CN111032083A - 抗globo h的人源化抗体及其在癌症治疗中的用途 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种人源化抗Globo H抗体或其scFv或Fab片段，包含具有三个由HCDR1、HCDR2及HCDR3组成的互补区的重链可变域及具有三个由LCDR1、LCDR2及LCDR3组成的互补区的轻链可变域，其中HCDR1的序列为GYISSDQILN(SEQ ID NO:4)，HCDR2的序列为RIYPVTGVTQYXHKFVG(SEQ ID NO:5，其中X为任何氨基酸)，且HCDR3的序列为GETFDS(SEQ ID NO:6)，其中LCDR1的序列为KSNQNLLX'SGNRRYZLV(SEQ ID NO:7，其中X'为F、Y或W，且Z为C、G、S或T)，LCDR2的序列为WASDRSF(SEQ ID NO:8)，且LCDR3的序列为QQHLDIPYT(SEQ ID NO:9)。

Description

抗GLOBO H的人源化抗体及其在癌症治疗中的用途
技术领域
本发明涉及特异性结合Globo H的人源化抗体。本发明也涉及使用这些抗体治疗和/或诊断癌症的方法。
背景技术
Globo H(Fuc-α1，2-Gal-β1，3-GalNAc-β1，3-Gal-α1，4-Gal-β1，4-Glc-β1，1-Cer)是一种六糖，其属于许多与肿瘤相关的碳水化合物抗原，这些抗原会过表达在多种上皮癌细胞的表面上，包括乳腺癌、结肠癌、卵巢癌、胰腺癌、肺癌和前列腺癌细胞。除Globo H之外，其他已知的碳水化合物抗原包括Tn(GalNAc-α-O-Ser/Thr)、唾液酸Tn(Neu5Ac-α2,6-GalNAc-α-O-Ser/Thr，STn)、GD2、GD3、GD3L、岩藻糖基-GM1、Lewis抗原(Lex、Ley、Lea、唾液酸Lex、唾液酸Lea)、TF(Gal-β1,3-GalNAc-α-O-Ser/Thr)也用作癌症免疫疗法的靶抗原(Susan F Slovin等人,碳水化合物疫苗作为癌症的免疫疗法,Immunology and CellBiology(2005)83,418-428；Zhongwu Guo及Qianli Wang,基于碳水化合物的癌症疫苗的最新进展,Curr.Opin.Chem.Biol.2009年12月；13(5-6):608-617；Therese Buskas等人,癌症的免疫疗法：基于碳水化合物的合成疫苗,Chem.Commun.(Comb).2009年9月28日；(36):5335-5349)。
然而，免疫系统常常耐受大部分碳水化合物抗原，因此这些碳水化合物所诱导的免疫原性会受限。此外，抗特定免疫原的抗体的产生通常涉及两类淋巴细胞(即B细胞与辅助T细胞)之间的协同相互作用。单独的Globo H不能激活辅助性T细胞，也是由于Globo H较差的免疫原性所致。因此，仅以单独Globo H进行免疫接种常常会产生低效价的免疫球蛋白M(IgM)，且无法类别转换成免疫球蛋白G(IgG)，以及无效的抗体亲和力成熟。
近来已证明，通过添加合适佐剂，可诱导出抗Globo H的抗体，包括从IgM类别转换成IgG。因此，Globo H是一种有前景的癌症疫苗治疗标靶。该方法已处于针对多种癌症，包括乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌及肺癌的临床试验的不同阶段中。
尽管抗Globo H的抗体已显示在癌症诊断及疗法中的前景，仍然需要更好的抗Globo H抗体。
发明内容
本发明的实施方式涉及特异性结合Globo H的人源化Globo H抗体以及将这类抗体用于诊断和/或治疗癌症的方法。通过特异性结合Globo H，本发明的抗体可用于诊断和/或治疗过表达Globo H的癌症，包括多种上皮癌。
在本发明的一个方面，涉及人源化抗Globo H抗体。根据本发明的一种实施方式，人源化抗Globo H抗体或其scFv或Fab片段包含重链可变域和轻链可变域，所述重链可变域具有三个由HCDR1、HCDR2及HCDR3组成的互补区，所述轻链可变域具有三个由LCDR1、LCDR2及LCDR3组成的互补区，其中HCDR1的序列为GYISSDQILN(SEQ ID NO:4)，HCDR2的序列为RIYPVTGVTQYXHKFVG(SEQ ID NO:5，其中X为任何氨基酸)，且HCDR3的序列为GETFDS(SEQ IDNO:6)，其中LCDR1的序列为KSNQNLLX'SGNRRYZLV(SEQ ID NO:7，其中X'为F、Y或W，且Z为C、G、S或T)，LCDR2的序列为WASDRSF(SEQ ID NO:8)，且LCDR3的序列为QQHLDIPYT(SEQ ID NO:9)。
根据本发明的一些实施方式，SEQ ID NO:5中的X为天冬酰胺或谷氨酰胺。根据本发明的一些实施方式，SEQ ID NO:7中的X'为色氨酸。根据本发明的一些实施方式，SEQ IDNO:7中的Z为丝氨酸或苏氨酸。
本发明的一个方面涉及诊断、预防和/或治疗癌症的方法。根据本发明的一种实施方式，所述方法包含向有需要的对象施用有效量的抗Globo H抗体。有效量为可实现所需治疗效果的量。本领域技术人员将了解有效量可基于患者的年龄、性别、体重、病状等加以变化。此类有效量通常是基于患者及病状来确定。本领域技术人员能够在不进行过度实验的情况下确定有效量。所述癌症为乳腺癌、结肠癌、卵巢癌、胰腺癌、肺癌、肝癌或前列腺癌。
附图说明
图1显示说明用于获得抗Globo H的抗体克隆的方法的流程图。
图2显示小鼠抗Globo H抗体、嵌合抗Globo H抗体及人源化抗Globo H抗体的示意图。
图3显示嵌合抗Globo H抗体的结合曲线，说明亚纳摩尔结合常数的高结合亲和力。
图4显示计算机建模中所使用的抗Globo H抗体的可变域的模型。
