WO2023121506A1 - Средство и способ терапии заболеваний, вызываемых вирусом sars-cov-2 - Google Patents

Средство и способ терапии заболеваний, вызываемых вирусом sars-cov-2 Download PDF

Info

Publication number
WO2023121506A1
WO2023121506A1 PCT/RU2022/000135 RU2022000135W WO2023121506A1 WO 2023121506 A1 WO2023121506 A1 WO 2023121506A1 RU 2022000135 W RU2022000135 W RU 2022000135W WO 2023121506 A1 WO2023121506 A1 WO 2023121506A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
virus
cov
sars
antibody
amino acid
Prior art date
Application number
PCT/RU2022/000135
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Дмитрий Викторович ЩЕБЛЯКОВ
Ильяс Булатович Есмагамбетов
Ирина Алексеевна ФАВОРСКАЯ
Инна Вадимовна ДОЛЖИКОВА
Юрий Степанович ЛЕБЕДИН
Артем Алексеевич ДЕРКАЕВ
Екатерина Игоревна РЯБОВА
Владимир Владимирович ПРОКОФЬЕВ
Ирина Александровна АЛЕКСЕЕВА
Дарья Владимировна ВОРОНИНА
Илья Дмитриевич ЗОРКОВ
Анна Витальевна КОВЫРШИНА
Анна Алексеевна ИЛЮХИНА
Андрей Геннадьевич Ботиков
Андрей Павлович КАРПОВ
Надежда Леонидовна ЛУБЕНЕЦ
Ольга Вадимовна ЗУБКОВА
Александр Сергеевич Семихин
Борис Савельевич НАРОДИЦКИЙ
Денис Юрьевич ЛОГУНОВ
Александр Леонидович ГИНЦБУРГ
Original Assignee
федеральное государственное бюджетное учреждение "Национальный исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф. Гамалеи" Министерства здравоохранения Российской Федерации
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by федеральное государственное бюджетное учреждение "Национальный исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф. Гамалеи" Министерства здравоохранения Российской Федерации filed Critical федеральное государственное бюджетное учреждение "Национальный исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф. Гамалеи" Министерства здравоохранения Российской Федерации
Publication of WO2023121506A1 publication Critical patent/WO2023121506A1/ru

