CN115960233A - 一种抗cd22的纳米抗体及其制备方法和应用 - Google Patents
一种抗cd22的纳米抗体及其制备方法和应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN115960233A CN115960233A CN202211277857.9A CN202211277857A CN115960233A CN 115960233 A CN115960233 A CN 115960233A CN 202211277857 A CN202211277857 A CN 202211277857A CN 115960233 A CN115960233 A CN 115960233A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- seq
- antibody
- nanobody
- car
- cell
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Images
Classifications
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
本发明公开了一种抗CD22的纳米抗体及其制备方法和应用,涉及生物医药领域。本发明从双峰驼VHH免疫文库中筛选到的抗CD22纳米抗体,其可特异性的结合CD22抗原,且亲和力较好,在10‑12~10‑9M数量级之间,属于高亲和力纳米抗体。本发明获得的24株抗CD22的纳米抗体分别与抗CD3抗体偶联制备的双特异性抗体对B细胞急性淋巴细胞表现出较强的杀伤活性,同时制备的CAR‑T细胞也表现出优异的抗肿瘤活性。本发明制备的CAR‑T细胞可与CD19 CAR‑T细胞联合、序贯应用,在血液或恶性淋巴瘤的治疗上具有良好的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药领域,具体而言,涉及一种抗CD22的纳米抗体及其制备方法和应用。
背景技术
B细胞急性淋巴细胞白血病(B cell acute lymphoblastic leukemia,B-ALL)是一种起源于淋巴细胞的B系细胞在骨髓内异常增生的恶性肿瘤性疾病。B-ALL在儿童急性白血病发病率中约占80%,而在成人中约占20%。目前,针对B-ALL免疫治疗的主要特异性靶点为B淋巴细胞抗原CD19(B-lymphocyte antigen CD19),靶向CD19的CAR-T细胞在血液肿瘤治疗领域取得显著成效。但其高发病率、高复发率导致难治/复发,因此需要研究者开发新的治疗靶点与治疗方案,进而为临床治疗提供新的策略。
CD22是Siglec家族的抑制受体,在60%-70%的B细胞淋巴瘤和白血病中表达,参与B细胞表面的IgM表达调节。大多数前体B细胞的细胞质也呈CD22阳性。在成熟B淋巴细胞中,细胞表面的CD22分子优先于IgM或IgD表达。CD22在T细胞及其对应的恶性肿瘤中不表达。由于CD22在B细胞上特异性高表达,所以近些年其被认为是一个非常有潜力的肿瘤治疗靶点。
1989年,Hamers教授等从单峰驼血液中发现一种分子量在100kDa左右的类似于传统IgG的分子,并于1993年进一步全面阐述了这种特殊的抗体分子。该抗体分子是一种天然缺失轻链(Light chain)和重链第一恒定区(First constant region of heavy chain,CH1)的特殊IgG分子,被称为重链抗体(Heavy chain-only Antibody,HcAb),其可变区称为(Variable domains of Camellidae heavy chain-only antibodies,VHH)。骆驼科动物重链抗体的VHH结构域经过5000多万年的演化,形成了独立于VL的具有高溶解度和高稳定性的特殊抗体,VHH结构呈橄榄球状,直径约2.5nm,高约4nm,由于其结构和分子量较小(15kDa),因此,也被称作纳米抗体(Nanobody,Nb),Nb被认为是目前发现的最小的具有结合完整抗原功能的抗体分子。与其他小分子基因工程抗体相比,纳米抗体由于具有良好的稳定性、可溶性、亲和力、特异性以及与不同蛋白分子偶联的灵活性和易改造等特点,受到各领域的高度关注。目前,纳米抗体的应用主要集中在疾病治疗、疾病与医学诊断、科学研究等。
嵌合抗原受体T细胞(CAR-T,Chimeric Antigen Receptor-T cell)是一类经过基因修饰的能够特异性识别特定抗原,且持续活化增殖并杀伤肿瘤细胞的T细胞。CAR由信号肽、抗原识别区、跨膜区以及T细胞的一系列信号转导域依次串联而成。利用慢病毒载体或者逆转录病毒载体转染哺乳动物细胞生产获得含有CAR的病毒颗粒,并感染原代T细胞使其能够稳定表达CAR,最终形成CAR-T细胞,并将其再回输至患者体内,经过修饰后的T细胞能够特异性识别和杀伤表达相关抗原的肿瘤细胞,从而达到清除肿瘤细胞的目的。
目前的抗CD22的抗体存在一些缺陷,如特异性不高,亲和力不强。
鉴于此,特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供一种抗CD22的纳米抗体及其制备方法和应用。
本发明是这样实现的:
第一方面,本发明实施例提供了一种抗CD22的纳米抗体,所述纳米抗体包括:CDR1~3的氨基酸序列如以下任一项所示的重链可变区:(1)如SEQ ID No.1~3所示;(2)如SEQID No.5~7所示;(3)如SEQ ID No.9~11所示;(4)如SEQ ID No.13~15所示;(5)如SEQ IDNo.17~19所示;(6)如SEQ ID No.21~23所示;(7)如SEQ ID No.25~27所示;(8)如SEQ IDNo.29~31所示;(9)如SEQ ID No.33~35所示;(10)如SEQ ID No.37~39所示;(11)如SEQID No.41~43所示;(12)如SEQ ID No.45~47所示;(13)如SEQ ID No.49~51所示;(14)如SEQ ID No.53~55所示;(15)如SEQ ID No.57~59所示;(16)如SEQ ID No.61~63所示;(17)如SEQ ID No.65~67所示;(18)如SEQ ID No.69~71所示;(19)如SEQ ID No.73~75所示;(20)如SEQ ID No.77、74和78所示;(21)如SEQ ID No.80~82所示;(22)如SEQ IDNo.84~86所示;(23)如SEQ ID No.88~90所示;(24)如SEQ ID No.92~94所示。
第二方面,本发明实施例提供了一种抗体,其含有如前述实施例所述的抗CD22的纳米抗体的重链可变区或VHH链。
第三方面,本发明实施例提供了一种分离的核酸或含所述分离的核酸的重组载体,所述分离的核酸编码如前述实施例所述的抗CD22的纳米抗体或前述实施例所述的抗体。
第四方面,本发明实施例提供了一种宿主细胞,其含有如前述实施例所述的重组载体。
第五方面,本发明实施例提供了一种抗体的制备方法,其包括:培养如前述实施例所述的宿主细胞,以获得抗体。
第六方面,本发明实施例提供了一种免疫缀合物或药物组合物,其包括前述实施例所述的抗CD22的纳米抗体或前述实施例所述的抗体。
第七方面,本发明实施例提供了一种嵌合抗原受体,所述嵌合抗原受体的抗原结合结构域包括如前述实施例所述的抗CD22的纳米抗体或抗体。
第八方面,本发明实施例提供了一种CAR-T细胞,其包括如前述实施例所述的嵌合抗原受体。
第九方面,本发明实施例提供了如前述实施例所述的抗CD22的纳米抗体或前述实施例所述的抗体或如前述实施例所述的分离的核酸或含所述分离的核酸的重组载体或如前述实施例所述的宿主细胞或如前述实施例所述的嵌合抗原受体或如前述实施例所述的CAR-T细胞在制备预防或治疗肿瘤的产品中的应用。
本发明具有以下有益效果:
本发明以人的CD22为靶点,通过噬菌体展示技术制备了抗CD22的特异性纳米抗体,其可特异性的结合CD22抗原,且亲和力较好,人源化后通过抗体亲和力的测定可知,人源化纳米抗体亲和力在10-12~10-9M数量级之间,属于高亲和力纳米抗体;
将抗CD22的纳米抗体与抗CD3抗体OKT3串联制备获得双特异性抗体(Nbs-OKT3),同时通过体外杀伤实验,验证了本发明的Nbs-OKT3双特异性抗体的抗肿瘤作用。结果表明,双特异性抗体Nbs-OKT3对NALM-6肿瘤细胞均具有显著的杀伤效应。
本发明的抗CD22纳米抗体制备的CAR-T细胞在体外、体内实验也表现出良好的抗肿瘤活性,可应用于制备预防、诊断和治疗B-ALL、非霍奇金淋巴瘤、慢性淋巴细胞白血病和毛细胞白血病中至少一种的药物。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案,下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍,应当理解,以下附图仅示出了本发明的某些实施例,因此不应被看作是对范围的限定,对于本领域普通技术人员来讲,在不付出创造性劳动的前提下,还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1是本发明实施例中SDS-PAGE分析纯化后的重组蛋白CD22-mFc;其中M为Maker,1为还原,2为非还原;
图2是本发明实施例中利用间接ELISA分析抗CD22的纳米抗体与CD22蛋白的结合特异性;
图3是利用间接ELISA比较抗CD22纳米抗体与CD22抗原的亲和力;
图4是利用FACS分析B-ALL天然细胞系Raji和NALM-6中CD22表达量;
图5是本发明实施例中双特异性抗体Nbs-OKT3对CD22阳性细胞系NALM-6的体外杀伤活性分析;
图6是本发明实施例中优选地双特异性抗体对CD22+-Hela细胞系的体外杀伤效率分析;
图7是本发明实施例中优选地CAR-T细胞对CD22+-Hela细胞系的体外杀伤活性分析;
图8是本发明实施例中优选地CAR-T细胞对B-ALL小鼠移植模型生存期分析。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚,下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者,按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者,均为可以通过市售购买获得的常规产品。
本发明实施例提供了一种抗CD22的纳米抗体,所述纳米抗体包括:CDR1~3的氨基酸序列如以下任一项所示的重链可变区:(1)如SEQ ID No.1~3所示;(2)如SEQ ID No.5~7所示;(3)如SEQ ID No.9~11所示;(4)如SEQ ID No.13~15所示;(5)如SEQ ID No.17~19所示;(6)如SEQ ID No.21~23所示;(7)如SEQ ID No.25~27所示;(8)如SEQ ID No.29~31所示;(9)如SEQ ID No.33~35所示;(10)如SEQ ID No.37~39所示;(11)如SEQ IDNo.41~43所示;(12)如SEQ ID No.45~47所示;(13)如SEQ ID No.49~51所示;(14)如SEQID No.53~55所示;(15)如SEQ ID No.57~59所示;(16)如SEQ ID No.61~63所示;(17)如SEQ ID No.65~67所示;(18)如SEQ ID No.69~71所示;(19)如SEQ ID No.73~75所示;(20)如SEQ ID No.77、74和78所示;(21)如SEQ ID No.80~82所示;(22)如SEQ ID No.84~86所示;(23)如SEQ ID No.88~90所示;(24)如SEQ ID No.92~94所示。具体序列可参照表3。
