CN116554326B - 一种靶向cd22同种异体通用car-t细胞的制备及用途 - Google Patents

一种靶向cd22同种异体通用car-t细胞的制备及用途 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种靶向CD22同种异体通用CAR‑T细胞的制备及用途，涉及生物医药技术领域。本发明通过噬菌体展示技术制备了抗CD22纳米抗体，亲和力在10‑12～10‑9M之间，均属于高亲和力抗体。由此制备了同种异体通用CAR‑T细胞，经过验证，其具有良好的抗肿瘤活性，可应用于制备预防、诊断和治疗B细胞急性淋巴细胞白血病、非霍奇金淋巴瘤、慢性淋巴细胞白血病、弥漫性大B细胞淋巴瘤、毛细胞白血病以及系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、多发性硬化症中的至少一种的药物。

Description

一种靶向CD22同种异体通用CAR-T细胞的制备及用途
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，具体而言，涉及一种靶向CD22同种异体通用CAR-T细胞的制备及用途。
背景技术
急性B淋巴细胞白血病（B cell-acute lymphoblastic leukemia, B-ALL）是急性淋巴细胞白血病（ALL）中最常见的一种类型，起源于B系淋巴前体细胞，其发病率约占ALL的85%；B-ALL在儿童急性白血病中发病率约占80%，成人中约占20%。现有传统治疗手段可使80%的儿童长期无病生存，但成人只有30%~40%，总体仍有约50%以上患者会发生复发。靶向CD19的自体CAR-T细胞在复发/难治性B-ALL中的缓解率达70%~90%，但由于CAR-T细胞自身原因、肿瘤细胞异质性及免疫抑制微环境等因素导致CAR-T细胞治疗诱导的缓解往往不持久，复发率高达20%~70%，这可能与抗原丢失或潜在的纯合子突变存在一定关系。研究显示，在CD19 CAR-T治疗的复发患者体内CD22仍然表达且未发生突变，因此CD22作为一个新的靶点或双靶点联合疗法对于B-ALL复发的临床治疗具有重要意义。
CD22，又称为Siglec-2，普遍存在于正常B细胞和B细胞来源的恶性肿瘤中。CD22的胞外段包括7个Ig样结构域和12个N-糖基化位点；CD22属于抑制性受体，主要抑制BCR信号转导。研究显示CD22可作为治疗CD19 CAR-T治疗后复发患者非常有前景的靶点，CD22与CD19双靶点 CAR-T可以减少因抗原丢失导致疗效降低的情况，从而提高持续缓解率。
在血液系统恶性肿瘤治疗中，自体CAR-T细胞免疫疗法显示出良好的抗肿瘤效果，极大的提高了多种血液瘤患者的生存率，使得血液系统恶性肿瘤的治疗方式发生了革命性变化，并推动了其他免疫细胞疗法的发展。自体CAR-T细胞输注后不会发生免疫排斥反应并在体内持续发挥作用，但是自体CAR-T细胞疗法仍受诸多不利因素的影响而限制了应用，例如经过多线治疗的患者体内T细胞数量减少或T细胞功能受损导致质量下降，制备过程周期长、成本高等，使患者错过了最佳治疗窗口。随着CRISPR/Cas9等多种基因编辑技术的快速发展，对健康供者来源T细胞的TCR、B2M和CD52等介导个体间免疫反应的基因敲除，从而最大程度降低GvHD和HvGR，进而制备成“现货型”同种异体通用CAR-T细胞（UCAR-T）。UCAR-T细胞疗法能够克服自体CAR-T细胞诸多缺点并可通过标准化流程进行规模化制造，从而实现CAR-T细胞治疗产品的批量化生产和产业化，同时显著降低治疗成本，使更多患者能够获益。
Nb被认为是目前发现的最小的（15 kDa）具有结合完整抗原功能的抗体分子，与其他基因工程抗体相比，Nb具有高稳定性、高可溶性、高亲和力、特异性强、与不同蛋白分子偶联的灵活性和易改造以及优良的组织穿透性等特点，受到各领域的高度关注，在疾病治疗和检测等领域具有广阔的开发和应用价值。
鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供一种靶向CD22同种异体通用CAR-T细胞的制备及用途以解决目前CAR-T细胞治疗B-ALL诱导的缓解往往不持久，复发率高，疗效不佳的问题。
本发明是这样实现的：
第一方面，本发明提供了一种抗CD22的纳米抗体，纳米抗体包括如下任一项所示的包含CDR1、CDR2和CDR3的重链可变区：
（1）如SEQ ID No.1~3所示；
（2）如SEQ ID No.5~7所示；
（3）如SEQ ID No.9~11所示；
（4）如SEQ ID No.13~15所示；
和（5）如SEQ ID No.17~19所示。
在本发明应用较佳的实施方式中，纳米抗体还包括骨架区；
在一种可选的实施方式中，纳米抗体为单价纳米抗体、多价纳米抗体、多特异性抗体和融合型纳米抗体中的至少一种；
在一种可选的实施方式中，当纳米抗体为单价纳米抗体时，纳米抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No.4、8、12、16、20、21、22、23、24和25中任意一项所示。