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies

Definitions

  • SUBSTANCE group of inventions relates to the field of biotechnology, immunology and virology and concerns a means and method for therapy and emergency prevention of diseases caused by various strains of severe acute respiratory syndrome virus S ARS-Co V -2.
  • the causative agent of the disease was a single-stranded RNA-containing virus SARS-CoV-2, belonging to the Coronaviridae family, to the Beta-CoV B line.
  • Coronavirus SARS-CoV-2 can be transmitted by airborne, airborne, contact, fecal-oral methods, as well as through contaminated objects and surfaces (fomites), through blood, from mother to child and from animals to humans (Mechanisms of transmission of the SARS-CoV virus -2 and their implications for prevention choices, Research Summary, 9 July 2020 WHO). In a few months, the virus spread around the world, and in January 2020, WHO declared the epidemic associated with SARS-CoV-2 an international health emergency, and in March 2020 described the spread of the disease as a pandemic.
  • COVID-19 The disease that SARS-CoV-2 causes has been given its own name, COVID-19. This is a potentially severe acute respiratory infection that can be mild or severe, and is accompanied by complications such as pneumonia, acute respiratory distress syndrome, acute respiratory failure, acute heart failure, acute renal failure, septic shock, cardiomyopathies. , etc. Currently, the number of cases of COVID-19 is more than 185 million people, and more than 4 million people have died, and these numbers continue grow. It is clear that there is an urgent need worldwide for the development of safe and effective means of prevention and treatment.
  • REGEN-COV consists of two monoclonal antibodies, casirivimab (REGN10933) and imdevimab (REGN 10987), that bind to non-overlapping epitopes of the S protein of SARS-CoV-2.
  • the results of clinical studies of this drug showed that it is able to reduce the viral load, with a large effect in patients in whom the immune response has not yet been initiated or who initially had a high viral load (Weinreich DM, Sivapalasingam S, NortonT, AliS, GaoH, BhoreR , MusserBJ, SooY, RofailD, ImJ, PerryC, PanC, HosainR, MahmoodA, DavisJD, TumerKC, HooperAT, HamiltonJD, BaumA, KyratsousCA, KimY, CookA, KampmanW, KohliA, SachdevaY, GraberX, KowalB, DiCioccioT, StahlN, LipsichL, BraunsteinN,
  • bamlanivimab Another monoclonal antibody drug, bamlanivimab (LY-CoV555, developer: Eli Lilly), has received emergency FDA clearance for the treatment of mild to moderate COVID-19 in hospitalized adults and children. However, the results of clinical studies are mixed. Among hospitalized patients with COVID-19, co-administration of bamlanivimab with remdesivir was not effective.
  • bamlanivimab and etsevimab.
  • bamlanivimab and etsevimab.
  • etsevimab The best effect was observed with combination therapy with two monoclonal antibodies: bamlanivimab and etsevimab.
  • GottliebRL NirulaA, ChenP, BosciaJ, HellerB, MorrisJ, HuhnG, CardonaJ, MocherlaB, StosorV, Shawal, KumarP, AdamsAC, VanNaardenJ, CusterKL, DuranteM, OakleyG, SchadeAE, Holzer TR, EbertPJ, HiggsRE, KallewaardNL, SaboJ, PatelDR, KlekotkaP, ShenL, SkovronskyDM Effect of Bamlanivimab as Monotherapy or in Combination With Etesevimab on Viral Load in Patients With Mild to Moderate COVID-19: A Randomized Clinical Trial.
  • nanoantibodies single-domain antibodies
  • Single domain antibodies Due to their relatively small size, single domain antibodies have favorable biophysical properties and are cheaper to produce than standard monoclonal antibodies. They can be produced using prokaryotic or eukaryotic expression systems. Their small size, as well as long complementarity-determining regions of the heavy chain, allow them to target concave epitopes.
  • nanoantibodies can be sprayed and delivered directly into the lungs of a Covid-19 patient using an inhaler, which is a better alternative to classical antibodies administered intravenously (Ram Sasisekharan. Preparing for the Future — Nanobodies for Covid-19? April 22, 2021 N Engl J Med 2021;384:1568-1571 DOI: 10.1056/NEJMcibr2101205)
  • a solution is known (CN112500480A, pub. 03/16/2021), in which variants of a single-domain antibody against the SARS-CoV-2 virus, the corresponding expression vector, as well as a cell line capable of expressing the above variants of a single-domain antibody, and a method for obtaining variants of this antibody are developed.
  • a solution is known (CN111825762A, pub. 12/27/2020), in which several variants of nanoantibodies to the RBD S domain of the SARS-COV-2 virus protein were developed, as well as a method for using nanoantibody variants for the preparation of drugs for inhibiting the SARS-COV-2 viral infection and preparation of reagents or kits for testing the SARS-COV-2 virus.
  • the patent (CN112094342 A, published 12/18/2020) presents a bi-epitope specific antibody derived from alpaca, or an antigen-binding fragment thereof, that binds to the RBD domain of SARS-CoV-2 with high affinity, which can be used for prevention, treatment and / or diagnosis of SARS-CoV-2 infection.
  • a solution is known (CN112062839A, pub. 12/11/2020), which describes the creation of a nanoantibody to the SARS-CoV-2 S protein, as well as a method for using it to prepare a reagent for the treatment and / or diagnosis of an infection caused by the SARS-CoV-2 coronavirus.
  • CN112062840 A published on 12/11/2020
  • CN112062840 A providing for the development of a nanoantibody to the SARS-CoV-2 S protein, as well as a method for using it to prepare a reagent for the treatment and / or diagnosis of an infection caused by the SARS-CoV-2 coronavirus.
  • the patent (CN111303279A, pub. 06/19/2020) describes the creation of a humanized single-domain antibody against SARS-CoV-2 coronavirus, a nucleic acid molecule encoding a single-domain antibody, as well as the creation of an expression cassette, a recombinant vector, a recombinant bacterium or a transgenic cell line containing the above described nucleic acid molecule.
  • a method has been developed for using a single-domain antibody or engineered nucleic acid molecule or engineered expression cassette, recombinant vector, recombinant bacterium, or transgenic cell line in the manufacture of a product that can be used to prevent and/or treat diseases caused by infection with the novel coronavirus SARS-CoV- 2; as well as to suppress infection with the novel coronavirus SARS-CoV-2.
  • the product may: communicate with the new coronavirus SARS-CoV-2; detect binding of the novel coronavirus SARS-CoV-2; bind to the S protein of the novel coronavirus SARS-CoV-2; detect the S protein of the new SARS-CoV-2 coronavirus.
  • a pharmaceutical composition has also been developed containing the created single-domain antibody and a pharmaceutically acceptable excipient, diluent or carrier.
  • the technical objective of the claimed group of inventions is to expand the arsenal of agents for therapy and emergency prevention of diseases caused by the SARS-CoV-2 virus.
  • the technical result consists in creating an effective agent with virus-neutralizing activity and protective activity against the SARS-CoV-2 virus, including variants that cause concern (Alpha, Beta, Gamma, Delta).
  • This technical problem is solved by obtaining an agent for the treatment and emergency prevention of diseases caused by the SARS-CoV-2 virus, containing a recombinant antibody having a CDR1 represented by the amino acid sequence SEQ ID N0:1, CDR2 represented by the amino acid sequence SEQ ID N0:2 , CDR3 represented by the amino acid sequence SEQ ID N0:3, as well as the Fc fragment of human IgGl (component
  • a humanized monoclonal antibody having a light chain CDR1 represented by SEQ ID N0:4, a light chain CDR2 represented by SEQ ID N0:5, a light chain CDR3 represented by SEQ ID N0:6, a heavy chain CDR1, represented by SEQ ID N0:7, heavy chain CDR2 represented by SEQ ID N0:8, heavy chain CDR3 represented by SEQ ID N0:9 (component 2 - GamXRH19).
  • the recombinant antibody may have the amino acid sequence of SEQ ID N0:10.
  • a humanized monoclonal antibody may have a heavy chain sequence of SEQ ID N0:11 and a light chain sequence of SEQ ID N0:12.
  • the technical problem is solved by the fact that a method has been created for the treatment and emergency prevention of diseases caused by the SARS-CoV-2 virus, which consists in the systemic administration of an effective amount of the created agent.
  • FIG. 1 shows the electropherogram of the analysis of the recombinant GamP2C5 antibody under denaturing conditions.
  • FIG. 2 is an electrophoregram of the analysis of the recombinant GamP2C5 antibody under non-denaturing conditions.
  • FIG. Shown is a schematic representation of the amino acid sequence of OatP2C5
  • FIG. 4 shows the electrophoregram of the analysis of the humanized monoclonal antibody OatX H19.
  • FIG. 5 is a schematic representation of a humanized monoclonal antibody Oat CKH19.
  • FIG. 6 shows the results of the analysis of the specific activity of the humanized monoclonal antibody GamXRH19 in indirect ELISA.
  • FIG. 7 shows the HPLC chromatogram of the GamP2C5 recombinant antibody sample in buffer no. 2.
  • FIG. 8 shows the HPLC chromatogram of the GamXRH19 recombinant antibody sample in buffer #2.
  • FIG. Figure 9 shows survival results of animals treated with recombinant GamP2C5 antibody (component 1) and humanized XRH19 monoclonal antibody (component 2) and animals in the placebo group for 15 days after infection with SARS-CoV-2 variant Delta.
  • mice a mixture of components 1 and 2 (20 mg / ml) 6 hours after infection with the virus;
  • FIG. 1 The results of the survival of animals that were injected with the recombinant GamP2C5 antibody (component 1) and the humanized monoclonal antibody XRH19 (component 2) and animals from the placebo group for 15 days after infection with the SARS-CoV-2 virus of the hCoV-19/ Russian/Moscow_PMVL- strain are presented. 1/2020.
  • the abscissa axis is the time after infection of animals with the SARS-CoV-2 virus, days
  • mice receiving a mixture of components 1 and 2 (10 mg/ml) 1 hour after infection with the virus;
  • the technical task of the claimed group of inventions is to create a drug for the treatment and emergency prevention of diseases caused by the SARS-CoV-2 virus based on monoclonal and single-domain antibodies and their modifications.
  • Monoclonal and single-domain antibodies with high specificity for the RBDS protein of the SARS-CoV-2 virus and virus-neutralizing activity are considered as promising agents for the treatment and emergency prevention of SOUGO 19.
  • monoclonal and single-domain antibodies as agents for the treatment of COVID 19 have both advantages and disadvantages.
  • Single-domain antibodies are able to interact with antigen epitopes that are difficult to access due to long antigen-binding regions (CDRs), but they are quickly eliminated from the body due to their low molecular weight, and they also lack Fc-dependent functions.
  • CDRs long antigen-binding regions
  • these shortcomings can be effectively eliminated by attaching human O-Fc fragment 1 to single-domain antibodies and thus obtaining a recombinant antibody.
  • an agent based on a recombinant antibody (GamP2C5) and a humanized monoclonal antibody (GamXRH 19) that specifically binds to the RBD domain S of the SARS-CoV-2 virus protein has been developed. virus-neutralizing and protective activity against various strains of the SARS-CoV-2 virus.
  • the alpaca was immunized with the recombinant RBD of the SARS-CoV-2 virus obtained in the CHO cell line and purified by metal affinity and size exclusion chromatography. The effectiveness of immunization was confirmed by assessing the titer of RBD-specific antibodies in the animal's blood serum. Further, peripheral blood mononuclear cells were isolated from animals, from which RNA was obtained. Based on RNA, cDNA was synthesized. On the matrix obtained cDNA, nested PCR was set, which allows amplifying the sequences of single-domain antibodies. Thus, a library of amplicon sequences about the bottom of domain antibodies was obtained.
  • Antibody selection was performed by phage display using antigen panning (RBD).
  • RBD antigen panning
  • Those skilled in the art will recognize that other selection approaches such as panning on viral particles, panning in a biotinylated antigen solution, panning using competitive binding and elution are possible for the purposes of the present invention.
  • other selection methods such as ribosome display, yeast display, may be used to carry out the present invention.
  • a single-domain antibody was selected that specifically binds to the RBD domain of the S protein of the SARS-CoV-2 virus. In subsequent experiments, it was shown that this antibody has virus-neutralizing activity.
  • sequences of SARS-CoV-2 RBD-specific single-domain antibodies may contain amino acid substitutions that do not affect the secondary and tertiary structure of single-domain antibodies and do not affect their ability to bind and neutralize the RBD of the SARS-CoV-2 virus.
  • antigen-binding loops CDR domains
  • any immunoglobulin or analogue thereof containing the same amino acid sequences of the CDR domains can be used to implement the present invention.
  • CDR domain sequences may contain amino acid substitutions/deletions/insertions that, when paired with amino acid sequences, provide homology of at least 70% and do not qualitatively affect the ability to bind to the antigen.
  • all immunoglobulins or their analogues containing sequences of CDR domains, the homology of which is at least 70% with the proposed sequences, can be used to implement the claimed invention.
  • Recombinant antibody OatP2C5 which is a single-domain antibody modified with the Fc fragment of immunoglobulin O! human, specifically binding to the RBD domain S of the protein of the SARS-CoV-2 virus, having virus-neutralizing and protective activity, having the amino acid sequence SEQIDNO.IO.
  • This antibody was obtained by expressing the nucleotide sequence of the recombinant antibody in CHO-producing cells.
  • nucleotide sequences of the recombinant GamP2C5 antibody were genetically engineered based on the nucleotide sequence of the single domain antibody and the nucleotide sequence of the human immunoglobulin O 1 Fc fragment. It is known to those skilled in the art that, for purposes of the present invention, the nucleotide sequence encoding a recombinant antibody may differ based on the principle of degeneracy of the genetic code. Thus, all nucleotide sequences encoding the amino acid sequence of the recombinant antibody (SEQIDNO:10) can be used to implement the claimed invention.
  • a producer cell expressing the recombinant Oat P2C5 antibody (SEQIDNO:10) was obtained.
  • a producer cell based on the CHO cell line expressing the GamP2C5 recombinant antibody was obtained.
  • Those skilled in the art will recognize that other eukaryotic expression systems can be used as a producer for the purposes of the present invention.
  • mice were immunized with recombinant RBD of the SARS-CoV-2 virus obtained in the CHO cell line and purified by metal affinity and size exclusion chromatography. The effectiveness of immunization was confirmed by assessing the titer of antibodies specific to RBD in the blood serum of mice.
  • splenocytes were isolated from mice, which were then fused with the mouse myeloma line Sp2/0-Ag-14, thus obtaining hybridomas.
  • Hybridoma selection was performed on RPMI-1640 nutrient medium (Sigma, USA) supplemented with HAT Media Supplement (Hybri-Max®, Sigma, USA). The selection of clones producing antibodies specific to RBD was carried out by the method of solid-phase ELISA.
  • a hybridoma clone was selected that produces the mouse monoclonal antibody XR19, which is specific to RBD and has a pronounced virus-neutralizing and protective activity against the SARS-CoV-2 virus, including the Delta variant.
  • sections of the genome of the selected hybridoma clone encoding the antigen-binding regions (CDR domains) of the XR19 antibody were sequenced and used to create humanized monoclonal antibody GamXRH19.
  • the nucleotide sequences encoding the humanized monoclonal antibody GamXRH19 (SEQIDNO:11 heavy chain and SEQIDNO:12 light chain) were obtained.
  • sequences of monoclonal antibodies specific to SARS-CoV-2 RBD may contain amino acid substitutions that do not affect the secondary and tertiary structure of the monoclonal antibodies and do not affect their ability to bind and neutralize the RBD of the SARS-CoV-2 virus.
  • CDR domains antigen binding sites
  • any immunoglobulin or analogue thereof containing the same amino acid sequences of CDR domains can be used to implement the claimed invention.
  • sequences of CDR domains can contain substitutions/deletions/insertions of amino acids, which, when paired with amino acid sequences, provide homology of at least 70% and do not qualitatively affect the ability to bind to the antigen.
  • all immunoglobulins or their analogues containing sequences of CDR domains whose homology is at least 70% with the proposed sequences can be used to implement the claimed invention.
  • the humanized monoclonal antibody GamXRH19 (human IgGl isotype), which specifically binds to the RBD domain S of the SARS-CoV-2 virus protein and has virus-neutralizing and protective activity, was obtained by expressing the nucleotide sequence of the heavy and light chains in CHO-producing cells.
  • nucleotide sequences of the heavy and light chains of the humanized monoclonal antibody GamXRH19 were genetically engineered based on the nucleotide sequence of human immunoglobulin O1 and the nucleotide sequences of the antigen-binding regions of the XR19 antibody.
  • nucleotide sequence encoding a humanized monoclonal antibody may differ based on the principle of degeneracy of the genetic code.
  • all nucleotide sequences encoding the amino acid sequence of the humanized monoclonal antibody GamXRH19 can be used to practice the present invention.
  • a producer cell expressing the humanized monoclonal antibody GamXRH19 (SEQIDNO:11 CHO expressing the humanized monoclonal antibody GamXRH19.
  • SEQIDNO:11 CHO expressing the humanized monoclonal antibody GamXRH19.
  • Those skilled in the art will recognize that other eukaryotic expression systems can be used as a producer for the purposes of the present invention.
  • the authors of the claimed invention obtained antibody variants that specifically bind to the RBDS protein of the SARS-CoV-2 virus, have virus-neutralizing activity and have improved pharmacokinetics compared to single-domain antibodies.
  • the authors of the patent obtained an agent based on antibodies that specifically bind to the RBDS protein of the SARS-CoV-2 virus, intended for the treatment and emergency prevention of COVID-19 disease.
  • the authors of the claimed invention have developed a method for the treatment and emergency prevention of diseases caused by the SARS-CoV-2 virus, which consists in introducing into the body of mammals in an effective amount of any of the developed antibody variants.
  • Example 1 Obtaining an immunogen - receptor-binding domain (RBD) S protein of the SARS-CoV-2 virus.
  • RBD immunogen - receptor-binding domain
  • an immunogen was obtained - the receptor-binding domain (RBD) S protein of the SARS-CoV-2 virus.
  • RBD receptor-binding domain
  • the amino acid sequence of the receptor-binding domain (RBD) of the surface Spike protein of the SARS-CoV-2 virus was modified from the N-terminus with the alkaline phosphatase signal peptide SEAP (MLLLLLLLGLRLQLSLGI ) and with C-terminal sequence of glycine-serine linker and histidine tag (GSHHHHHHHHH).
  • a nucleotide sequence was obtained, which was synthesized by Evrogen CJSC. After that, the nucleotide sequence of the resulting polypeptide was cloned into a plasmid for transient expression in mammalian cells. Next, the CHO cell culture was tariffed with the obtained plasmid using the CHO Gro kit (Minis Bio, USA) in accordance with the manufacturer's protocol. The cells were then cultured in Erlenmeyer flasks for 10 days. After this period, the culture liquid was clarified by centrifugation at 5000g.
  • Alpaca (Lama pacos - a member of the Cameliedae family) were immunized with the received RBD (10 ⁇ g per immunization) 5 times at intervals of 10-14 days. 7 days after the last immunization, 50.0 ml of peripheral blood was taken from alpacas and mononuclear cells were isolated on a ficoll gradient of 1.077 (Paneko, Russia). Isolated mononuclear cells were used for total RNA isolation with Trizol reagent (Invitrogene, USA) according to the manufacturer's protocol. The isolated RNA was used as a template for cDNA synthesis with random primers and SuperScriptHI reversease (Invitrogene, USA).
  • Nested PCR was used on the matrix obtained from cDNA, allowing amplification of the sequences of single-domain antibodies.
  • high fidelity polymerase Q5 NEB, UK
  • specific primers containing restriction sites at the ends were used.
  • the amplicons were digested with restriction enzymes and cloned into a phagemid vector digested at the same sites.
  • E. coli cells TG1 strain were transformed with phagemid vectors obtained by cloning.
  • a suspension of bacterial clone-transformants of E. coli cells (TG1 strain) was used for the production of recombinant bacteriophages using the M13KO7 helper bacteriophage (NEB, UK) according to the protocol of the company manufacturer.
  • Recombinant bacteriophages were precipitated by polyethylene glycol (PEG/NaCl) precipitation.
  • PEG/NaCl polyethylene glycol
  • recombinant bacteriophages was carried out by panning on the antigen of the original bacteriophage library. For this, recombinant RBD (Example 1) was immobilized in the well of an immunological plate in 50.0 mm carbonate-bicarbonate buffer overnight. Unbound protein was removed and the well was blocked with 5% milk powder in phosphate buffer for 1 hour at room temperature. Then a suspension of 10 11 recombinant bacteriophages was added and incubated for 1 hour at room temperature. Unbound bacteriophages were washed with a colloidal 0.1% solution of Tween-20 detergent in phosphate buffer. The bound bacteriophages were eluted with a trypsin solution (0.1 mg/ml).
  • the eluted bacteriophages were used to transduce E. coli TG1 cells, which were then plated on agar plates at a dilution to allow the isolation of individual colonies. The resulting colonies were used to build up the bacterial mass and isolate plasmid DNA. Plasmids were sequenced to determine the nucleotide sequences encoding single domain antibodies. 8 individual sequences were determined.
  • IPTG isopropyl thiogalactopyranoside
  • the SARS-CoV-2 virus neutralization test was performed in the variant of a constant dose of the virus - dilution of a sample of single-domain antibodies.
  • Samples of single domain antibodies were prepared in DMEM culture medium with 2% inactivated fetal bovine serum, then mixed with 100 PFU of SARS-CoV-2 virus, incubated for 1 hour at 37°C, and added to Vero E6 cells.
  • Initial concentrations of single-domain antibody preparations were 0.5-1 mg/ml.
  • Final dilutions of single domain antibodies were 1/20-1/1280. Cells were incubated at 37°C in 5% CO2.
  • Interaction constants (KD) of single domain antibodies p2c5, p5f8, and p2gl were determined by detecting changes in surface plasmon resonance parameters on a Biacore3000 instrument (General Electric, Sweden). To do this, recombinant RBD was covalently immobilized on the surface of the dextran matrix of the CM5 chip (General Electric, Sweden), and then various concentrations of the obtained single-domain antibodies were passed over the chip surface. Data processing and computing constants were carried out automatically using the Bioevaluation program
  • the p2c5 clone was taken for further work to obtain the recombinant GamP2C5 antibody.
  • the recombinant antibody is a single domain antibody modified with a human immunoglobulin Fc fragment. This modification of single-domain antibodies will improve their pharmacokinetic properties by adding the human IgGl Fc fragment and its proper glycosylation in eukaryotic producer cells. In addition, modification with an Fc fragment will allow antibodies to activate the complement system and bind to Fc receptors on the surface of immunocompetent cells.
  • a recombinant antibody (SEQIDNO:10), which is a single-domain antibody modified with the Fc fragment of human immunoglobulin G1.
  • SEQIDNO:10 a recombinant antibody
  • the nucleotide sequences of recombinant antibodies were obtained, which were synthesized at ZAO Evrogen.
  • the resulting nucleotide sequences were cloned into a vector for expression in eukaryotic cells.
  • CHO cells were transfected with the obtained expression vectors using the CHOGro system (MirusBio, USA) in accordance with the manufacturer's protocol. The cells were cultured in Erlenmeyer flasks for 10 days.
  • the culture liquid was clarified by centrifugation at 5000g.
  • the antibody was purified by affinity chromatography on an AKTA start system (Cytiva, Sweden) using MAbSelect SuRe 1 ml columns (Cytiva, Sweden) according to the manufacturer's protocol. Additional purification and replacement of the buffer was carried out on an XK 26/100 column (Cytiva, Sweden) packed with a sorbent Superdex 200 pg (Cytiva, Sweden).
  • the purity of the obtained recombinant OatP2C5 antibody preparation was determined by vertical polyacrylamide gel electrophoresis under non-denaturing conditions and denaturing conditions (Fig. 2 and Fig. 1).
  • a schematic representation of the recombinant GamP2C5 antibody is shown in FIG. 3.
  • mice (10 females, 5-6 weeks old, weighing 15-20 g) were immunized with the preparation of the recombinant RBD of the SARS-CoV-2 virus obtained in example 1.
  • the immunization schedule included 4 subcutaneous injections of the antigen with an injection interval of 21 days.
  • the dose of the drug was 50 ⁇ g per injection.
  • blood was taken from the paraorbital sinus and the titer of specific antibodies was determined using enzyme-linked immunosorbent assay. For this, the plates were sensitized with antigen in 50 mM carbonate-bicarbonate buffer pH 9.6.
  • Mouse blood samples were diluted by 10-fold titration in ELISA buffer (0.1 M phosphate-buffered saline supplemented with 1% bovine serum albumin (Serva, Germany) and 0.1% Tween 20 (Serva, Germany) and incubated in the plate wells for 30 minutes at 37 ° C.
  • the wells were washed with three additions of 0.9% sodium chloride with the addition of 0.1% Tween 20 (washing buffer) and antibodies against mouse immunoglobulins labeled with horseradish peroxidase (Cat. No. AS302-HRP, Khema, Russia) were added. ) in working dilution for 30 minutes at 37° C.
  • chromogen-substrate mixture Cat. No.
  • Cloning of cultures of hybrid cells was carried out by the method of limiting dilutions at the calculated seed concentration of one cell per well.
  • the production activity of individual clones was determined, starting from the 10th day, twice with an interval of three days by enzyme immunoassay according to the scheme described above. After the isolation of positive clones, their cells were expanded in sufficient quantity, the samples were frozen in RPMI growth medium containing 20% fetal calf serum and 8% dimethyl sulfoxide (Serva, Germany) and stored in a container with liquid nitrogen.
  • the cultural and secretory properties of the resulting clones were studied during in vitro cultivation in 24-well plates (Flow Laboratories, UK) for ten passages. After cloning, culture fluid samples from monoclonal cultures were studied by competitive ELISA.
  • the recombinant ACE2 receptor protein (Vaxine, Australia) was adsorbed into the wells of the plate at a concentration of 0.5 ⁇ g/ml in 0.1 M phosphate buffer, pH 7.2 for 12-16 hours at a temperature of +4 C.
  • RNA isolation 5 ⁇ g was used for cDNA synthesis using the SuperScriptIVTMfirst-strandsynthesissystem kit (Invitrogen).
  • the heavy and light chain variable domain sequences were amplified by PCR using a panel of primers specifically annealing at the beginning and end of mouse variable domain sequences.
  • the obtained PCR products were sequenced according to Sanger on the Genetic Analyzer 3500 Applied Biosystems.
  • variable domains of the heavy and light chains of the XR19 antibody were obtained, presented in Table 3.
  • Table 4 Humanized nucleotide and amino acid sequences of the heavy and light chain variable domains of the GamXRH19 antibody. Further, using literature analysis and bioinformatics methods in the light and heavy chain sequences of the GamXRH19 antibody, the sequences of CDR1-CDR3 were identified.
  • the amino acid sequence design of the full length heavy and light chains of the humanized GamXRH19 antibody was developed.
  • the humanized heavy amino acid sequence is shown in SEQIDNO:11 and the humanized light amino acid sequence is shown in SEQIDNO:12.
  • the nucleotide sequences of the GamXRH19 antibody were obtained, which were synthesized by ZAO Evrogen.
  • the resulting nucleotide sequences were cloned into a vector for expression in eukaryotic cells.
  • CHO cells were transfected with the obtained expression vectors using the CHOGro system (MirusBio, USA) in accordance with the manufacturer's protocol. The cells were cultured in Erlenmeyer flasks for 10 days.
  • the culture liquid was clarified by centrifugation at 5000g.
  • the antibody was purified by affinity chromatography on an AKTA start system (Cytiva, Sweden) using MAbSelect SuRe 1 ml columns (Cytiva, Sweden) according to the manufacturer's protocol. Additional purification and buffer replacement were carried out on an XK 26/100 column (Cytiva, Sweden) packed with a Superdex 200 pg sorbent (Cytiva, Sweden).
  • the purity of the resulting humanized XRH19 monoclonal antibody preparation was determined by vertical polyacrylamide gel electrophoresis under non-denaturing conditions and denaturing conditions (FIG. 4).
  • FIG. 5 A schematic representation of the humanized GamXRH19 monoclonal antibody is shown in FIG. 5.
  • a humanized monoclonal antibody GamXRH19 was obtained, having the amino acid sequence of heavy and light chains SEQIDNO:11 and SEQIDNO:12, respectively.
  • the light chain CDR1, CDR2, CDR3 sequences of the GamXRH19 antibody having the amino acid sequences of SEQIDNO:4, SEQIDNO:5 and SEQIDNO:6, respectively, and the heavy chain CDR1, CDR2, CDR3 sequences of the GamXRH19 antibody having the amino acid sequences of SEQIDNO:7, SEQIDNO:8 and SEQIDNO:9 respectively.
  • Example 4 Study of the specific activity of the humanized monoclonal antibody GamXRH19 in indirect ELISA.
  • an indirect ELISA method For this, the recombinant RBDS of the SARS-CoV-2 virus protein was immobilized in the well of an immunological plate in 50.0 mM carbonate-bicarbonate buffer overnight. Unbound protein was removed and the well was blocked with 5% milk powder in phosphate buffer for 1 hour at room temperature. The wells were then washed with 0.1% Tween-20 detergent solution in phosphate buffer and a solution of 5% milk powder in phosphate buffer containing various dilutions of the humanized GamXRH19 monoclonal antibody was added.
  • the interaction constants (KD) of the humanized monoclonal antibody GamXRH19 were determined by detecting changes in surface plasmon resonance parameters on a Biacore3000 instrument (General Electric, Sweden). For this, the recombinant RBDS protein of the SARS-CoV-2 virus was covalently immobilized on the surface of the dextran matrix of the CM5 chip (General Electric, Sweden), and then various concentrations of the resulting XRH19 antibody were passed over the chip surface. Data processing and calculation of constants were carried out automatically using the Bioevaluation program (General Electric, Sweden). As a result, the equilibrium dissociation constant of GamXRH19 was 4*10' 9 M, which demonstrates the high affinity of the antibody for recombinant RBD.
  • the purpose of this experiment was to evaluate the ability of the developed humanized monoclonal antibody OatX1 19 to neutralize the SARS-CoV-2 virus of various strains.
  • XRH19B antibody samples were prepared in a DMEM culture medium with 2% inactivated fetal bovine serum. Then, the obtained antibody samples were mixed with 100 pfu of the SARS-CoV-2 virus of various strains, incubated for 1 hour at 37°C, and added to Vero E6 cells. Cells were incubated at 37°C in 5% CO2. After 96 hours, the development of the cytopathic effect of the virus on the cell culture was recorded visually by assessing the violation of the cell monolayer. The virus-neutralizing antibody titer was taken as the highest dilution at which the cytopathic effect is suppressed in 2 out of 3 wells. As a result, the following working virus-neutralizing concentrations were determined, presented in table 5.
  • Virus-neutralizing titers of the humanized monoclonal antibody GamXRH19 against BHpycaSARS-CoV-2 of various strains demonstrate the pronounced virus-neutralizing activity of the humanized monoclonal antibody GamXRH19 against BHpycaSARS-CoV-2, including the variant of concern Delta.
  • Example 7 Determination of the virus-neutralizing activity of the recombinant GamP2C5 antibody against various strains of the SARS-CoV-2 virus.
  • the purpose of this experiment was to evaluate the ability of the developed recombinant OatP2C5 antibody to neutralize the SARS-CoV-2 virus of various strains.
  • samples of the recombinant GamP2C5B antibody were prepared in the DMEM culture medium with 2% inactivated fetal bovine serum.
  • the obtained antibody samples were mixed with 100 PFU of the SARS-CoV-2 virus of various strains, incubated for 1 hour at 37°C, and added to Vero E6 cells. Cells were incubated at 37°C in 5% CO2.
  • the virus-neutralizing antibody titer was taken as the highest dilution at which the cytopathic effect is suppressed in 2 out of 3 wells. As a result, the following working virus-neutralizing concentrations were determined, presented in table 6.
  • Table. b Virus-neutralizing titers of the recombinant GamP2C5 antibody against BnpycaSARS-CoV-2 of various strains.
  • this example demonstrates a pronounced virus-neutralizing activity of the recombinant GamP2C5 antibody against the SARS-CoV-2 virus, including variants of concern Alpha, Beta and Gamma.
  • Example 8 Preparation of the formulation of component 1 (recombinant GamP2C5 antibody).
  • a drug for the treatment and emergency prevention of COVID-19 disease based on the recombinant GamP2C5 antibody (component 1) was obtained by selecting a formulating buffer.
  • various physiological buffer systems were used, presented in Table 7.
  • the recombinant OatP2C5 antibody was transferred into each buffer system using size exclusion chromatography on a Superdex 200 pg sorbent and compressed to a concentration of 20 mg/ml. Next, the samples were incubated at 37°C for a week and then analyzed for their stability and purity using HPLC. The results of the analysis are shown in Table 8. Examples of HPLC analysis chromatograms are shown in FIG. 7.
  • an agent based on the recombinant GamP2C5 antibody (component 1) was obtained and the optimal buffer composition was selected.
  • Example 9 Formulation of component 2 (humanized monoclonal antibody GamXRH19).
  • a drug for the treatment and emergency prevention of COVID-19 disease based on the humanized monoclonal antibody GamXRH19 (component 2) was obtained by selecting a formulating buffer.
  • various physiological buffer systems were used, presented in Table 9.
  • the humanized monoclonal antibody GamXRH19 was transferred to each buffer system using size exclusion chromatography on a Superdex 200 pg sorbent and compressed to a concentration of 20 mg/ml. Next, the samples were incubated at 37°C for a week and then analyzed for their stability and purity using HPLC. The results of the analysis are presented in table 10. Examples of HPLC analysis chromatograms are shown in Fig.8.
  • Table. 10 Percentage of target and impurity peaks of the humanized monoclonal antibody GamXRH19 (component 2) in various buffer solutions.
  • an agent based on the humanized monoclonal antibody GamXRH19 (component 2) was obtained and the optimal buffer composition was selected.
  • Example 10 Determination of the virus-neutralizing activity of an agent based on the recombinant GamP2C5 antibody (component 1) and the humanized monoclonal antibody GamXRH19 (component 2).
  • this example demonstrates a pronounced virus-neutralizing activity of an agent based on the recombinant GamP2C5 antibody (component 1) and the humanized monoclonal antibody GamXRH19 (component 2) against various SARS-CoV-2 strains, including variants, AlphaVl, BetaV2, GammaV3, Delta.
  • component 1 was shown to have virus neutralizing activity against the AlphaVl, BetaV2 and GammaV3 variants of concern, and component 2 against the Delta variants of concern.
  • Example I A method for the treatment and emergency prevention of COVID-19 disease using an agent based on the recombinant GamP2C5 antibody (component 1) and the humanized monoclonal antibody GamXRH19 (component 2).
  • SARS-CoV-2 virus variant Delta B.1.617.2 T19R G142D E156G F157del R158del L452R T478K D614G P681R D950N
  • the infectious titer of the virus is 10 7 TSYu50/ml and 3.5x10 7 PFU/ml.
  • Animals were infected with the SARS-CoV-2 virus intranasally at a dose of 10 5 TCID50 per animal, followed by a monoclonal antibody preparation or placebo, according to Table 12.
  • FIG. 9 shows the survival data of animals after infection with SARS-CoV-2 variant Delta.
  • the developed agent based on the recombinant GamP2C5 antibody (component 1) and the humanized monoclonal antibody GamXRH19 (component 2). can be used for therapy and emergency prevention of the disease caused by the SARS-CoV-2 virus, including the Delta variant.
  • Example 12 A method for the treatment and emergency prevention of COVID-19 disease caused by various strains of the SARS-CoV-2 virus using an agent based on the recombinant GamP2C5 antibody (component 1) and the humanized monoclonal antibody GamXRH19 (component 2).
  • the SARS-CoV-2 virus of the hCoV- 19/Russia/Moscow_PMVL- 1/2020 strain, isolated in 2020 at the Federal State Budgetary Institution was used. "NITsEM them. N.F. Gamalei” of the Ministry of Health of Russia, stored in the State Collection of Viruses.
  • the infectious titer of the virus is 10 7 TSYu50/ml and 3.5x10 7 PFU/ml. Animals were infected SARS-CoV-2 virus intranasally at a dose of 10 5 TCID50 per animal, then a preparation of monoclonal antibodies or a placebo was administered, according to Table 13.
  • FIG. 10 shows the survival data of animals after infection with the SARS-CoV-2 virus of the hCoV-19/USD/Moscow_PMVL-l/2020 strain.
  • the developed agent based on the recombinant GamP2C5 antibody (component 1) and the humanized monoclonal antibody GamXRH19 (component 2) can be used for the treatment and emergency prevention of the disease caused by the SARS-CoV-2 virus of various variants and strains.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Abstract