在一些实施例中,所述纳米抗体还包括骨架区,其重链可变区的结构为:FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4。
在一些实施例中,所述纳米抗体为单价纳米抗体、多价纳米抗体和融合型纳米抗体中的至少一种。
单价纳米抗体:是用特异性的抗原从纳米抗体库中筛选得到的抗原特异性的纳米抗体,因其表面有大量的亲水残基,能保持严格的单体结构,且仅以这种单体形式就能高特异性、高亲和力地与其抗原相结合。
多价纳米抗体:多价抗体是识别同一种表位的单价抗体的聚合物,比对应的单价纳米抗体具有更高的抗原亲和力。多特异性抗体是识别不同表位的单价抗体的聚合物,能结合不同靶目标或同一靶目标的不同表位,比单价抗体具有更高的抗原识别能力。而纳米抗体结构简单,只有一个结构域,可通过短小的连接序列聚合在一起,从而转换成多价和多特异性的形式。
融合型纳米抗体:纳米抗体具有严格的单体特点且其相对分子质量很小,很容易通过基因工程技术与其他结构(如BSA、IgG-Fc等)结合形成新的融合分子,如能延长其半衰期的酶、抗菌肽或显影物质等。在新的融合分子中,纳米抗体与其靶抗原定向结合,与纳米抗体融合的部分就能发挥相应的功能。在临床,医生希望药物能在体内停留足够长的时间,然而纳米抗体的血液清除速度却很快,不利于它所携带的药物发挥作用。所以,通过基因技术将纳米抗体VHH和寿命较长的分子融合在一起,可以提高纳米抗体在血液中的存在时间即延长其半衰期,从而达到更好的治疗效果。
在一些实施例中,当所述纳米抗体为单价纳米抗体时,所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No.4、8、12、16、20、24、28、32、36、40、44、48、52、56、60、64、68、72、76、79、83、87、91、95、96、97、98和99中任意一项所示。
另一方面,本发明实施例还提供了一种抗体,其含有如前述任意实施例所述的抗CD22的纳米抗体的重链可变区或VHH链。
在一些实施例中,所述抗体可以为全长抗体、重链抗体、嵌合抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体、三特异性抗体、四特异性抗体等等)、鼠源抗体、人源化抗体或抗原结合片段中的任意一种。所述抗原结合片段包括所述抗原结合片段选自抗体的F(ab’)2、Fab’、Fab、Fv和scFv中的任意一种,只要它们展示出所期望的抗原结合活性。
本发明所述的“嵌合抗体”是将非人源性抗体的可变区与人抗体的恒定区或骨架区融合而成的抗体,可以减轻非人源性抗体诱发的免疫应答反应。
本发明实施例还提供了一种分离的核酸,其编码如前述任意实施例所述的抗CD22的纳米抗体。
本发明实施例还提供了一种重组载体,其含有如前述任意实施例所述的分离的核酸。
所述重组载体为表达载体或克隆载体,优选为表达载体,可以指任何重组的多核苷酸构建体,该构建体可通过转化,转染或转导的方式将目的DNA片段直接或间接(如包装成病毒)导入宿主细胞内,进行目的基因表达。其中一种类型的载体是质粒,即环状双链DNA分子,可将目的DNA片段连接至质粒环中。另一种类型的载体为病毒载体,其可将目的DNA片段连接包装至病毒基因组中(如腺病毒,腺相关病毒,逆转录病毒,慢病毒,溶瘤病毒)。这些载体进入宿主细胞后,可以进行目的基因的表达。
本发明实施例还提供了一种宿主细胞,其含有如前述任意实施例所述的重组载体。具体地,宿主细胞包括原核宿主细胞、真核宿主细胞以及噬菌体中的至少一种。所述原核宿主细胞可以为大肠杆菌、链霉菌或枯草杆菌等。所述真核宿主细胞可以为293细胞、293T细胞、293FT细胞、CHO细胞、COS细胞、Per6,酿酒酵母、毕赤酵母、汉森酵母、假丝酵母、部分昆虫细胞以及植物细胞。293系列细胞,Per6细胞和CHO细胞是用于生产制备抗体或重组蛋白的常用哺乳动物细胞,为本领域普通技术人员所熟知。
本发明实施例还提供了一种抗体的制备方法,其包括:培养如前述实施例所述的宿主细胞,以获得抗体。具体地,本发明对宿主细胞的培养条件没有具体地限定,基于常规技术知识可获得能够使得宿主细胞表达产生所述抗体的培养条件。
本发明实施例还提供了一种免疫缀合物或药物组合物,其包括前述任意实施例所述的抗CD22的纳米抗体或前述任意实施例所述的抗体。
在一些实施例中,所述免疫缀合物还包括治疗剂。
在一些实施例中,所述治疗剂包括:免疫检查点相关制剂、毒素、因子、药物、放射性核素、激酶抑制剂和细胞毒性剂中的至少一种。
本发明所述的“药物组合物”表示组合在一起以实现某种特定目的的至少一种药物以及任选地可药用载体或辅料的组合。在某些实施方案中,所述药物组合物包括在时间和/或空间上分开的组合,只要其能够共同作用以实现本发明的目的。一些药物组合物是通过联合施用一些可药用成分或化合物,达到增强本发明的生物功效或减小药物副作用(例如,可以和其他抗肿瘤药物联合使用,增强抗肿瘤效果)。另一些药物组合物的目的是促进对生物体的给药,利于活性成分的吸收,增强稳定性或靶向性,延长半衰期,进而更好的发挥本发明的生物功效。
在一些实施例中,所述药物组合物包括药用赋形剂、载体和稀释剂中的至少一种。
本发明实施例提供了一种嵌合抗原受体,所述嵌合抗原受体的抗原结合结构域包括如前述任意实施例所述的抗CD22的纳米抗体或前述任意实施例所述的抗体。
