JP7392200B2 - グリコシル化ｃｅａｃａｍ５に特異的に結合した抗体 - Google Patents

グリコシル化ｃｅａｃａｍ５に特異的に結合した抗体 Download PDF

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Description

本発明は、モノクローナル抗体に関する。より具体的には、本願は、グリコシル化ＣＥＡＣＡＭ５に特異的に結合するモノクローナル抗体、そのヒト化抗体の調製、およびその使用に関する。
中国では、結腸直腸癌、胃癌、および食道癌を含む胃腸関連腫瘍が一般的であり、これらの腫瘍の新規の症例数は、毎年５２０，０００、４６０，０００、および３１０，０００件である（ＷＨＯ，２０１８）。したがって、胃腸関連腫瘍は、肺癌を上回り、中国で最も一般的な癌になった。現在、胃腸腫瘍の治療方法としては主に、外科手術、化学療法、標的治療および免疫療法が挙げられる。一般的に用いられる化学療法薬としては、ドセタキセル、５－フルオロウラシル、マイトマイシンＣ、白金剤などが挙げられ、標的治療薬としては、ＶＥＧＦＲモノクローナル抗体、Ｈｅｒ２モノクローナル抗体などが挙げられ、免疫療法では主にＰＤ１／ＰＤＬ１抗体などが挙げられる。
ヒトがん胎児性抗原細胞接着因子（ＣＥＡＣＡＭ）ファミリーは、１９６０年代に発見された。ＣＥＡファミリーは、結腸直腸癌、膵癌、肺癌、胃癌、肝細胞癌、乳癌などの多様な胃腸および肺癌腫瘍に高度に発現する。ＣＥＡＣＡＭファミリーは、ＣＥＡＣＡＭサブグループおよびＰＳＧファミリーからなり、細胞外領域に連続する、非常に類似する構造を形成し、高度にグリコシル化された（グリコシル化部分は分子量の５０％を占める）ＩｇＶドメインによって特徴づけられ、ＣＥＡファミリーの細胞外領域は、連続するＡ１－Ｂ１－Ａ２－Ｂ２－Ａ３－Ｂ３構造（Ａ１－３またはＢ１－３は、非常に相同的な構造である）からなり、一般的なＣＥＡ分子は、ＣＥＡＣＡＭ５（ＣＤ６６ｅ）であり、グリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）により細胞膜に結合し、ＧＰＩの酵素分解（例えば、ホスホリパーゼＣ）により血中に放出されることができ、ＣＥＡＣＡＭ５分子は、細胞接着（ＣＥＡＣＡＭ６などの、ＣＥＡファミリーホモ―またはヘテロ二量体を介する）、細胞内シグナル伝達、腫瘍転移および薬剤耐性の発生に関与し、同時に、ＣＥＡＣＡＭ５は、大腸菌の消化管への接着に関係する。
ＣＥＡＣＡＭ５は、高度にグリコシル化されたタンパク質なので、組換えで発現したＣＥＡＣＡＭ５（例えば、２９３システム）抗原は、腫瘍細胞自身が発現したＣＥＡＣＡＭ５とは異なるグリコシル化を有することができるので、当該技術分野では、ＣＥＡＣＡＭ５の自然抗原を認識することができる抗体が必要とされる。さらに、ＣＥＡＣＡＭ５は、消化管などの正常組織に少量発現し、消化管の頂端膜側に位置しており、腫瘍細胞においては、ＣＥＡＣＡＭ５は、頂端膜側および基底膜側に発現し、ＣＥＡＣＡＭ５抗体薬が腫瘍部位に到達するのは難しい。したがって、当該技術分野においてＣＥＡＣＡＭ５抗体薬の局所濃度を高める問題に取り組むことが必要とされる。
本発明の内容
本発明の一つの態様は、グリコシル化ＣＥＡＣＡＭ５に対するモノクローナル抗体またはその抗原結合断片、ならびにグリコシル化ＣＥＡＣＡＭ５のドメインＡ１－Ｂ１、Ａ２－Ｂ２、および／もしくはＡ３－Ｂ３に特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片を提供する。
特定の実施形態において、本発明のモノクローナル抗体は、重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含んでなり、
ａ．この重鎖可変領域は、配列番号１に記載されるＣＤＲ－Ｈ１、配列番号２に記載されるＣＤＲ－Ｈ２および配列番号３に記載されるＣＤＲ－Ｈ３を含んでなり、一方この軽鎖可変領域は、配列番号４に記載されるＣＤＲ－Ｌ１、配列番号５に記載されるＣＤＲ－Ｌ２および配列番号６に記載されるＣＤＲ－Ｌ３を含んでなる、
ｂ．この重鎖可変領域は、配列番号７に記載されるＣＤＲ－Ｈ１、配列番号８に記載されるＣＤＲ－Ｈ２および配列番号９に記載されるＣＤＲ－Ｈ３を含んでなり、一方この軽鎖可変領域は、配列番号１０に記載されるＣＤＲ－Ｌ１、配列番号１１に記載されるＣＤＲ－Ｌ２および配列番号１２に記載されるＣＤＲ－Ｌ３を含んでなる、
ｃ．この重鎖可変領域は、配列番号１３に記載されるＣＤＲ－Ｈ１、配列番号１４に記載されるＣＤＲ－Ｈ２および配列番号１５に記載されるＣＤＲ－Ｈ３を含んでなり、一方この軽鎖可変領域は、配列番号１６に記載されるＣＤＲ－Ｌ１、配列番号１７に記載されるＣＤＲ－Ｌ２および配列番号１８に記載されるＣＤＲ－Ｌ３を含んでなる、または
ｄ．この重鎖可変領域は、配列番号１９に記載されるＣＤＲ－Ｈ１、配列番号２０に記載されるＣＤＲ－Ｈ２および配列番号２１に記載されるＣＤＲ－Ｈ３を含んでなり、一方この軽鎖可変領域は、配列番号２２に記載されるＣＤＲ－Ｌ１、配列番号２３に記載されるＣＤＲ－Ｌ２および配列番号２４に記載されるＣＤＲ－Ｌ３を含んでなる。
特定の実施形態において、本発明のモノクローナル抗体は、重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含んでなり、
ａ）この重鎖可変領域は、配列番号２５に記載されるポリペプチドを含んでなり、一方この軽鎖可変領域は、配列番号２６に記載されるポリペプチドを含んでなる、
ｂ）この重鎖可変領域は、配列番号２７に記載されるポリペプチドを含んでなり、一方この軽鎖可変領域は、配列番号２８に記載されるポリペプチドを含んでなる、
ｃ）この重鎖可変領域は、配列番号２９に記載されるポリペプチドを含んでなり、一方この軽鎖可変領域は、配列番号３０に記載されるポリペプチドを含んでなる、または
ｄ）この重鎖可変領域は、配列番号３１に記載されるポリペプチドを含んでなり、一方この軽鎖可変領域は、配列番号３２に記載されるポリペプチドを含んでなる。
１つの態様において、本発明は、グリコシル化ＣＥＡＣＡＭ５に特異的に結合するヒト化抗体またはその抗原結合断片を提供し、この抗体は、軽鎖可変領域および重鎖可変領域を含んでなり、
この軽鎖可変領域は、
配列番号８４、配列番号９０、配列番号９６、配列番号１０２、配列番号１０８、配列番号１１４、配列番号１２０および配列番号１２６からなる群から選択されるＣＤＲ－Ｌ１、
配列番号８５、配列番号９１、配列番号９７、配列番号１０３、配列番号１０９、配列番号１１５、配列番号１２１および配列番号１２７からなる群から選択されるＣＤＲ－Ｌ２、ならびに
列番号８６、配列番号９２、配列番号９８、配列番号１０４、配列番号１１０、配列番号１１６、配列番号１２２および配列番号１２８からなる群から選択されるＣＤＲ－Ｌ３を含んでなり、
この重鎖可変領域は、
配列番号８７、配列番号９３、配列番号９９、配列番号１０５、配列番号１１１、配列番号１１７、配列番号１２３および配列番号１２９からなる群から選択されるＣＤＲ－Ｈ１、
配列番号８８、配列番号９４、配列番号１００、配列番号１０６、配列番号１１２、配列番号１１８、配列番号１２４および配列番号１３０からなる群から選択されるＣＤＲ－Ｈ２、ならびに
配列番号８９、配列番号９５、配列番号１０１、配列番号１０７、配列番号１１３、配列番号１１９、配列番号１２５および配列番号１３１からなる群から選択されるＣＤＲ－Ｈ３を含んでなる。
特定の実施形態において、本発明のヒト化抗体において、この軽鎖可変領域は、配列番号６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含んでなり、この重鎖可変領域は、配列番号６９、７１、７３、７５、７７、７９、８１、８３から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含んでなる。
