JP2023109923A - グロボhに対するヒト化抗体および癌治療におけるその使用 - Google Patents
グロボhに対するヒト化抗体および癌治療におけるその使用 Download PDFInfo
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Abstract
【課題】ヒト化抗グロボ抗体、およびその抗原結合フラグメントを提供する。【解決手段】HCDR1、HCDR2、およびHCDR3からなる3つの相補性領域を有する重鎖可変ドメイン、ならびにLCDR1、LCDR2、およびLCDR3からなる3つの相補性領域を有する軽鎖可変ドメインを含み、HCDR1の配列がGYISSDQILNであり、HCDR2の配列がRIYPVTGVTQYXHKFVG(Xは任意のアミノ酸である)であり、HCDR3の配列がGETFDSであり、LCDR1の配列がKSNQNLLX’SGNRRYZLV(X’はF、YまたはWであり、ZはC、G、SまたはTである)であり、LCDR2の配列がWASDRSFであり、LCDR3の配列がQQHLDIPYTである、ヒト化抗グロボH抗体、またはそのscFvもしくはFabフラグメント。【選択図】なし
Description
本発明は、グロボHに特異的に結合するヒト化抗体に関する。本発明はまた、これらの抗体を使用して癌を治療および/または診断するための方法に関する。
グロボH(Fuc-α1,2-Gal-β1,3-GalNAc-β1,3-Gal-α1,4-Gal-β1,4-Glc-β1,1-Cer)は、乳癌、大腸癌、卵巣癌、膵臓癌、肺癌、および前立腺癌細胞を含む様々な上皮癌細胞の表面で過剰発現される多数の腫瘍関連炭水化物抗原に属する六糖である。グロボHに加えて、他の公知の炭水化物抗原は、Tn(GalNAc-α-O-Ser/Thr)、シアリルTn(Neu5Ac-α2,6-GalNAc-α-O-Ser/Thr、STn)、GD2、GD3、GD3L、フコシル-GMl、ルイス抗原(Lex、Ley、Lea、シアリルLex、シアリルLea)、TF(Gal-β1,3-GalNAc-α-O-Ser/Thr)を含み、癌免疫療法の標的抗原としても使用される(Susan F Slovin et al.,Carbohydrate Vaccines as Immunotherapy for Cancer,Immunology and Cell Biology(2005)83,418-428;Zhongwu Guo and Qianli Wang,Recent Development in Carbohydrate-Based Cancer Vaccines,Curr.Opin.Chem.Biol.2009 December;13(5-6):608-617;Therese Buskas et al.,Immunotherapy for Cancer:Synthetic Carbohydrate-based Vaccines,Chem.Commun.(Comb)2009 September 28;(36):5335-5349)。
しかし、ほとんどの炭水化物抗原はしばしば免疫系によって寛容され、その結果として、それらによって誘導される免疫原性は限られる。さらに、特定の免疫原に対する抗体の産生は、典型的には、2種類のリンパ球、すなわちB細胞とヘルパーT細胞との間の協調的相互作用を伴う。グロボH単独ではヘルパーT細胞を活性化することができず、これはグロボHの低い免疫原性にも帰せられる。したがって、グロボH単独での免疫化は、しばしば低い力価の免疫グロブリンM(IgM)、免疫グロブリンG(IgG)へのクラススイッチができないこと、および効果的でない抗体の親和性成熟をもたらす。
最近、適切なアジュバントの添加により、IgMからIgGへのクラススイッチを含む、グロボHに対する抗体を誘導できることが実証された。したがって、グロボHは癌ワクチン接種の有望な治療標的である。このアプローチは、乳癌、卵巣癌、前立腺癌および肺癌を含む様々な癌に対する様々な段階の臨床試験中である。
グロボHに対する抗体は癌の診断および治療に有望であることが示されているが、より良い抗グロボH抗体が依然として必要である。
本発明の実施形態は、グロボHに特異的に結合するヒト化グロボH抗体、ならびに癌の診断および/または治療においてそのような抗体を使用する方法に関する。グロボHに特異的に結合することにより、本発明の抗体は、様々な上皮癌を含む、グロボHを過剰発現する癌を診断および/または治療するために使用され得る。
本発明の一態様は、ヒト化抗グロボH抗体に関する。本発明の一実施形態によれば、ヒト化抗グロボH抗体、またはそのscFvもしくはFabフラグメントは、HCDR1、HCDR2、およびHCDR3からなる3つの相補性領域を有する重鎖可変ドメイン、ならびにLCDR1、LCDR2、およびLCDR3からなる3つの相補性領域を有する軽鎖可変ドメインを含み、HCDR1の配列はGYISSDQILN(配列番号4)であり、HCDR2の配列はRIYPVTGVTQYXHKFVG(配列番号5、Xは任意のアミノ酸である)であり、HCDR3の配列はGETFDS(配列番号6)であり、LCDR1の配列はKSNQNLLX’SGNRRYZLV(配列番号7、X’はF、YまたはWであり、ZはC、G、SまたはTである)であり、LCDR2の配列はWASDRSF(配列番号8)であり、LCDR3の配列はQQHLDIPYT(配列番号9)である。
本発明のいくつかの実施形態によれば、配列番号5のXはアスパラギンまたはグルタミンである。本発明のいくつかの実施形態によれば、配列番号7のX’はトリプトファンである。本発明のいくつかの実施形態によれば、配列番号7のZはセリンまたはトレオニンである。
