RU2817697C1 - Моноклональное антитело iC2 и его антигенсвязывающий фрагмент, селективно связывающие рецептор-связывающий домен Spike-белка вируса SARS-CoV-2, обладающие вируснейтрализующей активностью - Google Patents
Моноклональное антитело iC2 и его антигенсвязывающий фрагмент, селективно связывающие рецептор-связывающий домен Spike-белка вируса SARS-CoV-2, обладающие вируснейтрализующей активностью Download PDFInfo
- Publication number
- RU2817697C1 RU2817697C1 RU2023133176A RU2023133176A RU2817697C1 RU 2817697 C1 RU2817697 C1 RU 2817697C1 RU 2023133176 A RU2023133176 A RU 2023133176A RU 2023133176 A RU2023133176 A RU 2023133176A RU 2817697 C1 RU2817697 C1 RU 2817697C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- insdqualifier
- insdseq
- seq
- antibody
- virus
- Prior art date
Links
- 241001678559 COVID-19 virus Species 0.000 title claims abstract description 60
- 238000009739 binding Methods 0.000 title claims abstract description 50
- 230000027455 binding Effects 0.000 title claims abstract description 49
- 239000012634 fragment Substances 0.000 title claims abstract description 45
- 101710198474 Spike protein Proteins 0.000 title claims abstract description 18
- 229940096437 Protein S Drugs 0.000 title claims abstract description 17
- 230000000694 effects Effects 0.000 title claims abstract description 11
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims abstract description 36
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims abstract description 36
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims abstract description 36
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 claims abstract description 7
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 claims abstract description 7
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims abstract 11
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 24
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 19
- 108010047041 Complementarity Determining Regions Proteins 0.000 claims description 16
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 10
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims description 2
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 abstract description 19
- 238000011161 development Methods 0.000 abstract description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 27
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 17
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 16
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 16
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 13
- 238000000034 method Methods 0.000 description 13
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 10
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 10
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 9
- 241000315672 SARS coronavirus Species 0.000 description 8
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 8
- 208000025721 COVID-19 Diseases 0.000 description 6
- 101000629318 Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 Spike glycoprotein Proteins 0.000 description 6
- 238000012575 bio-layer interferometry Methods 0.000 description 6
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 6
- 102100031673 Corneodesmosin Human genes 0.000 description 5
- 101710139375 Corneodesmosin Proteins 0.000 description 5
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 5
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 5
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 5
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 5
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 5
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 5
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 5
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 5
- 208000001528 Coronaviridae Infections Diseases 0.000 description 4
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 4
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 4
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 4
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 4
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 4
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 4
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 4
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 4
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 3
- 108010067060 Immunoglobulin Variable Region Proteins 0.000 description 3
- 102000017727 Immunoglobulin Variable Region Human genes 0.000 description 3
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 3
- 229940052143 bamlanivimab Drugs 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 3
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 3
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 3
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 3
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 3
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 3
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 3
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 3
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 3
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 description 3
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 3
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 3
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 3
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 3
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 3
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 3
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 3
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 3
- FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 4',6-Diamino-2-phenylindol Chemical compound C1=CC(C(=N)N)=CC=C1C1=CC2=CC=C(C(N)=N)C=C2N1 FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000053723 Angiotensin-converting enzyme 2 Human genes 0.000 description 2
- 108090000975 Angiotensin-converting enzyme 2 Proteins 0.000 description 2
- 102100024222 B-lymphocyte antigen CD19 Human genes 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101000980825 Homo sapiens B-lymphocyte antigen CD19 Proteins 0.000 description 2
- 108010054477 Immunoglobulin Fab Fragments Proteins 0.000 description 2
- 102000001706 Immunoglobulin Fab Fragments Human genes 0.000 description 2
- 108700005091 Immunoglobulin Genes Proteins 0.000 description 2
- 102000006496 Immunoglobulin Heavy Chains Human genes 0.000 description 2
- 108010019476 Immunoglobulin Heavy Chains Proteins 0.000 description 2
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 2
- 108091007491 NSP3 Papain-like protease domains Proteins 0.000 description 2
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 2
- 239000012491 analyte Substances 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 229940051183 casirivimab Drugs 0.000 description 2
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 2
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- 230000036541 health Effects 0.000 description 2
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 2
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 2
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 2
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 2
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 2
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 description 2
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 239000002594 sorbent Substances 0.000 description 2
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- NFGXHKASABOEEW-UHFFFAOYSA-N 1-methylethyl 11-methoxy-3,7,11-trimethyl-2,4-dodecadienoate Chemical compound COC(C)(C)CCCC(C)CC=CC(C)=CC(=O)OC(C)C NFGXHKASABOEEW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UZOVYGYOLBIAJR-UHFFFAOYSA-N 4-isocyanato-4'-methyldiphenylmethane Chemical compound C1=CC(C)=CC=C1CC1=CC=C(N=C=O)C=C1 UZOVYGYOLBIAJR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- 108091093088 Amplicon Proteins 0.000 description 1
- 241000711573 Coronaviridae Species 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 241000713772 Human immunodeficiency virus 1 Species 0.000 description 1
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 description 1
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 description 1
- 102000013463 Immunoglobulin Light Chains Human genes 0.000 description 1
- 108010065825 Immunoglobulin Light Chains Proteins 0.000 description 1
- 241000713666 Lentivirus Species 0.000 description 1
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 1
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 1
- 239000012124 Opti-MEM Substances 0.000 description 1
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 1
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 1
- 241000288906 Primates Species 0.000 description 1
- 108091005634 SARS-CoV-2 receptor-binding domains Proteins 0.000 description 1
- 208000037847 SARS-CoV-2-infection Diseases 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 238000002441 X-ray diffraction Methods 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 1
- 239000000443 aerosol Substances 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 238000003766 bioinformatics method Methods 0.000 description 1
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 1
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 238000009510 drug design Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 238000001943 fluorescence-activated cell sorting Methods 0.000 description 1
- 210000004602 germ cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 1
- 229940051184 imdevimab Drugs 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 238000003119 immunoblot Methods 0.000 description 1
- 238000012760 immunocytochemical staining Methods 0.000 description 1
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 1
- 230000002998 immunogenetic effect Effects 0.000 description 1
- 238000011532 immunohistochemical staining Methods 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 238000010255 intramuscular injection Methods 0.000 description 1
- 239000007927 intramuscular injection Substances 0.000 description 1
- 238000010253 intravenous injection Methods 0.000 description 1
- 238000004020 luminiscence type Methods 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 229940126619 mouse monoclonal antibody Drugs 0.000 description 1
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 1
- 230000000869 mutational effect Effects 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 1
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 1
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 description 1
- 230000002064 post-exposure prophylaxis Effects 0.000 description 1
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 1
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 1
- 230000003449 preventive effect Effects 0.000 description 1
- 238000007639 printing Methods 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 238000011321 prophylaxis Methods 0.000 description 1
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 1
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 1
- 230000000241 respiratory effect Effects 0.000 description 1
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 1
- 210000003296 saliva Anatomy 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 239000012679 serum free medium Substances 0.000 description 1
- 238000007086 side reaction Methods 0.000 description 1
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 1
- AYEKOFBPNLCAJY-UHFFFAOYSA-O thiamine pyrophosphate Chemical compound CC1=C(CCOP(O)(=O)OP(O)(O)=O)SC=[N+]1CC1=CN=C(C)N=C1N AYEKOFBPNLCAJY-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 1
- 238000010361 transduction Methods 0.000 description 1
- 230000026683 transduction Effects 0.000 description 1
- 238000003151 transfection method Methods 0.000 description 1
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 1
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Abstract
Изобретение относится к области биотехнологии. Описана группа изобретений, включающая моноклональное антитело iC2 и его антигенсвязывающий фрагмент, селективно связывающие рецептор-связывающий домен (RBD) Spike-белка вируса SARS-CoV-2, обладающие вируснейтрализующей активностью. В одном из вариантов реализации изобретения моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент включают вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую последовательность аминокислот SEQ ID NO: 3, и вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую последовательность аминокислот SEQ ID NO: 4. Изобретение направлено на разработку нового моноклонального антитела, связывающегося с RBD Spike-белка вируса SARS-CoV-2, имеющего повышенную аффинность и способного нейтрализовать различные варианты вируса SARS-CoV-2 штамма Омикрон. 2 н. и 5 з.п. ф-лы, 4 ил., 2 табл., 4 пр.