第二方面，本发明还提供了一种抗体，其包括上述抗CD22的纳米抗体或包括抗CD22的纳米抗体的重链可变区。
第三方面，本发明还提供了一种核酸分子或包含核酸分子的重组载体，核酸分子编码上述的抗CD22的纳米抗体；或核酸分子编码上述的抗体。
在一种可选的实施方式中，重组载体为质粒或病毒；
在一种可选的实施方式中，病毒为腺病毒、腺相关病毒、逆转录病毒、慢病毒或溶瘤病毒。
第四方面，本发明还提供了一种宿主细胞，其含有上述的重组载体；
在一种可选的实施方式中，宿主细胞选自原核宿主细胞、真核宿主细胞和噬菌体中的至少一种；
在一种可选的实施方式中，原核宿主细胞为大肠杆菌、链霉菌、枯草杆菌或分枝杆菌；
在一种可选的实施方式中，真核宿主细胞为动物细胞、植物细胞或真菌；
在一种可选的实施方式中，动物细胞选自哺乳动物细胞、昆虫细胞或秀丽隐杆线虫；
哺乳动物细胞选自293细胞、293T细胞、293FT细胞、CHO细胞、COS细胞、小鼠L细胞、LNCaP细胞、633细胞、Vero、BHK细胞、CV1细胞、Hela细胞、MDCK细胞、Hep-2细胞和Per6细胞中的任一种；
在一种可选的实施方式中，真菌选自酿酒酵母、毕赤酵母、汉森酵母、假丝酵母、乳克鲁维酵母、构巢曲霉、粟酒裂殖酵母和解脂耶罗酵母中的任一种。
第五方面，本发明还提供了一种抗体的制备方法，其包括：培养上述的宿主细胞，以获得抗体。
第六方面，本发明还提供了一种免疫缀合物或药物组合物，其包括上述的抗CD22的纳米抗体或上述的抗体；
在一种可选的实施方式中，免疫缀合物还包括治疗剂；
在一种可选的实施方式中，治疗剂包括：免疫检查点相关制剂、毒素、因子、化疗药物、放射性核素、激酶抑制剂和细胞毒性剂中的至少一种；
在一种可选的实施方式中，药物组合物包括药用赋形剂、载体和稀释剂中的至少一种。
第七方面，本发明还提供了一种嵌合抗原受体，嵌合抗原受体的抗原结合结构域包括上述的抗CD22纳米抗体或上述的抗体；
在一种可选的实施方式中，嵌合抗原受体还包括信号肽、铰链区、跨膜区和信号转导结构域；
在一种可选的实施方式中，信号转导结构域选自CD3ζ、4-1BB(CD137) 、CD27、CD30、CD40、CD54、CD83、PD-1、ICOS(CD278)、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、CD270、CD273、CD274、DAP10、CD223、CD134、CD150和CD152中的至少一种；
在一种可选的实施方式中，信号转导结构域包括CD3ζ和4-1BB胞内区；
在一种可选的实施方式中，跨膜区为CD28跨膜结构域、CD8跨膜区、CD134跨膜区、CD137跨膜区、ICOS跨膜区和DAP10跨膜区中的一种或多种；
在一种可选的实施方式中，铰链区为IgG1FC-CH2-CH3铰链区、IgG2FC-CH2-CH3铰链区、IgG4FC-CH2-CH3铰链区、CD28铰链区和CD8α铰链区中的一种或多种；
在一种可选的实施方式中，信号肽为CD8α信号肽、IL-2信号肽或GM-CSF信号肽。
第八方面，本发明还提供了一种靶向CD22的CAR-T细胞，其包括上述的嵌合抗原受体；
在一种可选的实施方式中，CAR-T细胞选自通用型CAR-T细胞（UCAR-T）和自体CAR-T细胞中的至少一种；
在一种可选的实施方式中，通用型CAR-T细胞为敲除了B2M和TRAC基因的CAR-T细胞。
第九方面，本发明还提供了抗CD22的纳米抗体、抗体、核酸分子或含核酸分子的重组载体、宿主细胞、嵌合抗原受体或CAR-T细胞在如下任一项中的应用：
（1）制备预防或治疗肿瘤的产品中的应用；
（2）制备检测CD22产品；
（3）制备联合治疗药物。
应用（1）中，在一种可选的实施方式中，产品包括：免疫细胞、试剂、试剂盒、药物和药物组合物中的至少一种；
在一种可选的实施方式中，治疗肿瘤的产品包括靶向CD22以治疗或辅助治疗肿瘤的药物；
在一种可选的实施方式中，肿瘤为原发性肿瘤或继发性肿瘤；肿瘤包括B细胞急性淋巴细胞白血病、非霍奇金淋巴瘤、慢性淋巴细胞白血病、弥漫性大B细胞淋巴瘤、毛细胞白血病以及系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、多发性硬化症中的至少一种。
应用（2）中，产品为试剂、试剂盒或基因芯片。
本发明具有以下有益效果：
本发明以人CD22为靶点，通过噬菌体展示技术制备了抗CD22纳米抗体，且均可特异性结合CD22抗原，亲和力在10-12~10-9M之间，均属于高亲和力纳米抗体。
由此制备了UCAR-T细胞，经过验证，其具有良好的抗肿瘤活性，可应用于制备预防、诊断和治疗B细胞急性淋巴细胞白血病、非霍奇金淋巴瘤、慢性淋巴细胞白血病、弥漫性大B细胞淋巴瘤、毛细胞白血病以及系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、多发性硬化症中的至少一种的药物。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为本发明实施例中利用间接ELISA分析CD22纳米抗体与CD22抗原的结合特异性；