图5显示使用流式细胞仪测得的多种抗Globo H抗体与MCF7的结合结果。
图6显示重链可变域(VH)中R50的多种氨基酸置换的结果。结果显示，R50经任何其他氨基酸置换会显著地降低抗Globo H抗体的结合亲和力，表明该R50对抗原-抗体相互作用而言至关重要。
图7A显示轻链可变域(VL)中W27的多种氨基酸置换的结果。结果显示，该W27经其他芳香族氨基酸置换会导致抗体亲和力略微降低。然而，经非芳香族氨基酸置换会显著地降低抗Globo H抗体的结合亲和力。
图7B显示重链可变域(VH)中N55的多种氨基酸置换的结果。结果显示，在此位点下容许该N55经许多其他氨基酸置换。在多种氨基酸置换中，谷氨酰胺(Q)置换实质上产生更紧密的抗体。
图8A显示各种抗Globo H抗体(GBH)的VH区段的框架区的主要序列比对：小鼠GBH(M)、人源化GBH(H)、反向突变的人源化GBH(B1)、进一步改进的GBH(Re2)、和GBH(B11)。
图8B显示多种抗Globo H抗体(GBH)的VL区段的框架区的主要序列比对：小鼠GBH(M)、人源化GBH(H)、反向突变的人源化GBH(B1)、进一步改进的GBH(Re2)、和GBH(B13)。
图9A显示基于丙氨酸扫描及CDR区中多种氨基酸置换的结果的共同克隆GBH(C)的HCDR1、HCDR2及HCD3的序列。还显示示例性克隆GBH(B11)，其在HCDR2的非关键残基X处含有谷氨酰胺(Q)。
图9B显示基于丙氨酸扫描及CDR区中多种氨基酸置换的结果的共同克隆GBH(C)的LCDR1、LCDR2及LCDR3的序列。亦显示示例性克隆GBH(B13)，其在LCDR1的芳香族残基X处含有色氨酸(W)且在LCDR1中的柔性残基Z处含有苏氨酸(T)。
图10显示抗Globo H抗体对表达Glob H的乳腺癌细胞的识别。图A-C显示MCF7细胞的抗体识别的免疫荧光图像。图A'-C'显示经以光学显微镜可视化的细胞的相应图像。
图11(A)-11(G)显示FACS结果，表明通过抗Globo H抗体所检测，Glob H在各种癌细胞上会表达。图11(A)显示MCF7乳腺癌细胞会表达Her2(上图)与Globo H(下图)抗原。图11(B)显示HCC1428肝癌细胞会表达Her2(上图)与Globo H(下图)抗原。图11(C)显示BT474乳腺癌细胞会表达Her2(上图)，但不表达Globo H(下图)。类似地，图11(D)显示Capan-1胰腺癌细胞会表达Globo H。图11(E)显示A-431鳞状癌细胞会表达Globo H。图11(F)显示NCI-N87胃癌细胞会表达Globo H。图11(G)显示HT-29结肠直肠癌细胞表达低水平的Globo H。
图12A-12F显示抗Globo H抗体介导的抗体依赖性细胞毒性(ADCC)的结果。图12A显示MCF7细胞的结果。图12B显示HCC1428细胞的结果。图12C显示BT474细胞的结果。图12D显示Capan-1的结果。图12E显示NCI-N87的结果。图12F显示A431的结果。这些结果显示，抗Globo H抗体介导的ADCC需要Glob H的表达。
图13A-13E显示抗Globo H抗体介导的补体依赖性细胞毒性(CDC)的结果。图13A显示MCF7细胞的结果。图13B显示HCC1428细胞的结果。图13C显示BT474细胞的结果。图13D显示Capan-1细胞的结果。图13E显示NCI-N87的结果。这些结果显示，抗Globo H抗体介导的CDC需要Glob H的表达。
图14显示合成聚糖对抗Globo H抗体介导的细胞毒性的抑制的结果。结果说明Globo H可以剂量依赖性方式竞争及抑制抗Globo H抗体介导的细胞毒性，而Lewis-b四糖则不能。此特异性竞争表明抗Globo H介导的细胞毒性是借由结合于在细胞表面上表达的Globo H。
图15显示在预示模型中人源化抗Globo H抗体可以剂量依赖性方式抑制肿瘤生长。
图16显示在治疗模型中人源化抗Globo H抗体可以剂量依赖性方式抑制肿瘤生长。
图17显示多种抗Globo H抗体的GBH轻链可变域的序列(SEQ ID NO:1；SEQ ID NO:2及SEQ ID NO:3)。
定义
除非另外定义，否则本文所使用的科学及技术术语应是具有本领域常规技术的人员通常所了解的含义。此外，除非上下文另外要求，否则单数术语应包括复数，且复数术语应包括单数。一般而言，本文所述的与细胞及组织培养、分子生物学以及蛋白质及寡核苷酸或多核苷酸化学及杂交结合使用的命名法及其技术是本领域所熟知和常用的。
重组DNA、寡核苷酸合成以及组织培养及转化(例如电穿孔、脂质粒转染)是使用标准技术。酶促反应及纯化技术是根据制造商的说明书或如本领域通常所完成或如本文所描述的来进行。前述技术及程序一般是根据本领域熟知的已知方法及如在本说明书通篇中所引用及论述的各种通用及较特定参考文献中所描述的执行。参见例如Sambrook等人,分子克隆:实验室手册(第3版,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.(2001))，其以引用的方式并入本文中。
如本文所用，术语“嵌合抗体”是指含有来自超过一个来源(例如物种)的序列的抗体。
如本文所用，术语“人源化抗体”是指一种抗体，其中有少量的非人类抗体被引入人类抗体。
如本文所用，术语“人类抗体”是指其中蛋白质的实质上每个部分在人类中实质上是无免疫原性的，仅仅具有少量序列变化或变异的抗体。
如本文所用，术语“抗原结合片段”是指保留结合抗原的能力的抗体片段。此类抗原结合片段包括scFv、Fab、F(ab')2或其类似物。