Description
Группа изобретений относится к области биотехнологии, иммунологии и вирусологии, а именно к моноклональным антителам и их антигенсвязывающим фрагментам, которые связываются с рецептор-связывающим доменом (RBD) Spike-белка вируса SARS-CoV-2, нейтрализующие вирус SARS-CoV-2, к фрагментам ДНК, кодирующим указанные антитела.
За три года с начала пандемии, вызванной бета-коронавирусом SARS-CoV-2, была зарегистрирована гибель почти 7 млн человек. Использование ряда средств профилактики и терапии коронавирусной инфекции, вызванной SARS-CoV-2 (также называемой в данном документе ковид-19), позволяет снизить вероятность заражения, госпитализации и летального исхода. К таким средствам относятся вакцинопрофилактика, использование вирус-специфических малых молекул, препаратов плазмы реконвалесцентов, рекомбинантных Spike-специфичных белков (в том числе антител) и их производных. Несмотря на повсеместное проведение кампаний по иммунизации населения и идентификации нейтрализующих моноклональных антител против Spike-белка вируса SARS-CoV-2, существует значительная потребность в получении новых вариантов таких антител для расширения арсенала диагностических, профилактических и терапевтических средств особенно с учетом появления новых вариантов вируса. Кроме того, существуют группы населения, которым вакцинация либо не показана по медицинским соображениям, либо у которых не может быть выработан протективный иммунный ответ. Таким образом, проведение пассивной иммунизации - введение препаратов моноклональных антител в качестве пред- или пост-экспозиционной профилактики или терапии позволяет защитить таких людей, обеспечить менее длительное и тяжелое течение болезни, в том числе предотвратить развитие пост-ковидных осложнений, и снизить вероятность дальнейшей передачи вируса.
Используемый в настоящей заявке термин «антитело» предназначен для обозначения молекулы иммуноглобулина, составленной из четырех полипептидных цепей, при этом две тяжелые (Н) цепи и две легкие (L) цепи связываются друг с другом дисульфидными связями. Каждая тяжелая цепь содержит вариабельную область тяжелой цепи (сокращенно называемую в настоящем документе VH) и константную область тяжелой цепи. Константная область тяжелой цепи состоит из трех доменов: CH1, СН2 и СН3. Каждая легкая цепь содержит вариабельную область легкой цепи (сокращенно называемую в настоящем документе VL) и константную область легкой цепи. Константная область легкой цепи состоит из одного домена: CL.
Области VH и VL могут далее подразделяться на гипервариабельные районы, которые называются определяющими комплементарность областями (CDR), перемежаемые областями с более высоким уровнем консервативности, называемыми каркасными областями (FR). Каждая область VH и VL образована тремя CDR и четырьмя FR, расположенными от амино-терминального конца к карбокси-терминальному концу в следующем порядке: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4.
Четыре каркасных участка формируют конформацию типа бета-складчатого слоя. Участки CDR расположены в близком соседстве друг с другом благодаря каркасным участкам и вносят вклад в образование антигенсвязывающего участка. Участки CDR и каркасные участки антител могут быть определены путем ссылки на нумерационную систему Кабата (Kabat numberings ystem, Kabat et al., 1987, "Sequences of Proteins of Immunological Interest", US Dept. Of Health and Human Services, US Government Printing Office) в сочетании с данными рентгеноструктурного анализа, как указано в заявке WO 91/09967. Участки CDR и каркасные участки антител могут также быть определены по номенклатуре Международной информационной системы по иммуногенетике (IMGT, International Immunogenetics Information System, www.imgt.org) (Lefranc, M.P. and Lefranc, G. Methods Mol Biol. 2552: 3-59 (2023)).
Если не указано иное, любая представленная в описании полипептидная цепь имеет аминокислотную последовательность, которая начинается на N-конце и заканчивается на С-конце. Если антигенсвязывающий центр содержит и VH-, и VL-области, то они могут быть расположены на одной и той же полипептидной молекуле или предпочтительно каждая область может располагаться на разных цепях, VH-область может быть частью тяжелой цепи иммуноглобулина или ее фрагмента, a VL-область - частью легкой цепи иммуноглобулина или ее фрагмента.
В настоящем изобретении термин «антитело, обладающее вируснейтрализующей активностью» означает молекулу, которая связывается с SARS-CoV-2, образует стабильный комплекс и препятствует прикреплению и/или проникновению вируса SARS-CoV-2 в клетку. Способность антитела к связыванию с антигеном может быть определена специалистом в данной области с использованием методов, включающих, но не ограничивающихся, методом иммуноферментного анализа (ИФА), равновесным диализом, с использованием плазмон-поверхностного резонанса и биослойной интерферометрии (BLI). Методы определения аффинности хорошо известны специалисту в данной области техники, подробно описаны Janeway и соавт. (Immunobiology: The Immune System in Health and Disease (Garland Publishing Company, 1996)).
Используемый в настоящем изобретении термин «антигенсвязывающий фрагмент» антитела обозначает фрагмент антитела, который сохраняет способность к специфическому связыванию с антигеном. К примерам таких фрагментов, включенных в термин «антигенсвязывающий фрагмент» антитела, относятся: (i) фрагмент Fab, моновалентный фрагмент, состоящий из доменов VL, VH, CL и СН1; (ii) фрагмент F(ab')2, бивалентный фрагмент, состоящий из двух фрагментов Fab, связанных дисульфидным мостиком в шарнирной области; (iii) фрагмент Fd, состоящий из доменов VH и CH1; (iv) фрагмент Fv, состоящий из доменов VL и VH отдельной области антитела; (v) фрагмент dAb (Ward, E.S. et al. Nature. 241, 544-546, (1989)), состоящий из домена VH; и (vi) отдельная определяющая комплементарность область (CDR). Более того, несмотря на то, что два домена во фрагменте Fv, VL и VH кодируются различными генами, их можно объединить, используя рекомбинантные технологии, посредством синтетического линкера, который позволяет построить из них единую белковую цепочку, в которой области VL и VH связываются с образованием моновалентных молекул (известных как одноцепочечные антитела или scFv; см., например, Bird, R.E. et al. Science. 24, 423-426 (1988); Huston, J.S. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 5879-5883 (1988)). Такие одноцепочечные антитела также включаются в сферу охвата термина «антигенсвязывающий фрагмент» антитела.