图2是本发明实施例中利用间接ELISA分析CD22纳米抗体与CD22抗原的结合能力；
图3是本发明实施例5中B2M和TRAC敲除效率检测；
图4是本发明实施例5中CAR结构示意图；
图5是本发明实施例中通用CAR-T细胞对CD22阳性细胞系Raji的杀伤效率检测；
图6是本发明实施例中通用CAR-T细胞对B-ALL小鼠移植模型生存期分析。
具体实施方式
现将详细地提供本发明实施方式的参考，其一个或多个实例描述于下文。提供每一实例作为解释而非限制本发明。实际上，对本领域技术人员而言，显而易见的是，可以对本发明进行多种修改和变化而不背离本发明的范围或精神。例如，作为一个实施方式的部分而说明或描述的特征可以用于另一实施方式中，来产生更进一步的实施方式。
除非另外指明，否则实践本发明将采用细胞生物学、分子生物学(包含重组技术)、微生物学、生物化学和免疫学的常规技术，所述常规技术在本领域技术人员的能力范围内。文献中充分解释了这种技术，如《分子克隆：实验室手册(Molecular Cloning:ALaboratory Manual)》，第二版(Sambrook等人，1989)；《寡核苷酸合成(OligonucleotideSynthesis)》(M.J.Gait编，1984)；《动物细胞培养(Animal Cell Culture)》(R.I.Freshney编，1987)；《酶学方法(Methods in Enzymology)》(学术出版社有限公司(Academic Press，Inc.)；《实验免疫学手册(Handbook of Experimental Immunology)》(D.M.Weir和C.C.Blackwell编)；《哺乳动物细胞用基因转移载体(Gene Transfer Vectors forMammalian Cells)》(J.M.Miller和M.P.Calos编，1987)；《当代分子生物学方法(CurrentProtocols inMolecular Biology)》(F.M.Ausubel等人编，1987)；《PCR:聚合酶链反应(PCR:The Polymerase Chain Reaction)》(Mullis等人编，1994)；以及《当代免疫学方法(Current Protocols in Immunology)》(J.E.Coligan等人编，1991)，所述文献中的每个文献均通过引用明确并入本文中。
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
第一方面，本发明提供了一种抗CD22的纳米抗体，纳米抗体包括如下任一项所示的包含CDR1、CDR2和CDR3的重链可变区：
（1）如SEQ ID No.1~3所示；
（2）如SEQ ID No.5~7所示；
（3）如SEQ ID No.9~11所示；
（4）如SEQ ID No.13~15所示；
和（5）如SEQ ID No.17~19所示。
在本发明应用较佳的实施方式中，纳米抗体还包括骨架区；其重链可变区的结构为：FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4。
在一种可选的实施方式中，纳米抗体为单价纳米抗体、多价纳米抗体、多特异性抗体和融合型纳米抗体中的至少一种。
名词解释：
单价纳米抗体：是用特异性的抗原从纳米抗体库中筛选得到的抗原特异性的纳米抗体，因其表面有大量的亲水残基，能保持严格的单体结构，且仅以这种单体形式就能高特异性、高亲和力地与其抗原相结合。
多价纳米抗体：多价抗体是识别同一种表位的单价抗体的聚合物，比对应的单价纳米抗体具有更高的抗原亲和力。多特异性抗体是识别不同表位的单价抗体的聚合物，能结合不同靶目标或同一靶目标的不同表位，比单价抗体具有更高的抗原识别能力。而纳米抗体结构简单，只有一个结构域，可通过短小的连接序列聚合在一起，从而转换成多价和多特异性的形式。
融合型纳米抗体：纳米抗体具有严格的单体特点且其相对分子质量很小，很容易通过基因工程技术与其他结构（如BSA、IgG-Fc等）结合形成新的融合分子，如能延长其半衰期的酶、抗菌肽或显影物质等。在新的融合分子中，纳米抗体与其靶抗原定向结合，与纳米抗体融合的部分就能发挥相应的功能。在临床，医生希望药物能在体内停留足够长的时间，然而纳米抗体的血液清除速度却很快，不利于它所携带的药物发挥作用。所以，通过基因技术将纳米抗体VHH和寿命较长的分子融合在一起，可以提高纳米抗体在血液中的存在时间即延长其半衰期，从而达到更好的治疗效果。
在一种可选的实施方式中，当纳米抗体为单价纳米抗体时，纳米抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No.4、8、12、16、20、21、22、23、24和25中任意一项所示。
SEQ ID No.21、22、23、24和25均为人源化之后的纳米抗体的重链可变区氨基酸序列。