本発明の一態様は、癌を診断、または予防、および/または治療するための方法に関する。本発明の一実施形態による方法は、有効量の抗グロボH抗体を、それを必要とする被験体に投与することを含む。有効量は、望ましい治療結果を達成することができる量である。当業者は、有効量が患者の年齢、性別、体重、状態などに基づいて異なり得ることを認識するであろう。そのような有効量は、患者および状態に基づいて常套的に決定される。当業者は、過度の実験なしに有効量を決定することができるであろう。癌は、乳癌、大腸癌、卵巣癌、膵臓癌、肺癌、肝臓癌、または前立腺癌である。
定義
特に定義されない限り、本明細書で使用される科学用語および技術用語は、当業者によって一般に理解される意味を有するものとする。さらに、文脈上特に必要とされない限り、単数形の用語には複数形が含まれ、複数形の用語には単数形が含まれる。一般に、記載されている細胞および組織培養、分子生物学、ならびにタンパク質およびオリゴまたはポリヌクレオチドの化学およびハイブリダイゼーションに関連して使用される命名法は、当技術分野で周知であり、一般的に使用されている。
特に定義されない限り、本明細書で使用される科学用語および技術用語は、当業者によって一般に理解される意味を有するものとする。さらに、文脈上特に必要とされない限り、単数形の用語には複数形が含まれ、複数形の用語には単数形が含まれる。一般に、記載されている細胞および組織培養、分子生物学、ならびにタンパク質およびオリゴまたはポリヌクレオチドの化学およびハイブリダイゼーションに関連して使用される命名法は、当技術分野で周知であり、一般的に使用されている。
組換えDNA、オリゴヌクレオチド合成、組織培養および形質転換(例えばエレクトロポレーション、リポフェクション)には標準的な技術が使用される。酵素反応および精製技術は、製造者の仕様に従って、または当技術分野で一般的に行われるように、または本明細書に記載されているように実施される。上記の技術および手順は、一般に当技術分野で周知の従来の方法に従って、ならびに本明細書全体にわたって引用され、論じられる様々な一般的およびより具体的な参考文献に記載されているように実施される。例えば、参照により本明細書に組み込まれる、Sambrook et al.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual(3rd ed.,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.(2001))参照。
本明細書で使用される場合、「キメラ抗体」という用語は、複数の供給源(例えば種)からの配列を含む抗体を指す。
本明細書で使用される場合、「ヒト化抗体」という用語は、非ヒト抗体の最小部分が、他の点ではヒト抗体である抗体に導入されている抗体を指す。
本明細書で使用される場合、「ヒト抗体」という用語は、タンパク質の実質的にすべての部分がヒトにおいて実質的に非免疫原性であり、わずかな配列変化または変異のみを有する抗体を指す。
本明細書で使用される場合、「抗原結合フラグメント」という用語は、抗原に結合する能力を保持する抗体の断片を指す。そのような抗原結合フラグメントには、scFv、Fab、F(ab’)2などが含まれ得る。
「CDR領域」または「CDR」という用語は、Kabat et al.,1991(Kabat,E.A.et al.,(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th Edition.US Department of Health and Human Services,Public Service,NIH,Washington)およびそれ以降の版によって定義されるように、免疫グロブリンの重鎖または軽鎖の超可変領域を示すことが意図されている。抗体は、典型的には3つの重鎖CDRと3つの軽鎖CDRを含む。CDR(1つまたは複数)という用語は、場合によって、それが認識する抗原またはエピトープへの結合に関与するアミノ酸残基の大部分を含むこれらの領域の1つまたいくつかまたはさらに全体を示すために本明細書で使用される。
本明細書で言及される「CDRのセット」という用語は、CDR1、CDR2およびCDR3を含む。したがって、HCDRのセットはHCDR1、HCDR2およびHCDR3を指し(HCDRは重鎖CDRを指す)、LCDRのセットはLCDR1、LCDR2およびLCDR3を指す(LCDRは軽鎖CDRを指す)。特に明記されない限り、「CDRのセット」はHCDRおよび/またはLCDRを含み得る。
2つのアミノ酸配列は、それらの配列間に部分的または完全な同一性がある場合、「相同」である。例えば、85%の相同性は、2つの配列を最大一致のために整列した場合、85%のアミノ酸が同一であることを意味する。一致を最大化する際にギャップ(一致する2つの配列のいずれかにおける)が許容され、5以下のギャップ長が好ましく、2以下がより好ましい。2つのオーソロガス配列内に異なる相同性の領域が存在し得ることが認識されるべきである。例えば、マウスおよびヒトのオーソログの機能性領域は、非機能性領域よりも高度の相同性を有し得る。
抗原結合部位は一般に、可変重(VH)および可変軽(VL)免疫グロブリンドメインによって形成され、抗原結合界面は、相補性決定領域(CDR)と称される6つの表面ポリペプチドループによって形成される。各VH(HCDR1、HCDR2、HCDR3)および各VL(LCDR1、LCDR2、LCDR3)には、フレームワーク領域(FR)と共に3つのCDRが存在する。