Специалисту в данной области известно, что за взаимодействие антитела с антигеном наибольший вклад вносит тяжелая цепь (Н). Однако известны случаи, когда в распознавании антигена участвует только одна цепь (или Н, или L), а вторую цепь можно заменить без потери антигенсвязывающих свойств антителом (Shiraiwa, Н. et al. Engineering a bispecific antibody with a common light chain: Identification and optimization of an anti-CD3 epsilon and anti-GPC3 bispecific antibody, ERY974. Methods. 154: 10-20 (2009); Senn, B.M. et al. Combinatorial immunoglobulin light chain variability creates sufficient В cell diversity to mount protective antibody responses against pathogen infections. Eur J Immunol. 33(4): 950-61 (2003)). Таким образом, в широком понимании в сферу охвата термина «антигенсвязывающий фрагмент» антитела можно включить любые белковые молекулы, содержащие хотя бы один из VH и VL доменов заданного антитела.
Известно, что из трех поверхностных белков SARS-CoV-2 лишь один, Spike, вызывает образование вируснейтрализующих антител. Также было показано, что подавляющее число полученных к настоящему моменту Spike-специфических моноклональных антител, обладающих способностью нейтрализовать вирус, направлены против RBD-домена Spike, ответственного за связывание с основным входным рецептором вируса, белком АСЕ2.
Идентификация SARS-CoV-2-специфических нейтрализующих моноклональных антител, в основном, осуществляется методом секвенирования генов иммуноглобулинов из единичных В-клеток людей, перенесших ковид-19 (Pinto, D. et al. Cross-neutralization of SARS-CoV-2 by a human monoclonal SARS-CoV antibody. Nature 583, 290-295 (2020)).
В настоящий момент уже созданы сотни различных SARS-CoV-2-специфических, в том числе и вируснейтрализующих антител, обладающих различными профилями потентности и широты нейтрализации. Однако разработанные моноклональные антитела могут быть неактивными в отношении появившихся новых вариантов SARS-CoV-2. Так, например, моноклональное антитело бамланивимаб не способно нейтрализовать дельта-вариант SARS-CoV-2 (Planas, D. et al. Reduced sensitivity of SARS-CoV-2 variant Delta to antibody neutralization. Nature 596, 276-280 (2021)). В отношении бета-варианта бамланивимаб и этесивимаб полностью неактивны, а активность касиривимаба значительно снижена (Wang, P. Et al. Antibody resistance of SARS-CoV-2 variants B. 1.351 and B.1.1.7. Nature 593, 130-135 (2021)).
Антитела REGN10987 и REGN10933 (имдевимаб и касиривимаб) на 2-3 порядка хуже нейтрализуют вирус штаммов Омикрон ВА.1 и ВА.2, а сотровимаб и антитело S2X259 - чувствительны к этим же штаммам, но в меньшей степени (Iketani, S. et al., Antibody evasion properties of SARS-CoV-2 Omicron sublineages. Nature 604, 553-556. (2022)).
Таким образом, идентификация и всесторонняя характеризация новых SARS-CoV-2-специфических антител является актуальной задачей и позволяет создавать композиции антител, против новых вирусных вариантов SARS-CoV-2 и потенциально против других, в том числе, неописанных коронавирусов.
Существует множество публикаций, описывающих получение и характеризацию RBD-специфических моноклональных антител человека, в том числе и обладающих вируснейтрализующей активностью.
Например, известны человеческие RBD-специфические нейтрализующие антитела бамланивимаб (LY-CoV555) (Jones, В. et al. The neutralizing antibody, LY-CoV555, protects against SARS-CoV-2 infection in nonhuman primates. Sci. Transl. Med. 13(593), 1-17 (2021) и этесивимаб (LY-C0V016/JS016/CB6) (Shi, R. et al. A human neutralizing antibody targets the receptor-binding site of SARS-CoV-2. Nature 584, 120-124 (2020)), последовательности которых известны. Однако существенным недостатком данных антител является их неспособность нейтрализовать ряд циркулирующих вирусных вариантов SARS-CoV-2 (https://covdb.stanford.edu/page/susceptibility-data/), что ограничивает их профилактическое и терапевтическое использование.
Известна панель моноклональных антител человека iB1-iB26, которая нейтрализует Wu-1 и Delta варианты SARS-CoV-2 (патент RU 2800649 С2, опубл. 25.07.2023). Недостатком данного решения является отсутствие информации о нейтрализации вариантов вируса более поздних вариантов.
Известна общедоступная база данных CoV-AbDab (http://opig.stats.ox.ac.uk/webapps/covabdab/), содержащая информацию о последовательностях и свойствах сотен RBD-специфических моноклональных антител различного происхождения (в том числе и человеческих), многие из которых обладают вируснейтрализующей активностью в отношении SARS-CoV-2.
Недостатками большинства таких антител является их неполная характеризация в плане устойчивости к циркулирующим вариантам SARS-CoV-2, поскольку такие варианты появились позже, чем были получены антитела, а также в плане эпитопной специфичности, широты нейтрализации, наличия или отсутствия ауто- и полиреактивности и т.д. Таким образом, создание новых детально охарактеризованных RBD-специфических моноклональных антител, как нейтрализующих так и ненейтрализующих, является крайне актуальной задачей, поскольку может обеспечить рациональный дизайн композиций антител, предотвращающих мутационное ускользание вируса, а также более точную диагностику, эффективную терапию и профилактику коронавирусной инфекции.
Наиболее близкими к заявляемой группе изобретений - прототипом, являются моноклональное антитело мыши IgM-изотипа и его антигенсвязывающий фрагмент, селективно взаимодействующие с RBD фрагментом в составе S белка вируса SARS-CoV-2, обладающие вируснейтрализующей активностью к SARS-CoV-2. Моноклональное антитело получено путем иммунизации мышей Balb/C человеческим рекомбинантным RBD фрагментом S-белка вируса SARS-CoV-2, экспрессированным в E. coli и полноразмерным S-белком вируса SARS-CoV-2 в составе клеток линии НЕК293, получения и селекции линий гибридом, продуцирующих моноклональные антитела к рекомбинантному RBD фрагменту в составе S белка вируса SARS-CoV-2, анализа аффинности и специфичности отобранного МАт, определения нуклеотидной последовательности его вариабельных доменов. Специфичность моноклонального антитела к RBD фрагменту в составе S белка вируса SARS-CoV-2 подтверждена методами иммуноферментного анализа, иммуноблоттинга, иммуноцитохимического и иммуногистохимического окрашивания. Установлена нуклеотидная последовательность вариабельных доменов моноклонального антитела (заявка WO 2021211775 А1, опубл. 21.10.2021).
Недостатками данного мышиного антитела и его антигенсвязывающего фрагмента для целей терапии и профилактики коронавирусной инфекции, вызванной SARS-CoV-2, являются его чужеродность для организма человека, вследствие чего введение такого антитела пациентам может быть иммуногенным и сопровождаться нежелательными побочными реакциями. Также не известен уровень (ауто)реактивности данного антитела по отношению к клеткам человека, поскольку оно было получено в иммунизированных мышах и в процессе созревания В-клетки проходило негативную селекцию против антигенов мыши, а не человека.
Также недостатком данного мышиного антитела является его принадлежность к IgM классу: (i) это снижает время его полужизни, а, значит, будет требовать дополнительных инъекций антитела пациенту; (ii) производство антител IgM изотипа является крайне трудоемким и сопровождается низким выходом, а сохранение всех заявленных свойств данного антитела при его возможной конверсии в IgG1-формат для преодоления данного ограничения является сомнительным, поскольку будет связано, как минимум, со снижением его авидности.
Также недостатком данного изобретения является то, что нейтрализующая активность мышиного антитела была показана только in vitro на клетках Vero Е6 и с использованием раннего штамма SARS-CoV-2 Wuhan-Hu-1. Таким образом, уровень и механизм нейтрализующей активности данного антитела в отношении SARS-CoV-2, а также детали эпитопной специфичности (следовательно, и узнавание им вирусных вариантов, среди новых циркулирующих изолятов) - неизвестны.