第二方面，本发明还提供了一种抗体，其包括上述抗CD22的纳米抗体或包括抗CD22的纳米抗体的重链可变区（VHH）。
抗体可以为全长抗体、重链抗体、嵌合抗体、多特异性抗体（例如双特异性抗体、三特异性抗体、四特异性抗体等）、鼠源抗体、人源化抗体或抗原结合片段中的任意一种。抗原结合片段选自抗体的F(ab’)2、Fab’、Fab、Fv和scFv中的任意一种，只要它们展示出所期望的抗原结合活性均可行。
本发明所述的“嵌合抗体”是将非人源性抗体的可变区与人抗体的恒定区或骨架区融合而成的抗体，可以减轻非人源性抗体诱发的免疫应答反应。
上述抗原结合片段也即抗体的功能性片段，通常具有与其来源抗体相同的结合特异性。本领域技术人员根据本发明记载的内容容易理解到，上述抗体的功能性片段可以通过比如酶消化的方法（包括胃蛋白酶或木瓜蛋白酶）和/或通过化学还原分裂二硫键的方法获得。在本发明公开了完整抗体的结构基础上，本领域技术人员容易获得上述的功能性片段。
上述抗原结合片段还可以通过也是本领域技术人员所知的重组遗传学技术或通过例如自动肽合成仪，比如Applied BioSystems等销售的自动肽合成仪合成获得。
第三方面，本发明还提供了一种核酸分子或包含核酸分子的重组载体，核酸分子编码上述的抗CD22的纳米抗体；或核酸分子编码上述的抗体。
考虑到密码子的简并性，可在其编码区，在不改变氨基酸序列的条件下，编码上述抗体的基因序列可以进行修改，获得编码相同抗体的基因；也可以根据表达抗体宿主的密码子偏爱性，人工合成改造基因，以提高抗体的表达效率。
重组载体为表达载体或克隆载体，优选为表达载体，可以指任何重组的多核苷酸构建体，该构建体可通过转化，转染或转导的方式将目的DNA片段直接或间接（如包装成病毒）导入宿主细胞内，进行目的基因表达。
其中一种类型的载体是质粒，即环状双链DNA分子，可将目的DNA片段连接至质粒环中。另一种类型的载体为病毒载体，其可将目的DNA片段连接包装至病毒基因组中（如腺病毒，腺相关病毒，逆转录病毒，慢病毒，溶瘤病毒）。这些载体进入宿主细胞后，可以进行目的基因的表达。
第四方面，本发明还提供了一种宿主细胞，其含有上述的重组载体。
在一种可选的实施方式中，宿主细胞选自原核宿主细胞、真核宿主细胞和噬菌体中的至少一种；
在一种可选的实施方式中，原核宿主细胞为大肠杆菌、链霉菌、枯草杆菌或分枝杆菌；
在一种可选的实施方式中，真核宿主细胞为动物细胞、植物细胞或真菌；
在一种可选的实施方式中，动物细胞选自哺乳动物细胞、昆虫细胞或秀丽隐杆线虫；
哺乳动物细胞选自293细胞、293T细胞、293FT细胞、CHO细胞、COS细胞、小鼠L细胞、LNCaP细胞、633细胞、Vero、BHK细胞、CV1细胞、Hela细胞、MDCK细胞、Hep-2细胞和Per6细胞中的任一种。其中的293系列细胞、Per6细胞和CHO细胞是用于生产制备抗体或重组蛋白的常用哺乳动物细胞，为本领域普通技术人员所熟知。
在一种可选的实施方式中，真菌选自酿酒酵母、毕赤酵母、汉森酵母、假丝酵母、乳克鲁维酵母、构巢曲霉、粟酒裂殖酵母和解脂耶罗酵母中的任一种。假丝酵母例如选自白色假丝酵母或光滑假丝酵母。
第五方面，本发明还提供了一种抗体的制备方法，其包括：培养上述的宿主细胞，以获得抗体。具体地，本发明对宿主细胞的培养条件没有具体地限定，基于常规技术知识可获得能够使得宿主细胞表达产生所述抗体的培养条件。
第六方面，本发明还提供了一种免疫缀合物或药物组合物，其包括上述的抗CD22的纳米抗体或上述的抗体；
在一种可选的实施方式中，免疫缀合物还包括治疗剂；
在一种可选的实施方式中，治疗剂包括：免疫检查点相关制剂、毒素、因子、化疗药物、放射性核素、激酶抑制剂和细胞毒性剂中的至少一种。
免疫检查点相关制剂包括不限于：抑制性第二信号分子的抗体、PD-L1抑制剂、PD-1/PD-L1单抗药物。抑制性第二信号分子可以是PD-1；CTLA-4；PD-1和CTLA-4。
免疫检查点抑制剂治疗的相关生物标志物包括PD-L1、MSI/bMSI、TMB/bTMB、TNB及EGFR突变、ALK融合、TP53突变、KRAS突变。
在本发明应用较佳的实施方式中，PD-1/PD-L1单抗药物选自如下组中的至少一种：纳武单抗(Nivolumab)、派姆单抗(Pembrolizumab)、皮地利珠单抗(Pidilizumab)、兰伯丽珠单抗(Lambrolizumab)、BMS-936559、阿特珠单抗(Atezolizumab)、AMP-224、AMP224、AUNP12、BGB108、MCLA134、MEDI0680、PDROOl、REGN2810、SHR1210、STIAl lOX、STIAl l lO、TSR042，BMS-936558、BGB-A317、BCD-100和JS001。
在一种可选的实施方式中，上述化疗药物选自紫杉烷类、长春花生物碱类，蒽环霉素类，表鬼臼毒素类，酪氨酸激酶抑制剂，夫拉平度、伊利替康及其代谢物SN-38、拓扑替康、替尼泊苷、依托泊苷、伊马替尼、吉非替尼、达努塞替、多柔吡星、柔红霉素、米托蒽醌、甲氨蝶呤、喜树碱和沙奎那韦中的任意一种或多种。