VHドメインとVLドメインからなる抗体抗原結合部位は、典型的にはポリペプチドの6つのループ:軽鎖可変ドメイン(VL)からの3つと重鎖可変ドメイン(VH)からの3つによって形成される。公知の原子構造の抗体の分析は、抗体結合部位の配列と三次元構造との関係を解明することができる。
配列と構造の関係の研究は、公知の配列を有するが三次元構造が不明である抗体の残基を予測するために使用でき、これらの残基はCDRループの三次元構造を維持するのに重要であり、したがって結合特異性を維持する。構造的アプローチでは、WAMなどの自由に使用できるかまたは市販のパッケージを使用して抗体分子のモデルを作成することができる。次いで、Insight II(Accelrys,Inc.)またはDeep Viewなどのタンパク質可視化および分析ソフトウェアパッケージを使用して、CDRの各位置で可能な置換を評価し得る。次に、この情報を使用して、活性に対して最小限の作用または有益な作用を及ぼす可能性が高い置換を行い得る。
CDRおよび抗体VHまたはVLドメインの配列内でアミノ酸置換を行うための技術は当技術分野で利用可能である。
詳細な説明
本発明の実施形態は、抗グロボH抗体ならびに癌の診断および治療におけるそれらの使用に関する。本発明の実施は、細胞生物学、細胞培養、抗体技術、および遺伝子工学の従来の技術を含む技術を使用し、これらは当技術分野の通常の技術の範囲内である。
本発明の実施形態は、抗グロボH抗体ならびに癌の診断および治療におけるそれらの使用に関する。本発明の実施は、細胞生物学、細胞培養、抗体技術、および遺伝子工学の従来の技術を含む技術を使用し、これらは当技術分野の通常の技術の範囲内である。
以下の例は、ヒト化抗グロボH抗体の開発ならびに癌の診断および治療におけるそれらの使用を説明する。当業者は、これらの例が説明のみのためであり、本発明の範囲を限定することを意図しないことを認識するであろう。
上記のように、グロボHは六糖であり、乳癌、大腸癌、卵巣癌、膵臓癌、肺癌、および前立腺癌細胞を含む上皮癌細胞の表面で過剰発現される。グロボHに対する抗体は、そのような癌の治療と診断に有用であることが示されている。患者に使用するために、抗体は、望ましくない免疫学的応答がないなどの、副作用が最小限であるかまたは副作用を全く有さないべきである。本発明の実施形態は、ヒト化抗グロボH抗体に関する。これらのヒト化抗体は、良好な結合効率を有し、望ましくない免疫学的応答が全くないかまたは最小限である。
本発明の実施形態によれば、ヒト化抗グロボH抗体を生成するための一般的な方法は、グロボHに対するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを得ること、ハイブリドーマからCDR配列を得ること、およびCDR配列をヒトフレームワーク配列にクローニングしてヒト化抗体を作製することを含む。ヒト化抗体は、例えばフレームワーク領域の配列および/またはCDR配列を改善するためにさらに最適化し得る。図1は、ヒト化抗グロボH抗体を得るための本発明の一実施形態による方法を概説するフローチャートを示す。
様々な手順のための方法が当技術分野で公知である。以下の特定の例は、例示的な実施形態を説明する。しかしながら、当業者は、本発明の範囲から逸脱することなく修正または変形が可能であることを認識するであろう。
抗グロボH抗体のV領域の分子クローニング
最初に、抗グロボHのハイブリドーマ(例えばマウスGBHハイブリドーマ)を生成した。そのようなハイブリドーマは、モノクローナル抗体の作製のための標準的なプロトコルで生成され得る。次いで、例えばTRIzol(登録商標)試薬を使用して、ハイブリドーマの全RNAを単離した。次に、例えば一本鎖cDNA合成キット(Superscript III)とオリゴ(dT20)プライマーまたはIg-3’定常領域プライマーを使用して、cDNAを全RNAから合成した。
最初に、抗グロボHのハイブリドーマ(例えばマウスGBHハイブリドーマ)を生成した。そのようなハイブリドーマは、モノクローナル抗体の作製のための標準的なプロトコルで生成され得る。次いで、例えばTRIzol(登録商標)試薬を使用して、ハイブリドーマの全RNAを単離した。次に、例えば一本鎖cDNA合成キット(Superscript III)とオリゴ(dT20)プライマーまたはIg-3’定常領域プライマーを使用して、cDNAを全RNAから合成した。
次いで、免疫グロブリン遺伝子の重鎖および軽鎖可変領域をcDNAからクローニングした。例えば、抗グロボH mAbのVHおよびVL可変領域を、マウスIg-5’プライマーセット(Novagen)を使用して、PCRによってマウスGBHハイブリドーマcDNAから増幅した。PCR産物は、CloneJet(商標)PCR Cloning Kit(Ferments)を使用して適切なベクター(例えばpJET1.2ベクター)に直接クローニングし得る。pJET1.2ベクターには致死的な挿入が含まれており、所望の遺伝子がこの致死領域にクローニングされた場合にのみ選択条件を生き残る。これは、組換えコロニーの選択を容易にする。最後に、組換えコロニーを所望のクローンについてスクリーニングし、それらのクローンのDNAを単離して配列決定した。免疫グロブリン(IG)ヌクレオチド配列は、国際ImMunoGeneTics情報システム(IGMT)ウェブサイトで分析し得る。
抗体の発現および精製