Задачей заявляемой группы изобретений является получение новых моноклональных антител человека IgG1 подкласса, способных к связыванию с RBD Spike-белка вируса SARS-CoV-2, а также антигенсвязывающих фрагментов таких антител, обладающих вируснейтрализующей активностью широкого спектра, а также получение ДНК фрагментов, кодирующих антитело и его антигенсвязывающий фрагмент.
Техническим результатом группы изобретений является создание нового моноклонального антитела человека iC2, отличающегося по аминокислотной последовательности вариабельных доменов легкой и тяжелой цепей от известных моноклональных антител к RBD фрагменту в составе Spike-белка вируса SARS-CoV-2 и его антигенсвязывающего фрагмента, способного к связыванию с RBD Spike-белка вируса SARS-CoV-2 и нейтрализации различных вариантов вируса штамма Омикрон (ВА.1-ВА.3).
Также техническим результатом является повышение аффинности созданного антитела, что позволяет снизить его дозировку при применении, что в значительной степени снижает его стоимость при производстве, а значит - повышает привлекательность для коммерциализации.
Также техническим результатом является способность созданного антитела нейтрализовать различные варианты вируса SARS-CoV-2 штамма Омикрон, что позволяет использовать его для профилактики и терапии заболеваний, вызываемых вирусом SARS-CoV-2 этого штамма.
Поставленная задача решается созданием моноклонального антитела человека iC2, селективно связывающего RBD фрагмент Spike-белка вируса SARS-CoV-2, состоящего из тяжелой (Н) и легкой (L) цепей, имеющих аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 1 и 2, а также созданием кодирующих их фрагментов ДНК, имеющих нуклеотидные последовательности SEQ ID NO: 5 и 6, соответственно.
В аминокислотных последовательностях цепей антитела iC2 можно выделить вариабельный домен тяжелой цепи (VH) и вариабельный домен легкой цепи (VL), имеющих аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 3 и 4, кодируемые нуклеотидными последовательностями SEQ ID NO: 7 и 8, соответственно.
Вариабельный домен тяжелой цепи (VH) содержит последовательности гипервариабельных районов: CDRH1, имеющего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 9 (GFTFEDYA), CDRH2, имеющего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 10 (ISWNGGII), и CDRH3, имеющего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 11 (TKVLYHYDSSGYYPGPFDY). Вариабельный домен легких цепей (VL) содержит последовательности гипервариабельных районов: CDRL1, имеющего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 12 (QSVSSY), CDRL2, имеющего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 13 (DAS) и CDRL3, имеющего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 14 (QQRSDWPPYT). Участки CDR в VH и VL были определены по номенклатуре IMGT (Lefranc, М.Р. and Lefranc, G. Methods Mol Biol. 2552: 3-59 (2023)).
Как хорошо известно, минорные изменения аминокислотной последовательности, такие как делеция, добавление или замена одной, небольшого количества или даже нескольких аминокислот, могут приводить к получению аллельной формы исходного белка, которая обладает практически идентичными свойствами. Также известен способ «перевивки» CDR-петель одного антитела в контекст каркасных последовательностей другого антитела, также с сохранением исходных свойств, что в частности позволяет производить гуманизацию антител, полученных в других млекопитающих. Таким образом, антитело изобретения включает те варианты, аминокислотная последовательность которых вне CDR петель отличается от приведенных в настоящей заявке последовательностей, но которые сохранили ту же антигенсвязывающую активность.
Антитело iC2 было получено способом, включающим следующие стадии: (i) выделение В-лимфоцитов периферической крови доноров, перенесших вакцинацию и коронавирусную инфекцию ковид-19 и сформировавших высокие нейтрализующие титры антител в сыворотке крови; (ii) окрашивание В-лимфоцитов флуоресцентно меченными препаратами RBD SARS-CoV-1; (iii) сортировка единичных окрашенных RBD+ В-лимфоцитов; (iv) проведение обратной транскрипции и ПЦР с наборами вырожденных праймеров, комплементарных лидерным и константным последовательностям генов иммуноглобулинов; (v) секвенирование полученных ПЦР продуктов с целью выяснения нуклеотидной и аминокислотной последовательностей, экспрессируемых такими В-клетками антител; (vi) клонирование нуклеотидных последовательностей таких антител в экспрессионные векторы для наработки в культуре клеток млекопитающих; (vii) очистка, анализ специфичности и активности рекомбинантных моноклональных антител человека. В последующем также предусмотрено определение аминокислотной последовательности вариабельных доменов таких антител, измерение аффинности и специфичности, нейтрализующих свойств in vitro и in vivo.
Использованный метод является общепринятым, однако был модифицирован таким образом, чтобы отбираемые моноклональные антитела человека были обогащены антителами, способными распознавать консервативные участки RBD Spike-белка SARS-CoV-2. Достигается это тем, что окрашивание В-лимфоцитов (пункт ii) проводят флуоресцентно меченными препаратами RBD SARS-CoV-1, а не SARS-CoV-2, как это делается обычно. Данная модификация метода серьезно влияет на специфичность получаемых антител. Суть замены меченного препарата заключается в том, что тем самым производится отбор антител, распознающих SARS-CoV-1, но из крови реконвалесцентов, которые были вакцинированы прививкой на основе RBD SARS-CoV-2 и переболели ковид-19, а значит обладают антителами, распознающими SARS-CoV-2. Таким образом, происходит отбор только тех антител, которые распознают эпитопы, присутствующие в Spike-белках обоих вирусов (SARS-CoV-1 и SARS-CoV-2). Учитывая, что данные белки идентичны только на 76% по аминокислотной последовательности, отбираемые антитела с высокой долей вероятности будут распознавать эпитопы, которые являются консервативными, то есть не будут меняться в ходе дальнейшего мутагенеза SARS-CoV-2.
Также настоящим изобретением создан антигенсвязывающий фрагмент моноклонального антитела iC2, селективно связывающий RBD Spike-белка вируса SARS-CoV-2, обладающий вируснейтрализующей активностью, имеющий аминокислотные последовательности вариабельной области тяжелой цепи (VH) - SEQ ID NO: 3, и вариабельной области легкой цепи (VL) - SEQ ID NO: 4, кодируемые нуклеотидными последовательностями SEQ ID NO: 7 и 8, соответственно.
У белков, созданных в рамках заявляемого технического решения, CDR участки являются идентичными, то есть CDRH1 участок антитела iC2 совпадает с CDRH1 участком антигенсвязывающего фрагмента моноклонального антитела iC2, и т.д.
Антитело iC2 человека селективно связывается с RBD Spike-белка SARS-CoV-2, содержит приведенные выше последовательности вариабельных областей и может содержать консервативные участки обеих цепей, необходимые для функционирования указанного антитела. Консервативные участки тяжелых цепей иммуноглобулинов классов IgG, IgM, IgA, IgD или IgE человека и других млекопитающих могут быть использованы в качестве консервативных участков для тяжелых цепей согласно настоящему изобретению. Например, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, согласно изобретению, могут содержать консервативные участки тяжелых цепей, принадлежащие к изотипу IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4. Консервативные участки легкой цепи иммуноглобулинов изотипов каппа или лямбда человека и других млекопитающих могут быть использованы в качестве консервативных участков для легких цепей антител согласно настоящему изобретению.
Антитело настоящего изобретения является человеческим антителом. В частном случае антитело может быть гуманизованным антителом, мышиным антителом, химерным антителом или другим генно-инженерным антителом.