本发明所述的“药物组合物”表示组合在一起以实现某种特定目的的至少一种药物以及任选地可药用载体或辅料的组合。在某些实施方案中，所述药物组合物包括在时间和/或空间上分开的组合，只要其能够共同作用以实现本发明的目的。一些药物组合物是通过联合施用一些可药用成分或化合物，达到增强本发明的生物功效或减小药物副作用（例如，可以和其他抗肿瘤药物联合使用，增强抗肿瘤效果）。另一些药物组合物的目的是促进对生物体的给药，利于活性成分的吸收，增强稳定性或靶向性，延长半衰期，进而更好的发挥本发明的生物功效。
在一种可选的实施方式中，药物组合物包括药用赋形剂、载体和稀释剂中的至少一种。
本发明的优选技术方案中，上述载体为药学上可接受的载体，药学上可接受的载体包括但不限于聚乙烯吡咯烷酮及其衍生物、聚乙烯醇及其衍生物、甲基纤维素及其衍生物、乙基纤维素及其衍生物、羟丙基纤维素及其衍生物、淀粉及其衍生物、聚乙二醇及其衍生物、乳糖、蔗糖、甘露醇、海藻糖、山梨糖醇、糊精、微晶纤维素、丙烯酸树脂、磷酸氢钙、硬脂酸钙、硬脂酰富马酸钠、二氧化硅、二氧化钛、滑石粉、色靛中的一种或其组合。
赋形剂包括至少一种极性有机溶剂和至少一种增稠剂。
稀释剂例如选自药学上可接受的水或盐。
第七方面，本发明还提供了一种嵌合抗原受体，嵌合抗原受体的抗原结合结构域包括上述的抗CD22纳米抗体或上述的抗体。
在一种可选的实施方式中，嵌合抗原受体还包括信号肽、铰链区、跨膜区和信号转导结构域。
在一种可选的实施方式中，信号转导结构域选自CD3ζ、4-1BB(CD137) 、CD27、CD30、CD40、CD54、CD83、PD-1、ICOS(CD278)、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、CD270、CD273、CD274、DAP10、CD223、CD134、CD150和CD152中的至少一种；
在一种可选的实施方式中，信号转导结构域包括CD3ζ和4-1BB胞内区；
在一种可选的实施方式中，跨膜区为CD28跨膜结构域、CD8跨膜区、CD134跨膜区、CD137跨膜区、ICOS跨膜区和DAP10跨膜区中的一种或多种；
在一种可选的实施方式中，铰链区为IgG1FC-CH2-CH3铰链区、IgG2FC-CH2-CH3铰链区、IgG4FC-CH2-CH3铰链区、CD28铰链区和CD8α铰链区中的一种或多种；
在一种可选的实施方式中，信号肽为CD8α信号肽、IL-2信号肽或GM-CSF信号肽。
第八方面，本发明还提供了一种靶向CD22的CAR-T细胞，其包括上述的嵌合抗原受体；
在一种可选的实施方式中，CAR-T细胞选自同种异体通用型CAR-T细胞（UCAR-T）和自体CAR-T细胞中的至少一种；
在一种可选的实施方式中，通用型CAR-T细胞为敲除了B2M和TRAC基因的CAR-T细胞。
第九方面，本发明还提供了抗CD22的纳米抗体、抗体、核酸分子或含核酸分子的重组载体、宿主细胞、嵌合抗原受体或CAR-T细胞在如下任一项中的应用：
（1）制备预防或治疗肿瘤的产品中的应用；
（2）制备检测CD22产品；
（3）制备联合治疗药物；
（4）抑制肿瘤细胞的增殖。
应用（1）中，在一种可选的实施方式中，产品包括：免疫细胞、试剂、试剂盒、药物和药物组合物中的至少一种；
在一种可选的实施方式中，治疗肿瘤的产品包括靶向CD22以治疗或辅助治疗肿瘤的药物；
在一种可选的实施方式中，肿瘤为原发性肿瘤或继发性肿瘤。肿瘤包括B细胞急性淋巴细胞白血病、非霍奇金淋巴瘤、慢性淋巴细胞白血病、弥漫性大B细胞淋巴瘤、毛细胞白血病以及系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、多发性硬化症中的至少一种。
本发明所述的“治疗”包括治愈、改善、降低患者的病情或病理特征，或抑制病情的恶化。
应用（2）中，产品为试剂、试剂盒或基因芯片。
在可选的实施方式中，上述试剂或试剂盒中抗体或其功能性片段标记有可被检测的标记物。
可被检测的标记物是指具有能够被肉眼直接观察或被仪器检测或探测到的特性例如发光、显色、放射性等特性的一类物质，通过该特性可以实现对相应目标物的定性或定量检测。
在可选的实施方式中，可被检测的标记物包括但不限于荧光染料、催化底物显色的酶、放射性同位素、化学发光试剂和纳米颗粒类标记物。
在实际的使用过程中，本领域技术人员可以根据检测条件或实际需要选择合适的标记物，无论使用何种标记物，其均属于本发明的保护范围。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
实施例1抗CD22蛋白纳米抗体的筛选与制备
1.CD22重组蛋白表达及纯化
将含有CD22胞外段基因的重组质粒pVax-CD22(ECD)-mFc转染至HEK293T细胞中，表达5天后收集培养上清，利用NTA-Ni柱通过亲和层析的方式纯化获得高纯度的重组蛋白CD22-mFc。
2.动物免疫
将CD22-mFc重组蛋白（1mg）与等体积铝佐剂混合后对双峰驼通过颈部及背部皮下连续免疫4次，冲击免疫后第7天采集外周血。
3. VHH噬菌体抗体文库的构建及淘选
（1） 外周血淋巴细胞分离