在一些实施例中,所述嵌合抗原受体还包括信号肽、铰链区、跨膜区和信号转导结构域。
在一些实施例中,所述信号转导结构域包括CD3ζ。
在一些实施例中,所述信号转导结构域还包括4-1BB胞内区。
本发明实施例还提供了一种CAR-T细胞,其包括如前述实施例所述的嵌合抗原受体。
在一些实施例中,所述CAR-T细胞包括通用型CAR-T细胞和自体CAR-T细胞中的至少一种。
自体CAR-T细胞疗法具有不会发生免疫排斥反应、可以在体内持续存在较长时间等优势。但自体CAR-T细胞治疗存在一些局限性,例如制备成本高、多线治疗的AML患者T细胞数量少或化疗后T细胞功能受损导致其质量下降、患者T细胞功能障碍,以及制造周期长,使得患者错过最佳治疗时间。随着ZFN、TALEN、CRISPR/Cas9等多种基因编辑技术的快速发展,运用基因编辑技术敲除CAR-T细胞表面的T细胞受体(TCR)、HLA分子β2微球蛋白(B2M)和CD52等,以最大限度的降低GVHD风险。这种通用型CAR-T(UCAR-T)细胞疗法的开发可以克服大多数自体CAR-T细胞治疗缺点,如进行标准化流程的规模化和工业化制造,并降低了成本,可以从单个供体制备大量CAR-T细胞。同种异体CAR-T细胞可冻存,使患者能立即获得治疗,不错过最佳治疗时机。它简化了在单个细胞产品中引入多种修饰的过程,以及基于供体选择和处理CAR-T细胞产品的标准化。自体CAR-T细胞通常只为该患者制备一次CAR-T产品,而同种异体细胞在需要的情况下可以使用这些现成的产品重复给药。
此外,本发明实施例还提供了如前述任意实施例所述的抗CD22的纳米抗体或前述实施例所述的抗体或如前述任意实施例所述的分离的核酸或如前述任意实施例所述的重组载体在制备用于预防或治疗肿瘤的产品中的应用。
本发明所述的“治疗”包括治愈、改善、降低患者的病情或病理特征,或抑制病情的恶化。
可选地,所述产品包括:免疫细胞、试剂、试剂盒、药物和药物组合物中的至少一种。
可选地,所述治疗肿瘤的产品包括靶向CD22以治疗或辅助治疗肿瘤的药物;
可选地,所述肿瘤包括B细胞急性淋巴细胞白血病、非霍奇金淋巴瘤、慢性淋巴细胞白血病、毛细胞白血病以及自身免疫病中的至少一种。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
实施例1CD22蛋白真核表达载体的构建及其表达、纯化
1.1载体构建
以含有CD22全长基因的质粒为模板,设计引物扩增获得CD22胞外区(ECD)基因,并利用同源重组的方式将其连接至经限制性内切酶Pst Ⅰ和Xba Ⅰ双酶切后的pVax-mFc载体中,通过转化至DH5α感受态中涂布卡那抗性平板置于37℃温箱培养过夜,挑取单克隆测序鉴定。
1.2重组蛋白的表达及纯化
将构建成功的含有CD22胞外区基因的重组质粒pVax-CD22(ECD)-mFc转染至HEK293T细胞中,表达5天后收集培养上清,利用NTA-Ni柱通过亲和层析的方式纯化获得高纯度的重组蛋白CD22-mFc,结果如图1所示。
实施例2抗CD22蛋白纳米抗体的筛选与制备
2.1蛋白乳化与动物免疫
将1mg纯化的CD22-mFc重组蛋白与等体积的弗氏完全佐剂乳化后对阿拉善双峰驼通过颈部皮下进行第一次免疫,然后每隔2周将1mg蛋白与不完全弗氏佐剂乳化后连续进行4次免疫,冲击免疫后的第7天采集外周抗凝血和凝血。
2.2VHH噬菌体抗体文库的构建及淘选
2.2.1外周血淋巴细胞的分离
从骆驼颈部静脉无菌采集200mL外周抗凝血,先用等体积的RPMI-1640培养基稀释。再用Ficoll-Paque Plus淋巴细胞分离液(GE公司)和淋巴细胞分离管通过离心的方式分离获得外周血淋巴细胞,得到的淋巴细胞可直接提取总RNA或冻存于-80℃备用。
2.2.2VHH基因扩增
首先按照说明书提取获得的淋巴细胞总RNA(catalog 74134,RNeasy Plus MiniKit,QIAGEN),再利用反转录试剂盒(catalog 18080051,SuperScript III First-StrandSynthesis System,Invitrogen)以RNA为模板反转录获得cDNA,再以cDNA为模板,利用巢式PCR扩增VHH基因,第一轮PCR所用引物为(CALL001;CALL002),利用琼脂糖凝胶电泳分离并回收约700bp条带;然后以回收的700bp产物为模板进行第二轮PCR扩增,第二轮PCR所用引物为(VHH-FOR;VHH-REV),利用琼脂糖凝胶电泳分离并回收400bp条带。
表1VHH基因扩增所需引物序列
引物名称 | 引物序列(5’-3’) |
CALL001 | GTCCTGGCTGCTCTTCTACAAGG |
CALL002 | GGTACGTGCTGTTGAACTGTTCC |
VHH-FOR | GTCCTGGCTGCTCTTCTACAAGG |
VHH-REV | GGTACGTGCTGTTGAACTGTTCC |
2.2.3VHH噬菌体展示载体的构建
将2.2.2中回收的400bp产物和噬菌体展示载体pMECS均用Pst I和Not I双酶切并回收,然后利用T4 DNA连接酶连接。
2.2.4连接产物电转TG1感受态细胞及噬菌体抗体文库的收获
将2.2.3中连接产物加入大肠杆菌TG1感受态细胞中通过电转的方式使其进入TG1中,电转完成后立即加入SOC培养基并于37℃、200rpm培养1h后,涂布于LB/AMP-GLU平板,37℃培养6~8h后,收集菌苔,加入1/3体积的50%甘油,即为制备的噬菌体文库。
2.2.5噬菌体文库多样性和库容的测定
将电转化产物进行10倍稀释,然后涂布于LB/Amp-Glu平板,37℃培养12h后,计算转化子数量,最终得到库容量为2.86×108的噬菌体文库。