好ましい技術的解決法においては、本発明のヒト化抗体は、配列番号５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６から選択されるヌクレオチド配列によってコードされる軽鎖可変領域、および配列番号５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７から選択されるヌクレオチド配列によってコードされる重鎖可変領域を含んでなる。
好ましい技術的解決法においては、本発明のヒト化抗体は、配列番号６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２から選択される軽鎖可変領域および配列番号６９、７１、７３、７５、７７、７９、８１、８３から選択される重鎖可変領域を含んでなる。
好ましい技術的解決法においては、本発明のヒト化抗体は、軽鎖可変領域および重鎖可変領域を含んでなり、
ａ．この軽鎖可変領域は、配列番号８４に記載されるＣＤＲ－Ｌ１、配列番号８５に記載されるＣＤＲ－Ｌ２および配列番号８６に記載されるＣＤＲ－Ｌ３を含んでなり、一方この重鎖可変領域は、配列番号８７に記載されるＣＤＲ－Ｈ１、配列番号８８に記載されるＣＤＲ－Ｈ２および配列番号８９に記載されるＣＤＲ－Ｈ３を含んでなる、
ｂ．この軽鎖可変領域は、配列番号９０に記載されるＣＤＲ－Ｌ１、配列番号９１に記載されるＣＤＲ－Ｌ２および配列番号９２に記載されるＣＤＲ－Ｌ３を含んでなり、一方この重鎖可変領域は、配列番号９３に記載されるＣＤＲ－Ｈ１、配列番号９４に記載されるＣＤＲ－Ｈ２および配列番号９５に記載されるＣＤＲ－Ｈ３を含んでなる、
ｃ．この軽鎖可変領域は、配列番号９６に記載されるＣＤＲ－Ｌ１、配列番号９７に記載されるＣＤＲ－Ｌ２および配列番号９８に記載されるＣＤＲ－Ｌ３を含んでなり、一方この重鎖可変領域は、配列番号９９に記載されるＣＤＲ－Ｈ１、配列番号１００に記載されるＣＤＲ－Ｈ２および配列番号１０１に記載されるＣＤＲ－Ｈ３を含んでなる、
ｄ．この軽鎖可変領域は、配列番号１０２に記載されるＣＤＲ－Ｌ１、配列番号１０３に記載されるＣＤＲ－Ｌ２および配列番号１０４に記載されるＣＤＲ－Ｌ３を含んでなり、一方この重鎖可変領域は、配列番号１０５に記載されるＣＤＲ－Ｈ１、配列番号１０６に記載されるＣＤＲ－Ｈ２および配列番号１０７に記載されるＣＤＲ－Ｈ３を含んでなる、
ｅ．この軽鎖可変領域は、配列番号１０８に記載されるＣＤＲ－Ｌ１、配列番号１０９に記載されるＣＤＲ－Ｌ２および配列番号１１０に記載されるＣＤＲ－Ｌ３を含んでなり、一方この重鎖可変領域は、配列番号１１１に記載されるＣＤＲ－Ｈ１、配列番号１１２に記載されるＣＤＲ－Ｈ２および配列番号１１３に記載されるＣＤＲ－Ｈ３を含んでなる、
ｆ．この軽鎖可変領域は、配列番号１１４に記載されるＣＤＲ－Ｌ１、配列番号１１５に記載されるＣＤＲ－Ｌ２および配列番号１１６に記載されるＣＤＲ－Ｌ３を含んでなり、一方この重鎖可変領域は、配列番号１１７に記載されるＣＤＲ－Ｈ１、配列番号１１８に記載されるＣＤＲ－Ｈ２および配列番号１１９に記載されるＣＤＲ－Ｈ３を含んでなる、
ｇ．この軽鎖可変領域は、配列番号１２０に記載されるＣＤＲ－Ｌ１、配列番号１２１に記載されるＣＤＲ－Ｌ２および配列番号１２２に記載されるＣＤＲ－Ｌ３を含んでなり、一方この重鎖可変領域は、配列番号１２３に記載されるＣＤＲ－Ｈ１、配列番号１２４に記載されるＣＤＲ－Ｈ２および配列番号１２５に記載されるＣＤＲ－Ｈ３を含んでなる、または
ｈ．この軽鎖可変領域は、配列番号１２６に記載されるＣＤＲ－Ｌ１、配列番号１２７に記載されるＣＤＲ－Ｌ２および配列番号１２８に記載されるＣＤＲ－Ｌ３を含んでなり、一方この重鎖可変領域は、配列番号１２９に記載されるＣＤＲ－Ｈ１、配列番号１３０に記載されるＣＤＲ－Ｈ２および配列番号１３１に記載されるＣＤＲ－Ｈ３を含んでなる。
別の態様において、本発明は、グリコシル化ＣＥＡＣＡＭ５と特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片をコードするヌクレオチド配列を含んでなる単離された核酸分子を提供する。
別の態様において、本発明は、本明細書に開示されるグリコシル化ＣＥＡＣＡＭ５と特異的に結合する抗体をコードする核酸分子を含んでなる発現ベクターに関する。
別の態様において、本発明は、本明細書に開示される発現ベクターを含んでなる宿主細胞に関する。
別の態様において、本発明は、本明細書に開示されるグリコシル化ＣＥＡＣＡＭ５と特異的に結合する少なくとも１つの抗体および薬学的に許容される担体を含んでなる医薬組成物に関する。
別の態様において、本発明は、グリコシル化ＣＥＡＣＡＭ５と特異的に結合する抗体の調製方法であって、この方法は、宿主細胞に、グリコシル化ＣＥＡＣＡＭ５と特異的に結合する本明細書に開示される抗体をコードする核酸配列を発現すること、およびグリコシル化ＣＥＡＣＡＭ５と特異的に結合するこの抗体をこの宿主細胞から分離することを含んでなる。
別の態様において、本発明は、胃腸管関連腫瘍を治療するための医薬品の製造における本発明の抗体の使用を提供する。
別の態様において、本発明は、胃腸管関連腫瘍の治療を必要とする対象に本発明の抗体を投与することを含んでなる、胃腸管関連腫瘍の治療方法を提供する。
モノクローナル抗体の調製およびスクリーニング
モノクローナル抗体を以下のように調製することができる。第１に、マウスまたは他の適した宿主動物を免疫原で（必要に応じてアジュバントを加えて）免疫化する。免疫原またはアジュバントは通常、皮下多点注射または腹腔内注射により注射される。宿主中の抗原の免疫原性を増強するために、免疫原を、血清アルブミンまたは大豆トリプシンインヒビターなどの特定の既知のタンパク質と予め結合することができる。アジュバントは、フロイントアジュバントまたはＭＰＬ－ＴＤＭ等であってよい。動物を免疫化した後、免疫原に特異的に結合する抗体を分泌するリンパ球が体内で作成される。さらに、インビトロ免疫化によりリンパ球を得ることもできる。標的リンパ球を集め、ＰＥＧなどの適した融合剤を用いて骨髄腫細胞と融合してハイブリドーマ細胞を得る（Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp.59-103, Academic Press, 1996）．。好ましい骨髄腫細胞は、高い融合率、安定した抗体分泌能力、およびＨＡＴ培地に対する感受性を有するべきである。特異抗原に対するモノクローナル抗体を生成したかを検出するためにハイブリドーマ細胞を生育させるための培地を用いる。ハイブリドーマ細胞によって産生されたモノクローナル抗体の結合特異性を検出するための方法としては、例えば免疫沈降またはラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）などのインビトロ結合アッセイが挙げられる。例えば、モノクローナル抗体の親和性は、Munson et al., Anal. Biochem. 107:220 (1980)によって記載されるスキャッチャードアッセイを用いて決定することができる。ハイブリドーマによって産生された抗体の特異性、親和性および反応性を決定した後、標的細胞株にGoding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp. 59-103, Academic Press, 1996によって記載される標準的な限界希釈アッセイによるサブクローニングをかけることができる。適した培地は、ＤＭＥＭまたはＲＰＭＩ－１６４０等であってよい。さらに、ハイブリドーマ細胞を動物の腹水腫瘍の形態で増殖させることもできる。サブクローニング細胞によって分泌されたモノクローナル抗体を、プロテインＡアガロースゲル、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、またはアフィニティークロマトグラフィーなどの伝統的な免疫グロブリン精製方法を用いて、培地、腹水、または血清から単離することができる。