从颈部静脉无菌采集外周抗凝血，先用等体积RPMI-1640培养基稀释。再用Ficoll-Paque Plus淋巴细胞分离液分离获得外周血淋巴细胞，得到的淋巴细胞可直接提取总mRNA或冻存于-80℃备用。
（2）VHH基因扩增
提取淋巴细胞总mRNA，反转录获得cDNA，利用巢式PCR扩增VHH基因，第一轮PCR所用引物为（CALL001；CALL002），利用琼脂糖凝胶电泳分离并回收约700 bp条带；然后以回收的700 bp产物为模板进行第二轮PCR扩增（VHH-FOR；VHH-REV），利用琼脂糖凝胶电泳分离并回收400 bp条带。
表1 VHH基因扩增所需引物序列
（3）VHH 噬菌体展示载体构建
将回收的400 bp PCR产物和噬菌体展示载体pMECS均用PstI和NotI双酶切，然后利用T4 DNA连接酶连接。
（4）电转
将连接产物电转至大肠杆菌TG1感受态细胞中并涂布于LB/Amp-Glu平板，37℃培养过夜后，收集菌苔，加入甘油进行保存，即为制备的噬菌体文库。
（5）噬菌体文库多样性和库容的测定
将电转化产物进行10倍稀释，然后涂布于LB/Amp-Glu平板，37℃培养12 h后，计算转化子数量，最终得到库容量为3.94×109的噬菌体文库。
（6）抗CD22蛋白特异性纳米抗体的筛选
利用噬菌体展示技术经过3轮筛选后随机挑选96个克隆扩大培养，利用单克隆ELISA鉴定能够特异性结合CD22蛋白的纳米抗体，结果表明96个克隆中共有83个为阳性克隆；对阳性克隆测序结果比对分析，共获得5株抗CD22的特异性纳米抗体。
（7）抗CD22蛋白纳米抗体的特异性分析
以（6）中筛选获得的5株纳米抗体的重组上清为一抗分别与CD22重组蛋白及其他无关抗原（BCMA-mFc、CD123-mFc、CD5-His、CD7-His、CD47-mFc和B7H3-His）共孵育，利用HRPanti-M13抗体检测，结果如图1所示，获得的5株纳米抗体与CD22蛋白均能够结合，且不与其他无关抗原反应，表明上述纳米抗体均具有良好的特异结合活性。
实施例2抗CD22蛋白特异性纳米抗体的制备
以实施例1步骤（6）中含有纳米抗体基因的质粒为模板扩增VHH基因并通过同源重组的方式构建至真核表达载体pcDNA3.1-MCS-hFc中，构建成功后将其转染至HEK293T细胞中，表达5天后收集上清，利用NTA-Ni柱通过亲和层析的方式纯化获得重组纳米抗体。
实施例3 抗CD22蛋白纳米抗体与抗原结合检测
将实施例2中制备的5株特异性纳米抗体以及华道（上海）生物医药有限公司的抗CD22纳米抗体作为阳性对照纳米抗体（hu29）与包被于酶标板中的CD22重组蛋白（200 ng/孔）共孵育，利用HRP anti-human抗体进行检测，结果如图2所示，上述纳米抗体与CD22蛋白均具有良好的结合活性。
实施例4 纳米抗体与CD22蛋白的亲和力检测
将上述纳米抗体进行人源化改造后利用HEK293T细胞进行表达、纯化。将重组纳米抗体及人源化纳米抗体（huNb）和阳性对照纳米抗体（Nb29、hu29）分别与包被于CM5芯片上的抗原CD22-mFc利用Biacore 8k仪器检测结合亲和力，结果如表2所示，纳米抗体及对应的人源化纳米抗体与CD22蛋白的亲和力介于10-12~10-9M。
表2 抗CD22纳米抗体与CD22蛋白结合亲和力和动力学分析
实施例5 通用CAR-T细胞的制备
利用CRISPR基因编辑技术敲除健康供者T细胞中TRAC和B2M基因，获得TRAC-/B2M-T细胞；将含有本发明CD22纳米抗体基因的CAR慢病毒感染上述TRAC-/B2M-T细胞制备获得通用CAR-T细胞。体内外杀伤实验结果表明，本发明制备的靶向CD22同种异体通用CAR-T细胞均具有良好的抗肿瘤活性。可应用于制备预防、诊断和治疗B细胞急性淋巴细胞白血病、非霍奇金淋巴瘤、慢性淋巴细胞白血病、弥漫性大B细胞淋巴瘤、毛细胞白血病以及系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、多发性硬化症中的至少一种的药物。
具体地，UCAR-T细胞制备
（1）B2M和TRAC基因的敲除
采集健康供者外周血并分离淋巴细胞，利用CD3/CD28磁珠刺激活化增殖获得高纯度的T细胞，再将靶向B2M和TRAC的sgRNA（表3）及Cas9蛋白复合物电转至T细胞中，电转72 h后流式细胞术检测结果显示B2M和TRAC基因的敲除效率分别为63.04%和62.54%（图3），并利用含有抗β2m和HLA抗体的磁珠通过反向纯化的方式获得高纯度的B2M-/TRAC- T细胞。
表3 敲除B2M和TRAC基因的sgRNA序列
sgRNA名称 sgRNA序列
TRAC-sgRNA-1 ACAAAACTGTGCTAGACATG
TRAC-sgRNA-2 CTTCAAGAGCAACAGTGCTG
B2M-sgRNA-1 CGCGAGCACAGCTAAGGCCA
B2M-sgRNA-2 ACTCACGCTGGATAGCCTCC
（2）CAR慢病毒载体构建