Группа изобретений относится к области биотехнологии, иммунологии и вирусологии. Описаны средства и способа терапии и экстренной профилактики заболеваний, вызванных различными штаммами вируса тяжелого острого респираторного синдрома SARS-CoV-2. Создано средство, которое содержит рекомбинантное антитело, имеющее CDR1, представленный аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:1, CDR2, представленный аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:2, CDR3, представленный аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:3, а также Fc-фрагмент человеческого IgG1 и гуманизированное моноклональное антитело, имеющее CDR1 лёгкой цепи, представленный последовательностью SEQ ID NO:4, CDR2 лёгкой цепи, представленный последовательностью SEQ ID NO:5, CDR3 лёгкой цепи, представленный последовательностью SEQ ID NO:6, CDR1 тяжёлой цепи, представленный последовательностью SEQ ID NO:7, CDR2 тяжёлой цепи, представленный последовательностью SEQ ID NO: 8, CDR3 тяжёлой цепи, представленный последовательностью SEQ ID NO:9. Также раскрыт способ терапии и экстренной профилактики заболеваний, вызванных различными штаммами вируса тяжелого острого респираторного синдрома SARS-CoV-2 созданным средством. Группа изобретений обеспечивает создание эффективного средства, обладающего вируснейтрализующей активностью и протективной активностью в отношении вируса SARS-CoV-2, в том числе вариантов, вызывающих опасение (Alpha, Beta, Gamma, Delta).