术语“CDR区”或“CDR”是指如Kabat等人,1991(Kabat,E.A.等人,(1991)具有免疫性意义的蛋白质序列,第5版.US Department of Health and Human Services,PublicService,NIH,华盛顿)及随后发行版本所定义的免疫球蛋白的重链或轻链的高变区。抗体通常含有3个重链CDR及3个轻链CDR。术语CDR在此处是用于视情况指示这些区域中的一个或这些区域中的若干或甚至全部，其含有负责结合其可识别的抗原或表位的大部分氨基酸残基。
本文所提及的术语“CDR组”包含CDR1、CDR2及CDR3。因此，HCDR组是指HCDR1、HCDR2及HCDR3(HCDR是指重链CDR)，LCDR组是指LCDR1、LCDR2及LCDR3(LCDR是指轻链CDR)。除非另有说明，否则“CDR组”可包括HCDR和/或LCDR。
两个氨基酸序列之间若部分或完全一致，则这些序列是“同源”。举例而言，85％同源性意谓当两个序列进行比对以获得最大匹配时，85％的氨基酸是一致的。为了最大化匹配，间隙(在待匹配的两个序列中的任一者中)是容许存在的，间隙长度较佳为5或小于5，且更佳为2或小于2。应了解，两个直系同源序列内可存在同源性不同的区域。举例而言，小鼠及人类直系同源物的功能区可能具有比非功能区更高程度的同源性。
抗原结合位点一般是由可变重链(VH)及可变轻链(VL)免疫球蛋白结构域形成，其中抗原结合界面是由六个称为互补决定区(CDR)的表面多肽环形成。每个VH(HCDR1、HCDR2、HCDR3)及每个VL(LCDR1、LCDR2、LCDR3)中都有三个CDR，以及框架区(FR)。
由VH结构域及VL结构域构成的抗体抗原结合位点通常是由六个多肽环形成：三个来自轻链可变域(VL)及三个来自重链可变域(VH)。对已知原子结构的抗体的分析可阐明序列与抗体结合位点的三维结构之间的关系。
序列-结构关系的研究可用于预测具有已知序列但三维结构尚未知的抗体中对于维持其CDR环的三维结构而言重要且因此维持结合特异性的那些残基。在结构化方法中，可使用任何免费取得或商业软件包(诸如WAM)来建立抗体分子的模型。接着可使用蛋白质可视化及分析软件包(诸如Insight II(Accelrys,Inc.)或Deep View)来评估CDR中每个位置的可能取代。之后，此信息可用于制造出可能会在活性上具有最小或有益效应的取代。
在CDR及抗体VH或VL结构域的序列内进行氨基酸取代的技术是本领域可用的。
具体实施方式
本发明的实施例是关于抗Globo H抗体及其在诊断及治疗癌症上的用途。本发明的实施是采用包含细胞生物学、细胞培养、抗体技术及基因工程的传统技术，都是本领域的常规技术。
以下实例说明人源化抗Globo H抗体的发展及其在诊断及治疗癌症上的用途。本领域技术人员将了解这些实例仅仅为了说明，且不意味要限制本发明的范围。
如上所指，Globo H为一种六糖，且会过表达于包括乳腺癌、结肠癌、卵巢癌、胰腺癌、肺癌及前列腺癌细胞的上皮癌细胞的表面上。抗Globo H的抗体已显示可适用于治疗及诊断这些癌症。为用于患者，这些抗体应具有最小副作用或无副作用，诸如无不良免疫反应。本发明的实施方式是关于人源化抗Globo H抗体。这些人源化抗体具有良好结合效率且没有不良免疫反应或具有最小不良免疫反应。
根据本发明的实施方式，一种用于产生人源化抗Globo H抗体的通用方法包括：获得可以产生针对Globo H的单克隆抗体的杂交瘤、自该杂交瘤获得CDR序列，及将该CDR序列克隆至人类构架序列中以产生人源化抗体。人源化抗体可进一步优化，例如以改良框架区和/或CDR序列中的序列。图1显示概述用于获得人源化抗Globo H抗体的根据本发明的一实施方式的方法的流程图。
用于各种程序的方法是本领域已知的。以下具体实例说明示例性实施方式。然而，本领域技术人员要了解，在不背离本发明的范围下，修改或变化是有可能的。
抗Globo H抗体V区的分子克隆
首先，产生抗Globo H的杂交瘤(例如小鼠GBH杂交瘤)。此类杂交瘤可借由用于产生单克隆抗体的标准方案产生。接着例如使用
Figure BDA0002375671900000071
试剂分离出杂交瘤的总RNA。之后，例如使用第一链cDNA合成试剂盒(Superscript III)及寡核苷酸(dT20)引物或Ig-3'恒定区引物，从总RNA合成出cDNA。
接着，自cDNA克隆免疫球蛋白基因的重链及轻链可变区。举例而言，通过PCR，使用小鼠Ig-5'引物组(Novagen)，自小鼠GBH杂交瘤cDNA扩增抗Globo H mAb的VH及VL可变区。这些PCR产物可使用CloneJetTM PCR克隆试剂盒(Ferments)直接克隆至合适载体(例如pJET1.2载体)中。pJET1.2载体含有致死性插入序列，且仅在所需基因被克隆至此致死性区域中才能在选择条件下存活。这有助于重组菌落的选择。最后，筛选重组菌落中所需的克隆，分离那些克隆的DNA并测序。可在国际ImMunoGeneTics信息系统(IGMT)网站分析免疫球蛋白(IG)核苷酸序列。
抗体表达及纯化
为产生抗体，将该经分离的克隆在任何合适的细胞中表达。举例而言，F293细胞(Life technologies)经可表达抗Globo H mAb的质粒转染并培养7天。使用蛋白A亲和柱(GE)，自该培养基纯化出抗Globo H抗体。使用本领域已知的程序或根据制造商的说明书，用Bio-Rad蛋白质分析试剂盒测定蛋白质浓度，并且用12％SDS-PAGE分析。
ELISA分析
抗体亲和力可用本领域已知的任何合适方法(诸如ELISA或Biacore)来评估。举例而言，在4℃下，将用碳酸钠缓冲液(pH 9.5)稀释的Globo H-NH2(Oligotech)涂布在96孔板上过夜。经过封闭(例如用BSA)后，将两倍系列稀释的抗Globo H抗体添加至孔中，并在37℃下孵育2小时。在结合后，添加山羊抗人类IgG-HRP(1:15000)且在37℃下孵育1小时。接着，使用3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)底物以便进行显色，且添加1N H2SO4终止反应。抗原-抗体结合的程度通过读取板来确定，即通过使用ELISA读数器(BioRad Model680)在450-655nm处测量吸光度来确定。使用任何合适的软件(诸如GraphPad Prism 5软件)分析数据。