В ходе решения поставленной задачи были установлены последовательности нуклеиновых кислот, кодирующие тяжелую (Н) цепь антитела iC2 (нуклеотидная последовательность SEQ ID NO: 5), легкую (L) цепь антитела iC2 (нуклеотидная последовательность SEQ ID NO: 6), вариабельный VH домен антитела iC2 (нуклеотидная последовательность SEQ ID NO: 7) и вариабельный VL домен антитела iC2 (нуклеотидная последовательность SEQ ID NO: 8).
Специалистам в данной области техники известно, что ввиду вырожденности генетического кода могут быть различия в последовательности ДНК кодирующей одну и ту же аминокислотную последовательность (Льюин Б. Гены. Москва: Мир, 1987). Поэтому последовательности нуклеиновых кислот, согласно настоящему изобретению, могут отличаться, при условии, что они кодируют участки цепей антитела iC2, содержащего последовательность аминокислот, не менее чем на 90% гомологичную SEQ ID NO: 3, и последовательность аминокислот, не менее чем на 90% гомологичную SEQ ID NO: 4.
Вышеназванные аминокислотные последовательности антитела iC2 (SEQ ID NO: 1-4), кодируемые нуклеотидными последовательностями (SEQ ID NO: 5-8), а также аминокислотные последовательности антигенсвязывающего фрагмента (SEQ ID NO: 3-4), кодируемые нуклеотидными последовательностями (SEQ ID NO: 7-8) представлены в перечне последовательностей.
Для целей терапии RBD-специфические моноклональные антитела могут быть использованы при введении человеку или другому млекопитающему в короткий срок после появления первых симптомов заболевания, вызванного SARS-CoV-2. Пути введения антител могут включать внутривенную и внутримышечную инъекцию, доставку аэрозолем в дыхательные пути или подкожное введение. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент изобретения могут быть введены системно, назально или путем прямой доставки кодирующих его нуклеиновых кислот в организм млекопитающих. Помимо терапевтического применения антитела могут быть введены заранее в качестве меры профилактики. В таком случае целесообразно использование антител для лиц, имеющих высокий риск заражения вирусом SARS-CoV-2, тяжелого течения заболевания и не подлежащих вакцинации по медицинским или иным причинам. При профилактическом использовании необходимо учитывать период полужизни антител в кровотоке, который в среднем для антител изотипа IgG1 составляет 21 день, но может быть значительно увеличен за счет модификации последовательности аминокислотных остатков в Fc-части.
Краткое описание чертежей и таблиц, иллюстрирующих изобретение
На Фиг. 1 показана стратегия гейтирования и результаты FACS-окрашивания В-лимфоцитов донора-реконвалесцента.
На Фиг. 2 представлены аминокислотные последовательности вариабельных доменов тяжелой VH (А) и легкой VL (В) цепей моноклонального антитела человека iC2. CDR-районы отмечены жирным шрифтом.
На Фиг. 3 показаны результаты разделения очищенного рекомбинантного антитела iC2 в SDS-полиакриламидном геле, окрашенном Кумасси, где М - маркер молекулярного веса, L - легкая цепь антитела, Н - тяжелая цепь антитела.
На Фиг. 4 приведена серия сенсограмм, полученная при инжекции разных концентраций аналита методом биослойной интерферометрии (BLI). Полученные данные позволяют количественно рассчитать аффиность взаимодействия мноклонального антитела iC2 с рекомбинантным RBD SARS-CoV-2. Концентрация аналита (антитела iC2) указана справа от каждой из сенсограмм.
Последующие примеры приведены исключительно для целей объяснения и не ограничивают каким-либо образом объем настоящего изобретения.
Пример 1. Выделение В-лимфоцитов человека, специфических к RBD Spike-белка вируса SARS-CoV-1.
У доноров был произведены забор периферической венозной крови и выделение живых CD19+IgG+В-лимфоцитов (окрашивание DAPI, конъюгатами anti-human CD19-PE (ООО «Сорбент»), anti-human IgG-FITC (ООО «Сорбент»), 5 мкл/106 мононуклеарных клеток крови). При отборе доноров выбирали только тех, кто был вакцинирован и ревакцинирован (вакциной на основе Wu-1 штамма), а также переболел ковид-19 хотя бы один раз после начала циркуляции штаммов Дельта или Омикрон. В-лимфоциты были дополнительно окрашены биотинилированным рекомбинантным RBD SARS-CoV-1 (2 мкг/мл) с последующей детекцией при помощи конъюгата АРС-стрептавидин (Thermo Fisher Scientific). Поверхностный фенотип целевой популяции В-лимфоцитов для сортировки единичных клеток в индивидуальные ПЦР-пробирки, таким образом, был RBD+CD19+IgG+DAPI- (Фиг. 1). Окрашенные аналогичным образом В-лимфоциты здоровых доноров были использованы в качестве негативного контроля.
Пример 2. Получение моноклонального антитела человека против RBD Spike-белка вируса SARS-CoV-1.
Процедуры синтеза кДНК с единичных В-лимфоцитов и ПЦР с обратной транскрипцией проводили, как описано в работе Guselnikov и соавт. (Guselnikov, S.V. et al. A simple way to increase recovery of the expressed VH and VL genes in single-sorted human В cells. BioTechniques 67, 184-187 (2019)), за исключением того, что для амплификации последовательностей, кодирующих γ - и λ - цепи антител, был использован протокол для μ-цепей. В частности, для амплификации последовательностей генов VHγ, Vκ и Vλ был использован набор вырожденных праймеров из работы Tiller и соавт. (Tiller, Т. et al. Efficient generation of monoclonal antibodies from single human В cells by single cell RT-PCR and expression vector cloning. J. Immunol. Methods 329, 112-124 (2008)). Парные образцы ПЦР-ампликонов (VHγ+Vκ или Vλ) секвенировали по Сэнгеру и клонировали в векторы для эукариотической экспрессии, кодирующие константные районы y1, к или Х-цепей иммуноглобулинов человека.
В результате была расшифрована пара нуклеотидных последовательностей VH (SEQ ID NO: 7) и VL (SEQ ID NO: 8) генов из одиночного В-лимфоцита. С учетом генетического кода были определены аминокислотные последовательности VH (SEQ ID NO: 3) и VL (SEQ ID NO: 4) участков моноклонального антитела iC2, специфичного к RBD Spike-белка SARS-CoV-2. Анализ последовательности VL, а также ассоциированного с ним CL, показал принадлежность легкой цепи iC2 антитела к каппа типу (κ). Участки CDRs VH (CDRH1 - SEQ ID NO: 9; CDRH2 - SEQ ID NO: 10; CDRH3 - SEQ ID NO: 11) и VL (CDRL1 - SEQ ID NO: 12; CDRL2 - SEQ ID NO: 13; CDRL3 - SEQ ID NO: 14) были определены по номенклатуре IMGT (Lefranc M.P., Lefranc G. MethodsMolBiol. 2552: 3-59 (2023)) (Фиг. 2).
Проведенный биоинформатический анализ последовательности iC2 антитела против известных последовательностей антител к SARS-CoV-2 не выявил антител, на 100% совпадающих по последовательностям легкой и тяжелой цепи с антителом изобретения.
В дальнейшем нуклеотидная последовательность VH была клонирована в вектор для эукариотической экспрессии в одной рамке с последовательностью, кодирующей константную область тяжелой цепи иммуноглобулина человека (Fc(IgG1)), в результате чего была получена нуклеотидная последовательность (SEQ ID NO: 5), кодирующая аминокислотную последовательность (SEQ ID NO: 1). Аналогичным образом, VL последовательность была клонирована в одной рамке с константной областью лямбда легкой цепи иммуноглобулина человека (Сκ), в результате чего была получена нуклеотидная последовательность (SEQ ID NO: 6), кодирующая аминокислотную последовательность (SEQ ID NO: 2).