Description

СРЕДСТВО И СПОСОБ ТЕРАПИИ ЗАБОЛЕВАНИЙ, ВЫЗЫВАЕМЫХ ВИРУСОМ SARS-COV-2
Область техники
Группа изобретений относится к области биотехнологии, иммунологии ивирусологии и касается средства и способа терапии и экстренной профилактикизаболеваний, вызванных различными штаммами вируса тяжелого острого респираторногосиндрома S ARS-Co V -2.
Предшествующий уровень техники.
31 декабря 2019 года во Всемирную организацию здравоохранения (ВОЗ) поступила информация о вспышке пневмонии неизвестной этиологии в городе Ухань (Китайская Народная Республика). Возбудителем заболевания оказался одноцепочечный РНК- содержащий вирус SARS-CoV-2, относящийся к семейству Coronaviridae, к линии Beta- CoV В.
Коронавирус SARS-CoV-2 может передаваться воздушно-капельным, воздушнопылевым, контактным, фекально-оральным способами, а также через контаминированные предметы и поверхности (фомиты), через кровь, от матери ребенку и от животных к человеку (Механизмы передачи вируса SARS-CoV-2 и их значение для выбора мер профилактики, Резюме научных исследований, 9 июля 2020 г. ВОЗ). За несколько месяцев вирус распространился по всему миру, и в январе 2020 года ВОЗ объявила эпидемию, связанную с SARS-CoV-2, чрезвычайной ситуацией в области здравоохранения международного значения, а в марте 2020 года охарактеризовала распространение болезни как пандемию.
Заболевание, которое вызывает SARS-CoV-2 получило собственное название COVID-19. Это потенциально тяжёлая острая респираторная инфекция, которая может протекать как в легкой, так и в тяжелой форме, и сопровождаться такими осложнениями, как пневмония, острый респираторный дистресс-синдром, острая дыхательная недостаточность, острая сердечная недостаточность, острая почечная недостаточность, септический шок, кардиомиопатии, и др. В настоящее время число заболевших COVID-19 более 185 млн человек, а погибших- более 4 млн человек и эти числа продолжают расти. Очевидно, что во всем мире в настоящее время есть острая необходимость в разработке безопасных и эффективных средств профилактики и лечения.
Кроме того, с конца 2020 года начали появляться новые варианты вируса SARS- СоУ-2, содержащие точечные аминокислотные замены, позволяющие приобретать частичную или полную резистентность к иммунному ответу, выработанному на исходный вариант вируса. Один из таких новых вариантов В.1. 617.2 Delta, впервые изолированный в Индии, способен индуцировать образование клеточного синцития, что дополнительно помогает уходит от вирус-нейтрализующих антител.
Одним из перспективных подходов к терапии коронавирусной инфекции является применение антител против определенных антигенных детерминант вируса. Это обусловлено двумя основными причинами: высокой специфичностью антител и технологичностью их промышленного производства. (В. С. Смирнов, Арег А. Тотолян. Некоторые возможности иммунотерапии при коронавирусной инфекции. Инфекция и иммунитет 2020, Т. 10, № 3, с. 446^158).
В настоящее время в мире проводится более 50 клинических исследований, связанных с моноклональными антителами (Deb Р, Molla ММА, Saif-Ur-Rahman КМ. Ап update to monoclonal antibody as therapeutic option against COVID- 19. Biosaf Health. 2021 Apr;3(2):87-91. doi: 10.1016/j.bsheal.2021.02.001. Epub 2021 Feb 10. PMID: 33585808; PMCID: PMC7872849).
(https://www.sciencedirect.eom/science/article/pii/S2590053621000197#s0005).
В настоящий момент разрешено к экстренному использованию два препарата на основе моноклональных антител. 21 ноября 2020 года Управление по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов США (FDA) выдало разрешение на экстренное использование (EUA) препарата REGEN-COV (Regeneron Pharmaceuticals), для лечения COVID-19 от легкой до умеренной степени у людей в возрасте от двенадцати лет и старше с массой тела не менее 40 кг (88 фунтов) с положительными результатами прямого тестирования на вирус SARS-CoV-2 и которые имеют высокий риск развития тяжелой формы COVID-19. Сюда входят лица в возрасте 65 лет и старше или лица, страдающие определенными хроническими заболеваниями. REGEN-COV состоит из двух моноклональных антител: казиривимаба (REGN10933) и имдевимаба (REGN 10987), которые связываются с неперекрывающимися эпитопами S белка SARS-CoV-2. Результаты клинических исследований данного препарата показали, что он способен снижать вирусную нагрузку, с большим эффектом у пациентов, у которых иммунный ответ еще не был инициирован или у которых исходно была высокая вирусная нагрузка (Weinreich DM, Sivapalasingam S, NortonT, AliS, GaoH, BhoreR, MusserBJ, SooY, RofailD, ImJ, PerryC, PanC, HosainR, MahmoodA, DavisJD, TumerKC, HooperAT, HamiltonJD, BaumA, KyratsousCA, KimY, CookA, KampmanW, KohliA, SachdevaY, GraberX, KowalB, DiCioccioT, StahlN, LipsichL, BraunsteinN, HermanG, YancopoulosGD; Triallnvestigators. REGN-COV2, a Neutralizing Antibody Cocktail, in Outpatients with Covid-19. N Engl J Med. 2021 Jan 21;384(3):238-251. doi: 10.1056/NEJMoa2035002. Epub 2020 Dec 17. PMID: 33332778; PMCID: PMC7781102).
Другой препарат на основе моноклонального антитела - бамланивимаб (LY-CoV555, разработчик: Eli Lilly) получил разрешение FDA на экстренное применение для лечения COVID-19 от легкой до умеренной степени тяжести у негоспитализированных взрослых и детей. Однако результаты клинических исследований неоднозначны. Среди госпитализированных пациентов с COVID-19 одновременное применение бамланивимаба с ремдесивиром не было эффективно. (ACTIV-3/TICO LY-CoV555 Study Group, Lundgren JD, Grund B, Barkauskas CE, Holland TL, Gottlieb RL, Sandkovsky U, Brown SM, Knowlton KU, Self WH, Files DC, Jain MK, Benfield T, Bowdish ME, Leshnower BG, Baker JV, Jensen JU, Gardner EM, Ginde AA, Harris ES, Johansen IS, Markowitz N, Matthay MA, Ostergaard L, Chang CC, Davey VJ, Goodman A, Higgs ES, Murray DD, Murray TA, Paredes R, Parmar MKB, Phillips AN, Reilly C, Sharma S, Dewar RL, Teitelbaum M, Wentworth D, Cao H, Klekotka P, Babiker AG, Gelijns AC, Kan VL, Polizzotto MN, Thompson ВТ, Lane HC, Neaton JD. A Neutralizing Monoclonal Antibody for Hospitalized Patients with Covid- 19. N Engl J Med. 2021 Mar 11;384(10):905-914. doi: 10.1056/NEJMoa2033130. Epub 2020 Dec 22. PMID: 33356051; PMCID: PMC7781100). Клинические исследования на амбулаторных пациентах показали, что только одна из трех доз исследуемого препарата (2800 мг LY-CoV555) достоверно ускоряла естественное снижение вирусной нагрузки. (ChenP, NirulaA, HellerB, GottliebRL, BosciaJ, MorrisJ, HuhnG, CardonaJ, MocherlaB, StosorV, Shawal, AdamsAC, VanNaardenJ, CusterKL, ShenL, DuranteM, OakleyG, SchadeAE, SaboJ, PatelDR, KlekotkaP, SkovronskyDM; BLAZE-1 Investigators. SARS-CoV-2 Neutralizing Antibody LY-CoV555 in Outpatients with Covid-19. N Engl J Med. 2021 Jan 21;384(3):229-237. doi:10.1056/NEJMoa2029849. Epub 2020 Oct 28. PMID: 33113295; PMCID: PMC7646625).
Наилучший эффект наблюдался при комбинированной терапии двумя моноклональными антителами: бамланивимаб и этесевимаб. (GottliebRL, NirulaA, ChenP, BosciaJ, HellerB, MorrisJ, HuhnG, CardonaJ, MocherlaB, StosorV, Shawal, KumarP, AdamsAC, VanNaardenJ, CusterKL, DuranteM, OakleyG, SchadeAE, Holzer TR, EbertPJ, HiggsRE, KallewaardNL, SaboJ, PatelDR, KlekotkaP, ShenL, SkovronskyDM. Effect of Bamlanivimab as Monotherapy or in Combination With Etesevimab on Viral Load in Patients With Mild to Moderate COVID- 19: A Randomized Clinical Trial. JAMA. 2021 Feb 16;325(7):632-644. doi: 10.1001/jama.2021.0202. PMID: 33475701; PMCID: PMC7821080).
Кроме того, перспективным направлением для терапии и экстренной профилактики инфекционных заболеваний является использование однодоменных антител (наноантител), которые в природе можно найти у представителей семейства верблюдовые. Благодаря относительно небольшому размеру однодоменные антитела обладают благоприятными биофизическими свойствами и дешевле в производстве, чем стандартные моноклональные антитела. Они могут быть получены с использованием прокариотических или эукариотических систем экспрессии. Их небольшой размер, а также длинные, определяющие комплементарность участки тяжелой цепи позволяют им нацеливаться на вогнутые эпитопы. Кроме того, наноантитела можно распылять и доставлять прямо в легкие пациента с Covid- 19 с помощью ингалятора, что представляет собой лучшую альтернативу внутривенно вводимым классическим антителам (Ram Sasisekharan. Preparing for the Future — Nanobodies for Covid- 19? April 22, 2021 N Engl J Med 2021; 384:1568-1571 DOI: 10.1056/NEJMcibr2101205)
В настоящее время нет препаратов на основе однодоменных антител, разрешенных к применению для лечения COVID-19.
Известно решение (CN112500480А, опуб. 16.03.2021), в котором разработаны варианты однодоменного антитела против вируса SARS-CoV-2, соответствующий вектор экспрессии, а также линия клеток, способная экспрессировать вышеуказанные варианты однодоменного антитела, и способ получения вариантов данного антитела.
Известно решение (CN111825762A, опуб. 27.12.2020), в котором разработано несколько вариантов наноантитела к домену RBD S белка вируса SARS-COV-2, а также способ применения вариантов наноантитела для приготовления лекарственных средств для ингибирования вирусной инфекции SARS-COV-2 и приготовлении реагентов или наборов для тестирования вируса SARS-COV-2.
В патенте (CN112094342 А, опуб. 18.12.2020) представлено биэпитопное специфическое антитело, происходящее из альпака, или его антигенсвязывающий фрагмент, который связывается с доменом RBD SARS-CoV-2 с высоким сродством, что может использоваться для профилактики, лечения и / или диагностики инфекции SARS- CoV-2.
Известно решение (CN112062839А, опуб. 11.12.2020), в котором описано создание наноантитела к S белку SARS-CoV-2, а также способ его использования для приготовления реагента для лечения и / или диагностики инфекции, вызванной коронавирусом SARS-CoV-2. Также известно решение (CN112062840 А, опуб. 11.12.2020) предусматривающее разработку наноантитела к S белку SARS-CoV-2, а также способ его использования для приготовления реагента для лечения и / или диагностики инфекции, вызванной коронавирусом SARS-CoV-2.
В патенте (CN111303279А, опуб. 19.06.2020) описано создание гуманизированного однодоменного антитела против коронавируса SARS-CoV-2, молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей однодоменное антитело, а также создание кассеты экспрессии, рекомбинантного вектора, рекомбинантной бактерии или линии трансгенных клеток, содержащей вышеописанную молекулу нуклеиновой кислоты. Кроме того, разработан способ применения однодоменного антитела или созданной молекулы нуклеиновой кислоты или созданной экспрессионной кассеты, рекомбинантного вектора, рекомбинантной бактерии или линии трансгенных клеток при производстве продукта, который может применяться для предотвращения и / или лечение заболеваний, вызванных инфицированием новым коронавирусом SARS-CoV-2; а также для подавления заражения новым коронавирусом SARS-CoV-2. При этом продукт может: связываться с новым коронавирусом SARS-CoV-2; обнаруживать связывание нового коронавируса SARS-CoV- 2; связываться с белком S нового коронавируса SARS-CoV-2; обнаруживать белок S нового коронавируса SARS-CoV-2. Также разработана фармацевтическая композиция, содержащая созданное однодоменное антитело и фармацевтически приемлемый наполнитель, разбавитель или носитель.
Данное решение, как наиболее близкое к заявляемому, было выбрано авторами патента за прототип. Однако, недостатком прототипа является отсутствие данных по возможности применения полученных антител для терапии заболевания, вызванного вирусом SARS-CoV-2 вариантов Alpha, Beta, Gamma, ОеЙа(вариантов, вызывающих опасение)кроме того, однодоменные антитела быстро выводятся из организма в следствии низкой молекулярной массы и, таким образом, требуют многократного введения.
Таким образом, в уровне техники существует потребность в созданиипрепаратадля терапиии экстренной профилактики заболевания, вызываемого вирусом тяжелого острого респираторного синдрома SARS-CoV-2, лишенного указанного недостатка.
Раскрытие сущности изобретения
Технической задачей заявленной группы изобретений является расширение арсенала средств для терапии и экстренной профилактики заболеваний, вызываемых вирусом SARS-CoV-2. Технический результат заключается в создании эффективного средства, обладающего вируснейтрализующей активностью и протективной активностью вотношении вируса SARS-CoV-2, в том числе вариантов, вызывающих опасение (Alpha, Beta, Gamma, Delta).
Указанная технический задача решается тем, что получено средство для терапии и экстренной профилактики заболеваний, вызываемых вирусом SARS-CoV-2, содержащее рекомбинантное антитело, имеющее CDR1, представленный аминокислотной последовательностью SEQ ID N0:1, CDR2, представленный аминокислотной последовательностью SEQ ID N0:2, CDR3, представленный аминокислотной последовательностью SEQ ID N0:3, а также Fc-фрагмент человеческого IgGl (компонент
1 - GamP2C5) и гуманизированное моноклональное антитело, имеющее CDR1 лёгкой цепи, представленный последовательностью SEQ ID N0:4, CDR2 лёгкой цепи, представленный последовательностью SEQ ID N0:5, CDR3 лёгкой цепи, представленный последовательностью SEQ ID N0:6, CDR1 тяжёлой цепи, представленный последовательностью SEQ ID N0:7, CDR2 тяжёлой цепи, представленный последовательностью SEQ ID N0:8, CDR3 тяжёлой цепи, представленный последовательностью SEQ ID N0:9 (компонент 2 - GamXRH19).
При этом рекомбинантное антитело может иметь аминокислотную последовательность SEQ ID N0:10.
Также гуманизированное моноклональное антитело может иметь последовательность тяжелой цепи SEQ ID N0:11 и последовательность легкой цепи SEQ ID N0:12.
В то же времятехническая задача решается тем, что создан способ терапии и экстренной профилактики заболеваний, вызываемых вирусом SARS-CoV-2, заключающийся системном введении эффективного количества созданного средства.
Краткое описание чертежей
На фиг. 1 представлена электрофореграмма анализарекомбинантного антитела GamP2C5 в денатурирующих условиях.
1 - маркер молекулярного веса
2 - образец рекомбинантного антитела GamP2C5 На фиг. 2 представлена электрофореграмма анализарекомбинантного антитела GamP2C5 в неденатурирующих условиях.
1 - маркер молекулярного веса
2 - образец рекомбинантного антитела GamP2C5
На фиг. Зпредставлено схематическое изображение аминокислотной последовательностиОатР2С5
1 - глицин-сериновый линкер;
2 -последовательность однодоменного антитела;
2 - шарнирный регион;
3 - Fc-фрагмент IgGl человека.
На фиг. 4 представлена электрофореграмма анализагуманизированного моноклонального антителаОатХ Н19.
1 - образец гуманизированного моноклонального антитела GamXRH19 в денатурированных условиях;
2 - маркер молекулярного веса;
3 - образец гуманизированного моноклонального антитела GamXRH19 в неденатурированных условиях;
На фиг. 5 представлено схематическое изображениегуманизированного моноклонального антителаОатХКН19.
На фиг. 6 представлены результаты анализа специфической активности гуманизированного моноклонального антитела GamXRH19 в непрямом ИФА.
Ось ординат - оптические единицы, ОД450нм
Ось абсцисс - концентрация антитела GamXRH19, мкг/мл - уровень сигнала антитела GamXRH19 на бычий сывороточный альбумин (отрицательный контроль);
Figure imgf000011_0001
- уровень сигнала антитела GamXRH19 на RBD;
На фиг. 7 представлена хроматограмма ВЭЖХ пробы рекомбинантного антитела GamP2C5 в буфере №2.
Ось ординат - единицы оптической плотности 280нм, mAu
Ось абсцисс - время удерживания пиков, мин
На фиг. 8 представлена хроматограмма ВЭЖХ пробы рекомбинантного антитела GamXRH19 в буфере №2.
Ось ординат - единицы оптической плотности 280нм, mAu
Ось абсцисс - время удерживания пиков, мин