抗Globo H抗体的人源化
本发明的实施方式是关于抗Globo H抗体的人源化。图2显示嵌合抗体及人源化抗体的示意图。嵌合抗体为具有来自不同来源(例如不同物种)的可变区及恒定区的抗体。举例而言，可将自上述方法克隆的小鼠抗Globo H抗体的可变区嫁接到人抗体的恒定区上，以产生嵌合抗体。
图3显示根据本发明的一实施方式的嵌合抗体的结合测定。结合测定如上所述用ELISA进行。根据结合曲线，可估计此嵌合抗体的结合常数比1.0nM更佳，表明将抗体可变域嫁接至人抗体的恒定域上不会像预期的那样有损结合。
参考图2，人源化抗体含有来自一个物种的CDR以及来自人类免疫球蛋白的框架区及恒定区。用于产生人源化抗体的一种示例性方法可如下。
1)人类V区框架的选择
自IMGT数据库选择与小鼠的上述克隆可变区中的框架区具有最高程度同源性的人类免疫球蛋白的构架。基于同源性比较，针对人源化抗Globo H mAb(GBH)分别选择以下的框架：VH3亚群中重链的构架及Vk1亚群中轻链的框架。
2)CDR嫁接的抗Globo H抗体的构建
通过PCR组装具有六个完整鼠类CDR序列的人类框架(VLκ亚群I及VH亚群III)，然后亚克隆到抗体表达载体中。可使用本领域已知的任何合适的载体。这将会产生混合(hybrid)可变区(VH及VL)。
3)反向突变(Back mutation)
将CDR嫁接至框架上会产生来自不同来源的可变域(VH及VL)。此异源结构域可能不具有最佳序列。因此，抗体的亲和力可能并非最佳。为提高结合亲和力，一些氨基酸可能会突变回其他物种。
如图4中所示，通过计算机建模分析可能会影响抗体结合的关键氨基酸残基。该模型可检查(例如在
Figure BDA0002375671900000091
区内)上部核心区及界面区。在模型建立时，也可应用基于成功案例的现有技术。基于该模型，可进行氨基酸取代，例如，以用初始物种中的对应氨基酸残基置换氨基酸残基(即反向突变)。接着，可评估突变抗体的结合情况以选择改良的抗体。
因此，自第一轮反向突变选择克隆GBH(B1)。基于B1克隆，在以下额外考虑因素下进行进一步突变，产生克隆GBH(Re1)及GBH(Re2)：(i)避免Fvβ-桶的结构上最保守链；(ii)通过相对较高的表面可接近性(例如超过30％)将表面重塑位点(小鼠氨基酸)排序；以及(iii)对构架的一般报导的风险位点进行分类。
如图5中所示，嵌合抗体(cGBH)可良好地结合至MCF7细胞。然而，人源化会显著地减少此结合(参见GBH(HH))。在第一轮反向突变后，GBH(B1)会恢复抗体大部分的结合活性。进一步突变后，GBH(Re1Re2)及GBH(re2Re2)会显著提高结合亲和力。这些突变体的轻链可变域及重链可变域的序列显示在图8A及8B中。
4)CDR亲和力优化及关键氨基酸残基的丙氨酸扫描
除框架区中上述反向突变之外，可借由优化CDR序列进一步提高抗体亲和力。基于计算机建模及Globo H抗原与GBH(Re2Re2)抗体的计算机对接(computational docking)，通过定点突变诱发可产生选择性CDR突变克隆。经突变克隆的结合亲和力可用任何合适的方法进行分析，如通过ELISA、Biacore或ForteBio。
表1显示使用GBH(Re2Re2)作为起始抗体的丙氨酸扫描结果的一实例。这些结果显示，4个位点(CDRH1中的I33、CDRH2中的R50、CDRH3中的E96及CDRL1中的W27)处的丙氨酸取代会造成抗体亲和力显著降低，表明这4个残基对于抗体结合而言至关重要。另一方面，其他位点(例如CDRH2中的N58、CDRL1中的N28、CDRL1中的D93及CDRL3中的I94)处的丙氨酸取代不会显著影响抗体结合，表明这些残基对于抗原-抗体相互作用而言并非关键。
表1.CDR残基的丙氨酸扫描的结果
克隆名称 CDR 突变位点 经取代的氨基酸 KD(M)*
Re2Re2 3.37E-09
VHB1 H1 I33 A ***
VHB2 H2 R50 A ***
VHB3 H2 N58 A 5.24E-09
VHB4 H3 E96 A ***
VLB1 L1 W27 A ***
VLB2 L1 N28 A 3.46E-09
VLB3 L3 D93 A 2.32E-10
VLB4 L3 I94 A 1.78E-08
ELISA测量
以上丙氨酸扫描的关键残基可进一步进行测试以证实这些关键残基的重要性。如图6中所示，CDRH2中的R50是关键残基，且经任何其他氨基酸取代后基本上会消除结合。
另一方面，某些经丙氨酸扫描技术证实的明显关键残基可耐受类似的氨基酸。举例而言，如图7A中所显示，虽然LCDR1中的W27(参见图9B)对于结合很重要，但是耐受其他芳香族氨基酸残基(Y及F)置换，而此位点处的其他氨基酸取代基本上会消减抗体结合。这些结果表明，只要具有芳香族侧链的氨基酸残基在此位置，则实质上仍会保留抗体结合活性。
另一方面，从丙氨酸扫描结果而言并非关键的氨基酸可进一步优化。举例而言，残基58(显示为图9A中GBH(C)中HCDR2中的X')并非关键，且在此位置处充分地耐受许多氨基酸(图7B)。在这些氨基酸中，谷氨酰胺(Q)会产生最佳结合活性。类似地，显示为LCDR1中的Z(图9B)的残基32可耐受具有类似极性的若干氨基酸。在示例性抗体GBH(B13)中，Z为苏氨酸(图9B)。
研究CDR中的其他残基以查看经其他氨基酸(亦即除丙氨酸外)置换是否会提高结合。如表2中所示，仅仅N58经Q置换(克隆名称：VHB11)会略微提高结合。关键残基的所有其他氨基酸置换会导致结合丧失或减少结合。
表2.