Смесь плазмидных ДНК экспрессионных конструкций, кодирующих легкую или тяжелую цепь антитела iC2, была доставлена в клетки линии HEK293T, используя метод кальций-фосфатной трансфекции (Chenuet, S. et al. Calcium phosphate transfection generates mammalian recombinant cell lines with higher specific productivity than polyfection. Biotechnol. Bioeng. 101, 937-945 (2008)). Как правило, за 12 часов до проведения трансфекции 107 клеток рассаживали в культуральные флаконы площадью 150 см2 в среде IMDM (Gibco, Thermo Fisher Scientific) с добавлением 10% FBS (Gibco, Thermo Fisher Scientific) и смеси пенициллина/стрептомицина (Gibco, Thermo Fisher Scientific). Плазмидные ДНК смешивали в молярном соотношении 1:1, к полученной смеси добавляли 2 М СаС12 до финальной концентрации 25 мМ и доводили суммарный объем смеси стерильной водой до 3 мл. Затем смесь медленно добавляли к 3 мл раствора 2×HBS (50 мМ HEPES, 1,5 мМ Na2HPO4, 280 мМ NaCl, 10 мМ KCl, 12 мМ сахароза, рН=7.11) при постоянном интенсивном перемешивании. Полученный раствор добавляли по каплям к клеткам. Спустя 8 часов, культуральную среду заменяли на бессывороточную среду ЕХ-CELL® 293 Serum-Free Medium (Sigma). Трансфицированные клетки росли в течение 6 дней в CO2-инкубаторе при 37°С, 5% СО2. Супернатантны, очищенные от клеточного дебриса при помощи центрифугирования (4000×g, 10 мин), фильтровали через 0.22 мкм PES-фильтр (ТРР). Антитела очищали на колонке с Protein А агарозой (McLab, USA, #РРА-503) в соответствии с инструкциями производителя. Вкратце, после загрузки колонку промывали дважды PBS. Антитело элюировали раствором 0,1 М глицина, рН 2,7, 150 мМ NaCl в нейтрализующий буфер состава 1 М Tris, рН 8,0, в соотношении 1:10. Затем проводили диализ в течение ночи в PBS и концентрировали с использованием колонок Ultra-15 Ultracel-100K (Amicon) до финальной концентрации 2 мг/мл. Чистоту и выход препарата антитела контролировали посредством разделения в 15% SDS-полиакриламидном геле (Фиг. 3).
Пример 3. Определение аффинности связывания моноклонального антитела iC2 человека и разных вариантов рекомбинантого RBD SARS-CoV-2.
Для измерения кинетики взаимодействия антитела iC2 с RBD вариантом дикого типа (Wu-1) была использована биослойная интерферометрия на приборе Octet (ForteBio). С этой целью была вначале проведена иммобилизация антитела iC2 на поверхности биосенсора АНС (45 мкг/мл). На референсном сенсоре в качестве нерелевантного антитела было использовано рекомбинантное моноклональное антитело человека glVRC01 (Georgiev, I.S. et al. Antibodies VRC01 and 10E8 neutralize HIV-1 with high breadth and potency even with Ig-framework regions substantiaily reverted to germline. J Immunol. 192(3), 1100-1106 (2014)). Характеризация связывания была проведена в диапазоне девяти концентраций RBD (0.5625-144 нМ) (Фиг. 4). Для обработки данных были использованы параметры полного глобального фиттинга, бивалентная модель, R^2>0,9, Х^2<3 и последовательный переход между режимами: Baseline 60 с, Loading 120 с, Association 300 с, Dissociation 1800 с, Regeneration 3 раза по 5 с. В Табл. 1 представлены результаты измерения аффинности связывания рекомбинантного RBD с антителом iC2 методом биослойной интерферометрии, где KD - равновесная константа диссоциации, ka - константа скорости ассоциации, a kdis - константа скорости диссоциации.
Из таблицы 1 видно, что KD имеет высокое значение, что позволяет использовать iC2 для детекции вируса, например, в образцах слюны человека.
Пример 4. Определение вируснейтрализующей активности моноклонального антитела iC2 человека in vitro.
Для оценки уровня вируснейтрализующей активности моноклонального антитела iC2 использовали лентивирусные частицы, псевдотипированные разными вариантами S-белка SARS-CoV-2. Детекцию уровня заражения клеток HEK293T проводили с использованием люминометрического теста (Табл. 2).
Для получения лентивирусных частиц, псевдотипированных Spike-белком SARS-CoV-2, проводили кальций-фосфатную трансфекцию клеток линии НЕК293Т смесью плазмид psPAX2, pLV-Luc и pCAGGS-SpikeΔ19 в молярном соотношении 4:6:3. Плазмида pCAGGS-SpikeΔ19 кодировала укороченный с С-конца на 19 аминокислотных остатков Spike-белок, соответствующий вариантам Spike SARS-CoV-2 (SΔ19 штамма Омикрон. Через восемь часов после трансфекции среду заменяли на Opti-Mem (Gibco, Thermo Fisher Scientific) с добавлением 2,5% FBS (Gibco, Thermo Fisher Scientific). Супернатанты собирали два дня спустя, центрифугировали при 4000 об/мин в течение 5 минут, после чего лентивирусные частицы концентрировали путем центрифугирования при 20000×g, 4°С в течение 90 минут. Для проведения нейтрализационного теста в качестве мишеней использовали клетки линии АСЕ2-HEK293T со стабильной поверхностной экспрессией белка АСЕ2, рассаженные с плотностью 30000 клеток/лунку в 96-луночном штативе в день проведения теста. Антитело iC2 серийно двукратно разводили в среде Opti-MEM с добавлением 2,5% FBS в диапазоне от 0,5 нг/мл до 1 мкг/мл и ко-инкубировали с 20000 лентивирусных частиц, псевдотипированных Spike-белком SARS-CoV-2 в течение 30 мин при 37°С в объеме 100 мкл. Полученную смесь антител и лентивирусных частиц добавляли к клеткам АСЕ2-HEK293T и возвращали в CO2-инкубатор. Спустя 48 часов после трансдукции измеряли уровень люминесценции клеточного лизата с использованием люминометра. Значение концентрации полумаксимального ингибирования IC50 определяли, используя нелинейную регрессию, как концентрацию антитела, обеспечивавшую нейтрализацию 50% псевдотипированных лентивирусных частиц.
В Табл. 2 продемонстрирована способность антитела iC2 нейтрализовать лентивирусы, псевдотипированные разными вариантами Spike-белка SARS-CoV-2 штамма Омикрон с помощью люминометрического теста.
Таким образом, было установлено, что моноклональное антитело iC2 является высокопотентным нейтрализатором различных вариантов (ВА.1-ВА.3) штамма Омикрон SARS-CoV-2 (IC50<100 нг/мл).
Высокая аффинность заявляемого антитела позволит снизить его дозировку при диагностическом, профилактическом и терапевтическом применении, а способность нейтрализовать различные варианты штамма Омикрон SARS-CoV-2 говорят о его широком спектре действия и наличии потенциала для нейтрализации новых вариантов SARS-CoV-2.