На фиг. 9представлены результаты выживаемости животных, которым вводили рекомбинантное антитело GamP2C5 (компонент 1) и гуманизированное моноклональное антитело XRH19 (компонент 2), и животных из группы плацебо в течение 15 суток после заражения вирусом SARS-CoV-2 вариант Delta.
Ось ординат - выживаемость, %
Ось абсцисс - время после заражения животных вирусом SARS-CoV-2, дни мыши, смесь компонента 1 и 2 (10 мг/мл) спустя 1 час после заражения вирусом; мыши, смесь компонента 1 и 2 (10 мг/мл) спустя 6 часов после заражения вирусом; мыши, смесь компонента 1 и 2 (20 мг/мл) спустя 1 час после заражения вирусом;
~ “ - мыши, смесь компонента 1 и 2 (20 мг/мл) спустя 6 часов после заражения вирусом;
— ♦ — мыши, получившие фосфатно-солевой буфер (PBS); На фиг. Юпредставлены результаты выживаемости животных, которым вводили рекомбинантное антитело GamP2C5 (компонент 1) и гуманизированное моноклональное антитело XRH19 (компонент 2), и животных из группы плацебо в течение 15 суток после заражения вирусом SARS-CoV-2 штамма hCoV-19/Russia/Moscow_PMVL- 1/2020.
Ось ординат - выживаемость, %
Ось абсцисс - время после заражения животных вирусом SARS-CoV-2, дни
- мыши, получившие смесь компонента 1 и 2 (10 мг/мл) спустя 1 час после заражения вирусом;
_ МЫШИз получившие смесь компонента 1 и 2 (20 мг/мл) спустя 1 час после заражения вирусом; - мыши, получившие фосфатно-солевой буфер (PBS);
Реализация изобретения.
Технической задачей заявленной группы изобретений является создание препарата для терапии и экстренной профилактикизаболеваний, вызываемых вирусом SARS-CoV-2 на основе моноклональных и однодоменных антител и их модификаций. Моноклональные и однодоменные антитела, обладающие высокой специфичностью к RBDS-белка вируса SARS-CoV-2 и обладающие вирус-нейтрализующей активностью, рассматриваются в качестве перспективных средств для терапиии экстренной профилактикиСОУГО 19. Вместе с тем, моноклональные и однодоменные антитела, как средства для терапии COVID 19 имеют как преимущества, так и недостатки. Однодоменные антитела способны взаимодействовать с трудно доступными эпитопами антигенов за счет длинных антиген- связывающих участков (CDR), однако быстро выводятся из организма за счет низкой молекулярной массы, а также лишены Fc-зависимых функций. Однако упомянутые недостатки могут быть эффективно нивелированы за счет присоединения к однодоменным антителам Fc-фрагмента 1 Очеловека и получения, таким образом, рекомбинантногоантитела.
Для этого разработаносредство на основе рекомбинантного антитела (GamP2C5) и гуманизированного моноклонального антитела (GamXRH 19), специфически связывающихся с RBD доменом S белка вируса SARS-CoV-2, обладающее вируснейтрализующей и протективной активностью в отношении различных штаммов вируса SARS-CoV-2.
Для получения рекомбинантногоантитела GamP2C5 осуществляли иммунизацию альпака рекомбинантным RBD вируса SARS-CoV-2, полученным в клеточной линии СНО и очищенным металл-аффинной и эксклюзионной хроматографией. Эффективность иммунизации подтверждали оценкой титра специфических к RBD антител в сыворотке крови животного. Далее у животных выделяли мононуклеарные клетки периферической крови, из которых получали РНК. На основе РНК синтезировали кДНК. На матрице, полученной кДНК ставили гнездовую ПЦР, позволяющую амплифицировать последовательности однодоменных антител. Таким образом, была получена библиотека ампликонов последовательностей о дно доменных антител.
Специалистам в данной области известно, что в целях осуществления настоящего изобретения, возможно использование не только мононуклеарных клеток, а также цельной крови, лимфатических узлов, селезенки, тимуса или других клеток и органов иммунизированного животного, экспрессирующих однодоменные антитела. Также специалистам в данной области известно, что в целях осуществления настоящего изобретения возможно использование синтетических библиотек последовательностей о дно доменных антител.
Селекцию антител проводили методом фагового дисплея с использованием паннинга на антигене (RBD). Специалистам в данной области известно, что в целях осуществления настоящего изобретения, возможно использование других подходов селекции, таких как паннинг на вирусных частицах, паннинг в растворе биотинилированного антигена, паннинг с использованием конкурентного связывания и элюции. Также специалистам в данной области известно, что в целях осуществления настоящего изобретения возможно использование других методов селекции, таких как рибосомный дисплей, дрожжевой дисплей. В результате селекции было отобрано однодоменное антитело, специфически связывающиеся с RBD доменом S белка вируса SARS-CoV-2. В последующих экспериментах было показано, что данное антитело обладает вируснейтрализующей активностью.
Специалистам в данной области известно, что в целях осуществления настоящего изобретения последовательности однодоменных антител, специфических к RBD вируса SARS-CoV-2, могут содержать в себе аминокислотные замены, которые не сказываются на вторичной и третичной структуре однодоменных антител и не влияют на их способность связывать и нейтрализовать RBD вируса SARS-CoV-2. Более того, поскольку в связывании с антигеном участвуют только антигенсвязывающие петли (CDR домены) однодоменных антител, то, как известно специалистам в данной области, любой иммуноглобулин или его аналог, содержащий такие же аминокислотные последовательности CDR доменов могут быть использованы в целях осуществления данного изобретения. Более того, последовательности CDR доменов могут содержать замены/делеции/вставки аминокислот, которые при парном выравнивании аминокислотных последовательностей обеспечиваютгомологичность не менее 70% и не оказывают качественного влияния на способность связываться с антигеном. Таким образом, все иммуноглобулины или их аналоги, содержащие последовательности CDR доменов, гомология которых составляет не менее 70% с предлагаемыми последовательностями, могут быть использованы в целях осуществления заявленного изоберетения.
РекомбинантноеантителоОатР2С5, представляющее собой однодоменное антитело, модифицированное Fc-фрагментом иммуноглобулинаО! человека, специфически связывающееся с RBD доменом S белка вируса SARS-CoV-2, обладающее вируснейтрализующей и протективной активностью, имеющее аминокислотную последовательность SEQIDNO.IO. Данное антитело было получено путем экспрессии нуклеотидной последовательностирекомбинантного антитела в клетках-продуцентах СНО.
Нуклеотидные последовательности рекомбинантного антитела GamP2C5 были созданы генно-инженерным путем на основе нуклеотидной последовательности однодоменного антитела и нуклеотидной последовательности Fc-фрагмента иммуноглобулинаО 1 человека. Специалистам в данной области известно, что в целях осуществления настоящего изобретения нуклеотидная последовательность, кодирующая рекомбинантное антитело, может отличаться, основываясь на принципе вырожденности генетического кода. Таким образом, все последовательности нуклеотидов, кодирующие аминокислотную последовательность рекомбинантного антитела (SEQIDNO:10) могут ь быть использованы в целях осуществления заявленного изобретения.
С помощью методов генной инженерии была получена клетка-продуцент, экспрессирующаярекомбинантное антителоОатР2С5 (SEQIDNO:10). Таким образом, была получена: клетка-продуцент на основе клеточной линии СНО, экспрессирующаярекомбинантное антитело GamP2C5. Специалистам в данной области известно, что в целях осуществления настоящего изобретения в качестве продуцента можно использовать другие эукариотические системы экспрессии.
Кроме того, была разработана технологическая схема культивирования клетки- продуцента рекомбинантного антитела GamP2C5 в волновых биореакторах объемом 200л. Специалистам в данной области известно, что в целях осуществления настоящего изобретения для культивирования клетки-продуцента можно использовать биореакторы любого другого типа и объема. Таким образом, все технологические схемы культивирования клетки-продуцента рекомбинантногоантитела GamP2C5 могут быть использованы в целях осуществления заявленного изобретения.
Также, разработана технологическая схема хроматографической очистки рекомбинантного антитела GamP2C5 с использованием аффинной хроматографии на протеине А, анионообменной хроматографии и мультимодальной хроматографии. Специалистам в данной области известно, что в целях осуществления настоящего изобретения для очистки антител могут использоваться различные технологические схемы с применением различных сорбентов. Таким образом, все технологические схемы очистки рекомбинантного антитела GamP2C5 могут быть использованы в целях осуществления заявленного изобретения.
Для получения гуманизированного моноклонального антитела GamXRH19 осуществляли иммунизацию мышей линии Balb/c рекомбинантным RBD вируса SARS- CoV-2, полученным в клеточной линии СНО и очищенным металл-аффинной и эксклюзионной хроматографией. Эффективность иммунизации подтверждали оценкой титра специфических к RBD антител в сыворотке крови мышей. Далее у мышей выделяли спленоциты, которые затем сливали с линией мышиной миеломы Sp2/0-Ag-14, получая таким образом, гибридомы. Селекцию гибридом проводили на питательной среде RPMI- 1640 («Sigma», США) с добавлением HAT Media Supplement (Hybri-Max®, «Sigma», США). Отбор клонов, продуцирующих антитела специфичные к RBD, осуществляли методом твердофазного ИФА.
Специалистам в данной области известно, что в целях осуществления настоящего изобретения, возможно использование не только спленоцитов, а также цельной крови, лимфатических узлов клеток и органов иммунизированного животного, экспрессирующих моноклональные антитела. Также специалистам в данной области известно, что в целях осуществления настоящего изобретения возможно использование синтетических библиотек последовательностей моноклональных антител.
В результате селекции и отбора клонов, был отобран клон гибридомы, продуцирующий мышиное моноклональное антитело XR19, специфичное к RBD и обладающее выраженной вирус-нейтрализующей и протективной активностью в отношении вируса SARS-CoV-2, в том числе варианта Delta. Далее участки генома отобранного клона гибридомы, кодирующие антиген-связывающие участки (CDR домены) антитела XR19 были сиквенированы и использованы для создания гуманизированного моноклонального антитела GamXRH19. Таким образом, были получены нуклеотидные последовательности кодирующие гуманизированное моноклональное антитело GamXRH19 (SEQIDNO:11 тяжелая цепь и SEQIDNO:12 легкая цепь).
Специалистам в данной области известно, что в целях осуществления настоящего изобретения последовательности моноклональных антител, специфических к RBD вируса SARS-CoV-2, могут содержать в себе аминокислотные замены, которые не сказываются на вторичной и третичной структуремоноклональных антител и не влияют на их способность связывать и нейтрализовать RBD вируса SARS-CoV-2. Более того, поскольку в связывании с антигеном участвуют только антигенсвязывающие участки (CDR домены) то, как известно специалистам в данной области, любой иммуноглобулин или его аналог, содержащий такие же аминокислотные последовательности CDR доменов может быть использован в целях осуществления заявленного изобретения. Более того, последовательности CDR доменов могут содержать замены/делеции/вставки аминокислот, которые при парном выравнивании аминокислотных последовательностей обеспечивают гомо логичность не менее 70% и не оказывают качественного влияния на способность связываться с антигеном. Таким образом, все иммуноглобулины или их аналоги, содержащие последовательности CDR доменов, гомология которых составляет не менее 70% с предлагаемыми последовательностями могут быть использованы в целях осуществления заявленного изобретения.
Гуманизированное моноклональное антитело GamXRH19 (изотип IgGl человека), специфически связывающееся с RBD доменом S белка вируса SARS-CoV-2, обладающее вируснейтрализующей и протективной активностью, было получено путем экспрессии нуклеотидной последовательности тяжелой и легкой цепи в клетках-продуцентах СНО.
Нуклеотидные последовательности тяжелой и легкой цепи гуманизированного моноклонального антитела GamXRH19 были созданы генно-инженерным путем на основе нуклеотидной последовательности иммуноглобулинаО1 человека и нуклеотидных последовательностей антиген-связывающих участков антитела XR19. Специалистам в данной области известно, что в целях осуществления настоящего изобретения нуклеотидная последовательность, кодирующая гуманизированное моноклональное антитело, может отличаться, основываясь на принципе вырожденности генетического кода. Таким образом, все последовательности нуклеотидов, кодирующие аминокислотную последовательность гуманизированное моноклональное антитело GamXRH19 (SEQIDNO:11 тяжелая цепь и SEQIDNCH2 легкая цепь), могут быть использованы в целях осуществления настоящего изобретения. С помощью методов генной инженерии была получена клетка-продуцент, экспрессирующая гуманизированное моноклональное антитело GamXRH19 (SEQIDNO:11 1 яже.1ая пень u SI QII )\( ): 12 ло кая пены Таким образом, была получена: клетка-продуцент на основе клеточной линии СНО, экспрессирующаягуманизированное моноклональное антитело GamXRH19. Специалистам в данной области известно, что в целях осуществления настоящего изобретения в качестве продуцента можно использовать другие эукариотические системы экспрессии.
Изучена фармакокинетика однодоменных антител и их модификаций. Продемонстрировано что модификация однодоменных антител и их олигомеров Fc- фрагментом IgGl человека, позволяет увеличить время их циркуляции в организме с нескольких часов до нескольких недель.
Таким образом, авторами заявленного изобретения были получены варианты антител, специфически связывающееся с RBDS белка вируса SARS-CoV-2, обладающее вируснейтрализующей активностью и обладающие улучшенной фармакокинетикой по сравнению с однодоменными антителами.
Кроме того, была разработана оптимальная формуляциясредстваантитела GamP2C5 (компонент 1) и антитела GamXRH19 (компонент 2), обеспечивающая наибольшую стабильность.
Таким образом, авторами патента было полученосредство на основе антител, специфически связывающихся с RBDS белка вируса SARS-CoV-2, предназначенного для терапии и экстренной профилактикизаболевания COVID-19.
Кроме того, авторами заявленного изобретения разработан способ терапии и экстренной профилактикизаболеваний, вызываемых вирусом SARS-CoV-2, заключающийся во введении в организм млекопитающих в эффективном количестве любого из разработанных вариантов антител.
Осуществление изобретения подтверждается следующими примерами.
Пример 1 . Получение иммуногена - рецептор-связывающего домена (RBD) S белка вируса SARS-CoV-2.
На первом этапе работы был получен иммуноген - рецептор-связывающий домен (RBD) S белка вируса SARS-CoV-2. Для этого аминокислотную последовательность рецептор-связывающего домена (RBD) поверхностного Spike-белка вируса SARS-CoV-2 (а.о. 319 - 541, UniProtKB: locus SPIKJEJSARS2, accession P0DTC2) модифицировали с N- конца сигнальным пептидом щелочной фосфатазы SEAP (MLLLLLLLGLRLQLSLGI) и с С-конца последовательностью глицин-серинового линкера и гистидиновой метки (GSHHHHHHHHH). На основе аминокислотной последовательности получили нуклеотидную последовательность, которая была синтезирована ЗАО «Евроген». После этого нуклеотидную последовательность полученного полипептида клонировали в плазмиду для транзиентной экспрессии в клетках млекопитающих. Далее, культуру клеток СНО тарифицировали полученной плазмидой с помощью набора СНО Gro (Minis Bio, США) в соответствии с протоколом производителя. Затем клетки культивировали в колбах Эрленмейера в течение 10 дней. По истечении этого срока культуральную жидкость осветляли центрифугированием при 5000g. Рецептор-связывающий домен (RBD) очищали металл-аффинной хроматографией на системе АКТА start («GE Healthcare Life Sciences», США), используя колонки HisTrap FF 5 мл («GE Healthcare Life Sciences», США) в соответствии с протоколом производителя. Дополнительную очистку и замену буфера на 20 мМ фосфат натрия, 500 мМ натрия хлорид (рН=7,2) проводили на колонке ХК 26/100 («GE Healthcare Life Sciences», США), упакованной сорбентом Superdex 200 pg («GE Healthcare Life Sciences», США). Таким образом, в результате проведенной работы был получен очищенный рекомбинантный RBDS белка вируса SARS-CoV-2.