また、モノクローナル抗体は、遺伝子操作および遺伝的組換え技術により取得することもできる。モノクローナル抗体の重鎖および軽鎖遺伝子と特異的に結合する核酸プライマーを用いてＰＣＲ増幅を実行することにより、モノクローナル抗体の重鎖および軽鎖遺伝子をコードするＤＮＡ分子をハイブリドーマ細胞から単離することができる。生じるＤＮＡ分子を発現ベクターに挿入し、宿主細胞（例えば、免疫グロブリンを産生しない大腸菌、ＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞、または他の骨髄腫細胞）に遺伝子導入し、適切な条件下で培養して、組換えで発現した関心のある抗体を取得する。
本発明においては、ＣＥＡＣＡＭ５の自然抗原を認識する抗体を取得する目的でマウスを免疫化するために、ＣＥＡＣＡＭ５高発現の腫瘍細胞株（例えば、Ｌｏｖｏ）を用いる。
ＣＲＩＳＰＲ技術を通して、ＣＥＡＣＡＭ５特異抗体を効率的にスクリーニングする目的で標的ゲノムを切断し、遺伝子発現を効率的にノックアウトし、そしてＣＥＡＣＡＭ５ノックアウト細胞株を作成するためにｓｇＲＮＡガイドＣａｓ９を用いる。本発明によりスクリーニングし、取得した抗体は、ＣＥＡＣＡＭ５の３個の構造ドメイン（Ａ１－Ｂ１、Ａ２－Ｂ２、Ａ３－Ｂ３）に同時に結合し、その結果抗体はＣＥＡＣＡＭ５高発現の腫瘍細胞の表面結合量を増やすことができ、これにより抗体の局所濃度および薬効が高まる。
ヒト化抗体
スクリーニングしたマウス抗体のヒト化デザインおよびスクリーニングは、臨床応用におけるＨＡＭＡ（ヒト抗マウス抗体）効果を低減することができ、これにより患者が中和抗体を産生するのを低減し、薬物の血中濃度を上昇させて効果を高める。
「ヒト化抗体」は、ヒト化ＶＨドメインおよびヒト化ＶＬドメインの一方または両方を含んでなる抗体である。１つまたは複数の免疫グロブリンの定常領域は、存在する必要はないが、存在する場合、定常領域は完全にまたは実質的にヒト免疫グロブリン定常領域に由来する。
ヒト化抗体は、非ヒト「ドナー」抗体由来のＣＤＲがヒト「レシピエント」抗体配列に移植された遺伝子操作された抗体である（例えば、Queen, US 5,530,101 and 5,585,089; Winter, US 5,225,539; Carter, US 6,407,213; Adair, US 5,859,205; and Foote, US 6,881,557を参照する）。レシピエント抗体配列は、例えば、成熟ヒト抗体配列、このような配列の複合体、ヒト抗体配列の共通配列または生殖系列配列であってよい。可変領域フレームワークが、レシピエントおよびドナーＣＤＲの間の典型的なパターンならびに他の基準と一致するようにドナー配列に対する高度の配列同一性を有するように、ヒトレシピエント配列を選択することができる。したがって、ヒト化抗体とは、ＣＤＲが完全にまたは実質的にドナー抗体および可変領域フレームワーク配列に由来し、定常領域（存在する場合）が完全にまたは実質的にヒト抗体配列に由来する抗体である。同様に、ヒト化重鎖は典型的には、実質的にドナー抗体重鎖および重鎖可変領域フレームワーク配列に由来する３個全てのＣＤＲ、および実質的にヒト重鎖可変領域フレームワークおよび定常領域配列に由来する重鎖定常領域（存在する場合）を有する。同様に、ヒト化軽鎖は典型的には、完全にまたは実質的にドナー抗体軽鎖および軽鎖可変領域フレームワーク配列に由来する３個全てのＣＤＲ、および実質的にヒト軽鎖可変領域フレームワークおよび定常領域配列に由来する軽鎖定常領域（存在する場合）を有する。それぞれのＣＤＲの間で、対応する残基（Ｋａｂａｔ番号付けシステムにより定義される）の少なくとも約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％が同一である、または対応する残基（Ｋａｂａｔ番号付けシステムにより定義される）の約１００％が同一である場合、ヒト化抗体のＣＤＲは、実質的に非ヒト抗体の対応するＣＤＲに由来する。対応する残基（可変領域は、Ｋａｂａｔ番号付けシステムにより定義され、定常領域は、ＥＵ番号付けシステムにより定義される）の少なくとも約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％が同一である、または対応する残基（可変領域は、Ｋａｂａｔ番号付けシステムにより定義され、定常領域は、ＥＵ番号付けシステムにより定義される）の約１００％が同一である場合、抗体鎖の可変領域フレームワーク配列または抗体鎖の定常領域はそれぞれ、実質的にヒト可変領域フレームワーク配列またはヒト定常領域に由来する。
ヒト化抗体は、マウス抗体由来の６個全てのＣＤＲ（好ましくはＫａｂａｔまたはＩＭＧＴにより定義される）を組み込むことが多いが、ヒト化抗体はまた、マウス抗体由来の６個全てより少ないＣＤＲ（例えば、少なくとも３、４または５個のＣＤＲ）からなってもよい（例えば、 Pascalis et al., J. Immunol. 169:3076, 2002; Vajdos et al., Journal of Molecular Biology, 320:415-428, 2002; Iwahashi et al., Mol. Immunol.36 :1079-1091, 1999; Tamura et al., Journal of Immunology, 164:1432-1441, 2000）。
それぞれのＣＤＲの間で対応する残基（ＫａｂａｔまたはＩＭＧＴにより定義される）の少なくとも６０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または１００％が同一である場合、ヒト化抗体のＣＤＲは、非ヒト抗体の対応するＣＤＲに「実質的に由来する」。ＣＤＲが非ヒト免疫グロブリンのヒト化ＶＨまたはＶＬドメインに実質的に由来する特異的変化においては、ヒト化ＶＨまたはＶＬドメインのＣＤＲは、対応する非ヒトＶＨまたはＶＬ ＣＤＲに関して３個全てのＣＤＲにおよび、６個以下の（例えば、５個以下、４個以下、３個以下、２個以下、または１個以下）のアミノ酸置換（好ましくは保存的置換）を有する。対応する残基（可変領域は、Ｋａｂａｔ番号付けシステムにより定義され、定常領域は、ＥＵ番号付けシステムにより定義される）の少なくとも約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％が同一である、または対応する残基（可変領域は、Ｋａｂａｔ番号付けシステムにより定義され、定常領域は、ＥＵ番号付けシステムにより定義される）の約１００％が同一である場合、抗体ＶＨまたはＶＬドメインの可変領域フレームワーク配列または免疫グロブリン定常領域配列（存在する場合）はそれぞれ、ヒトＶＨまたはＶＬフレームワーク配列またはヒト定常領域に「実質的に由来する」。したがって、ヒト化抗体の全ての部分（ＣＤＲ以外）は通常、ヒト自然免疫グロブリン配列の対応する部分に完全にまたは実質的に由来する。
一般的用語の定義
本発明において、特に指定されない限り、本明細書において用いられる科学的および技術的用語は、当業者によって一般的に理解される意味を有する。さらに、本明細書において用いられる細胞培養、分子遺伝学、核酸化学、および免疫学の実験操作工程は、全て対応する分野で広く用いられるルーチン工程である。一方で、本発明をより良く理解するために、関連する用語の定義および説明を以下に提供する。