--->
Перечень последовательностей
<?xml version="1.0" encoding="UTF-8"?>
<!DOCTYPE ST26SequenceListing PUBLIC "-//WIPO//DTD Sequence Listing
1.3//EN" "ST26SequenceListing_V1_3.dtd">
<ST26SequenceListing dtdVersion="V1_3" fileName="Перечень
последовательностей iC1.xml" softwareName="WIPO Sequence"
softwareVersion="2.0.0" productionDate="2022-06-08">
<ApplicantFileReference>1</ApplicantFileReference>
<ApplicantName languageCode="ru">Федеральное государственное
бюджетное учреждение науки Институт молекулярной и клеточной биологии
Сибирского отделения Российской академии наук (ИМКБ СО
РАН)</ApplicantName>
<ApplicantNameLatin>Institute of Molecular and Cellular Biology,
Siberian Branch of Russian Academy of Sciences</ApplicantNameLatin>
<InventionTitle languageCode="ru">Моноклональное антитело iC2,
селективно связывающее рецептор-связывающий домен Spike-белка вируса
SARS-CoV-2 и его антигенсвязывающий фрагмент, обладающие
вируснейтрализующей активностью</InventionTitle>
<SequenceTotalQuantity>14</SequenceTotalQuantity>
<SequenceData sequenceIDNumber="1">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>456</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..456</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAAAGFTFEDYAMHWVRQAPGKGLEWVS
GISWNGGIIDYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTALYYCTKVLYHYDSSGYYPGPFDYWGQG
TLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLY
SLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDT
LMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYK
CKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENN
YKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK</INSDSeq_seq
uence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="2">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>215</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..215</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIY
DASNRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSDWPPYTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIF
PPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEK
HKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="3">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>126</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..126</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAAAGFTFEDYAMHWVRQAPGKGLEWVSGIS
WNGGIIDYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTALYYCTKVLYHYDSSGYYPGPFDYWGQGTLV
TVSS</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
</ST26SequenceListing>
<SequenceData sequenceIDNumber="4">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>108</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..108</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDAS
NRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSDWPPYTFGQGTKLEIK</INSDSeq_sequ
ence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
</ST26SequenceListing>
<SequenceData sequenceIDNumber="5">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>1371</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..1371</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>GAAGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGCAGGTCCC
TGAGACTCTCCTGTGCAGCCGCTGGATTCACCTTTGAAGATTATGCCATGCACTGGGTCCGGCAAGCTCC
AGGGAAGGGCCTGGAGTGGGTCTCAGGCATTAGTTGGAATGGTGGTATCATAGACTATGCGGACTCTGTG
AAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAACTCCCTCTATCTGCAAATGAACAGTCTGAGAG
CTGAGGACACGGCCTTGTATTACTGTACAAAAGTATTGTATCACTATGATAGTAGTGGTTATTACCCTGG
CCCCTTTGACTATTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCAGCGTCGACCAAGGGCCCATCGGTC
TTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACT
ACTTCCCCGAACCTGTGACGGTCTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGC
TGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACC
CAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAAT
CTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCT
CTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGAC
GTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGA
CAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGA
CTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACC
ATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGA
CCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGA
GAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTC
CTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGC
ATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGA</INSDSeq_s
equence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
</ST26SequenceListing>
<SequenceData sequenceIDNumber="6">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>648</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..648</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>GAAATTGTGTTGACACAGTCTCCAGCCACCCTGTCTTTGTCTCCAGGGGAAA
GAGCCACCCTCTCCTGCAGGGCCAGTCAGAGTGTTAGCAGCTACTTAGCCTGGTACCAACAGAAACCTGG
CCAGGCTCCCAGGCTCCTCATCTATGATGCATCCAACAGGGCCACTGGCATCCCAGACAGGTTCAGTGGC
AGTGGGTCTGGGACAGACTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTAGAGCCTGAAGATTTTGCAGTTTATTACT
GTCAGCAGCGTAGCGACTGGCCTCCGTACACTTTTGGCCAGGGGACCAAGCTGGAGATCAAACGTACGGT
GGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTG
TGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGG
GTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGAC
GCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCG
CCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTGA</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
</ST26SequenceListing>
<SequenceData sequenceIDNumber="7">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>378</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..378</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>GAAGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGCAGGTCCC
TGAGACTCTCCTGTGCAGCCGCTGGATTCACCTTTGAAGATTATGCCATGCACTGGGTCCGGCAAGCTCC
AGGGAAGGGCCTGGAGTGGGTCTCAGGCATTAGTTGGAATGGTGGTATCATAGACTATGCGGACTCTGTG
AAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAACTCCCTCTATCTGCAAATGAACAGTCTGAGAG
CTGAGGACACGGCCTTGTATTACTGTACAAAAGTATTGTATCACTATGATAGTAGTGGTTATTACCCTGG
CCCCTTTGACTATTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCA</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
</ST26SequenceListing>
<SequenceData sequenceIDNumber="8">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>324</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..324</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>GAAATTGTGTTGACACAGTCTCCAGCCACCCTGTCTTTGTCTCCAGGGGAAA
GAGCCACCCTCTCCTGCAGGGCCAGTCAGAGTGTTAGCAGCTACTTAGCCTGGTACCAACAGAAACCTGG
CCAGGCTCCCAGGCTCCTCATCTATGATGCATCCAACAGGGCCACTGGCATCCCAGACAGGTTCAGTGGC
AGTGGGTCTGGGACAGACTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTAGAGCCTGAAGATTTTGCAGTTTATTACT
GTCAGCAGCGTAGCGACTGGCCTCCGTACACTTTTGGCCAGGGGACCAAGCTGGAGATCAAA</INSDSe
q_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
</ST26SequenceListing>
<SequenceData sequenceIDNumber="9">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>8</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..8</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>GFTFEDYA</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="10">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>8</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..8</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>ISWNGGII</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
</ST26SequenceListing>
<SequenceData sequenceIDNumber="11">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>19</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..19</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
/INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>TKVLYHYDSSGYYPGPFDY</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="12">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>6</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..6</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>QSVSSY</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
</ST26SequenceListing>
<SequenceData sequenceIDNumber="13">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>3</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..3</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>DAS</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
</ST26SequenceListing>
<SequenceData sequenceIDNumber="14">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>10</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..10</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>QQRSDWPPYT</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
</ST26SequenceListing>
<---
Claims (13)
1. Моноклональное антитело iC2, селективно связывающее рецептор-связывающий домен Spike-белка вируса SARS-CoV-2, обладающее вируснейтрализующей активностью, состоящее из тяжелой (Н) цепи, имеющей последовательность аминокислот SEQ ID NO: 1, и легкой (L) цепи, имеющей последовательность аминокислот SEQ ID NO: 2, включающее вариабельную область тяжелой цепи (VH) указанного антитела, содержащую последовательность аминокислот SEQ ID NO: 3, и вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую последовательность аминокислот SEQ ID NO: 4, кодируемые нуклеотидными последовательностями SEQ ID NO: 5-8 соответственно.
2. Антигенсвязывающий фрагмент моноклонального антитела iC2, селективно связывающий рецептор-связывающий домен Spike-белка вируса SARS-CoV-2, обладающий вируснейтрализующей активностью, включающий вариабельную область тяжелой цепи (VH) указанного антитела, содержащую последовательность аминокислот SEQ ID NO: 3, и включающий вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую последовательность аминокислот SEQ ID NO: 4, кодируемые нуклеотидными последовательностями SEQ ID NO: 7 и 8 соответственно.