以本发明中抗CD22人源化纳米抗体质粒为模板扩增靶向CD22的抗体基因并利用同源重组方式克隆至pSLCAR-BBz质粒中，构建获得一种二代CAR，该CAR主要包含以下元件：CD8α信号肽、抗原结合域、CD8α铰链区、CD28跨膜域、4-1BB胞内信号转导结构域和CD3ζ信号转导结构域（图4）。
（3）慢病毒感染制备UCAR-T细胞
将本发明中制备的CAR慢病毒质粒与包装质粒psPAX2和pMD2.G共转染HEK293T细胞收集细胞上清超速离心浓缩后获得CAR慢病毒，再将其感染B2M-/TRAC- T细胞制备成UCAR-T细胞。本发明中不同抗体的靶向CD22-UCART细胞中CAR的阳性率分别为89.3%、92.5%、90.35%、88.57%和93.15%，表明UCAR-T细胞制备成功。
实施例6 CD22-UCART细胞体外抗肿瘤实验
通过体外共培养实验检测CD22-UCART细胞抗肿瘤效果；将购自ATCC的Raji细胞（CD22表达阳性）制备成稳定表达luciferase的细胞系Raji-luciferase，并将其与UCAR-T细胞按照不同效靶比（4:1、2:1、1:1和1:2）共培养24 h后，加入荧光素钾盐避光反应5 min，置于酶标仪中检测荧光强度并计算杀伤效率。结果如图5所示，抗CD22的同种异体通用CAR-T细胞UCAR-hu501、UCAR-hu513、UCAR-hu544、UCAR-hu586和UCAR-hu590细胞对Raji细胞均具有显著的杀伤活性。UCAR-hu105、UCAR-hu29均为本发明制备的对照UCAR-T细胞。其中阴性对照UCAR-hu105细胞对Raji细胞没有杀伤活性，阳性对照UCAR-hu29细胞对Raji细胞的杀伤活性要低于本发明制备的UCAR-T细胞的肿瘤杀伤活性。
实施例7 体内检测通用CAR-T细胞在B-ALL小鼠移植模型中的抗肿瘤活性。
将购自ATCC的NALM-6和Raji细胞制备成稳定表达luciferase的细胞系NALM-6-luciferase和Raji-luciferase并分别按照每只2×106个细胞通过尾静脉接种至6~8周龄的NCG小鼠中，接种10天后在活体成像仪中检测肿瘤生长情况并将其随机分为8组，每组5只。分别于接种肿瘤细胞后第10天，将靶向CD22的UCAR-T细胞及其对照UCAR-T细胞（UCAR-hu105、UCAR-hu29）通过尾静脉接种，其中空白对照组接种相同体积的PBS。观察统计实验组和对照组每只小鼠的生存状态，观察统计时间长度为60天。利用Kaplan-Meier法绘制小鼠生存曲线并通过log-rank (Mantel-Cox)检验统计比较各组小鼠生存期的差异性。
结果如图6所示，靶向CD22的UCAR-T细胞组生存期显著长于阴性对照组（CAR-hu105）和空白对照组（PBS），表明本发明中的靶向CD22的UCAR-T细胞均有效的控制了B-ALL细胞的增殖与生长并显著延长了小鼠生存期。
前述实施例和实验例中所涉及的抗体序列及根据IMGT数据库分析比对汇总的CDR序列如下：
表4 抗体序列信息
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以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (34)

1.一种抗CD22的纳米抗体，其特征在于，所述纳米抗体包括如下所示的包含CDR1、CDR2和CDR3的重链可变区：
如SEQ ID No.9~11所示。
2.根据权利要求1所述的抗CD22的纳米抗体，其特征在于，所述纳米抗体还包括骨架区。
3.根据权利要求2所述的抗CD22的纳米抗体，其特征在于，所述纳米抗体为单价纳米抗体、多价纳米抗体、多特异性抗体和融合型纳米抗体中的至少一种。
4. 根据权利要求3所述的抗CD22的纳米抗体，其特征在于，当所述纳米抗体为单价纳米抗体时，所述纳米抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No.12和SEQ ID No.23中任意一项所示。
5.一种核酸分子或包含所述核酸分子的重组载体，其特征在于，所述核酸分子编码权利要求1-4任一项所述的抗CD22的纳米抗体。
6.根据权利要求5所述的核酸分子或包含所述核酸分子的重组载体，其特征在于，所述重组载体为质粒或病毒。
7.根据权利要求6所述的核酸分子或包含所述核酸分子的重组载体，其特征在于，所述病毒为腺病毒、腺相关病毒、逆转录病毒、慢病毒或溶瘤病毒。
8.一种宿主细胞，其特征在于，其含有权利要求5-7任一项所述的重组载体。
9.根据权利要求8所述的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞选自原核宿主细胞和真核宿主细胞中的至少一种。
10.根据权利要求9所述的宿主细胞，其特征在于，所述原核宿主细胞为大肠杆菌、链霉菌、枯草杆菌或分枝杆菌。
11.根据权利要求9所述的宿主细胞，其特征在于，所述真核宿主细胞为动物细胞、植物细胞或真菌。
12.根据权利要求11所述的宿主细胞，其特征在于，所述动物细胞选自哺乳动物细胞、昆虫细胞或秀丽隐杆线虫；