2.2.6抗CD22蛋白的特异性纳米抗体的筛选
以制备的噬菌体文库为抗体来源,利用噬菌体展示技术经过3轮筛选。再从第三轮筛选的平板中随机挑选288个克隆扩大培养,利用单克隆ELISA鉴定其中能够特异性结合CD22蛋白的纳米抗体,结果表明288个克隆中共有262个为阳性克隆(P/N>3.0,P代表CD22孔OD450数值,N代表对照孔OD450数值);对阳性克隆测序结果比对分析,共获得24株抗CD22的特异性纳米抗体。
2.2.7抗CD22蛋白纳米抗体的特异性分析
以2.2.6中筛选获得的24株特异性纳米抗体的重组上清为一抗,与包被于酶标板中的CD22重组蛋白及其他无关抗原(BCMA-mFc、CD123-mFc、CD5-His、CD7-His、CD47-mFc和B7H3-His)共孵育,利用HRP-anti-M13抗体为检测抗体,结果如图2所示,获得的24株纳米抗体与CD22蛋白均特异性结合,且不与其他无关抗原反应,表明上述纳米抗体均具有良好的特异结合活性。
实施例3抗CD22蛋白的特异性纳米抗体的制备
以2.2.6步骤中含有纳米抗体基因的质粒为模板扩增VHH基因并通过同源重组的方式构建至真核表达载体pcDNA3.1-hFc中,经测序无误后提取质粒并将其转染至HEK293T细胞中,表达5天后收集上清,利用NTA-Ni柱通过亲和层析的方式纯化获得重组纳米抗体。
实施例4抗CD22蛋白的纳米抗体亲和力比较
以实施例3中制备获得的24株特异性纳米抗体为一抗,与包被于酶标板中的CD22重组蛋白(200ng/孔、100ng/孔、50ng/孔和25ng/孔)共孵育,利用HRP-anti-human抗体为检测抗体,结果如图3所示,上述纳米抗体与CD22蛋白均具有良好的结合活性。
实施例5Biacore检测优选纳米抗体与CD22蛋白的亲和力
根据实施例4结果,将重组纳米抗体及其优选地抗体对应的人源化纳米抗体(huNb)和阳性对照纳米抗体(Nb248、hu248)分别与包被于CM5芯片上的抗原CD22-mFc利用Biacore 8k仪器检测结合亲和力,结果如表2所示,纳米抗体及对应的人源化纳米抗体与CD22蛋白的亲和力介于10-12M~10-9M。
表2抗CD22纳米抗体与CD22蛋白体外结合亲和力和动力学分析
纳米抗体 | 结合速率ka(1/M*s) | 解离速率kd(1/s) | 亲和力KD(M) |
194 | 2.68E+05 | 6.38E-07 | 2.38E-12 |
402 | 1.93E+05 | 8.47E-05 | 4.39E-10 |
403 | 5.72E+05 | 3.65E-06 | 6.38E-12 |
404 | 6.94E+05 | 1.69E-06 | 2.44E-12 |
405 | 9.61E+06 | 5.34E-05 | 5.56E-12 |
408 | 3.89E+05 | 5.91E-05 | 1.52E-10 |
412 | 7.63E+05 | 3.54E-06 | 4.64E-12 |
414 | 3.84E+05 | 6.94E-06 | 1.81E-11 |
420 | 2.21E+05 | 8.33E-05 | 3.77E-10 |
426 | 6.95E+05 | 2.15E-05 | 3.09E-11 |
428 | 5.28E+05 | 7.69E-06 | 1.46E-11 |
430 | 3.28E+06 | 1.67E-06 | 5.09E-11 |
437 | 9.35E+05 | 1.09E-06 | 1.17E-12 |
445 | 6.38E+05 | 2.95E-05 | 4.62E-11 |
449 | 9.34E+05 | 3.45E-05 | 3.69E-11 |
453 | 6.76E+05 | 1.23E-05 | 1.82E-11 |
454 | 6.94E+05 | 1.97E-06 | 2.84E-12 |
474 | 6.64E+05 | 9.67E-05 | 1.46E-10 |
512 | 1.13E+06 | 1.08E-04 | 9.56E-11 |
546 | 2.45E+05 | 1.06E-05 | 4.33E-11 |
570 | 6.97E+05 | 1.25E-05 | 1.79E-11 |
579 | 4.98E+05 | 2.42E-06 | 4.86E-12 |
591 | 3.15E+05 | 8.61E-06 | 2.73E-11 |
625 | 2.13E+06 | 1.91E-04 | 8.93E-11 |
Nb248 | 2.95E+05 | 4.10E-04 | 1.39E-09 |
hu194 | 2.57E+05 | 1.15E-06 | 4.46E-12 |
hu512 | 1.26E+06 | 2.35E-04 | 1.86E-10 |
hu579 | 6.77E+05 | 2.08E-06 | 3.07E-12 |
hu625 | 2.37E+06 | 2.81E-04 | 1.19E-10 |
hu248 | 2.48E+05 | 2.86E-04 | 1.16E-09 |
实施例6B-ALL细胞系中CD22分子的表达分析
将APC anti-human CD22 antibody(catalog 363506,Biolegend)与B细胞淋巴细胞白血病细胞系NALM-6和Raji分别共孵育,利用FACS进行检测上述两种细胞表面CD22的表达量,结果如图4所示,上述细胞系中CD22分子均呈强阳性表达。
实施例7双特异性抗体Nbs-OKT3对B-ALL细胞系的体外杀伤活性分析