本明細書で使用される場合、「抗体」という用語は、通常２対のポリペプチド鎖（各対は軽鎖および重鎖を有する）からなる、免疫グロブリン分子を指す。抗体の軽鎖は、κおよびλ軽鎖と分類することができる。重鎖は、μ、δ、γ、α、またはεと分類することができ、抗体アイソタイプはそれぞれ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、およびＩｇＥと定義される。軽鎖および重鎖内部では、可変および定常領域が約１２個以上のアミノ酸の「Ｊ」領域により結合される一方、重鎖も約３個以上のアミノ酸の「Ｄ」領域を含んでなる。各重鎖は、重鎖可変領域（ＶＨ）および重鎖定常領域（ＣＨ）からなる。重鎖定常領域は、３ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３）からなる。各軽鎖は、軽鎖可変領域（ＶＬ）および軽鎖定常領域（ＣＬ）からなる。軽鎖定常領域は、１つのドメイン、ＣＬからなる。抗体の定常領域は、免疫グロブリンの、宿主組織または種々の免疫系細胞（例えば、エフェクター細胞）および古典補体系の第１成分（Ｃｌｑ）を含む、因子への結合を媒介することができる。ＶＨおよびＶＬ領域は、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる保存性の高い領域で散在された相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる可変性が高い領域に細分することもできる。各ＶＨおよびＶＬは、アミノ末端からカルボキシ末端に、以下の順序：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４で配置された、３個のＣＤＲおよび４個のＦＲからなる。各重鎖／軽鎖対の可変領域（ＶＨおよびＶＬ）はそれぞれ、抗体結合部位を形成する。アミノ酸の領域またはドメインへの割当は、Kabat Sequences of Proteins of Immunological Interest の定義に従う（National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1987 and 1991)), or Chothia & Lesk (1987) J. Mol. Biol. 196: 901-917; Chothia et al. (1989) Nature 342:878-883。「抗体」という用語は、抗体を作成するためのいかなる特定の方法も限定しない。例えば、抗体は、組換え抗体、モノクローナル抗体およびポリクローナル抗体を含む。抗体は、例えば、ＩｇＧ（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４サブタイプ）、ＩｇＡｌ、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、ＩｇＥまたはＩｇＭ抗体などの異なるアイソタイプのものであってよい。
本明細書において、「抗体」という用語が指す場合、文脈上別段の意味を有することが明らかな場合を除き、用語は、抗体全体だけではなく、抗体の抗原結合断片も含む。本明細書で使用される場合、抗体の「抗原結合断片」という用語は、全長抗体の断片を含んでなるポリペプチドを指し、このポリペプチドは、全長抗体が結合する同一の抗原に特異的に結合する能力を保持する、および／または抗原に対する特異的な結合を全長抗体と競合する能力を保持し、この用語はまた、「抗原結合部分」とも呼ばれる。一般的にFundamentalImmunology, Ch. 7 (Paul, W., ed., 2nd ed., Raven Press, N.Y. (1989)を参照し、この文献は全ての目的のためにその全体を本明細書に参照により援用される。抗体の抗原結合断片は、組換えＤＮＡ技術により、またはインタクトな抗体の酵素的または化学的分解により取得することができる。いくつかの場合において、抗原結合断片は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ、Ｆｖ、ｄＡｂ、および相補性決定領域（ＣＤＲ）断片、単鎖抗体（例えば、ｓｃＦｖ）、キメラ抗体、二重特異性抗体、およびこのポリペプチドに特異的抗原結合能力を与えるのに充分な抗体の少なくとも一部を含むポリペプチドを含む。
抗体の抗原結合断片（例えば、上述した抗体断片）を、所定の抗体から当業者に既知の従来技術（例えば、組換えＤＮＡ技術または酵素的若しくは化学的断片化方法など）を用いて取得することができ、インタクトな抗体と同一の方式で抗体の抗原結合断片の特異性をスクリーニングするために用いることができる。
本明細書で使用される場合、「ｍＡｂ」および「モノクローナル抗体」という用語は、高度に同種の抗体分子の集団、すなわち自然に起こってよい自然突然変異を除く同一抗体のグループに由来する抗体または抗体の断片を指す。ｍＡｂｓは、抗原上の単一のエピトープに対して高度に特異的である。モノクローナル抗体と比較すると、ポリクローナル抗体は通常、少なくとも２個以上の異なる抗体を含有し、これらの異なる抗体は通常、抗原上の異なるエピトープを認識する。モノクローナル抗体は通常、Kohler et al. (Nature, 256:495, 1975)により初めて報告されたハイブリドーマ技術により取得することができるが、組換えＤＮＡ技術（例えば、U.S.P. 4,816,567を参照する）により取得することもできる。
例えば、モノクローナル抗体を以下のように調製することができる。マウスまたは他の適した宿主動物を初めに免疫原での注射方法で免疫化する（必要に応じてアジュバントと共に加える）。免疫原またはアジュバントは通常、多点で皮下にまたは腹腔内に注射される。宿主内での抗原の免疫原性を高めるために、免疫原を、血清アルブミンまたは大豆トリプシンインヒビターなどの特定の既知のタンパク質と予め結合することができる。アジュバントは、フロイントアジュバントまたはＭＰＬ－ＴＤＭなどであってよい。動物を免疫化した後、免疫原に特異的に結合する抗体を分泌するリンパ球が、生体内で作成される。さらに、リンパ球を、インビトロ免疫化により取得することもできる。関心のあるリンパ球を集め、ＰＥＧなどの適した融合剤を用いて骨髄腫細胞と融合してハイブリドーマ細胞を取得する（Goding, Monoclonal Antibodies:Principles and Practice, pp. 59-103, Academic Press, 1996）。上で調製したハイブリドーマ細胞を播種して適した培地で増殖させることができ、この培地は好ましくは、未融合の、親の骨髄腫細胞の増殖を抑制することができる１つまたは複数の物質を含有する。例えば、親の骨髄腫細胞はヒポキサンチングアニンホスホトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴまたはＨＰＲＴ）を欠いているので、培地にヒポキサンチン、アミノプテリン、およびチミンなどの物質を加えると（ＨＡＴ培地）、ＨＧＰＲＴ欠損細胞の増殖を抑制することになる。好ましい骨髄腫細胞は、高い融合率、安定した抗体分泌能力、およびＨＡＴ培地に対する感受性という特性を有するべきである。これらのなかでも、骨髄腫細胞としての第１の選択肢は、ＭＯＰ－２１またはＭＣ－１１マウス腫瘍由来株（THE Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, Calif. USA）、およびＳＰ－２／０またはＸ６３－Ａｇ８－６５３細胞株（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ， Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ， Ｍｄ． ＵＳＡ）などのマウス骨髄腫である。