抗体作製のために、単離したクローンを任意の適切な細胞で発現させ得る。一例として、F293細胞(Life technology)に抗グロボH mAb発現プラスミドをトランスフェクトし、7日間培養した。プロテインAアフィニティカラム(GE)を使用して抗グロボH抗体を培地から精製した。タンパク質濃度は、当技術分野で公知の手順を使用して、または製造者の指示に従って、Bio-Radタンパク質アッセイキットで測定し、12%SDS-PAGEで分析し得る。
抗体作製のために、単離したクローンを任意の適切な細胞で発現させ得る。一例として、F293細胞(Life technology)に抗グロボH mAb発現プラスミドをトランスフェクトし、7日間培養した。プロテインAアフィニティカラム(GE)を使用して抗グロボH抗体を培地から精製した。タンパク質濃度は、当技術分野で公知の手順を使用して、または製造者の指示に従って、Bio-Radタンパク質アッセイキットで測定し、12%SDS-PAGEで分析し得る。
ELISAアッセイ
抗体親和性は、ELISAまたはBiacoreなどの当技術分野で公知の任意の適切な方法で評価し得る。例えば、炭酸ナトリウム緩衝液(pH9.5)で希釈したグロボH-NH2(Oligotech)を96ウェルプレートに4℃で一晩被覆した。ブロッキング(例えばBSAを用いて)後、2倍連続希釈した抗グロボH抗体をウェルに添加し、37℃で2時間インキュベートした。結合後、ヤギ抗ヒトIgG-HRP(1:15000)を添加し、37℃で1時間インキュベートした。次に、3,3’,5,5’-テトラメチルベンジジン(TMB)基質を使用して発色させ、1N H2SO4の添加によって反応を停止させた。抗原抗体結合の程度は、プレートを読み取ることによって、すなわちELISAリーダ(BioRad Model680)を使用して450~655nmでの吸光度を測定することによって決定した。GraphPad Prism 5ソフトウェアなどの適切なソフトウェアを使用してデータを分析し得る。
抗体親和性は、ELISAまたはBiacoreなどの当技術分野で公知の任意の適切な方法で評価し得る。例えば、炭酸ナトリウム緩衝液(pH9.5)で希釈したグロボH-NH2(Oligotech)を96ウェルプレートに4℃で一晩被覆した。ブロッキング(例えばBSAを用いて)後、2倍連続希釈した抗グロボH抗体をウェルに添加し、37℃で2時間インキュベートした。結合後、ヤギ抗ヒトIgG-HRP(1:15000)を添加し、37℃で1時間インキュベートした。次に、3,3’,5,5’-テトラメチルベンジジン(TMB)基質を使用して発色させ、1N H2SO4の添加によって反応を停止させた。抗原抗体結合の程度は、プレートを読み取ることによって、すなわちELISAリーダ(BioRad Model680)を使用して450~655nmでの吸光度を測定することによって決定した。GraphPad Prism 5ソフトウェアなどの適切なソフトウェアを使用してデータを分析し得る。
抗グロボH抗体のヒト化
本発明の実施形態は、抗グロボH抗体のヒト化に関する。図2は、キメラ抗体およびヒト化抗体の概略図を示す。キメラ抗体は、異なる供給源(例えば異なる種)からの可変領域と定常領域を有するものである。例えば、上記の手順からクローニングしたマウス抗グロボH抗体の可変領域をヒト抗体の定常領域に移植して、キメラ抗体を生成し得る。
本発明の実施形態は、抗グロボH抗体のヒト化に関する。図2は、キメラ抗体およびヒト化抗体の概略図を示す。キメラ抗体は、異なる供給源(例えば異なる種)からの可変領域と定常領域を有するものである。例えば、上記の手順からクローニングしたマウス抗グロボH抗体の可変領域をヒト抗体の定常領域に移植して、キメラ抗体を生成し得る。
図3は、本発明の一実施形態によるキメラ抗体の結合アッセイを示す。結合アッセイは、上記のようにELISAで実施した。この結合曲線から、このキメラ抗体の結合定数は1.0nMより良好であると推定でき、予想されるように抗体の可変ドメインをヒト抗体の定常ドメインに移植しても結合を損なわないことを示す。
図2を参照すると、ヒト化抗体は、1つの種からのCDRと、ヒト免疫グロブリンからのフレームワーク領域および定常領域とを含む。ヒト化抗体を生成するための例示的な工程は以下の通りであり得る。
1)ヒトV領域フレームワークの選択。
マウスからの上記のクローニングした可変領域のフレームワーク領域と最も高い相同性を有するヒト免疫グロブリンからのフレームワークをIMGTデータベースから選択した。相同性比較に基づき、VH3サブグループの重鎖のフレームワークおよびVk1サブグループの軽鎖のフレームワークを、それぞれ、ヒト化抗グロボH mAb(GBH)のために選択した。
マウスからの上記のクローニングした可変領域のフレームワーク領域と最も高い相同性を有するヒト免疫グロブリンからのフレームワークをIMGTデータベースから選択した。相同性比較に基づき、VH3サブグループの重鎖のフレームワークおよびVk1サブグループの軽鎖のフレームワークを、それぞれ、ヒト化抗グロボH mAb(GBH)のために選択した。
2)CDR移植した抗グロボH抗体の構築。
6つの完全なマウスCDR配列を有するヒトフレームワーク(VLκサブグループIおよびVHサブグループIII)をPCRによって構築し、次いで抗体発現ベクターにサブクローニングした。当技術分野で公知の任意の適切なベクターを使用し得る。これによってハイブリッド可変領域(VHおよびVL)が生成される。
6つの完全なマウスCDR配列を有するヒトフレームワーク(VLκサブグループIおよびVHサブグループIII)をPCRによって構築し、次いで抗体発現ベクターにサブクローニングした。当技術分野で公知の任意の適切なベクターを使用し得る。これによってハイブリッド可変領域(VHおよびVL)が生成される。