Figure BDA0002375671900000111
图8A显示小鼠克隆(M)(SEQ ID NO:10)、人源化克隆(H)(SEQ ID NO:11)、反向突变的克隆(B1)(SEQ ID NO:12)、重复反向突变的克隆(Re2)(SEQ ID NO:13)及VHB11克隆(B11)(SEQ ID NO:14)的重链可变域的框架区的序列比对。图8B显示小鼠克隆(M)(SEQ IDNO:15)、人源化克隆(H)(SEQ ID NO:16)、反向突变的克隆(B1)(SEQ ID NO:17)、重复反向突变的克隆(Re2)(SEQ ID NO:18)及VHB11克隆(B11)(SEQ ID NO:19)的轻链可变域的框架区的序列比对。
在CDRL1中，残基-32对于结合而言并非关键。若干残基C、S、G及T为可接受的。举例而言，在此位置处具有T的克隆B13显示于图9B中。
图9A显示共同克隆GBH(C)(SEQ ID NO:20)及示例性克隆GBH(B13)(SEQ ID NO:21)的重链可变域的序列。图9B显示共同克隆GBH(C)(SEQ ID NO:22)及示例性克隆GBH(B13)(SEQ ID NO:23)的轻链可变域的序列。
亲和力测定法-ForteBio
为评估抗Globo H抗体亲和力，根据制造商的说明书将Globo H-胺固定在能与胺反应的生物传感器上。所有测量均在30℃下使用ForteBio Octet Red96进行。使用由Octet数据分析软件所提供的预定模型(1:1结合)进行亲和力结合曲线拟合。
表3展示某些实施例的ForteBio分析的结果。
表3.
Figure BDA0002375671900000121
荧光成像
本发明的抗体可用于使表达Globo H的细胞可视化，例如诊断表达Globo H的癌症。举例而言，为了使结合在细胞表面(例如MCF7细胞)上表达的Globo H的抗Globo H抗体可视化，将MCF7细胞培养在玻璃载片(NUNC)上并用4％多聚甲醛(paraformaldehyde)固定。PBS洗涤后，该细胞先用抗Globo H抗体，再用山羊抗人类FITC抗体(1:1000；ThermoScientific)进行染色。作为对照的没有一抗的细胞包括在实验内。通过FITC荧光检查安装的载玻片，通过荧光显微镜检(Olympus)检查明场图像(bright-field images)。
图10显示用抗Globo H抗体对MCF7细胞进行免疫染色的结果。图A-C显示利用抗Globo H Ab对MCF7细胞进行荧光成像，且图A'-C'显示相同细胞的黑场(BF)成像。这些结果表明，本发明的抗体确实可结合细胞表面上的Globo H。
亲和力测定法-BiacoreTM
抗体亲和力可用ELISA或BiaCoreTM评估。以BiaCoreTM分析而言，根据制造商说明书，使用标准胺化学，将Globo H-胺固定在BiacoreTM CM5芯片(Biacore,Uppsala,瑞典)上。在微孔板上制备抗Globo H抗体的独立系列稀释液。每个样品在两个流通池中例如以50μL/min的流速注入2.5分钟：一个流通池是对照槽，另一个流通池有经固定的Globo H。在注射结束时测量结合动力学。每个样品后，通过以30μL/min的流速注射10mM甘氨酸pH 2.5/1.5(v/v＝1)45秒使芯片再生。所有的实验在25.0℃的恒定温度下在HBS-EP缓冲液(BiacoreTM)中使用Biacore T100仪器进行。使用由Biacore T100评估软件2.0所提供的预定模型(1:1结合)进行亲和力结合曲线拟合。
荧光激活细胞分选(FACS)
抗Globo H抗体可用于检测在细胞表面上表达Globo H的细胞或例如使用FACS分选表达Globo H的细胞。收获可表达Globo H的细胞MCF7或HCC1428，且将这些细胞再悬浮于5％PBS/FBS缓冲液中。将细胞(1×105)与抗Globo H抗体(10μg/ml)或赫赛汀(Herceptin)(10μg/ml，阴性对照)在4℃下孵育1小时，然后在4℃下用山羊抗人IgG FITC结合物(1/1000)染色1小时。对于每个测定，制备两个附加的对照；一个不带一抗，另一个不带任何抗体。将所有经处理的样品用FACSVerse(Becton Dickinson)分析，结果经FACSuite软件(Becton Dickinson)处理。
基于FACS，评估多种癌细胞以查看其是否表达Globo H。图11(A)-11(G)显示使用抗Globo H抗体及FACS进行多种细胞株的Globo H检测的结果。图11(A)显示MCF7乳腺癌细胞会表达Her2(上图)与Globo H(下图)抗原两者。图11(B)显示HCC1428肝癌细胞会表达Her2(上图)与Globo H(下图)抗原两者。图11(C)显示BT474乳腺癌细胞会表达Her2(上图)，但不会表达Globo H(下图)。类似地，图11(D)显示Capan-1胰腺癌细胞会表达Globo H。图11(E)显示A-431鳞状癌细胞会表达Globo H。图11(F)显示NCI-N87胃癌细胞会表达Globo H。图11(G)显示HT-29结肠直肠癌细胞会表达低水平的Globo H。这些结果证明，抗Globo H抗体在诊断各种癌症上的实用性。
抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)
抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)在基于抗体的癌症疗法中扮演重要角色。本发明的人源化抗Globo H抗体是有前景的针对表达Globo H的癌症的治疗剂。为评估抗Globo H抗体的ADCC活性，将经纯化的人类NK细胞与经抗体处理的人类乳腺癌细胞(例如HCC1428、MCF7、Capan-1、NCI-N87、A431或BT474细胞)以5:1E/T比率孵育3小时。将抗IL20抗体作为ADCC分析的阴性对照，而将赫赛汀(Herceptin)(Roche)作为阳性对照。使用TDA释放和DELFIA EuTDA细胞毒性试剂盒(PerkinElmer)来测量细胞死亡百分比。在时间分辨荧光计(CLARIO,BGM)中测量荧光。
图12A-12F显示抗Globo H抗体能够在各种癌细胞中诱导ADCC，包括MCF7(图12A)、HCC1428(图12B)、Capan-1(图12D)、NCI-N87(图12E)及A431(图12F)癌细胞。然而，抗GloboH抗体却无法在BT474细胞中诱导ADCC，此与BT474细胞(图12C)在表面上不会表达Glob H的观测结果相符。这些结果支持抗Globo H抗体诱导的ADCC依赖于细胞表面Globo H的表达，并证实抗Glob H抗体能有效诱导杀死表达Globo H的癌细胞。
补体依赖性细胞毒性(CDC)
类似于ADCC，补体依赖性细胞毒性(CDC)在基于抗体的癌症疗法中发挥重要的作用。为评估本发明的抗Globo H抗体诱导CDC的能力，进行以下实验。在这些测试中，将40％正常人类血清(Normal Human Serum；NHS)(v:v)添加至经抗体处理的人类癌细胞，包括HCC1428、MCF7、BT474、Capan-1或NCI-N87细胞，历时3小时。将抗IL20抗体与赫赛汀(Herceptin)都用作CDC分析中的阴性对照。使用TDA释放和DELFIA EuTDA细胞毒性试剂盒(PerkinElmer)来测量细胞死亡百分比。以时间分辨荧光计(CLARIO,BGM)测量荧光。
图13A-13E显示抗Globo H抗体会在MCF7细胞(图13A)、HCC1428细胞(图13B)、Capan-1细胞(图13D)及NCI-N87细胞(图13E)中诱导CDC。然而，抗Globo H抗体在BT474细胞中却无法诱导CDC。这些结果与以下事实相符：Globo H会在MCF7、Capan-1、NCI-N87及HCC1428细胞的表面上表达，但不会在BT4747细胞表达。这些结果证实抗Globo H抗体可诱导CDC，且证实由抗Globo H抗体所诱导的CDC是视Globo H在细胞表面上的表达而定。