Пример 2. Получение рекомбинантного антитела GamP2C5
Альпака (Lama pacos - представитель семейства Cameliedae) иммунизировали полученным RBD (ЮОмкг на иммунизацию) 5 раз с промежутками в 10-14 дней. Через 7 дней после последней иммунизации у альпака отбирали 50,0 мл периферической крови и выделяли мононуклеарные клетки на градиенте фиколла 1,077 (Панэко, Россия). Изолированные мононуклеарные клетки использовали для выделения тотальной РНК реагентом Trizol (Invitrogene, США) согласно протоколу фирмы-производителя. Выделенную РНК использовали в качестве матрицы для синтеза кДНК со случайными праймерами и ревертазой SuperScriptHI (Invitrogene, США). На матрице, полученной кДНК, ставили гнездовую ПЦР, позволяющую амплифицировать последовательности однодоменных антител. Для этой процедуры использовали высокоточную полимеразу Q5 (NEB, Великобритания) и специфические праймеры, содержащие на концах сайты рестрикции. Далее, ампликоныгидролизовали рестриктазами и клонировали в фагмидный вектор, гидролизованный по тем же сайтам. Затем, клетки E.coli (штамм TG1), трансформировали фагмидными векторами, полученными в результате клонирования.
Суспензию бактериальных клонов-трансформантов клеток E.coli (штамм TG1) использовали для продукции рекомбинантных бактериофагов с использованием бактериофага-помощника М13КО7 (NEB, Великобритания) согласно протоколу фирмы- производителя. Рекомбинантные бактериофаги осаждали путем преципитации полиэтиленгликолем (PEG/NaCl). Таким образом, получена библиотека рекомбинантных бактерифагов с титром 1012 трансдуцирующих единиц/мл суспензии.
Селекцию специфических рекомбинантных бактериофагов осуществляли путем паннинга на антигене исходной библиотеки бактериофагов. Для этого рекомбинантный RBD (пример 1) иммобилизовали в лунке иммунологического планшета в 50,0 мМ карбонатно-бикарбонатном буфере в течение ночи. Не связавшийся белок удаляли, а лунку блокировали 5% раствором сухого молока в фосфатном буфере в течение 1 часа при комнатной температуре. Затем добавляли суспензию 1011 рекомбинантных бактерифагов и инкубировали 1 час при комнатной температуре. Не связавшиеся бактерифаги отмывали коллоидным 0,1% раствором детергента Твин-20 в фосфатном буфере. Связавшиеся бактериофаги элюировали при помощи раствора трипсина (0,1 мг/мл). Элюированные бактериофаги использовали для трансдукции клеток E.coli TG1, которые затем высевали на агаризованные чашки в разведении, позволяющем изолировать индивидуальные колонии. Полученные колонии использовали для наращивания бактериальной массы и выделения плазмидной ДНК. Плазмиды секвенировали для определения нуклеотидных последовательностей, кодирующих однодоменные антитела. Было определено 8 индивидуальных последовательностей.
Для продукции однодоменных антител к интенсивно делящимся клеткам E.coli TG1, полученных из колоний на предыдущем этапе, добавляли 1,0 мкМ изопропил тиогалактопиранозид (IPTG) (Хеликон, Россия), спустя 4 часа бактериальную массу использовали для выделения рекомбинантных белков на колонке HisTrap FF 5 мл («GE Healthcare Life Sciences», США) с использованием хроматографической системы АКТА start («GE Healthcare Life Sciences», США), согласно протоколу фирмы-производителя.
Очищенные однодоменные антитела, далее изучали в реакции вирус-нейтрализации. Реакцию нейтрализации вируса SARS-CoV-2 ставили в варианте постоянная доза вируса - разведения образца однодоменных антител. Готовили образцы однодоменных антител в культуральной среде ДМЕМ с 2% инактивированной фетальной бычьей сывороткой, далее смешивали со 100 БОЕ вируса SARS-CoV-2, инкубировали 1 час при 37°С и добавляли к клеткам Vero Е6. Исходные концентрации препаратов одно доменных антител составляла 0,5-1 мг/мл. Конечные разведения однодоменных антител составили 1/20- 1/1280. Клетки инкубировали при 37°С в 5% СО2. Через 96 часов производили учет развития цитопатического действия вируса на культуру клеток визуально по оценке нарушения монослоя клеток. За вируснейтрализующий титр однодоменных антител принимали высшее их разведение, при котором происходит подавление цитопатического действия в 2-х лунках из 3-х.
Данные по вируснейтрализующей активности выбранных антител представлены в таблице 1.
Таблица 1. Вируснейтрализующая активность полученных о дно доменных антител.
Figure imgf000020_0001
Как видно из представленных данных все 8 образцов обладали выраженной вируснейтрализующей активностью (рабочая концентрация от 1 до 12,5 мкг/мл), из которых 3 образца обладали наиболее выраженной вируснейтрализующей активностью (рабочая концентрация от менее 1 мкг/мл). Три образца однодоменных антител, обладающих наиболее выраженной вируснейтрализующей активностью, были выбраны для дальнейших исследований.
Константы взаимодействия (KD) однодоменных антител р2с5, p5f8 и p2gl определяли путем детекции изменения показателей поверхностного плазмонного резонанса на приборе Biacore3000 (General Electric, Швеция). Для этого рекомбинантный RBD ковалентно иммобилизировали на поверхности декстранового матрикса чипа СМ5 (General Electric, Швеция), а затем пропускали над поверхностью чипа различные концентрации полученных однодоменных антител. Обработку данных и вычисление констант проводили в автоматическом режиме при помощи программы Bioevaluation
(General Electric, Швеция). Полученные данные представлены в таблице 2
Таблица. 2. Константа равновесной диссоциации полученных о дно доменных антител с рекомбинантным RBD.
Figure imgf000021_0001
Далее, основываясь на данных вирус-нейтрализации и констант равновесных диссоциаций, клон р2с5 был взят в дальнейшую работу для получения рекомбинантного антитела GamP2C5. рекомбинантное антитело представляет собой однодоменное антитело, модифицированное Fc-фрагментом иммуноглобулина человека. Данная модификация однодоменных антител позволит улучшить их фармакокинетические свойства за счет добавления Fc-фрагмента IgGl человека и его правильного гликозилирования в эукариотических клетках-продуцентах. Кроме того, модификация Fc-фрагментом позволит антителам активировать систему комплимента и связываться с Fc-рецепторами на поверхности иммунокомпитентных клеток.
На первом этапе работы разработали дизайн аминокислотной последовательности рекомбинантного антитела (SEQIDNO:10) которое представляет собой однодоменное антитело, модифицированное Fc-фрагментом иммуноглобулина G1 человека. На основе аминокислотной последовательности были получены нуклеотидные последовательности рекомбинантных антител, которые были синтезированы в компании ЗАО «Евроген». Полученные нуклеотидные последовательности клонировали в вектор для экспрессии в эукариотических клетках. Далее проводили трансфекцию клеток линии СНО полученными экспрессионными векторами с использованием системы CHOGro (MirusBio, США) в соответствии с протоколом производителя.Клетки культивировали в колбах Эрленмейера в течение 10 дней. После чего культуральную жидкость осветляли центрифугированием при 5000g. Антитело очищали аффинной хроматографией на системе АКТА start (Cytiva, Швеция), используя колонки MAbSelect SuRe 1 мл (Cytiva, Швеция) в соответствии с протоколом производителя. Дополнительную очистку и замену буфера проводили на колонке ХК 26/100 (Cytiva, Швеция), упакованной сорбентом Superdex 200 pg (Cytiva, Швеция). Чистоту полученного препарата рекомбинантного антителаОатР2С5, определяли методом вертикального электрофореза в полиакриламидном геле в неденатурирующих условиях и денатурирующих условиях (фиг. 2 и фиг. 1). Схематичное изображение рекомбинантного антитела GamP2C5 представлено на фиг. 3.
Далее, при помощи, анализа литературных данных и методов биоинформатики в последовательности рекомбинантного антитела GamP2C5 были идентифицированы последовательности CDR1-CDR3.
Таким образом, в результате проведенной работы было получено рекомбинантного антитела GamP2C5, имеющее аминокислотную последовательность SEQIDNO:10, а также идентифицированы последовательности CDR1, CDR2, CDR3, имеющие аминокислотные последовательности SEQIDNO:1, SEQIDNO:2 и SEQIDNO:3 соответственно.
Пример 3. Получение гуманизированного моноклонального антитела GamXRH19.
Мышей линии BALB/c (10 самок 5-6-недельного возраста массой 15-20 г) иммунизировали препаратом рекомбинантного RBD вируса SARS-CoV-2, полученного в примере 1. Схема иммунизации включала 4 подкожные инъекции антигена с интервалом введения 21 день. Доза препарата составила 50 мкг на инъекцию.Через 18 дней после последней инъекции осуществляли взятие крови из параорбитального синуса и определяли титр специфических антител с помощью твердофазного иммуно ферментного анализа. Для этого планшеты сенсибилизировали антигеном, в 50 мМ карбонат- бикарбонатном буфере с pH 9,6. Образцы крови мышей разбавляли 10-кратным титрованием в буфере для ИФА (0.1М фосфатно-солевой буфер с добавлением 1% бычьего сывороточного альбумина (Serva, Германия) и 0,1% Твин 20 (Serva, Германия) и инкубировали в лунках планшет в течение 30 минут при 37 °C. Лунки отмывали трехкратным внесением 0,9% натрия хлорида с добавлением 0,1% Твин 20 (отмывочного буфера) и добавляли антитела против иммуноглобулинов мыши, меченые пероксидазой хрена (кат. № AS302-HRP, Хема, Россия) в рабочем разведении на 30 минут при 37°С. После 5 -кратной отмывки отмывочным буфером в лунки добавляли хромоген - субстратную смесь (кат. № R055, Хема, Россия) на 15 минут, останавливали реакцию 5% раствором серной кислоты и считывали оптическую плотность при 450 нм на планшетном ридере НуРо (Biosan, Латвия). Удовлетворительным считали титр антител не менее 1:100 000. Далее животным с наибольшим уровнем продукции антител через 20 дней после иммунизации делали внутрибрюшную инъекцию (бустер-доза) антигена в количестве 50 мкг. На четвертые сутки с момента бустерной инъекции селезенку асептически извлекали, спленоциты получали путем перфузии средой RPMI1640 (Sigma- Aldrich, США).
Процедуру слияния иммунных спленоцитов и клеток миеломы SP2/0-Agl4 проводили по методике, предложенной G.Kohler и C.Milstein в модификации De St.Fazekas, S. Groth и D.Scheidegger. В качестве индуктора слияния клеток использовали 50% раствор полиэтиленгликоля с молекулярной массой 1450 (Sigma- Aldrich, США). Гибридные клетки культивировали in vitro в СО2-инкубаторе при температуре 37 °C и содержании диоксида углерода равном 5%. Для культивирования использовали ростовую среду RPMI-1640, содержащую 2 мМ L-глютамина, с добавлением 20% фетальной телячьей сыворотки (Thermo Scientific, США) и 80 мг/л гентамицина (Россия). С целью проведения селекции гибридных клеток в ростовую среду добавляли HAT (Sigma-Aldrich, США), содержащий гипоксантин (Н), аминоптерин (А) и тимидин (т) в рабочем разведении.
Первичный скрининг гибридных культур проводили, начиная с 10-х суток после гибридизации. Специфическую активность антителопродукции гибридных культур определяли в культуральной жидкости без разведения методом ИФА аналогично описанному в разделе «Контроль иммунного ответа» трижды с интервалом 2-3 дня по мере интенсивности роста клеток. Пробы считали положительными, если оптическая плотность в лунках с исследуемыми образцами превышала на 0,5 значение оптической плотности в контрольных лунках со средой культивирования.
Клонирование культур гибридных клеток проводили методом лимитирующих разведений при расчетной посевной концентрации одна клетка на лунку. Продуцирующую активность отдельных клонов определяли, начиная с 10-х суток, дважды с интервалом три дня методом иммуноферментного анализа по схеме, описанной выше. После выделения положительных клонов их клетки размножали в достаточном количестве, образцы замораживали в ростовой среде RPMI, содержащей 20% фетальной телячьей сыворотки и 8% диметилсульфоксида (Serva, Германия), и помещали на хранение в контейнер с жидким азотом.
Культуральные и секреторные свойства полученных клонов изучали в процессе культивирования in vitro в 24-луночных планшетах (Flow Laboratories, Великобритания) в течение десяти пассажей. После клонирования образцы культуральной жидкости от моноклональных культур изучали методом конкурентного ИФА. Рекомбинантный белок - рецептор АСЕ2 (Vaxine, Австралия) сорбировали в лунках планшет в концентрации 0,5 мкг/мл в 0,1М фосфатном буфере, pH 7,2 в течение 12-16 часов при температуре +4 С. После однократной отмывки отмывочным буфером (см Контроль иммунного ответа) планшет в лунки вносили 50 мкл образцов культуральной жидкости и 50 мкл разведения белка RBD, меченого пероксидазой хрена (Faizyme, ЮАР) и инкубировали 30 минут при 37 С. После 5х кратной отмывки отмывочным буфером реакцию проявляли с помощью хромоген-субстратной смеси и фотометрии при 450 нм. В контрольной лунке вместо образца культуральной жидкости помещали среду культивирования. Отбирали культуры, которые давали максимальное ингибирование взаимодействия АСЕ2 и RBD-пероксидаза (не менее 90%). Методику вторичного скрининга повторяли у выбранных клонов на всех этапах получения моноклональных антител с целью получения антител, в итоге выбрали моноклональное антитело XR19, дающее максимальную удельную активность ингибиции.
Далее, проводили сиквенирование отобранного клона гибридомы, для определения нуклеотидных последовательностей кодирующих. Для этого, клетки гибридомы линии XR19 лизировали с помощью 1 мл TRIzol reagent (Thermofisher scientific) с последующим выделением тотальной РНК. 5 мкг тотальной РНК использовали для синтеза кДНК с помощью набора SuperScriptIVTMfirst-strandsynthesissystem (Invitrogen). Последовательности вариабельных доменов тяжелой и легкой цепи амплифицировали методом ПЦР с использованием панели праймеров, специфично отжигающихся в начале и конце последовательностей вариабельных доменов мыши. Полученные ПЦР-продукты секвенировали по Сэнгеру на приборе Genetic Analyzer 3500 Applied Biosystems.
Таким образом, были получены последовательности вариабельных доменов тяжелой и легкой цепей антитела XR19, представленные в таблице 3.
Таблица. 3. Нуклеотидные и аминокислотные последовательности вариабельных доменов тяжелой и легкой цепи антитела XR19.
Figure imgf000024_0001
Figure imgf000025_0001
Далее аминокислотные последовательности вариабельных доменов тяжелой и легкой цепей антитела XR19 были гуманизированы при помощи биоинформатического ресурса Abisysdatabase (http://www.abysis.org/abysis/). Полученные аминокислотные последовательности гуманизированного моноклонального антитела XR19 (GamXRH19), представлены в таблице 4.
Таблица 4. Гуманизированные нуклеотидные и аминокислотные последовательности вариабельных доменов тяжелой и легкой цепи антитела GamXRH19.
Figure imgf000025_0002
Далее, при помощи, анализа литературных данных и методов биоинформатики в последовательности легкой и тяжелой цепи антитела GamXRH19, были идентифицированы последовательности CDR1-CDR3.