さらに、研究報告書もあり、この報告書では、ヒトモノクローナル抗体を調製するためにヒト骨髄腫およびヒトマウスヘテロ骨髄腫（ｈｅｔｅｒｏｍｙｅｌｏｍａ）細胞株を使用する（Kozbor, J. Immunol., 133:3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp 51-63, Marcel Dekker, Inc., New York, 1987）。特異抗原に対するモノクローナル抗体の産生を検出するためにハイブリドーマ細胞を増殖するための培地を用いる。ハイブリドーマ細胞が産生したモノクローナル抗体の結合特異性を検出するための方法としては、例えば、免疫沈降またはラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）などのインビトロ結合アッセイが挙げられる。例えば、ｍＡｂの親和性を、Munson et al., Anal. Biochem. 107:220 (1980)に記載されるスキャッチャードアッセイを用いて検出することができる。ハイブリドーマが産生した抗体の特異性、親和性および反応性を決定した後、標的細胞株に、Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp. 59-103, Academic Press, 1996により記載された標準的な限界希釈アッセイによるサブクローニングをかけることができる。適した培地は、ＤＭＥＭまたはＲＰＭＩ－１６４０などであってよい。さらに、ハイブリドーマ細胞は、動物中で腹水腫瘍の形態で増殖することもできる。プロテインＡアガロースゲル、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、またはアフィニティークロマトグラフィーなどの伝統的な免疫グロブリン精製方法を用いることにより、細胞培養液、腹水または血清からサブクローニングされた細胞が分泌したモノクローナル抗体を精製することができる。
モノクローナル抗体は、遺伝子操作および組換え技術により取得することもできる。モノクローナル抗体の重鎖および軽鎖遺伝子と特異的に結合する核酸プライマーを用いてＰＣＲ増幅を実行することにより、モノクローナル抗体の重鎖および軽鎖遺伝子をコードするＤＮＡ分子をハイブリドーマ細胞から単離することができる。生じるＤＮＡ分子を発現ベクターに挿入し、宿主細胞（例えば、免疫グロブリンを産生しない大腸菌細胞、ＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞、または他の骨髄腫細胞）に遺伝子導入し、適切な条件下で培養して組換えで発現した関心のある抗体を取得する。
本明細書で使用される場合、「キメラ抗体」という用語は、軽鎖および／または重鎖が１つの抗体（この抗体は、特定の生物種に由来し、または特定の抗体クラス若しくはサブクラスに属してよい）に部分的に由来し、軽鎖および／または重鎖の他の部分は別の抗体（この抗体は、同一のもしくは異なる生物種に由来し、または同一のもしくは異なる抗体クラス若しくはサブクラスに属してよい）に由来する抗体を指すが、いかなる場合においても、キメラ抗体は標的抗原に対する結合活性を保持する（U.S.P 4,816,567 to Cabilly et al.; Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851 6855 (1984)）。
本明細書で使用される場合、「ヒト抗体」という用語は、ヒト化抗体またはヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）のＣＤＲ領域の全てまたは一部を非ヒト抗体（ドナー抗体）のＣＤＲ領域によって置換することによって得られる抗体または抗体断片を指し、ドナー抗体は、所望の特異性、親和性または反応性を有する非ヒト（例えば、マウス、ラットまたはウサギ）抗体であってよい。さらに、抗体の性能をさらに改善しまたは最適化するように、レシピエント抗体のフレームワーク領域（ＦＲ）のいくつかのアミノ酸残基を、対応する非ヒト抗体のアミノ酸残基により、または他の抗体のアミノ酸残基により置換することもできる。ヒト化抗体の更なる詳細については、例えば、Jones et al., Nature, 321:522 525 (1986); Reichmann et al., Nature, 332:323 329 (1988); Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2:593 596 (1992); and Clark, Immunol. Today 21:397 402 (2000)を参照する。
本明細書で使用される場合、「エピトープ」という用語は、免疫グロブリンまたは抗体により特異的に結合される抗原上の部位を指す。「エピトープ」はまた、当該技術分野において「抗原決定基」とも呼ばれる。エピトープまたは抗原決定基は通常、アミノ酸または炭水化物または糖側鎖などの分子の化学的に活性な表面基からなり、通常特異的な三次元構造特性および特異的な電荷特性を有する。例えば、エピトープは典型的には、特有の空間的立体構造で少なくとも３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、または１５個の連続的なまたは非連続的なアミノ酸を含んでなり、空間的立体構造は、「直線的」または「立体構造的」であってよい。例えば、Molecular Biology, Vol. 66, G. E. Morris, Ed. (1996)の方法のエピトープマッピングプロトコルを参照する。直線的エピトープにおいては、タンパク質および相互作用分子（例えば抗体）の間の相互作用の全ての点が、タンパク質の一次アミノ酸配列に沿って直線的に存在する。立体構造的エピトープにおいては、相互作用の点は、互いに離れているタンパク質アミノ酸残基にわたって存在する。
本明細書で使用される場合、「エピトープペプチド」という用語は、エピトープとして働くことができる抗原上のペプチドセグメントを指す。いくつかの場合において、エピトープペプチドは単独で、エピトープに向けられた抗体により特異的に認識され／結合されることができる。他の場合においては、エピトープペプチドを特異抗体が認識できるように、エピトープペプチドを担体タンパク質に融合することが必要になってよい。本明細書で使用される場合、「担体タンパク質」という用語は、エピトープペプチド用の担体として働くことができるタンパク質を指す、すなわち、担体タンパク質は、エピトープペプチドを特異的な位置（例えばタンパク質の内部、Ｎ－末端またはＣ－末端）に挿入することができ、その結果エピトープペプチドを提示することができ、その結果エピトープペプチドを抗体または免疫系が認識することができる。このような担体タンパク質は当業者に周知であり、例えばＨＰＶ Ｌ１タンパク質（エピトープペプチドをタンパク質のアミノ酸１３０～１３１の間またはアミノ酸４２６～４２７の間に挿入することができる、Slupetzky, K. et al Chimeric papillomavirus-like particles expressing a foreign epitope on capsid surface loops[J] J Gen Virol,2001, 82:2799-2804; Varsani, A. et al Chimeric human papillomavirus type 16 (HPV-16) L1 particles presenting the common neutralizing epitope for the L2 minor capsid protein of HPV-6 and HPV-16[J]. J Virol, 2003, 77:8386-8393．