3)復帰突然変異。
フレームワークへのCDRの移植は、異なる供給源からの可変ドメイン(VHおよびVL)をもたらす。そのような異種ドメインは、最適な配列を有さない場合がある。したがって、抗体の親和性は最良でない場合がある。結合親和性を改善するために、一部のアミノ酸を他の種に復帰突然変異させ得る。
フレームワークへのCDRの移植は、異なる供給源からの可変ドメイン(VHおよびVL)をもたらす。そのような異種ドメインは、最適な配列を有さない場合がある。したがって、抗体の親和性は最良でない場合がある。結合親和性を改善するために、一部のアミノ酸を他の種に復帰突然変異させ得る。
図4に示すように、抗体結合に影響を及ぼし得る重要なアミノ酸残基をコンピュータモデリングによって分析し得る。モデリングは、上部コア領域と界面領域を(例えば5Å領域内で)検討し得る。モデリングでは、成功事例に基づいて事前の知識も適用し得る。モデリングに基づき、例えばアミノ酸残基を元の種の対応するアミノ酸残基で置き換えるために、アミノ酸置換を実施し得る(すなわち復帰突然変異)。次に、改善された抗体を選択するために変異抗体を結合について評価し得る。
したがって、クローンGBH(B1)は初回の復帰突然変異から選択した。クローンGBH(Re1)およびGBH(Re2)は、B1クローンに基づいて、以下の追加の考慮事項を伴うさらなる突然変異から生成した:(i)Fv βバレルのほとんどの構造的に保存された鎖を回避する;(ii)比較的高い表面アクセス可能性(例えば30%を超える)によってリサーフェシング部位(マウスアミノ酸)をランク付けする;および(iii)一般的に報告されている危険部位のフレームワークを分類する。
図5に示すように、キメラ抗体(cGBH)はMCF7細胞に良好に結合する。しかし、ヒト化はこの結合を有意に低下させる(GBH(HH)を参照)。初回の復帰突然変異後、GBH(B1)は抗体のほとんどの結合活性を回復した。さらなる変異、GBH(Re1Re2)およびGBH(re2Re2)は、結合親和性を有意に改善した。これらの変異体の軽鎖および重鎖可変ドメインの配列を図8Aおよび8Bに示す。
4)重要なアミノ酸残基のCDR親和性の最適化およびアラニンスキャニング。
フレームワーク領域における上記の復帰突然変異に加えて、CDR配列を最適化することによって抗体親和性をさらに改善し得る。グロボH抗原とGBH(Re2Re2)抗体のコンピュータモデリングおよびコンピュータドッキングに基づき、部位特異的突然変異誘発によって選択的CDR変異クローンを生成した。変異クローンの結合親和性は、ELISA、Biacore、またはForteBioなどの任意の適切な方法で分析し得る。
フレームワーク領域における上記の復帰突然変異に加えて、CDR配列を最適化することによって抗体親和性をさらに改善し得る。グロボH抗原とGBH(Re2Re2)抗体のコンピュータモデリングおよびコンピュータドッキングに基づき、部位特異的突然変異誘発によって選択的CDR変異クローンを生成した。変異クローンの結合親和性は、ELISA、Biacore、またはForteBioなどの任意の適切な方法で分析し得る。
表1は、GBH(Re2Re2)を出発抗体として使用したアラニンスキャニング結果の例を示す。これらの結果は、4つの部位(CDRH1のI33、CDRH2のR50、CDRH3のE96、およびCDRL1のW27)でのアラニン置換が抗体親和性の著しい低下をもたらすことを示しており、これら4つの残基が抗体結合に重要であることを示す。一方で、他の部位(例えばCDRH2のN58、CDRL1のN28、CDRL1のD93、およびCDRL3のI94)でのアラニン置換は抗体結合に有意の影響を及ぼさず、これらの残基が抗原抗体相互作用に重要ではないことを示す。
上記のアラニンスキャニングからの重要な残基をさらに試験して、これらの重要な残基の重要性を確認することができる。図6に示すように、CDRH2のR50は重要な残基であり、他のアミノ酸による置換は結合を本質的に無効にした。
一方で、アラニンスキャニングによるいくつかの明らかに重要な残基は、類似のアミノ酸を許容し得る。例えば、図7Aに示すように、LCDR1のW27(図9B参照)は結合に重要であるが、他の芳香族アミノ酸残基(YおよびF)による置換は十分に許容され、しかし、この部位の他のアミノ酸置換は抗体結合を本質的に無効にした。これらの結果は、芳香族側鎖を有するアミノ酸残基がこの位置にある限り、抗体結合活性が実質的に保持されることを示す。
一方、アラニンスキャニング結果から重要ではないアミノ酸は、さらに最適化され得る。例えば、残基58(図9AにおけるGBH(C)のHCDR2のX’として示される)は重要ではなく、多くのアミノ酸がこの位置で十分に許容される(図7B)。中でも、グルタミン(Q)は最も高い結合活性を与える。同様に、LCDR1のZとして示される残基32(図9B)は、類似の極性を有するいくつかのアミノ酸を許容できる。例示的な抗体GBH(B13)では、このZはトレオニンである(図9B)。
他のアミノ酸(すなわちアラニン以外)での置換が結合の改善をもたらすかどうかを調べるために、CDRの他の残基も検討した。表2に示すように、QによるN58の置換(クローン名:VHB11)だけが結合のわずかな改善をもたらした。重要な残基の他のすべてのアミノ酸置換は、結合の喪失または減少をもたらした。