Globo H竞争测定
为了证实抗Globo H抗体所诱导的细胞毒性为Globo H依赖性的，可进行Globo H竞争。将1μM抗Globo H抗体与多种浓度的合成Globo H或Lewis-b四糖(Sigma)在37℃下预孵育1小时。Lewis-b四糖为阴性对照。将40％NHS(v:v)添加至抗Globo H抗体-聚糖混合物且接着与人类乳腺癌细胞株MCF7孵育3小时。使用TDA释放和DELFIA EuTDA细胞毒性试剂盒(PerkinElmer)来测量细胞死亡百分比。以时间分辨荧光计(CLARIO,BGM)测量荧光。
图14显示抗Globo H所诱导的细胞毒性可以剂量依赖性方式与Globo H(岩藻糖-半乳糖-N-Ac-半乳糖胺-半乳糖-半乳糖-葡萄糖)竞争，但不会与Lewis-b四糖(岩藻糖-半乳糖-N-Ac-葡糖胺-岩藻糖)竞争。这些结果进一步证实，由抗Globo H抗体所诱导的细胞毒性是Globo H依赖性的。
异种移植动物模型
抗Globo H可诱导表达Globo H的细胞的ADCC及CDC的事实表明，这些抗体可用于预防和/或治疗在其表面上表达Globo H的癌症。
为评估抗Globo H抗体预防和/或治疗癌症的能力，使用重量为20-24公克(6-7周龄)的5只为一组的雌性(NOD/SCID)小鼠。将活的人类乳腺癌HCC1428细胞(由赞助商提供，0.2ml基质胶中1×107个细胞)皮下注射至裸鼠的背侧中。在细胞植入之前的一周开始，每周两次皮下注射作为补充剂的Estol-Depot(100微克/小鼠)，历时7周。在细胞植入后2小时(预防模型)或7天(治疗模型)，开始静脉内施用测试试剂(抗Globo H抗体、紫杉醇或载剂)。每周两次记录体重及肿瘤尺寸，历时至多60天。根据针对长椭圆球体的公式估计肿瘤重量(mm3)：长度(mm)×[宽度(mm)]2×0.5。经测试化合物处理的动物中的肿瘤生长计算为T/C(治疗/对照)×100％；42％的T/C的数值被视为显著证明具有抗肿瘤活性。
图15显示，在预防模型中，抗Globo H抗体能够以剂量依赖性方式预防肿瘤生长。在剂量为10mg/Kg(mpk)时，该抗体与紫杉醇一样有效，在剂量为30mpk时，该抗体在预防癌症生长方面比紫杉醇更有效。
图16显示，在治疗模型中，抗Globo H抗体能够以剂量依赖性方式抑制肿瘤生长。在剂量为10mg/Kg(mpk)时，该抗体与紫杉醇一样有效，在剂量为20mpk时30mpk时，该抗体在预防癌症生长方面比紫杉醇更有效。
这些体内模型的结果表明，人源化抗Globo H抗体可用于预防和治疗表达Globo H的癌症，例如各种上皮癌，包括乳腺癌、结肠癌、卵巢癌、胰腺癌、肺癌、肝癌及前列腺癌。
序列表
<110> 财团法人生物技术开发中心
DCB-USA LLC
<120> 抗GLOBO H的人源化抗体及其在癌症治疗中的用途
<130> DCB012-721PCT
<150> US 62/510,742
<151> 2017-05-24
<160> 23
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 339
<212> DNA
<213> 小鼠（Mus musculus)
<400> 1
gaaattgtgt tgacccagtc tataccatcc ctgactgtgt cagcaggaga gagggtcact 60
atcaactgca agtccaatca gaatctttta tggagtggaa atcgaagata ctgtttagtt 120
tggcaccagt ggaaaccggg gcaaagtcct aaaccgttga tcacctgggc atctgatagg 180
tcttttggag tccctgatcg tttcatcggc ggtggatctg tgacagattt cactctgacc 240
atcagcagtg tacgggctga agatgtggca gtttatttct gtcaacaaca tttagacatt 300
ccgtacacgt tcggaggggg gaccaagttg gaaataaaa 339
<210> 2
<211> 339
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 2
gatattcagt tgacccagtc tatatcctcc ctgtccgtgt cagtgggaga cagggtcact 60
atcaactgca agtccaatca gaatctttta tggagtggaa atcgaagata ctgtttagtt 120
tggcaccagt ggaaaccggg gaagagtcct aaaccgttga tcacctgggc atctgatagg 180
tcttttggag tccctagccg tttcagcggc agcggatctg tgacagattt cactctgacc 240
atcagcagtg tacagcccga agatttcgca gtttatttct gtcaacaaca tttagacatt 300
ccgtacacgt tcggaggggg gaccaagttg gaaataaaa 339
<210> 3
<211> 339
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 3
gacatccagc tgacccagtc catctcctcc ctgtccgtgt ccgtgggcga cagagtgacc 60
atcaactgca agtccaacca gaacctgctg tggagcggca accggcggta caccctcgtg 120
tggcatcagt ggaagcccgg caagtccccc aagcccctga tcacctgggc ctccgacaga 180
tctttcggcg tgccctccag attctccggc tccggctctg tgaccgactt taccctgacc 240
atctccagcg tgcagcccga ggacttcgcc gtgtacttct gccagcagca cctggacatc 300
ccttacacct tcggcggagg caccaagctg gaaatcaag 339
<210> 4
<211> 10
<212> PRT
<213> 小鼠（Mus musculus)
<400> 4
Gly Tyr Ile Ser Ser Asp Gln Ile Leu Asn
1 5 10
<210> 5
<211> 17
<212> PRT
<213> 小鼠（Mus musculus)
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (12)..(12)
<223> X是任何氨基酸
<400> 5
Arg Ile Tyr Pro Val Thr Gly Val Thr Gln Tyr Xaa His Lys Phe Val
1 5 10 15
Gly
<210> 6
<211> 6
<212> PRT
<213> 小鼠（Mus musculus)
<400> 6
Gly Glu Thr Phe Asp Ser
1 5
<210> 7
<211> 17
<212> PRT
<213> 小鼠（Mus musculus)
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (8)..(8)
<223> 8位的X是F, Y, 或W.