将本发明提供的24株纳米抗体分别与抗CD3分子的抗体OKT3(SEQ ID No.100)利用(G4S)3linker串联构建至真核表达载体,转染HEK293T细胞表达,并利用Ni柱纯化。将上述纯化的双特异性抗体(1μg/mL、0.1μg/mL、0.01μg/mL、0.001μg/mL)分别与B-ALL细胞系NALM-6-luciferase及激活的T细胞按照效靶比3:1共孵育24h后,通过检测实验组与对照组Luciferase值评价杀伤活性,结果如图5所示,上述24种双特异性抗体对CD22阳性的天然B-ALL细胞系均具有较强的体外杀伤活性。
实施例8RTCA检测优选人源化双特异性抗体对CD22+-Hela细胞系的体外杀伤活性
将CD22+-Hela细胞按照每孔5000个细胞、100μL/孔(复孔)缓慢加入非标记杀伤检测仪(RTCA)仪器专用96孔板中,置于仪器中培养至Cell Index数值位于1.0~2.0之间,按照E:T为3:1的比例加入T细胞、优选地人源化双特异性抗体以及无关对照抗体(hu388-OKT3)进行共培养,启动仪器继续检测,结果如图6所示,共培养60h后,双特异性抗体hu194-OKT3、hu512-OKT3和hu579-OKT3的体外杀伤活性相当且强于hu625-OKT3及阳性对照抗体hu248-OKT3,无关对照抗体hu388-OKT3与空白对照相似均无杀伤活性。
实施例9嵌合抗原受体T细胞体外抗肿瘤实验
效应细胞和靶细胞的准备:提取健康捐献者外周血,分离T细胞,经刺激扩增后,通过慢病毒转染的方式将构建的嵌合抗原受体转染至T细胞,检测CAR的表达并分离CAR-T细胞;靶细胞选择CD22稳定转染的Hela细胞,培养于添加了10%胎牛血清的DMEM培养基中。
通过体外共培养实验检测CAR-T细胞抗肿瘤效果;取对数生长期CD22+-Hela(2×104/孔)细胞于96孔板,按照特定的效靶比加入CAR-T细胞,经过24h共培养后,通过荧光显微镜观察孔内细胞形态,结果如图7所示,CAR-hu194、CAR-hu512、CAR-hu579以及CAR-hu625组对CD22+-Hela细胞具有显著的杀伤活性且强于对照组CAR-hu248。
实施例10体内检测CAR-T细胞在B-ALL小鼠移植模型中的抗肿瘤活性
结合上述24种双特异性抗体的体外杀伤活性及对CD22蛋白的亲和力,选择人源化纳米抗体hu579制备的CAR-T细胞用于体内药效学评价。
将NALM-6-luciferase和Raji-luciferase细胞分别按照每只2×106个细胞通过尾静脉接种至6~10周龄的NCG小鼠中,接种10天后在活体成像仪中检测肿瘤生长情况并将其随机分为3组,每组5只。分别于接种肿瘤细胞后第10天,将优选地CAR-T(CAR-hu579)及其对照CAR-T(CAR-hu388、CAR-hu248)通过尾静脉注射,其中空白对照组接种相同体积的PBS。观察统计实验组和对照组每只小鼠的生存状态,观察统计时间长度为60天。利用Kaplan-Meier法绘制小鼠生存曲线并通过log-rank(Mantel-Cox)检验统计比较各组小鼠生存期的差异性。结果如图8所示,阳性CAR-T组(CAR-hu579和CAR-hu248)生存期显著长于阴性对照组(CAR-hu388)和空白对照组(PBS),表明本发明中的CAR-T(CAR-hu579)有效的控制了B-ALL细胞的增殖与生长并显著延长了小鼠生存期。
前述实施例中所涉及的抗体序列及根据IMGT数据库分析比对汇总的CDR序列如下:
表3抗体的序列信息
以上所述仅为本发明的优选实施例,并不用于限制本发明,对于本领域的技术人员来说,本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内,所作的任何修改、等同替换、改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种抗CD22的纳米抗体,其特征在于,所述纳米抗体包括:CDR1~3的氨基酸序列如以下任一项所示的重链可变区:
(1)如SEQ ID No.1~3所示;
(2)如SEQ ID No.5~7所示;
(3)如SEQ ID No.9~11所示;
(4)如SEQ ID No.13~15所示;
(5)如SEQ ID No.17~19所示;
(6)如SEQ ID No.21~23所示;
(7)如SEQ ID No.25~27所示;
(8)如SEQ ID No.29~31所示;
(9)如SEQ ID No.33~35所示;
(10)如SEQ ID No.37~39所示;
(11)如SEQ ID No.41~43所示;
(12)如SEQ ID No.45~47所示;
(13)如SEQ ID No.49~51所示;
(14)如SEQ ID No.53~55所示;
(15)如SEQ ID No.57~59所示;
(16)如SEQ ID No.61~63所示;
(17)如SEQ ID No.65~67所示;
(18)如SEQ ID No.69~71所示;
(19)如SEQ ID No.73~75所示;
(20)如SEQ ID No.77、74和78所示;
(21)如SEQ ID No.80~82所示;
(22)如SEQ ID No.84~86所示;
(23)如SEQ ID No.88~90所示;
(24)如SEQ ID No.92~94所示。
2.根据权利要求1所述的抗CD22的纳米抗体,其特征在于,所述纳米抗体还包括骨架区;
优选地,所述纳米抗体为单价纳米抗体、多价纳米抗体、多特异性抗体和融合型纳米抗体中的至少一种;
优选地,当所述纳米抗体为单价纳米抗体时,所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ IDNo.4、8、12、16、20、24、28、32、36、40、44、48、52、56、60、64、68、72、76、79、83、87、91、95、96、97、98和99中任意一项所示。