Далее, был разработан дизайн аминокислотной последовательности полноразмерных тяжелых и легких цепей гуманизированного антитела GamXRH19. Аминокислотная последовательность гуманизированной тяжелой представлена SEQIDNO:11 и аминокислотная последовательность гуманизированной легкой представлена SEQIDNO:12. На основе аминокислотных последовательностей были получены нуклеотидные последовательности антитела GamXRH19, которые были синтезированы в компании ЗАО «Евроген». Полученные нуклеотидные последовательности клонировали в вектор для экспрессии в эукариотических клетках. Далее проводили трансфекцию клеток линии СНО полученными экспрессионными векторами с использованием системы CHOGro (MirusBio, США) в соответствии с протоколом производителя.Клетки культивировали в колбах Эрленмейера в течение 10 дней. После чего культуральную жидкость осветляли центрифугированием при 5000g. Антитело очищали аффинной хроматографией на системе АКТА start (Cytiva, Швеция), используя колонки MAbSelect SuRe 1 мл (Cytiva, Швеция) в соответствии с протоколом производителя. Дополнительную очистку и замену буфера проводили на колонке ХК 26/100 (Cytiva, Швеция), упакованной сорбентом Superdex 200 pg (Cytiva, Швеция). Чистоту полученного препарата гуманизированного моноклонального антитела XRH19, определяли методом вертикального электрофореза в полиакриламидном геле в неденатурирующих условиях и денатурирующих условиях (фиг. 4). Схематичное изображение гуманизированного моноклонального антитела GamXRH19 представлено на фиг. 5.
Таким образом, в результате проведенной работы было получено гуманизированного моноклонального антитела GamXRH19, имеющее аминокислотную последовательность тяжелых и легких цепей SEQIDNO:11 и SEQIDNO:12 соответственно. Кроме того, были идентифицированы последовательности CDR1, CDR2, CDR3 легкой цепи антитела GamXRH19, имеющие аминокислотные последовательности SEQIDNO:4, SEQIDNO:5 и SEQIDNO:6 соответственно и последовательности CDR1, CDR2, CDR3 тяжелой цепи антитела GamXRH19, имеющие аминокислотные последовательности SEQIDNO:7, SEQIDNO:8 и SEQIDNO:9 соответственно.
Пример 4. Изучение специфической активности гуманизированного моноклонального антитела GamXRH19 в непрямом ИФА. Для определения специфической активности антитела GamXRH19 метод непрямого ИФА. Для этогорекомбинантный RBDS белка вируса SARS-CoV-2 иммобилизовали в лунке иммунологического планшета в 50,0 мМ карбонатно-бикарбонатном буфере в течение ночи. Не связавшийся белок удаляли, а лунку блокировали 5% раствором сухого молока в фосфатном буфере в течение 1 часа при комнатной температуре. Затем лунки промывали 0,1% раствором детергента Твин-20 в фосфатном буфере и добавляли раствор 5% раствором сухого молока в фосфатном буфере, содержащим различные разведения гуманизированного моноклонального антитела GamXRH19. Каждое разведение вносили в 3-х повторах, инкубировали 1 час при 37° С при слабом перемешивании. Затем проводили 3-х кратную отмывку 0,1% раствором детергента Твин-20 в фосфатном буфере. После отмывки вносили раствор конъюгата, меченного перексидазой и инкубировали 1 час при 37° С при слабом перемешивании. Далее проводили 5-х кратную отмывку 0,1% раствором детергента Твин-20 в фосфатном буфере. Далее вносили раствор субстрата ТМБ и инкубировали 10 мин при комнатной температуре без перемешивания, после чего реакцию останавливали добавлением раствора серной кислоты и проводили измерение на спектрофотометре. Результаты исследования представлены на фиг. 6. Было продемонстрировано, что антитело GamXRH19 обладает специфической активность в концентрации как минимум 3,3 нг/мл.
Таким образом, в данном примере была изучена специфическая активность антитела GamXRH19 в непрямом ИФА и определена его минимальная рабочая концентрация.
Пример 5. Определение константы аффинности гуманизированного моноклонального антитела GamXRH19.
Константы взаимодействия (KD) гуманизированного моноклонального антитела GamXRH19 определяли путем детекции изменения показателей поверхностного плазмонного резонанса на приборе Biacore3000 (General Electric, Швеция). Для этого рекомбинантный RBDS-белка вирусма SARS-CoV-2 ковалентно иммобилизировали на поверхности декстранового матрикса чипа СМ5 (General Electric, Швеция), а затем пропускали над поверхностью чипа различные концентрации полученногоантитела XRH19. Обработку данных и вычисление констант проводили в автоматическом режиме при помощи программы Bioevaluation (General Electric, Швеция). В результате константа равновесной диссоциации GamXRH19 составила 4*10‘9М, что демонстрирует высокую аффинность антитела к рекомбинантному RBD.
Таким образом, в данном примере была продемонстрирована высокая аффинность антитела GamXRH19 к рекомбинантный RBDS-белка вирусма SARS-CoV-2. Пример 6. Определение вируснейтрализующей активности гуманизированного моноклонального антитела GamXRH19, в отношении различных штаммов вируса SARS- CoV-2.
Целью данного эксперимента являлась оценка способности разработанногогуманизированного моноклонального антитела ОатХ1 19нейтрализовать вирус SARS-CoV-2 различных штаммов. На первом этапе работы подготовили образцы антитела XRH19B культуральной среде ДМЕМ с 2% инактивированной фетальной бычьей сывороткой. Затем полученные образцы антител смешивали со 100 БОЕ вируса SARS- CoV-2 различных штаммов, инкубировали 1 час при 37°С и добавляли к клеткам Vero Е6. Клетки инкубировали при 37°С в 5% СО2. Через 96 часов производили учет развития цитопатического действия вируса на культуру клеток визуально по оценке нарушения монослоя клеток. За вируснейтрализующий титр антитела принимали высшее их разведение, при котором происходит подавление цитопатического действия в 2-х лунках из 3-х. В результате были определены следующие рабочие вируснейтрализующие концентрации, представленные в таблице 5.
Таблица. 5. Вирус -нейтрализующие титры гуманизированного моноклонального антитела GamXRH19 в отношении BHpycaSARS-CoV-2 различных штаммов.
Figure imgf000028_0001
Таким образом, в данном примере продемонстрирована выраженная вирус- нейтрализующая активность гуманизированного моноклонального антитела GamXRH19 в отношении BHpycaSARS-CoV-2, в том числе варианта, вызывающего опасение Delta.
Пример 7. Определение вируснейтрализующей активности рекомбинантногоантитела GamP2C5, в отношении различных штаммов вируса SARS- CoV-2.
Целью данного эксперимента являлась оценка способности разработанногорекомбинантного антитела ОатР2С5нейтрализовать вирус SARS-CoV-2 различных штаммов. На первом этапе работы подготовили образцы рекомбинантного антитела GamP2C5B культуральной среде ДМЕМ с 2% инактивированной фетальной бычьей сывороткой. Затем полученные образцы антител смешивали со 100 БОЕ вируса SARS-CoV-2 различных штаммов, инкубировали 1 час при 37°С и добавляли к клеткам Vero Е6. Клетки инкубировали при 37°С в 5% СО2. Через 96 часов производили учет развития цитопатического действия вируса на культуру клеток визуально по оценке нарушения монослоя клеток. За вируснейтрализующий титр антитела принимали высшее их разведение, при котором происходит подавление цитопатического действия в 2-х лунках из 3-х. В результате были определены следующие рабочие вируснейтрализующие концентрации, представленные в таблице 6.
Таблица. б.Вирус-нейтрализующие титры рекомбинантного антитела GamP2C5 в отношении BnpycaSARS-CoV-2 различных штаммов.
Figure imgf000029_0001
Figure imgf000030_0001
Таким образом, в данном примере продемонстрирована выраженная вирус- нейтрализующая активность рекомбинантного антитела GamP2C5 в отношении вируса SARS-CoV-2, в том числе вариантов, вызывающих опасение Alpha, Beta и Gamma.
Пример 8. Получение формуляции компонента 1 (рекомбинантного антитела GamP2C5).
Препарат для терапии и экстренной профилактики заболевания COVID-19 на основе рекомбинантного антитела GamP2C5 (компонент 1) получали путем подбора формулирующего буфера. Для сравнения использовали различные физиологические буферные системы, представленные в таблице 7.
Таблица 7. Состав буферных систем для разработки средства.
Figure imgf000030_0002
Рекомбинантного антитела ОатР2С5переводили в каждую буферную систему при помощи эксклюзионной хроматографии на сорбенте Superdex 200 pg и ужимали до концентрации 20 мг/мл. Далее образцы инкубировали при 37°С в течении недели и далее анализировали их стабильность и чистоту при помощи ВЭЖХ. Результаты анализа представлены в таблице 8. Примеры хроматограмм ВЭЖХ анализа представлены на фиг. 7.
Таблица. 8. Процентное содержание целевых и примесных пиков рекомбинантного антитела GamP2C5 (компонент 1) в различных буферных растворах.
Figure imgf000030_0003
Figure imgf000031_0001
В результате было продемонстрировано что наибольшая стабильность 1-ого компонента наблюдается в буфере №2 Фосфат натрия 20мМ, Хлорид натрия 150 мМ, полисорбат 80 0,05%, pH 7,2.
Таким образом, в данном примере было полученосредство на основе рекомбинантного антитела GamP2C5 (компонент 1) и подобран оптимальный буферный состав.
Пример 9. Получение формуляции компонента 2(гуманизированного моноклонального антитела GamXRH19).
Препарат для терапии и экстренной профилактики заболевания COVID-19 на основе гуманизированного моноклонального антитела GamXRH19 (компонент 2) получали путем подбора формулирующего буфера. Для сравнения использовали различные физиологические буферные системы, представленные в таблице 9.
Таблица 9. Состав буферных систем для разработки средства.
Figure imgf000031_0002
Гуманизированное моноклональное антитело GamXRH19 переводили в каждую буферную систему при помощи эксклюзионной хроматографии на сорбенте Superdex 200 pg и ужимали до концентрации 20 мг/мл. Далее образцы инкубировали при 37° С в течении недели и далее анализировали их стабильность и чистоту при помощи ВЭЖХ. Результаты анализа представлены в таблице 10. Примеры хроматограмм ВЭЖХ анализа представлены на фиг.8.
Таблица. 10. Процентное содержание целевых и примесных пиков гуманизированного моноклонального антитела GamXRH19 (компонент 2) в различных буферных растворах.
Figure imgf000031_0003
Figure imgf000032_0001
В результате было продемонстрировано что наибольшая стабильность компонента 2 наблюдается в буфере №2 Фосфат натрия 20мМ, Хлорид натрия 150 мМ, полисорбат 80 0,05%, pH 7,2.
Таким образом, в данном примере было получено средство на основе гуманизированного моноклонального антитела GamXRH19 (компонент 2) и подобран оптимальный буферный состав.
Пример 10. Определение вируснейтрализующей активности средствана основе рекомбинантного антитела GamP2C5 (компонент 1) и гуманизированного моноклонального антитела GamXRH19 (компонент 2).
Целью данного эксперимента являлась оценка способности каждого из компонентов средства и их смеси в оптимальном буферном растворе нейтрализовать вирус SARS-CoV- 2 различных штаммов. Методика данного анализа описана в примерахб и 7. В результате были определены следующие рабочие вируснейтрализующие концентрации компонентов препарата, представленные в таблице 11.
Таблица. 11. Вирус-нейтрализующие титры рекомбинантного антитела GamP2C5 в отношении вируса SARS-CoV-2 различных штаммов.
Figure imgf000032_0002
Figure imgf000033_0001
Таким образом, в данном примере продемонстрирована выраженная вирус - нейтрализующая активность средства на основе рекомбинатного антитела GamP2C5 (компонент 1) и гуманизированного моноклонального антитела GamXRH19 (компонент 2) против различных штаммов SARS-CoV-2 включая варианты, AlphaVl, BetaV2, GammaV3, Delta. Кроме того, было показано, что компонент 1 обладает вирус-нейтрализующей активностью в отношение вариантов, вызывающих опасение AlphaVl, BetaV2 и GammaV3, а компонент 2 в отношение вариантов, вызывающих опасение Delta.
Пример И. Способ терапии и экстренной профилактики заболевания COVID-19 при помощи средства на основе рекомбинатного антитела GamP2C5 (компонент 1) и гуманизированного моноклонального антитела GamXRH19 (компонент 2).
Терапевтическую эффективность и эффективность при экстренной профилактикерекомбинантного антитела GamP2C5 (компонент 1) и гуманизированного моноклонального антитела GamXRH19 (компонент 2), а также их смесиоценивали на модели инфекции, вызванной вирусом SARS-CoV-2, у АСЕ2-трансгенных мышей. Данные животные были выбраны, так как они высоко чувствительны к инфекции SARS- CoV-2. Летальность животных после заражения вирусом SARS-CoV-2 составляет 100%.
В работе использовали вирус SARS-CoV-2 варианта Delta В.1.617.2 (T19R G142D E156G F157del R158del L452R Т478К D614G P681R D950N), изолированный в 2021 году в ФГБУ «НИЦЭМ им. Н.Ф.Гамалеи» Минздрава России, хранящийся в Государственной коллекции вирусов. Инфекционный титр вируса 107 ТСЮ50/мл и 3,5x107 БОЕ/мл. Животных заражали вирусом SARS-CoV-2 интраназально в дозе 105 TCID50 на животное, далее вводили препарат моноклональных антител или плацебо, согласно таблице 12.
Таблица 12. Дизайн экспериментального изучения эффективности рекомбинантного антитела GamP2C5 (компонент 1) и гуманизированного моноклонального антитела GamXRH19 (компонент 2), а также их смеси.
Figure imgf000034_0001
В течение 30 суток после заражения оценивали вес и выживаемость животных.
На фиг. 9 представлены данные выживаемости животных после заражения вирусом SARS-CoV-2 варианта Delta. В результатате исследования было показано, что однократное системное введение смеси двух компонентов препарата в дозах 10и 20 мг/кгживотным через час и через 6 часов после заражения позволяет защитить животных от инфекции, вызванной вирусом SARS-CoV-2 варианта Delta. В контрольной группе животныхпосле заражения получивших плацебо наблюдалось снижение массы тела. К10 суткам все животные из группы контроля погибли.
Таким образом, можно сделать вывод, что разработанноесредство на основе рекомбинантного антитела GamP2C5 (компонент 1) и гуманизированного моноклонального антитела GamXRH19 (компонент 2). может быть использовано для терапии и экстренной профилактики заболевания, вызванного вирусом SARS-CoV-2 в том числе варианта Delta.
Пример 12. Способ терапии и экстренной профилактики заболевания COVID-19, вызванного различными штаммами вируса SARS-CoV-2, при помощи средства на основе рекомбинантного антитела GamP2C5 (компонент 1) и гуманизированного моноклонального антитела GamXRH19 (компонент 2).
Для оценки широты терапевтических свойств средства на основе рекомбинатного антитела GamP2C5 (компонент 1) и гуманизированного моноклонального антитела GamXRH19 (компонент 2) использовали вирус SARS-CoV-2 штамма hCoV- 19/Russia/Moscow_PMVL- 1/2020, изолированный в 2020 году в ФГБУ «НИЦЭМ им. Н.Ф.Гамалеи» Минздрава России, хранящийся в Государственной коллекции вирусов. Инфекционный титр вируса 107 ТСЮ50/мл и 3,5x107 БОЕ/мл. Животных заражали вирусом SARS-CoV-2 интраназально в дозе 105 TCID50 на животное, далее вводили препарат моноклональных антител или плацебо, согласно таблице 13.
Таблица 13. Дизайн экспериментального изучения широты протективной активности средства на основе рекомбинатного антитела GamP2C5 (компонент 1) и гуманизированного моноклонального антитела GamXRH19 (компонент 2), а также их смеси.
Figure imgf000035_0001
В течение 30 суток после заражения оценивали выживаемость животных.
На фиг. 10 представлены данные выживаемости животных после заражения вирусом SARS-CoV-2 штамма штамма hCoV-19/Russia/Moscow_PMVL-l/2020. В результате исследования было показано, что однократное системное введение смеси двух компонентов препарата в дозах 10 и 20 мг/кг животным через час после заражения позволяет защитить животных от инфекции, вызванной вирусом SARS-CoV-2 штамма hCoV- 19/Russia/Moscow_PMVL- 1 /2020.
Таким образом, можно сделать вывод, что разработанноесредство на основе рекомбинантного антитела GamP2C5 (компонент 1) и гуманизированного моноклонального антитела GamXRH19 (компонент 2) может быть использовано для терапии и экстренной профилактики заболевания, вызванного вирусом SARS-CoV-2 различных вариантов и штаммов.
Промышленная применимость
Все приведенные примеры подтверждают эффективность созданногопрепарата на основе рекомбинатного антитела GamP2C5 (компонент 1) и гуманизированного моноклонального антитела GamXRH19 (компонент 2) для терапии и экстренной профилактики заболевания, вызванного вирусом SARS-CoV-2, в том числе вариантов, вызывающих опасения Alpha, Beta, Gamma nDelta, и его промышленную применимость.