3. Моноклональное антитело iC2 или его антигенсвязывающий фрагмент по пп. 1, 2, имеющие определяющие комплементарность области (CDR) со следующими аминокислотными последовательностями:
(i) CDRH1 - SEQ ID NO: 9;
(ii) CDRH2 - SEQ ID NO: 10;
(iii) CDRH3 - SEQ ID NO: 11;
(iv) CDRL1 - SEQ ID NO: 12;
(v) CDRL2 - SEQ ID NO: 13;
(vi) CDRL3 -SEQ ID NO: 14.
4. Моноклональное антитело iC2 или его антигенсвязывающий фрагмент по пп. 1, 2, содержащее вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую последовательность аминокислот, не менее чем на 90% сходную с SEQ ID NO: 3, и вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую последовательность аминокислот, не менее чем на 90% сходную с SEQ ID NO: 4.
5. Моноклональное антитело iC2 или его антигенсвязывающий фрагмент по пп. 1, 2, где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержат консервативные участки тяжелых цепей, относящиеся к классу IgG, IgM, IgA, IgD или IgE.
6. Моноклональное антитело iC2 или его антигенсвязывающий фрагмент по пп. 1, 2, где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержат консервативные участки тяжелых цепей, принадлежащие к изотипу IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4.
7. Антигенсвязывающий фрагмент по п. 2, где антигенсвязывающий фрагмент представляет собой Fv, scFv, Fab, F(ab')2, Fab' или любой иной белок, содержащий VH и/или VL последовательности антитела iC2.
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2817697C1 true RU2817697C1 (ru) | 2024-04-18 |
Family
ID=
Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2744274C1 (ru) * | 2020-11-20 | 2021-03-04 | Федеральное государственное бюджетное учреждение науки институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук (ИБХ РАН) | Моноклональное антитело к RBD фрагменту в составе S белка вируса SARS-CoV-2 |
| WO2021045836A1 (en) * | 2020-04-02 | 2021-03-11 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Anti-sars-cov-2-spike glycoprotein antibodies and antigen-binding fragments |
| RU2765731C1 (ru) * | 2021-12-22 | 2022-02-02 | федеральное государственное бюджетное учреждение "Национальный исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф. Гамалеи" Министерства здравоохранения Российской Федерации | Гуманизированное моноклональное антитело, специфически связывающиеся с RBD S белка вируса SARS-CoV-2, средство и способ для терапии и экстренной профилактики заболеваний, вызываемых вирусом SARS-CoV-2 |
| WO2022065445A1 (ja) * | 2020-09-25 | 2022-03-31 | 学校法人慶應義塾 | ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２中和抗体又はその断片 |
| US11370828B2 (en) * | 2020-03-09 | 2022-06-28 | Abcellera Biologies Inc. | Anti-coronavirus antibodies and methods of use |
| RU2800649C2 (ru) * | 2021-12-29 | 2023-07-25 | Общество с ограниченной ответственностью "Имген+" | Моноклональные антитела против рецептор-связывающего домена spike-белка вируса sars-cov-2 и их антигенсвязывающие фрагменты, кодирующие их нуклеиновые кислоты, а также способы применения |
Patent Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US11370828B2 (en) * | 2020-03-09 | 2022-06-28 | Abcellera Biologies Inc. | Anti-coronavirus antibodies and methods of use |
| WO2021045836A1 (en) * | 2020-04-02 | 2021-03-11 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Anti-sars-cov-2-spike glycoprotein antibodies and antigen-binding fragments |
| WO2022065445A1 (ja) * | 2020-09-25 | 2022-03-31 | 学校法人慶應義塾 | ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２中和抗体又はその断片 |
| RU2744274C1 (ru) * | 2020-11-20 | 2021-03-04 | Федеральное государственное бюджетное учреждение науки институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук (ИБХ РАН) | Моноклональное антитело к RBD фрагменту в составе S белка вируса SARS-CoV-2 |
| RU2765731C1 (ru) * | 2021-12-22 | 2022-02-02 | федеральное государственное бюджетное учреждение "Национальный исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф. Гамалеи" Министерства здравоохранения Российской Федерации | Гуманизированное моноклональное антитело, специфически связывающиеся с RBD S белка вируса SARS-CoV-2, средство и способ для терапии и экстренной профилактики заболеваний, вызываемых вирусом SARS-CoV-2 |
| RU2800649C2 (ru) * | 2021-12-29 | 2023-07-25 | Общество с ограниченной ответственностью "Имген+" | Моноклональные антитела против рецептор-связывающего домена spike-белка вируса sars-cov-2 и их антигенсвязывающие фрагменты, кодирующие их нуклеиновые кислоты, а также способы применения |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Bordoloi D. et al. Identification of novel neutralizing monoclonal antibodies against SARS-CoV-2 spike glycoprotein //ACS Pharmacology & Translational Science, 2021, 4(4), p. 1349-1361. * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US11421031B2 (en) | Bispecific molecules that are immunoreactive with immune effector cells that express an activating receptor and an antigen expressed by a cell infected by a virus and uses thereof | |
| JP6908722B2 (ja) | 抗ｐｄ−１抗体及びその使用 | |
| US20050288491A1 (en) | Super-humanized antibodies against respiratory syncytial virus | |
| US20200347130A1 (en) | CD96 Antibody, Antigen-Binding Fragment and Pharmaceutical use Thereof | |
| JP2019528050A (ja) | 抗ジカ（ｚｉｋａ）ウイルス抗体およびその使用方法 | |
| CN113728003A (zh) | 重组多克隆蛋白及其使用方法 | |
| US11773155B2 (en) | Bispecific antibody against rabies virus, and application thereof | |
| CN116785427B (zh) | 呼吸道合胞病毒特异性结合分子的用途 | |
| CA3128104A1 (en) | Anti-pd-1 antibody, antigen-binding fragment thereof and pharmaceutical use thereof | |
| AU2016334290B2 (en) | Antibody to hepatitis B surface antigen and use thereof | |
| US20230272048A1 (en) | Hiv-1 antibodies | |
| RU2817697C1 (ru) | Моноклональное антитело iC2 и его антигенсвязывающий фрагмент, селективно связывающие рецептор-связывающий домен Spike-белка вируса SARS-CoV-2, обладающие вируснейтрализующей активностью | |
| EP4353744A1 (en) | Antibody against respiratory syncytial virus and use thereof | |
| JP2001510329A (ja) | ヒトモノクローナル抗体 | |
| RU2817696C1 (ru) | Моноклональное антитело iC1 и его антигенсвязывающий фрагмент, селективно связывающие рецептор-связывающий домен Spike-белка вируса SARS-CoV-2, обладающие вируснейтрализующей активностью | |
| WO2022127066A9 (zh) | 一种特异性中和辅助性T细胞TGF-β信号的双特异性抗体、其药物组合及其用途 | |
| JP2011504893A (ja) | ヒト・モノクローナル・ニコチン特異的抗体 | |
| WO2022122788A1 (en) | Multispecific antibodies against severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 | |
| WO2022026775A1 (en) | Compositions and methods for targeting coronavirus | |
| US11440951B2 (en) | Therapeutic antibodies to Marburg virus | |
| WO2024088342A1 (en) | Antibodies against cd24 and uses thereof | |
| JP7510209B2 (ja) | ヘルパーＴ細胞ＴＧＦ－βシグナルを特異的に中和する二重特異性抗体、その薬物組成物およびその使用 | |
| US20210198346A1 (en) | Treatment of immune diseases by means of the antibody-mediated neutralization of specific intestinal bacteria | |
| CN114751987A (zh) | 一种中和冠状病毒的多特异性抗体 | |
| CN114751986A (zh) | 中和新冠病毒的多特异性抗体 |