所述哺乳动物细胞选自293细胞、293T细胞、293FT细胞、CHO细胞、COS细胞、小鼠L细胞、LNCaP细胞、633细胞、Vero、BHK细胞、CV1细胞、Hela细胞、MDCK细胞、Hep-2细胞和Per6细胞中的任一种。
13.根据权利要求11所述的宿主细胞，其特征在于，所述真菌选自酿酒酵母、毕赤酵母、汉森酵母、假丝酵母、乳克鲁维酵母、构巢曲霉、粟酒裂殖酵母和解脂耶罗酵母中的任一种。
14.一种抗体的制备方法，其特征在于，其包括：培养权利要求8-13任一项所述的宿主细胞，以获得抗体。
15.一种免疫缀合物或药物组合物，其特征在于，其包括权利要求1-4任一项所述的抗CD22的纳米抗体。
16.根据权利要求15所述的免疫缀合物或药物组合物，其特征在于，所述免疫缀合物还包括治疗剂。
17.根据权利要求16所述的免疫缀合物或药物组合物，其特征在于，所述治疗剂包括：免疫检查点相关制剂、毒素、因子、化疗药物、放射性核素、激酶抑制剂和细胞毒性剂中的至少一种。
18.根据权利要求15所述的免疫缀合物或药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包括药用赋形剂、载体和稀释剂中的至少一种。
19.一种嵌合抗原受体，其特征在于，所述嵌合抗原受体的抗原结合结构域包括如权利要求1-4任一项所述的抗CD22纳米抗体。
20.根据权利要求19所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述嵌合抗原受体还包括信号肽、铰链区、跨膜区和信号转导结构域。
21.根据权利要求20所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述信号转导结构域选自CD3ζ、4-1BB(CD137) 、CD27、CD30、CD40、CD54、CD83、PD-1、ICOS(CD278)、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、CD270、CD273、CD274、DAP10、CD223、CD134、CD150和CD152中的至少一种。
22.根据权利要求21所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述信号转导结构域包括CD3ζ和4-1BB胞内区。
23.根据权利要求20所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述跨膜区为CD28跨膜结构域、CD8跨膜区、CD134跨膜区、CD137跨膜区、ICOS跨膜区和DAP10跨膜区中的一种或多种。
24.根据权利要求20所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述铰链区为IgG1FC-CH2-CH3铰链区、IgG2FC-CH2-CH3铰链区、IgG4FC-CH2-CH3铰链区、CD28铰链区和CD8α铰链区中的一种或多种。
25.根据权利要求20所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述信号肽为CD8α信号肽、IL-2信号肽或GM-CSF信号肽。
26.一种靶向CD22的CAR-T细胞，其特征在于，其包括如权利要求19-25任一项所述的嵌合抗原受体。
27.根据权利要求26所述的靶向CD22的CAR-T细胞，其特征在于，所述CAR-T细胞选自同种异体通用型CAR-T细胞（UCAR-T）和自体CAR-T细胞中的至少一种。
28.根据权利要求27所述的靶向CD22的CAR-T细胞，其特征在于，所述通用型CAR-T细胞为敲除了B2M和TRAC基因的CAR-T细胞。
29.如权利要求1-4任一项所述的抗CD22的纳米抗体、如权利要求5-7任一项所述的核酸分子或含所述核酸分子的重组载体、如权利要求8-13任一项所述的宿主细胞、如权利要求19-25任一项所述的嵌合抗原受体或如权利要求26-28任一项所述的CAR-T细胞在如下任一项中的应用：
（1）制备预防或治疗肿瘤的产品中的应用；
（2）制备检测CD22产品；
（3）制备联合治疗药物。
30.根据权利要求29所述的应用，其特征在于，所述应用（1）中，所述产品包括：免疫细胞、试剂、试剂盒、药物和药物组合物中的至少一种。
31.根据权利要求29所述的应用，其特征在于，所述治疗肿瘤的产品包括靶向CD22以治疗或辅助治疗肿瘤的药物。
32.根据权利要求29所述的应用，其特征在于，所述肿瘤为原发性肿瘤或继发性肿瘤。
33.根据权利要求32所述的应用，其特征在于，所述肿瘤为包括B细胞急性淋巴细胞白血病、非霍奇金淋巴瘤、慢性淋巴细胞白血病、弥漫性大B细胞淋巴瘤、毛细胞白血病、系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、多发性硬化症中的至少一种。
34.根据权利要求29所述的应用，其特征在于，应用（2）中，所述产品为试剂、试剂盒或基因芯片。
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