3.一种抗体,其特征在于,其含有如权利要求1或2所述的抗CD22的纳米抗体的重链可变区或VHH链。
4.一种分离的核酸或含所述分离的核酸的重组载体,其特征在于,所述分离的核酸编码如权利要求1或2任一项所述的抗CD22的纳米抗体或权利要求3所述的抗体。
5.一种宿主细胞,其特征在于,其含有如权利要求4所述的重组载体。
6.一种抗体的制备方法,其特征在于,其包括:培养如权利要求5所述的宿主细胞,以获得抗体。
7.一种免疫缀合物或药物组合物,其特征在于,其包括权利要求1或2所述的抗CD22的纳米抗体或权利要求3所述的抗体;
优选地,所述免疫缀合物还包括治疗剂;
优选地,所述治疗剂包括:免疫检查点相关制剂、毒素、因子、药物、放射性核素、激酶抑制剂和细胞毒性剂中的至少一种;
优选地,所述药物组合物包括药用赋形剂、载体和稀释剂中的至少一种。
8.一种嵌合抗原受体,其特征在于,所述嵌合抗原受体的抗原结合结构域包括如权利要求1或2所述的抗CD22的纳米抗体或权利要求3所述的抗体;
优选地,所述嵌合抗原受体还包括信号肽、铰链区、跨膜区和信号转导结构域;
优选地,所述信号转导结构域包括CD3ζ;
优选地,所述信号转导结构域还包括4-1BB胞内区。
9.一种CAR-T细胞,其特征在于,其包括如权利要求7所述的嵌合抗原受体;
优选地,所述CAR-T细胞包括通用型CAR-T细胞和自体CAR-T细胞中的至少一种。
10.如权利要求1或2所述的抗CD22的纳米抗体或权利要求3所述的抗体或如权利要求4所述的分离的核酸或含所述分离的核酸的重组载体或如权利要求5所述的宿主细胞或如权利要求8所述的嵌合抗原受体或如权利要求9所述的CAR-T细胞在制备预防或治疗肿瘤的产品中的应用;
优选地,所述产品包括:免疫细胞、试剂、试剂盒、药物和药物组合物中的至少一种;
优选地,所述治疗肿瘤的产品包括靶向CD22以治疗或辅助治疗肿瘤的药物;
优选地,所述肿瘤包括B细胞急性淋巴细胞白血病、非霍奇金淋巴瘤、慢性淋巴细胞白血病、毛细胞白血病以及自身免疫病中的至少一种。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202211277857.9A CN115960233B (zh) | 2022-10-19 | 2022-10-19 | 一种抗cd22的纳米抗体及其制备方法和应用 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202211277857.9A CN115960233B (zh) | 2022-10-19 | 2022-10-19 | 一种抗cd22的纳米抗体及其制备方法和应用 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN115960233A true CN115960233A (zh) | 2023-04-14 |
CN115960233B CN115960233B (zh) | 2023-09-22 |
Family
ID=87357671
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN202211277857.9A Active CN115960233B (zh) | 2022-10-19 | 2022-10-19 | 一种抗cd22的纳米抗体及其制备方法和应用 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN115960233B (zh) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN116554326A (zh) * | 2023-04-19 | 2023-08-08 | 四川大学 | 一种靶向cd22同种异体通用car-t细胞的制备及用途 |
Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2019204132A1 (en) * | 2018-04-15 | 2019-10-24 | Biosion Inc. | Antibodies binding pd-1 and uses thereof |
CN112480258A (zh) * | 2020-12-11 | 2021-03-12 | 华道(上海)生物医药有限公司 | 抗cd123纳米抗体及其应用 |
CN112830970A (zh) * | 2021-02-06 | 2021-05-25 | 河南创新生物科技研究院有限公司 | 一种cd22纳米抗体、分离的核酸分子、药物组合物及其应用 |
CN114149506A (zh) * | 2021-12-16 | 2022-03-08 | 华道(上海)生物医药有限公司 | 一种抗cd22抗体及其应用 |
-
2022
- 2022-10-19 CN CN202211277857.9A patent/CN115960233B/zh active Active
Patent Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2019204132A1 (en) * | 2018-04-15 | 2019-10-24 | Biosion Inc. | Antibodies binding pd-1 and uses thereof |
CN112480258A (zh) * | 2020-12-11 | 2021-03-12 | 华道(上海)生物医药有限公司 | 抗cd123纳米抗体及其应用 |