を参照する）、ＨＢＶコア抗原（タンパク質のアミノ酸７９～８１を置換するためにエピトープペプチドを使用してよい、： Koletzki, D., et al. HBV core particles allow the insertion and surface exposure of the entire potentially protective region of Puumala hantavirus nucleocapsid protein[J]. Biol Chem,1999, 380:325-333を参照する）、ウッドチャック肝炎ウイルスコアタンパク質（タンパク質のアミノ酸７９～８１を置換するためにエピトープペプチドを使用することができる、Sabine Koenig, Gertrud Beterams and Michael Nassal, J. Virol. 1998, 72(6):4997を参照する），ＣＲＭ１９７タンパク質（タンパク質またはその断片のＮ－末端またはＣ－末端にエピトープペプチドを結合することができる）が挙げられる。場合により、エピトープペプチドおよび担体タンパク質のフォールディングを促進するために、これらの間にリンカー（例えば柔軟なまたは強固なリンカー）を使用することができる。
当業者に公知のルーチン技術を用いて、抗体の同一のエピトープへの結合を競合的にスクリーニングすることができる。例えば、互いに競合するまたは抗原に対する結合を交差競合する抗体を取得するために競合および交差競合研究を実行することができる。抗体の交差競合に基づいて同一のエピトープに結合する抗体を取得するためのハイスループット方法は、国際公開第０３／４８７３１号に記載される。したがって、当業者に公知のルーチン技術を用いて、本発明のモノクローナル抗体とインフルエンザウイルスヘマグルチニンタンパク質の同一のエピトープへの結合を競合する抗体およびその抗原結合断片（すなわち、抗原結合部分）を取得することができる。
本明細書で使用される場合、「特異的に結合する」という用語は、抗体および抗体が向けられる抗原の間の反応などの、２分子間のノンランダムの結合反応を指す。特定の実施形態において、抗原に特異的に結合する抗体（または抗原に対する特異性を有する抗体）とは、約１０－５Ｍ未満、例えば、約１０－６Ｍ未満、約１０－７Ｍ未満、約１０－８Ｍ未満、約１０－９Ｍ未満または約１０－１０Ｍ未満またはそれ以下の親和性（ＫＤ）で抗原と結合する抗体を指す。
本明細書で使用される場合、「ＫＤ」という用語は、特定の抗体－抗原相互作用の解離平衡定数を指し、抗体および抗原の間の結合親和性を記述するために用いられる。平衡解離定数が小さいほど、抗体－抗原結合が緊密で、抗体および抗原の間の親和性が高い。「ＫＤ」は、例えば表面プラズモン共鳴法（ＳＰＲ）を用いるＢＩＡＣＯＲＥ装置などの、種々の方法を用いて決定することができる。
本明細書で使用される場合、「ハイブリドーマ」および「ハイブリドーマ細胞株」は互換的に用いられ、「ハイブリドーマ」および「ハイブリドーマ細胞株」に言及する場合、用語には、ハイブリドーマのサブクローンおよび子孫細胞も含まれる。例えば、ハイブリドーマ細胞株２Ｆ４に言及する場合、この用語は、ハイブリドーマ細胞株２Ｆ４のサブクローンおよび子孫細胞も指す。
図１は、ＣＲＩＳＰＲ法によりベクター（ＣＥＡＣＡＭ５ ＫＯ１－３）を用いてＣＥＡＣＡＭ５高発現のＬｏｖｏ ６－１細胞のＣＥＡＣＡＭ５遺伝子をノックアウトした結果を示す。 図２は、ＣＥＡＣＡＭ５ ＫＯ３ベクターを用いてＣＥＡＣＡＭ５高発現のＬｏｖｏ ６－１細胞のＣＥＡＣＡＭ５遺伝子をノックアウトした結果を示す。 図３は、ＣＥＡＣＡＭ５組換えタンパク質に対するマウスモノクローナル抗体の結合結果を示す。 図４は、ＣＥＡＣＡＭ５の細胞外ドメインへのマウスモノクローナル抗体の結合を示す。 図５は、ＣＥＡＣＡＭ５高発現のＬＳ１７４Ｔ細胞およびＫＡＴＯ３細胞に対するマウスモノクローナル抗体の結合を示す。 図６は、組換えＣＥＡＣＡＭ５抗原に対するヒト化抗体の結合を示す。 図７は、ＣＥＡＣＡＭ５高発現のＫＡＴＯ３細胞に対するヒト化抗体の結合を示す。 図８は、ヒト化抗体およびマウスｍ２Ｆ４抗体のＣＥＡＣＡＭ５に対する競合結合を示す。
配列情報
本願に関わる配列情報の一部を以下の表に記載し、残りを実施例に記載する。
Figure 0007392200000001
Figure 0007392200000002
Figure 0007392200000003
Figure 0007392200000004
本発明を実行するための特定のモデル
本願の実施形態を、実施例と組み合わせて以下に詳細に説明するが、当業者は、以下の実施例は、本願の範囲を制限するよりむしろ、本願を説明するためのものにすぎないことを理解するだろう。好ましい実施形態の以下の詳細な説明から、本願の種々の対象および利点が当業者に明らかになるだろう。
実施例１ モノクローナル抗体の調製
本実施例においては、モノクローナル抗体を調製する目的でマウスを免疫化するために、ＣＥＡＣＡＭ５ を発現した腫瘍細胞株を使用した。
１．ＳＪＬマウス免疫化／ハイブリドーマ融合
ＣＥＡＣＡＭ５を高度に発現したＬｏｖｏ細胞株ＡＴＣＣ ＣＣＬ－２２９を、１０％ＦＢＳを含有するＲＰＭＩ１６４０培地中で培養した。Ｌｏｖｏ細胞をＴｒｙｐＬＥトリプシンで消化した後、細胞をＤＰＢＳ溶液に再懸濁し、各ＳＪＬマウスを皮下に多点で免疫化し、１０７個のＬｏｖｏ細胞を１回あたり、１週間に１回、合計５回免疫化した。血清力価に対する検査をするマウスを犠牲にし、脾臓を取り、粉砕し、そしてふるいにかけ、標準的な融合手順にしたがってＳＰ２０骨髄種細胞を融合してハイブリドーマ細胞を得た。
２．Ｌｏｖｏ ＣＥＡＣＡＭ５ ＫＯ細胞株の作成およびスクリーニング
２．１ Ｌｏｖｏ ＣＥＡＣＡＭ５高発現のモノクローナル細胞株のスクリーニング
Ｌｏｖｏ細胞を、組換えにより発現した抗ＣＥＡＣＡＭ５抗体ｈＭＮ１４（Ｉｍｍｕｎｏｍｅｄｉｃｓ，第２相の薬物）で標識し、この配列は、以下の通りである。
＞ｈＭＮ１４ ＶＨ
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＶＶＱＰＧＲＳＬＲＬＳＣＳＡＳＧＦＤＦＴＴＹＷＭＳＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＩＧＥＩＨＰＤＳＳＴＩＮＹＡＰＳＬＫＤＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＬＦＬＱＭＤＳＬＲＰＥＤＴＧＶＹＦＣＡＳＬＹＦＧＦＰＷＦＡＹＷＧＱＧＴＰＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
＞ｈＭＮ１４ ＶＬ
ＤＩＱＬＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＫＡＳＱＤＶＧＴＳＶＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＷＴＳＴＲＨＴＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＦＴＩＳＳＬＱＰＥＤＩＡＴＹＹＣＱＱＹＳＬＹＲＳＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ，