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (15)..(15)
<223> 15位的X是C, G, S, 或T.
<400> 7
Lys Ser Asn Gln Asn Leu Leu Xaa Ser Gly Asn Arg Arg Tyr Xaa Leu
1 5 10 15
Val
<210> 8
<211> 7
<212> PRT
<213> 小鼠（Mus musculus)
<400> 8
Trp Ala Ser Asp Arg Ser Phe
1 5
<210> 9
<211> 9
<212> PRT
<213> 小鼠（Mus musculus)
<400> 9
Gln Gln His Leu Asp Ile Pro Tyr Thr
1 5
<210> 10
<211> 115
<212> PRT
<213> 小鼠（Mus musculus)
<400> 10
Gln Ile Gln Leu His Gln Ser Gly Ile Glu Leu Ala Ser Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Ile Thr Leu Ser Cys Lys Pro Ser Gly Tyr Ile Ser Ser Asp Gln
20 25 30
Ile Leu Asn Trp Val Lys Lys Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Arg Ile Tyr Pro Val Thr Gly Val Thr Gln Tyr Asn His Lys Phe
50 55 60
Val Gly Lys Ala Thr Phe Ser Val Asp Arg Ser Ser Asp Thr Val Arg
65 70 75 80
Met Val Met Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Gly Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Gly Arg Gly Glu Thr Phe Asp Ser Trp Gly Gln Gly Thr Ile Leu Thr
100 105 110
Val Ser Ser
115
<210> 11
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 11
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Ile Ser Ser Asp Gln
20 25 30
Ile Leu Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Arg Ile Tyr Pro Val Thr Gly Val Thr Gln Tyr Asn His Lys Phe
50 55 60
Val Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Glu Thr Phe Asp Ser Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser
115
<210> 12
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 12
Gln Ile Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Pro Ser Gly Tyr Ile Ser Ser Asp Gln
20 25 30
Ile Leu Asn Trp Val Lys Lys Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Arg Ile Tyr Pro Val Thr Gly Val Thr Gln Tyr Asn His Lys Phe
50 55 60
Val Gly Lys Ala Thr Phe Ser Val Asp Arg Ser Lys Asp Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Gly Arg Gly Glu Thr Phe Asp Ser Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser
115
<210> 13
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 13
Glu Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Ala Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Ile Arg Leu Ser Cys Ala Pro Ser Gly Tyr Ile Ser Ser Asp Gln
20 25 30
Ile Leu Asn Trp Val Lys Lys Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Arg Ile Tyr Pro Val Thr Gly Val Thr Gln Tyr Asn His Lys Phe
50 55 60
Val Gly Lys Ala Thr Phe Ser Val Asp Arg Ser Lys Asp Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Gly Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Gly Arg Gly Glu Thr Phe Asp Ser Trp Gly Gln Gly Thr Leu Leu Thr
100 105 110
Val Ser Ser
115
<210> 14
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 14
Glu Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Ala Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Ile Arg Leu Ser Cys Ala Pro Ser Gly Tyr Ile Ser Ser Asp Gln
20 25 30
Ile Leu Asn Trp Val Lys Lys Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Arg Ile Tyr Pro Val Thr Gly Val Thr Gln Tyr Asn His Lys Phe
50 55 60
Val Gly Lys Ala Thr Phe Ser Val Asp Arg Ser Lys Asp Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Gly Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Gly Arg Gly Glu Thr Phe Asp Ser Trp Gly Gln Gly Thr Leu Leu Thr
100 105 110
Val Ser Ser
115
<210> 15
<211> 114
<212> PRT
<213> 小鼠（Mus musculus)
<400> 15
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Ile Pro Ser Leu Thr Val Ser Ala Gly
1 5 10 15
Glu Arg Val Thr Ile Asn Cys Lys Ser Asn Gln Asn Leu Leu Trp Ser
20 25 30
Gly Asn Arg Arg Tyr Cys Leu Val Trp His Gln Trp Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Ser Pro Lys Pro Leu Ile Thr Trp Ala Ser Asp Arg Ser Phe Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ile Gly Gly Gly Ser Val Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Val Arg Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Phe Cys Gln Gln
85 90 95
His Leu Asp Ile Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile
100 105 110
Lys Arg
<210> 16
<211> 114
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 16
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ser Asn Gln Asn Leu Leu Trp Ser
20 25 30
Gly Asn Arg Arg Tyr Cys Leu Val Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys
35 40 45
Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Asp Arg Ser Phe Gly Val
50 55 60
Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln
85 90 95
His Leu Asp Ile Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile
100 105 110
Lys Arg
<210> 17
<211> 114
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 17
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Asn Cys Lys Ser Asn Gln Asn Leu Leu Trp Ser
20 25 30
Gly Asn Arg Arg Tyr Cys Leu Val Trp His Gln Trp Lys Pro Gly Lys
35 40 45
Ala Pro Lys Pro Leu Ile Thr Trp Ala Ser Asp Arg Ser Phe Gly Val
50 55 60
Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Val Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln
85 90 95
His Leu Asp Ile Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile
100 105 110
Lys Arg
<210> 18
<211> 114
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 18