CN112830970A (zh) * | 2021-02-06 | 2021-05-25 | 河南创新生物科技研究院有限公司 | 一种cd22纳米抗体、分离的核酸分子、药物组合物及其应用 |
CN114149506A (zh) * | 2021-12-16 | 2022-03-08 | 华道(上海)生物医药有限公司 | 一种抗cd22抗体及其应用 |
Non-Patent Citations (2)
Title |
---|
HU Y ET AL: "CRISPR/Cas9-Engineered Universal CD19/CD22 Dual-Targeted CAR-T Cell Therapy for Relapsed/Refractory B-cell Acute Lymphoblastic Leukemia", CLIN CANCER RES, vol. 27, no. 10, pages 2764 - 2772 * |
毛俊等: "抗体偶联药物研究进展", 海峡药学, vol. 28, no. 6, pages 1 - 4 * |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN116554326A (zh) * | 2023-04-19 | 2023-08-08 | 四川大学 | 一种靶向cd22同种异体通用car-t细胞的制备及用途 |
CN116554326B (zh) * | 2023-04-19 | 2024-02-23 | 四川大学 | 一种靶向cd22同种异体通用car-t细胞的制备及用途 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN115960233B (zh) | 2023-09-22 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN110041433B (zh) | 一种靶向bcma的嵌合抗原受体及其应用 | |
JP7091447B2 (ja) | 新型なscFvアミノ酸配列、それを含むキメラ抗原受容体、およびその使用 | |
US11912770B2 (en) | Blocking type PD-L1 single-domain camel antibody and application thereof | |
RU2748281C2 (ru) | Полностью человеческие антитела к мезотелину и иммунные эффекторные клетки, нацеленные на мезотелин | |
US11090334B2 (en) | Chimeric antigen receptor specific to b-cell maturation antigen, a recombinant expression vector and a method thereof | |
CN107814845B (zh) | 新的抗pd-1纳米抗体及其应用 | |
WO2018233574A1 (zh) | 一种抗pd-l1人源化纳米抗体及其应用 | |
CN111454358A (zh) | 一种嵌合抗原受体及其应用 | |
CN111909271B (zh) | 一种基于单域抗体的bcma嵌合抗原受体及其应用 | |
CN111499767B (zh) | 一种合成t细胞受体抗原受体复合物及其应用 | |
CA3039797A1 (en) | Humanized anti-muc1* antibodies and use of cleavage enzyme | |
EP3868783A1 (en) | Anti-l1cam antibody or antigen-binding fragment thereof and chimeric antigen receptor comprising same | |
CN113896801A (zh) | 靶向人Claudin18.2和NKG2DL的嵌合抗原受体细胞及其制备方法和应用 | |
CN115960233B (zh) | 一种抗cd22的纳米抗体及其制备方法和应用 | |
CN112679618B (zh) | 一种靶向trbc1的人源化嵌合抗原受体、t细胞及用途 | |
CN109608547B (zh) | 表达Her2的嵌合抗原受体、慢病毒表达载体及其应用 | |
CN116284389A (zh) | 抗afp/hla02 tcr样抗体及其用途 | |
CN116396385A (zh) | 一种抗bcma的纳米抗体及其制备方法和应用 | |
CN110950954A (zh) | 抗cd123人源化单链抗体及其应用 | |
CN116239690B (zh) | 一种抗cd123的纳米抗体及其制备方法和应用 | |
WO2023088295A1 (zh) | 一种多特异性抗体及其药物用途 | |
JPH10155489A (ja) | 組換え抗体及びそれをコードする核酸 | |
US20230242666A1 (en) | Methods and Compositions for the Reduction of Chimeric Antigen Receptor Tonic Signaling | |
CN117736327A (zh) | 靶向clec12a同种异体通用car-t细胞的制备及用途 | |
CN106916224B (zh) | 抗b淋巴细胞刺激因子单克隆抗体及其制备方法和用途 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
GR01 | Patent grant | ||
GR01 | Patent grant |