標識後、抗マウスＦｃ－ＰＥ蛍光標識二次抗体を加え、ＢＤ ＦＡＣＳ Ａｒｉａにより９６－ウェルプレートへと選別し、モノクローナル培養を実行した後、モノクローナルＣＥＡＣＡＭ５の発現を検出するためにＭＮ１４を使用し、結果は以下の通りとなった。
Figure 0007392200000005
上の結果から、クローン６－１は、他のクローンより純度が高く、９８．６％に達し、クローン６－１のＣＥＡＣＡＭ５発現ＭＦＩは、他のクローンより有意に高いことが示され、その結果ＣＥＡＣＡＭ５ノックアウト用にクローン６－１を選択した。
２．２ Ｌｏｖｏ ＣＥＡＣＡＭ５ ＫＯ細胞株のスクリーニング
ＣＲＩＳＰＲ法によりＬｏｖｏ６－１クローンをＣＥＡＣＡＭ５遺伝子ノックアウトにかけ、Ｌｏｖｏ ＣＥＡＣＡＭ５ ＫＯ細胞株（以下Ｌｏｖｏ ＣＥＡ ＫＯ細胞株と称する）をスクリーニングした。ＣＲＩＳＰＲおよびｓｇＲＮＡを有するベクターをレンチウイルスベクターにパッケージし（ＣＥＡＣＡＭ５ ＫＯ１－３）、Ｌｏｖｏ６－１細胞に形質導入した。形質導入後、ＦＡＣＳによりＣＥＡＣＡＭ５発現（ＭＮ１４抗体）を検出し、マウスＦｃ－ＡＰＣ二次抗体によりＭＮ１４結合を検出した。結果を図１に示す。結果から、ＣＥＡＣＡＭ５ ＫＯ１－３はＣＥＡＣＡＭ５をノックアウトすることができ、ＣＥＡＣＡＭ５ ＫＯ３ベクターのノックアウト効率は高いことが示され、ＣＥＡＣＡＭ５－陰性集団は、より明白であると示された。ＣＥＡＣＡＭ５を標的にする３種類のｓｇＲＮＡの配列は以下の通りである。
Figure 0007392200000006
図２に示すように、ＣＲＩＳＰＲ法によりＬｏｖｏ ６－１クローンにＣＥＡＣＡＭ５ノックアウトをかけた後、細胞集団中に１００％～２９．３％を占めるＣＥＡＣＡＭ５ノックアウト集団が出現し、ＣＥＡＣＡＭ５ノックアウトは、首尾よく実行されたことが分かった。
３． ハイブリドーマクローニングおよびスクリーニング
Ｌｏｖｏ細胞およびＬｏｖｏ ＣＥＡ ＫＯ細胞を９６－ウェルプレートにウェルあたり１０４個で播種し、一晩培養し、Ｌｏｖｏ／Ｌｏｖｏ ＣＥＡ ＫＯ細胞培養プレートに１～１０μｌのハイブリドーマ上清を加え、１時間インキュベーションし、上清を捨て、抗マウスＦｃ－ＦＩＴＣ蛍光二次抗体を加え、１時間インキュベーションし、上清を捨て、２％ＢＳＡを含有するＤＰＢＳ溶液を加え、Ｃｅｌｉｇｏで蛍光シグナルおよびＦＩＴＣ染色面積を読み、解析した。
スクリーニングにより４種類のクローンＭ１９（２Ｆ４）、Ｍ７（１１Ｂ６）、Ｍ１７（６Ａ８）およびＭ１８（７Ｇ１）を取得した。
Figure 0007392200000007
４． ハイブリドーマ配列決定／組換え発現ベクター作成
スクリーニングにより４種類のクローンＭ１９（２Ｆ４）、Ｍ７（１１Ｂ６）、Ｍ１７（６Ａ８）およびＭ１８（７Ｇ１）を取得した。標準的なハイブリドーマ配列決定方法にしたがって選択されたハイブリドーマクローンを配列決定して選択されたクローンの重鎖および軽鎖可変領域（ＶＨおよびＶＬ）を取得した。全遺伝子合成によりＶＨおよびＶＬを合成し、ヒトＩｇＧ１およびκ鎖定常領域に連結し、重鎖および軽鎖配列をｐｃＤＮＡ３．４ベクターに連結し、２９３システムの一過性発現にかけ、プロテインＡ／Ｇにより精製した。ＰＢＳ溶液での緩衝液置換のため、得られたキメラ組換え抗体を限外濾過にかけた。配列決定結果を以下の表に示す。
Figure 0007392200000008
Figure 0007392200000009
Figure 0007392200000010
実施例２ 抗原結合のＥＬＩＳＡ実験
組換えＣＥＡＣＡＭ５抗原（Ｓｉｎｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ，１１０７７－Ｈ０８Ｈ）をＤＰＢＳ溶液により１μｇ／ｍｌに希釈し、９６ウェルプレートにウェルあたり１００μｌで加え、２～８℃で一晩コーティングし、コーティング溶液を捨て、ＰＢＳ溶液で２回洗浄を行い、２％ＢＳＡを含有するＰＢＳ溶液を加え、室温で２時間ブロッキングし、ブロッキング溶液を捨て、濃度勾配で希釈した抗体を加え、３７℃で１時間インキュベーションし、抗体溶液を捨て、０．０５％Ｔｗｅｅｎ ２０を含有するＰＢＳ溶液（ＰＢＳＴ溶液）で４回洗浄をおこない、抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ－ＨＲＰ二次抗体を加え、３７℃で３０分間インキュベーションし、ＰＢＳＴ溶液で４回洗浄を行い、ＴＭＢ発色基質を加え、５～１０分間発色を行い、等体積の１Ｍ Ｈ２ＳＯ４で反応を終わらせ、マイクロプレートリーダーで４５０ｎｍの吸光度を読んだ。上の４種類の抗体Ｍ７、Ｍ１７、Ｍ１８、およびＭ１９のＣＥＡＣＡＭ５組換えタンパク質に対する結合結果を図３および以下の表に示した。結果から、上の４種類全ての抗体は、ＣＥＡＣＡＭ５－Ｈｉｓ組換えタンパク質に結合できることが示された。
Figure 0007392200000011
実施例３ 抗体エピトープ結合実験
ＣＥＡＣＡＭ５分子を細胞外ドメイン（Ａ１－Ｂ１－Ａ２－Ｂ２－Ａ３－Ｂ３）にしたがって分割し、Ａ１－Ｂ１－Ｈｉｓタグ、Ａ２－Ｂ２－Ｈｉｓタグ、Ａ３－Ｂ３－Ｈｉｓタグ発現ベクターを作成し、２９３システム中で発現した後Ｎｉカラムを用いて精製し、分子の配列を以下の表に示した。
Figure 0007392200000012
Figure 0007392200000013
上のＣＥＡＣＡＭ５断片をＤＰＢＳ溶液で１μｇ／ｍｌに希釈し、９６－ウェルプレートにウェルあたり１００μｌで加え、２～８℃で一晩コーティングし、コーティング溶液を捨て、ＰＢＳ溶液により２回洗浄を行い、２％ＢＳＡを含有するＰＢＳ溶液を加え、室温で２時間ブロッキングを行い、ブロッキング溶液を捨て、濃度勾配で希釈した抗体を加え、３７℃で１時間インキュベーションし、抗体溶液を捨て、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０を含有するＰＢＳ溶液（ＰＢＳＴ溶液）で４回洗浄を行い、抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ－ＨＲＰ二次抗体を加え、３７℃で３０分間インキュベーションし、ＰＢＳＴ溶液で４回洗浄を行い、ＴＭＢ発色基質を加え、５～１０分間発色を行い、等体積の１ＭＨ２ＳＯ４で反応を終わらせ、マイクロプレートリーダーで４５０ｎｍの吸光度を読んだ。結果を図４に示した。
ＣＥＡＣＡＭ５分子に結合する上の４種類の抗体Ｍ７、Ｍ１７、Ｍ１８、およびＭ１９のエピトープは以下の通りだった。
Figure 0007392200000014
上の結果から、Ｍ１９抗体は、３種類全てのＣＥＡＣＡＭ５ドメインを認識し、結合することができ、その中でＡ２－Ｂ２に対するドメイン結合ＥＣ５０が最小で（ＥＣ５０＝０．００３μｇ／ｍｌ）、この値はＡ１－Ｂ１（ＥＣ５０＝０．９５μｇ／ｍｌ）のものおよびＡ３－Ｂ３（ＥＣ５０＝３．２３μｇ／ｍｌ）ドメイン結合よりずっと小さく、このことから、Ｍ１９抗体の主要な結合部分は、ＣＥＡＣＡＭ５分子のＡ２－Ｂ２ドメインに位置するが、Ｍ１９抗体は、Ａ１－Ｂ１およびＡ３－Ｂ３ドメインにも結合することができ、おそらくＢ１－Ａ２およびＢ２－Ａ３ドメインにも結合できると分かった。
実施例４ 抗原結合のＦＡＣＳ実験
ＬＳ１７４Ｔ細胞およびＫＡＴＯ３細胞（ＣＥＡＣＡＭ５高発現；ＡＴＣＣ，ＣＬ－１８８）を１０％ＦＢＳを含有するＲＰＭＩ１６４０培地中で培養した。細胞をＴｒｙｐＬＥで消化した後、細胞を遠心分離し、２％ＢＳＡを含有するＤＰＢＳ溶液（ＦＡＣＳ緩衝液、４℃）に再懸濁し、Ｕ底９６－ウェルプレートに５×１０５／１００μｌ／ウェルで加え、濃度勾配で希釈した抗体を加え、４℃で１時間インキュベーションし、遠心分離後に上清を捨て、抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ－ＡＰＣ二次抗体の溶液１００μｌを加え、４℃で１時間インキュベーションし、ＦＡＣＳ緩衝液で１回洗浄を行い、２００μｌ ＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁を行い、ＢＤ ＣａｎｔｏＩＩで蛍光シグナル値を読んだ。結果を図５に示した。結果から、上の抗体は全てＬＳ１７４Ｔ細胞およびＫＡＴＯ３細胞に結合したことが示された。