図8Aは、マウスクローン(M)(配列番号10)、ヒト化クローン(H)(配列番号11)、復帰突然変異クローン(B1)(配列番号12)、反復復帰突然変異クローン(Re2)(配列番号13)、およびVHB11クローン(B11)(配列番号14)の重鎖可変ドメインのフレームワーク領域の配列アラインメントを示す。図8Bは、マウスクローン(M)(配列番号15)、ヒト化クローン(H)(配列番号16)、復帰突然変異クローン(B1)(配列番号17)、反復復帰突然変異クローン(Re2)(配列番号18)、およびVHB11クローン(B11)(配列番号19)の軽鎖可変ドメインのフレームワーク領域の配列アラインメントを示す。
CDRL1では、残基32は結合に重要ではない。いくつかの残基、C、S、G、およびTは許容される。一例として、この位置にTを有するクローンB13を図9Bに示す。
図9Aは、コンセンサスクローンGBH(C)(配列番号20)および例示的なクローンGBH(B13)(配列番号21)の重鎖可変ドメインの配列を示す。図9Bは、コンセンサスクローンGBH(C)(配列番号22)および例示的なクローンGBH(B13)(配列番号23)の軽鎖可変ドメインの配列を示す。
親和性測定アッセイ-ForteBio
抗グロボH抗体の親和性を評価するために、グロボH-アミンを製造者の指示に従ってアミン反応性バイオセンサに固定化した。すべての測定は、ForteBio Octet Red96を使用して30°Cで実施した。親和性結合曲線の適合は、Octet Data Analysisソフトウェアが提供する所定のモデル(1:1結合)を使用して実施した。
抗グロボH抗体の親和性を評価するために、グロボH-アミンを製造者の指示に従ってアミン反応性バイオセンサに固定化した。すべての測定は、ForteBio Octet Red96を使用して30°Cで実施した。親和性結合曲線の適合は、Octet Data Analysisソフトウェアが提供する所定のモデル(1:1結合)を使用して実施した。
本発明の抗体は、例えばグロボHを発現する癌の診断において、グロボHを発現する細胞を可視化するために使用し得る。例として、細胞表面(例えばMCF7細胞)で発現されるグロボHに結合した抗グロボH抗体を可視化するために、MCF7細胞をスライドガラス(NUNC)上で培養し、次に4%パラホルムアルデヒドで固定した。PBSで洗浄した後、細胞を抗グロボH抗体で染色し、続いてヤギ抗ヒトFITC抗体(1:1000;Thermo Scientific)で染色した。一次抗体を含まない細胞を対照として含めた。試料を載せたスライドガラスを蛍光顕微鏡(Olympus)によるFITC蛍光画像および明視野画像によって検査した。
図10は、抗グロボH抗体によるMCF7細胞の免疫染色の結果を示す。パネルA~Cは、抗グロボH Abを用いたMCF7細胞の蛍光イメージングを示し、パネルA’~C’は同じ細胞の暗視野(BF)イメージングを示す。これらの結果は、本発明の抗体が実際に細胞表面のグロボHに結合できることを示す。
親和性測定アッセイ-Biacore(商標)
抗体親和性は、ELISAまたはBiaCore(商標)を用いて評価し得る。BiaCore(商標)アッセイでは、製造者の指示に従って標準的なアミン化学を使用して、グロボH-アミンをBiacore(商標)CM5チップ(Biacore,Uppsala,Sweden)に固定化した。抗グロボH抗体の独立した連続希釈液をマイクロプレート上で調製した。各試料を、例えば2つのフローセル:1つは対照細胞および他の1つはグロボHを固定化した細胞に50μL/分の流量で、2.5分間注入した。注入の終了時に結合速度を測定した。各試料の後に、10mMグリシンpH 2.5/1.5(v/v=1)を30μL/分の流量で45秒間注入することによってチップを再生した。すべての実験は、Biacore T100機器を使用して25.0°Cの一定温度で、HBS-EP緩衝液(Biacore(商標))中で行った。親和性結合曲線の適合は、Biacore T100評価ソフトウェア2.0が提供する所定のモデル(1:1結合)を使用して実施した。
抗体親和性は、ELISAまたはBiaCore(商標)を用いて評価し得る。BiaCore(商標)アッセイでは、製造者の指示に従って標準的なアミン化学を使用して、グロボH-アミンをBiacore(商標)CM5チップ(Biacore,Uppsala,Sweden)に固定化した。抗グロボH抗体の独立した連続希釈液をマイクロプレート上で調製した。各試料を、例えば2つのフローセル:1つは対照細胞および他の1つはグロボHを固定化した細胞に50μL/分の流量で、2.5分間注入した。注入の終了時に結合速度を測定した。各試料の後に、10mMグリシンpH 2.5/1.5(v/v=1)を30μL/分の流量で45秒間注入することによってチップを再生した。すべての実験は、Biacore T100機器を使用して25.0°Cの一定温度で、HBS-EP緩衝液(Biacore(商標))中で行った。親和性結合曲線の適合は、Biacore T100評価ソフトウェア2.0が提供する所定のモデル(1:1結合)を使用して実施した。
蛍光活性化細胞選別(FACS)
抗グロボH抗体は、例えばFACSを用いて、細胞表面でグロボHを発現する細胞を検出するために、またはグロボHを発現する細胞を選別するために使用し得る。グロボHを発現する細胞、MCF7またはHCC1428を採取し、5%PBS/FBS緩衝液に再懸濁した。細胞(1x105)を抗グロボH抗体(10μg/ml)またはハーセプチン(10μg/ml、陰性対照)と共に4℃で1時間インキュベートし、次にヤギ抗ヒトIgG FITCコンジュゲート(1/1000)を用いて4℃で1時間染色した。各アッセイについて、2つの追加対照を調製した;1つは一次抗体なしおよび他の1つは全く抗体なしの対照であった。処理したすべての試料をFACSVerse(Becton Dickinson)で分析し、結果をFACSuiteソフトウェア(Becton Dickinson)によって処理した。