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Ile Ser Ser Leu Ser Val Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Asn Cys Lys Ser Asn Gln Asn Leu Leu Trp Ser
20 25 30
Gly Asn Arg Arg Tyr Cys Leu Val Trp His Gln Trp Lys Pro Gly Lys
35 40 45
Ser Pro Lys Pro Leu Ile Thr Trp Ala Ser Asp Arg Ser Phe Gly Val
50 55 60
Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Val Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Val Gln Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Phe Cys Gln Gln
85 90 95
His Leu Asp Ile Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile
100 105 110
Lys Arg
<210> 19
<211> 114
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 19
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Ile Ser Ser Leu Ser Val Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Asn Cys Lys Ser Asn Gln Asn Leu Leu Trp Ser
20 25 30
Gly Asn Arg Arg Tyr Cys Leu Val Trp His Gln Trp Lys Pro Gly Lys
35 40 45
Ser Pro Lys Pro Leu Ile Thr Trp Ala Ser Asp Arg Ser Phe Gly Val
50 55 60
Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Val Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Val Gln Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Phe Cys Gln Gln
85 90 95
His Leu Asp Ile Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile
100 105 110
Lys Arg
<210> 20
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (59)..(59)
<223> X是任何氨基酸
<400> 20
Glu Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Ala Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Ile Arg Leu Ser Cys Ala Pro Ser Gly Tyr Ile Ser Ser Asp Gln
20 25 30
Ile Leu Asn Trp Val Lys Lys Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Arg Ile Tyr Pro Val Thr Gly Val Thr Xaa Tyr Asn His Lys Phe
50 55 60
Val Gly Lys Ala Thr Phe Ser Val Asp Arg Ser Lys Asp Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Gly Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Gly Arg Gly Glu Thr Phe Asp Ser Trp Gly Gln Gly Thr Leu Leu Thr
100 105 110
Val Ser Ser
115
<210> 21
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 21
Glu Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Ala Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Ile Arg Leu Ser Cys Ala Pro Ser Gly Tyr Ile Ser Ser Asp Gln
20 25 30
Ile Leu Asn Trp Val Lys Lys Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Arg Ile Tyr Pro Val Thr Gly Val Thr Gln Tyr Asn His Lys Phe
50 55 60
Val Gly Lys Ala Thr Phe Ser Val Asp Arg Ser Lys Asp Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Gly Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Gly Arg Gly Glu Thr Phe Asp Ser Trp Gly Gln Gly Thr Leu Leu Thr
100 105 110
Val Ser Ser
115
<210> 22
<211> 114
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (31)..(31)
<223> X是W, Y, 或F.
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (38)..(38)
<223> X是C, G, S, 或T.
<400> 22
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Ile Ser Ser Leu Ser Val Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Asn Cys Lys Ser Asn Gln Asn Leu Leu Xaa Ser
20 25 30
Gly Asn Arg Arg Tyr Xaa Leu Val Trp His Gln Trp Lys Pro Gly Lys
35 40 45
Ser Pro Lys Pro Leu Ile Thr Trp Ala Ser Asp Arg Ser Phe Gly Val
50 55 60
Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Val Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Val Gln Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Phe Cys Gln Gln
85 90 95
His Leu Asp Ile Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile
100 105 110
Lys Arg
<210> 23
<211> 114
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 23
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Ile Ser Ser Leu Ser Val Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Asn Cys Lys Ser Asn Gln Asn Leu Leu Trp Ser
20 25 30
Gly Asn Arg Arg Tyr Thr Leu Val Trp His Gln Trp Lys Pro Gly Lys
35 40 45
Ser Pro Lys Pro Leu Ile Thr Trp Ala Ser Asp Arg Ser Phe Gly Val
50 55 60
Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Val Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Val Gln Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Phe Cys Gln Gln
85 90 95
His Leu Asp Ile Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile
100 105 110
Lys Arg

Claims (8)

1.一种人源化抗Globo H抗体或其抗原结合片段，包含具有三个由HCDR1、HCDR2及HCDR3组成的互补决定区的重链可变域和具有三个由LCDR1、LCDR2及LCDR3组成的互补决定区的轻链可变域，其中HCDR1的序列为GYISSDQILN(SEQ ID NO:4)，HCDR2的序列为RIYPVTGVTQYXHKFVG(SEQ ID NO:5，其中X为任何氨基酸)，且HCDR3的序列为GETFDS(SEQ IDNO:6)，其中LCDR1的序列为KSNQNLLX'SGNRRYZLV(SEQ ID NO:7，其中X'为F、Y或W，且Z为C、G、S或T)，LCDR2的序列为WASDRSF(SEQ ID NO:8)，且LCDR3的序列为QQHLDIPYT(SEQ ID NO:9)。
2.如权利要求1所述的人源化抗Globo H抗体或其抗原结合片段，其特征在于，SEQ IDNO:5中的X为天冬酰胺或谷氨酰胺。
3.如权利要求1或2所述的人源化抗Globo H抗体或其抗原结合片段，其特征在于，SEQID NO:7中的X'为色氨酸。
4.如权利要求1-3任一项所述的人源化抗Globo H抗体或其抗原结合片段，其特征在于，SEQ ID NO:7中的Z为苏氨酸或丝氨酸。
5.如权利要求1所述的人源化抗Globo H抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述重链可变域包含序列SEQ ID NO:20且所述轻链可变域包含序列SEQ ID NO:22。
6.如权利要求1所述的人源化抗Globo H抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述重链可变域包含序列SEQ ID NO:21且所述轻链可变域包含序列SEQ ID NO:23。
7.一种用于治疗或预防癌症的药物组合物，包含如权利要求1-6中任一项所述的抗体或其抗原结合片段。
8.如权利要求7所述的药物组合物，其特征在于，所述癌症为乳腺癌、结肠癌、卵巢癌、胰腺癌、肺癌、肝癌或前列腺癌。
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