Figure 0007392200000015
実施例５ ヒト化抗体の設計および発現
Ｍ１９抗体（ｍ２Ｆ４）をＩＭＧＴデータベースと比較し、Ｍ１９抗体のＶＨ／ＶＬに対する相同性が最も高いヒトフレームワーク配列を選択し、ＣＤＲ移植にかけ、ＣＤＲの抗原に対する結合を維持するように計算化学シミュレーションを実行した。ヒト化抗体の設計を以下の表に示した。
上の抗体のＶＨおよびＶＬ領域をヒトＩｇＧ１Ｆｃ領域およびκ定常領域に連結し、抗体の重鎖および軽鎖配列をｐｃＤＮＡ３．４ベクターに挿入し、２９３細胞で一過性に発現し、プロテインＡまたはＧにより精製した。
実施例６ ヒト化抗体のＥＬＩＳＡ結合実験
組換えＣＥＡＣＡＭ５抗原（Ｓｉｎｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ，１１０７７－Ｈ０８Ｈ）をＤＰＢＳ溶液で１μｇ／ｍｌに希釈し、９６－ウェルプレートにウェルあたり１００μｌで加え、２～８℃で一晩コーティングし、コーティング溶液を捨て、ＰＢＳ溶液で２回洗浄を行い、２％ＢＳＡを溶液を含有するＰＢＳ溶液を加え、室温で２時間ブロッキングを行い、ブロッキング溶液を捨て、濃度勾配に希釈したヒト化抗体を加え、３７℃で１時間インキュベーションし、抗体溶液を捨て、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０を含有するＰＢＳ溶液（ＰＢＳＴ溶液）で４回洗浄を行い、抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ－ＨＲＰ二次抗体を加え、３７℃で３０分間インキュベーションし、ＰＢＳＴ溶液で４回洗浄を行い、ＴＭＢ発色基質を加え、５～１０分間発色を実行し、等体積の１Ｍ Ｈ２ＳＯ４を加えることにより反応を終わらせ、マイクロプレートリーダーで４５０ｎｍの吸光度を読んだ。上のヒト化抗体のＣＥＡＣＡＭ５組換えタンパク質に対する結合結果を図６に示した。結果から、ｈＡｂ－００５抗体を除いて、他のヒト化抗体はＣＥＡＣＡＭ５－Ｈｉｓ抗原と結合できたことが示された。
Figure 0007392200000024
実施例７ ヒト化抗体の細胞結合実験
ＫＡＴＯ３細胞（ＣＥＡＣＡＭ５高発現）を１０％ＦＢＳを含有するＲＰＭＩ１６４０培地中で培養した。細胞をＴｒｙｐＬＥトリプシンで消化した後、細胞を遠心分離し、２％ＢＳＡを含有するＤＰＢＳ溶液（ＦＡＣＳ緩衝液、４℃）に再懸濁し、Ｕ底９６－ウェルプレートに５×１０５個／１００μｌ／ウェルで加え、濃度勾配に希釈した抗体を加え、４℃で１時間インキュベーションし、遠心分離の後上清を捨て、各ウェルに抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ－ＡＰＣ二次抗体を含有する溶液１００μｌを加え、４℃で１時間インキュベーションし、ＦＡＣＳ緩衝液で１回洗浄を行い、ＦＡＣＳ緩衝液２００μｌに再懸濁を行い、ＢＤ Ｃ６ ｐｌｕｓで蛍光シグナル値を読んだ。結果を図７に示した。
ヒト化抗体がＫＡＴＯ３細胞に結合するＥＣ５０およびＥｍａｘを以下の表に示した。
Figure 0007392200000025
上の結果から、ｈＡｂ－００５は、ＣＥＡＣＡＭ５タンパク質およびＫＡＴＯ３細胞株に結合する能力を失ったことが示され、その中でｈＡｂ－００９ヒト化抗体は、ＫＡＴＯ３細胞に対する最も強い結合能力を有し、最大結合を維持した。
実施例８ 抗体結合のブロッキング実験
ＫＡＴＯ３細胞（ＣＥＡＣＡＭ５高発現）を１０％ＦＢＳを含有するＲＰＭＩ１６４０培地中で培養した。細胞をＴｒｙｐＬＥトリプシンで消化した後、細胞を遠心分離し、２％ＢＳＡを含有するＤＰＢＳ溶液（ＦＡＣＳ緩衝液、４℃）に再懸濁し、Ｕ－底９６－ウェルプレートに５×１０５個／１００μｌ／ウェルで加え、マウスモノクローナル抗体Ｍ１９抗体（ｍ２Ｆ４）を１μｇ／ｍｌに加え、勾配に希釈したヒト化抗体（５０μｇ／ｍｌ，３－倍希釈）を加え、４℃で１時間インキュベーションし、遠心分離の後に上清を捨て、抗マウスＩｇＧＦｃ－ＡＰＣ二次抗体を含有する溶液１００μｌを各ウェルに加え、４℃で１時間インキュベーションし、ＦＡＣＳ緩衝液で１回洗浄を行い、ＦＡＣＳ緩衝液２００μｌに再懸濁を行い、ＢＤ Ｃ６ ｐｌｕｓで蛍光シグナル値を読んだ。結果を図８に示した。
ヒト化抗体がマウスモノクローナル抗体Ｍ１９抗体（ｍ２Ｆ４）の結合をブロッキングした結果を以下の表に示した。
Figure 0007392200000026
上の結果から、ｈＡｂ－００３、ｈＡｂ－００６、ｈＡｂ－００９、ｈＡｂ－０１０、ｈＡｂ－０１３、ｈＡｂ－０１６、ｈＡｂ－０１７抗体は、ｍ２Ｆ４抗体と競合することができることが示され、ヒト化抗体は、ＣＥＡＣＡＭ５分子上の同一のエピトープと結合できることが分かった。

Claims (11)

  1. グリコシル化ＣＥＡＣＡＭ５に特異的に結合するヒト化抗体またはその抗原結合断片であって、前記抗体は、軽鎖可変領域および重鎖可変領域を含んでなり、
    前記軽鎖可変領域は、配列番号８４に記載されるＣＤＲ－Ｌ１、配列番号８５に記載されるＣＤＲ－Ｌ２、および配列番号８６に記載されるＣＤＲ－Ｌ３を含み、前記重鎖可変領域は、配列番号８７に記載されるＣＤＲ－Ｈ１、配列番号８８に記載されるＣＤＲ－Ｈ２、および配列番号８９に記載されるＣＤＲ－Ｈ３を含む、
    ヒト化抗体またはその抗原結合断片。
  2. 前記軽鎖可変領域は、配列番号６８のアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含んでなり、前記重鎖可変領域は、配列番号６９のアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含んでなる、請求項１に記載のヒト化抗体またはその抗原結合断片。
  3. 前記抗体は、配列番号５２のヌクレオチド配列によりコードされる軽鎖可変領域、および配列番号５３のヌクレオチド配列によりコードされる重鎖可変領域を含んでなる、請求項１に記載のヒト化抗体またはその抗原結合断片。
  4. 前記抗体は、配列番号６８の軽鎖可変領域および配列番号６９の重鎖可変領域を含んでなる、請求項１に記載のヒト化抗体またはその抗原結合断片。
  5. 単離された核酸分子であって、前記核酸分子は、請求項１～４のいずれか一項に記載のヒト化抗体またはその抗原結合断片をコードするヌクレオチド配列を含んでなる、核酸分子。
  6. 請求項５に記載の核酸分子を含んでなる、ベクター。
  7. 請求項６に記載のベクターを含んでなる、宿主細胞。
  8. 医薬組成物であって、前記医薬組成物は、請求項１～４のいずれか一項に記載のヒト化抗体またはその抗原結合断片および薬学的に許容される担体を含んでなる、医薬組成物。
  9. 宿主細胞中で請求項５に記載の核酸分子を発現すること、および前記宿主細胞からグリコシル化ＣＥＡＣＡＭ５に特異的に結合するヒト化抗体を単離することを含む、グリコシル化ＣＥＡＣＡＭ５に特異的に結合するヒト化抗体の調製方法。
  10. 胃腸管関連腫瘍を治療するための医薬品の製造における請求項１～４のいずれか一項に記載のヒト化抗体の使用。
  11. 胃腸管関連腫瘍の治療において使用するための、請求項１～４のいずれか一項に記載のヒト化抗体。
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