番号：６７に示すアミノ酸配列を含む、抗ＢＣＭＡ単一ドメイン抗体。
2. 抗ＢＣＭＡ単一ドメイン抗体の遺伝子であって、前記単一ドメイン抗体の遺伝子が、配列番号：１３３に示すヌクレオチド配列を含むか、または請求項１に記載の単一ドメイン抗体をコードするヌクレオチド配列である、抗ＢＣＭＡ単一ドメイン抗体の遺伝子。
3. 請求項１に記載の１つまたは複数の単一ドメイン抗体を有する、ポリペプチド。
4. 請求項２に記載の単一ドメイン抗体の遺伝子から選択される１つまたは複数の遺伝子を含む発現ベクターであって、原核生物細胞発現ベクター、真核生物細胞発現ベクター、またはレンチウイルスベクターである、発現ベクター。
5. 請求項４に記載の発現ベクターを含む宿主細胞であって、前記宿主細胞が、原核生物発現細胞、真核生物発現細胞、真菌細胞、または酵母細胞である、前記宿主細胞。
6. 前記原核生物発現細胞が、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉである、請求項５に記載の宿主細胞。
7. 請求項１に記載の１つまたは複数の単一ドメイン抗体を有し、前記複数の単一ドメイン抗体は同じかまたは異なる、キメラ抗原受容体。
8. キメラ抗原受容体によって修飾されたＴ細胞であって、請求項７に記載のキメラ抗原受容体によって修飾された、Ｔ細胞。
9. 活性成分として、請求項１に記載の１つまたは複数の単一ドメイン抗体を含む、医薬組成物。
10. 請求項１に記載の単一ドメイン抗体のヒト化によって得られる、ヒト化抗ＢＣＭＡ単一ドメイン抗体。
11. ＢＣＭＡの検出における、請求項１に記載の単一ドメイン抗体の使用。
12. ＢＡＦＦとＢＣＭＡとの間の相互作用のブロックのための、請求項９に記載の医薬組成物。
13. 前記単一ドメイン抗体が、細胞傷害剤、酵素相、放射性同位体、蛍光化合物、または化学発光化合物のうちの１つまたは複数へ連結される、請求項１２に記載の医薬組成物。
14. 異常に増加したＢＣＭＡ発現と関連する疾患の治療のための、請求項９に記載の医薬組成物。
15. 異常に増加したＢＣＭＡ発現と関連する前記疾患が、多発性骨髄腫疾患である、請求項１４に記載の医薬組成物。

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