抗グロボH抗体は、例えばFACSを用いて、細胞表面でグロボHを発現する細胞を検出するために、またはグロボHを発現する細胞を選別するために使用し得る。グロボHを発現する細胞、MCF7またはHCC1428を採取し、5%PBS/FBS緩衝液に再懸濁した。細胞(1x105)を抗グロボH抗体(10μg/ml)またはハーセプチン(10μg/ml、陰性対照)と共に4℃で1時間インキュベートし、次にヤギ抗ヒトIgG FITCコンジュゲート(1/1000)を用いて4℃で1時間染色した。各アッセイについて、2つの追加対照を調製した;1つは一次抗体なしおよび他の1つは全く抗体なしの対照であった。処理したすべての試料をFACSVerse(Becton Dickinson)で分析し、結果をFACSuiteソフトウェア(Becton Dickinson)によって処理した。
FACSに基づき、様々な癌細胞を、それらがグロボHを発現するかどうかを調べるために評価し得る。図11(A)~11(G)は、抗グロボH抗体とFACSを使用した様々な細胞株からのグロボH検出の結果を示す。図11(A)は、MCF7乳癌細胞がHer2抗原(上のパネル)およびグロボH抗原(下のパネル)の両方を発現することを示す。図11(B)は、HCC1428肝細胞癌細胞がHer2抗原(上のパネル)およびグロボH抗原(下のパネル)の両方を発現することを示す。図11(C)は、BT474乳癌細胞がHer2(上のパネル)を発現するが、グロボH(下のパネル)を発現しないことを示す。同様に、図11(D)は、Capan-1膵臓癌細胞がグロボHを発現することを示す。図11(E)は、A-431扁平上皮癌細胞がグロボHを発現することを示す。図11(F)は、NCI-N87胃癌細胞がグロボHを発現することを示す。図11(G)は、HT-29結腸直腸癌細胞が低レベルのグロボHを発現することを示す。これらの結果は、様々な癌の診断における抗グロボH抗体の有用性を実証する。
抗体依存性細胞媒介性細胞傷害(ADCC)
抗体依存性細胞媒介性細胞傷害(ADCC)は、抗体に基づく癌治療において重要な役割を果たす。本発明のヒト化抗グロボH抗体は、グロボHを発現する癌を治療するための有望な治療薬である。抗グロボH抗体のADCC活性を評価するために、精製ヒトNK細胞を抗体処理したヒト乳癌細胞(例えばHCC1428、MCF7、Capan-1、NCI-N87、A431、またはBT474細胞)と共に5:1のE/T比で3時間インキュベートした。ADCCアッセイのために、抗IL20抗体を陰性対照として使用し、ハーセプチン(Roche)を陽性対照として使用した。DELFIA EuTDA Cytotoxicity Reagents Kit(PerkinElmer)でTDA放出を用いて細胞死の割合を測定した。蛍光は、時間分解蛍光計(CLARIO、BGM)で測定した。
抗体依存性細胞媒介性細胞傷害(ADCC)は、抗体に基づく癌治療において重要な役割を果たす。本発明のヒト化抗グロボH抗体は、グロボHを発現する癌を治療するための有望な治療薬である。抗グロボH抗体のADCC活性を評価するために、精製ヒトNK細胞を抗体処理したヒト乳癌細胞(例えばHCC1428、MCF7、Capan-1、NCI-N87、A431、またはBT474細胞)と共に5:1のE/T比で3時間インキュベートした。ADCCアッセイのために、抗IL20抗体を陰性対照として使用し、ハーセプチン(Roche)を陽性対照として使用した。DELFIA EuTDA Cytotoxicity Reagents Kit(PerkinElmer)でTDA放出を用いて細胞死の割合を測定した。蛍光は、時間分解蛍光計(CLARIO、BGM)で測定した。
図12A~12Fは、抗グロボH抗体がMCF7(図12A)、HCC1428(図12B)、Capan-1(図12D)、NCI-N87(図12E)、およびA431(図12F)癌細胞を含む様々な癌細胞でADCCを誘導できることを示す。しかし、抗グロボH抗体は、BT474細胞(図12C)が表面にグロボHを発現しないという観察と一致して、BT474細胞ではADCCを誘導することができなかった。これらの結果は、抗グロボH抗体によって誘導されるADCCが細胞表面でのグロボHの発現に依存することを裏付け、抗グロボH抗体がグロボHを発現する癌細胞の死滅を誘導するのに有効であることを確認する。
補体依存性細胞傷害(CDC)
ADCCと同様に、補体依存性細胞傷害(CDC)は、抗体に基づく癌治療において重要な役割を果たす。CDCの誘導における本発明の抗グロボH抗体の能力を評価するために、以下の実験を実施した。これらの試験では、HCC1428、MCF7、BT474、Capan-1、またはNCI-N87細胞を含む抗体処理したヒト癌細胞に40%の正常ヒト血清(NHS)(v:v)を3時間添加した。抗IL20抗体とハーセプチンの両方をCDCアッセイの陰性対照として使用した。DELFIA EuTDA Cytotoxicity Reagents Kit(PerkinElmer)でTDA放出を用いて細胞死の割合を測定した。蛍光は、時間分解蛍光計(CLARIO、BGM)で測定した。
ADCCと同様に、補体依存性細胞傷害(CDC)は、抗体に基づく癌治療において重要な役割を果たす。CDCの誘導における本発明の抗グロボH抗体の能力を評価するために、以下の実験を実施した。これらの試験では、HCC1428、MCF7、BT474、Capan-1、またはNCI-N87細胞を含む抗体処理したヒト癌細胞に40%の正常ヒト血清(NHS)(v:v)を3時間添加した。抗IL20抗体とハーセプチンの両方をCDCアッセイの陰性対照として使用した。DELFIA EuTDA Cytotoxicity Reagents Kit(PerkinElmer)でTDA放出を用いて細胞死の割合を測定した。蛍光は、時間分解蛍光計(CLARIO、BGM)で測定した。