Claims

Формула изобретения
1. Средство для терапии и экстренной профилактики заболеваний, вызываемых вирусом SARS-CoV-2, содержащее рекомбинантное антитело, имеющее CDR1, представленный аминокислотной последовательностью SEQ ID N0:1, CDR2, представленный аминокислотной последовательностью SEQ ID N0:2, CDR3, представленный аминокислотной последовательностью SEQ ID N0:3, а также Fc- фрагмент человеческого IgGl, и гуманизированное моноклональное антитело, имеющее CDR1 лёгкой цепи, представленный последовательностью SEQ ID N0:4, CDR2 лёгкой цепи, представленный последовательностью SEQ ID N0:5, CDR3 лёгкой цепи, представленный последовательностью SEQ ID N0:6, CDR1 тяжёлой цепи, представленный последовательностью SEQ ID N0:7, CDR2 тяжёлой цепи, представленный последовательностью SEQ ID N0:8, CDR3 тяжёлой цепи, представленный последовательностью SEQ ID N0:9.
2. Средство для терапии и экстренной профилактики заболеваний, вызываемых вирусом SARS-CoV-2 по п.1, где рекомбинантное антитело имеет аминокислотную последовательность SEQ ID N0:10.
3. Средство для терапии и экстренной профилактики заболеваний, вызываемых вирусом SARS-CoV-2 по п.1, где гуманизированное моноклональное антитело имеет последовательность тяжелой цепи SEQ ID N0:11 и последовательность легкой цепи SEQ ID N0:12.
4. Средство для терапии и экстренной профилактики заболеваний, вызываемых вирусом SARS-CoV-2 по п.1, где рекомбинантное антитело имеет последовательность SEQ ID N0: 10 и гуманизированное моноклональное антитело имеет последовательность тяжелой цепи SEQ ID N0:11 и последовательность легкой цепи SEQ ID N0:12.
5. Способ терапии и экстренной профилактики заболеваний, вызываемых вирусом SARS-CoV-2, заключающийся в системном введении эффективного количества средства по п.1-4.
33
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26)
PCT/RU2022/000135 2021-12-22 2022-04-22 Средство и способ терапии заболеваний, вызываемых вирусом sars-cov-2 WO2023121506A1 (ru)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2021138330 2021-12-22
RU2021138330A RU2769223C1 (ru) 2021-12-22 2021-12-22 Средство и способ терапии и экстренной профилактики заболеваний, вызываемых вирусом SARS-CoV-2 на основе рекомбинантного антитела и гуманизированного моноклонального антитела

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2023121506A1 true WO2023121506A1 (ru) 2023-06-29

Family

ID=81076118

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/RU2022/000135 WO2023121506A1 (ru) 2021-12-22 2022-04-22 Средство и способ терапии заболеваний, вызываемых вирусом sars-cov-2

Country Status (2)

Country Link
RU (1) RU2769223C1 (ru)
WO (1) WO2023121506A1 (ru)

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2744274C1 (ru) * 2020-11-20 2021-03-04 Федеральное государственное бюджетное учреждение науки институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук (ИБХ РАН) Моноклональное антитело к RBD фрагменту в составе S белка вируса SARS-CoV-2
WO2021183456A1 (en) * 2020-03-08 2021-09-16 Humanigen, Inc. Methods for treating coronavirus infection and resulting inflammation-induced lung injury
WO2021203034A2 (en) * 2020-04-03 2021-10-07 Firebreak, Inc. Alimentary and systemic antiviral therapeutics
WO2021207948A1 (en) * 2020-04-14 2021-10-21 Tsb Therapeutics (Beijing) Co., Ltd. Anti-sars-cov-2 antibodies and uses thereof

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2021183456A1 (en) * 2020-03-08 2021-09-16 Humanigen, Inc. Methods for treating coronavirus infection and resulting inflammation-induced lung injury
WO2021203034A2 (en) * 2020-04-03 2021-10-07 Firebreak, Inc. Alimentary and systemic antiviral therapeutics
WO2021207948A1 (en) * 2020-04-14 2021-10-21 Tsb Therapeutics (Beijing) Co., Ltd. Anti-sars-cov-2 antibodies and uses thereof
RU2744274C1 (ru) * 2020-11-20 2021-03-04 Федеральное государственное бюджетное учреждение науки институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук (ИБХ РАН) Моноклональное антитело к RBD фрагменту в составе S белка вируса SARS-CoV-2

Also Published As

Publication number Publication date
RU2769223C1 (ru) 2022-03-29

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN108026166B (zh) 多瘤病毒中和抗体
Hansson et al. An in vitro selected binding protein (affibody) shows conformation-dependent recognition of the respiratory syncytial virus (RSV) G protein
US8298545B2 (en) Anti-autoimmune antibodies for treatment of pemphigus
EA027069B1 (ru) Моноклональные антитела, способные взаимодействовать с множеством подтипов вируса гриппа а
RU2744274C1 (ru) Моноклональное антитело к RBD фрагменту в составе S белка вируса SARS-CoV-2
BRPI0914012B1 (pt) Composição farmacêutica e uso da composição farmacêutica
RU2763001C1 (ru) Однодоменное антитело и его модификации, специфически связывающиеся с RBD S белка вируса SARS-CoV-2, и способ их применения для терапии и экстренной профилактики заболеваний, вызываемых вирусом SARS-CoV-2
CN110317267B (zh) 针对狂犬病病毒的双特异性抗体及其用途
WO2016173558A1 (zh) 抗诺如病毒gii.4型鼠源单克隆抗体的制备和应用
CN111606993B (zh) 抗呼吸道合胞病毒的全人广谱中和抗体4f1及其应用
CN117247944A (zh) 抗前-s1 hbv抗体
Bar-Peled et al. A potent neutralizing site III-specific human antibody neutralizes human metapneumovirus in vivo
CN110114370B (zh) 能够与人白细胞介素-6受体结合的抗体或其抗原结合片段
CN113817052A (zh) 抗SARS-CoV-2核衣壳蛋白单克隆抗体及其制备方法和用途
CN111153988A (zh) 广谱抗肠道病毒d68型的中和性单克隆抗体
JP2014526886A (ja) マクロファージ遊走阻止因子（ｍｉｆ）とｄ−ドーパクロームトートメラーゼ（ｄ−ｄｔ）に交差反応性がある抗体
CN114805579B (zh) 一种抗人ace2蛋白单克隆抗体、核酸分子及应用
CN113698487B (zh) 抗人ace2单克隆抗体及其应用
Pavan et al. Nanobodies against SARS-CoV-2 reduced virus load in the brain of challenged mice and neutralized Wuhan, Delta and Omicron Variants
RU2769223C1 (ru) Средство и способ терапии и экстренной профилактики заболеваний, вызываемых вирусом SARS-CoV-2 на основе рекомбинантного антитела и гуманизированного моноклонального антитела
RU2765731C1 (ru) Гуманизированное моноклональное антитело, специфически связывающиеся с RBD S белка вируса SARS-CoV-2, средство и способ для терапии и экстренной профилактики заболеваний, вызываемых вирусом SARS-CoV-2
CN114805570B (zh) 一种抗人ace2单克隆抗体及其应用
Zhou et al. Recombinant antibody Fab against the hypervariable region 1 of hepatitis C virus blocks the virus adsorption to susceptible cells in vitro
US9090675B2 (en) Monoclonal antibodies directed against the human immunodeficiency virus type 1 (hiv-1) P17 matrix (ma) protein
Marghani COVID-19 immunotherapy: novel humanized 47D11 monoclonal antibody

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 22912081

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1