図13A~13Eは、抗グロボH抗体がMCF7細胞(図13A)、HCC1428細胞(図13B)、Capan-1細胞(図13D)、およびNCI-N87(図13E)細胞においてCDCを誘導できることを示す。しかし、抗グロボH抗体は、BT474細胞ではCDCを誘導することができなかった。これらの結果は、MCF7、Capan-1、NCI-N87、およびHCC1428細胞が表面にグロボHを発現するのに対し、BT4747細胞は発現しないという事実と一致する。これらの結果は、抗グロボH抗体がCDCを誘導できること、および抗グロボH抗体によって誘導されるCDCが細胞表面でのグロボHの発現に依存することを確認する。
グロボH競合アッセイ
抗グロボH抗体によって誘導される細胞傷害がグロボH依存性であることを確認するために、グロボH競合を実施することができる。1μMの抗グロボH抗体を、様々な濃度の合成グロボHまたはルイスb四糖(Sigma)のいずれかと共に37℃で1時間プレインキュベートした。ルイスb四糖を陰性対照として使用した。40%のNHS(v:v)を抗グロボH抗体-グリカン混合物に添加し、次いでヒト乳癌細胞株MCF7と共に3時間インキュベートした。DELFIA EuTDA Cytotoxicity Reagents Kit(PerkinElmer)でTDA放出を用いて細胞死の割合を測定した。蛍光は、時間分解蛍光計(CLARIO、BGM)で測定した。
抗グロボH抗体によって誘導される細胞傷害がグロボH依存性であることを確認するために、グロボH競合を実施することができる。1μMの抗グロボH抗体を、様々な濃度の合成グロボHまたはルイスb四糖(Sigma)のいずれかと共に37℃で1時間プレインキュベートした。ルイスb四糖を陰性対照として使用した。40%のNHS(v:v)を抗グロボH抗体-グリカン混合物に添加し、次いでヒト乳癌細胞株MCF7と共に3時間インキュベートした。DELFIA EuTDA Cytotoxicity Reagents Kit(PerkinElmer)でTDA放出を用いて細胞死の割合を測定した。蛍光は、時間分解蛍光計(CLARIO、BGM)で測定した。
図14は、抗グロボHによって誘導される細胞傷害が用量依存的にグロボH(フコース-ガラクトース-N-Ac-ガラクトサミン-ガラクトース-ガラクトース-グルコース)と競合することができるが、ルイスb四糖(フコース-ガラクトース-N-Ac-グルコサミン-フコース)とは競合できないことを示す。これらの結果は、抗グロボH抗体によって誘導される細胞傷害がグロボH依存性であることをさらに確認する。
異種移植動物モデル
抗グロボHがグロボH発現細胞のADCCおよびCDCを誘導できるという事実は、これらの抗体が表面にグロボHを発現する癌を予防および/または治療するのに有用であることを示す。
抗グロボHがグロボH発現細胞のADCCおよびCDCを誘導できるという事実は、これらの抗体が表面にグロボHを発現する癌を予防および/または治療するのに有用であることを示す。
癌の予防および/または治療における抗グロボH抗体の能力を評価するために、体重20~24g(6~7週齢)の5匹の雌性(NOD/SCID)マウスの群を使用する。生存可能なヒト乳癌HCC1428細胞(主催者によって提供された、マトリゲル0.2ml中1x107)をヌードマウスの背側に皮下注射する。Estol-Depot(100μg/マウス)を、細胞移植の1週間前から開始して週2回、7週間にわたってサプリメントとして皮下注射する。試験試薬(抗グロボH抗体、タキソール、またはビヒクル)を、細胞移植の2時間後(予防モデル)または7日後(治療モデル)から静脈内投与する。体重と腫瘍サイズを週2回、最大60日間記録する。腫瘍重量(mm3)は、長楕円体の式:長さ(mm)x[幅(mm)]2x0.5に従って推定する。試験化合物で処置した動物の腫瘍成長は、T/C(治療/対照)x100%として計算する;T/C 42%の値は、抗腫瘍活性を示すうえで有意と見なされる。
図15は、予防モデルにおいて、抗グロボH抗体が用量依存的に腫瘍の成長を防ぐことができたことを示す。10mg/Kg(mpk)の用量では、抗体はタキソールと同程度に有効であり、30mpkでは、抗体は癌の成長を防ぐうえでタキソールよりも有効であった。
図16は、治療モデルにおいて、抗グロボH抗体が用量依存的に腫瘍成長を抑制することができたことを示す。10mg/Kg(mpk)の用量では、抗体はタキソールと同程度に有効であり、20mpkおよび30mpkでは、抗体は癌の成長を防ぐうえでタキソールよりも有効であった。
これらのインビボモデルからの結果は、ヒト化抗グロボH抗体がグロボHを発現する癌、例えば乳癌、大腸癌、卵巣癌、膵臓癌、肺癌、肝臓癌、および前立腺癌を含む様々な上皮癌の予防および治療に使用できることを示す。
Claims (8)
- HCDR1、HCDR2、およびHCDR3からなる3つの相補性決定領域を有する重鎖可変ドメイン、ならびにLCDR1、LCDR2、およびLCDR3からなる3つの相補性決定領域を有する軽鎖可変ドメインを含み、
HCDR1の配列がGYISSDQILN(配列番号4)であり、
HCDR2の配列がRIYPVTGVTXYNHKFVG(配列番号5、Xは任意のアミノ酸である)であり、
HCDR3の配列がGETFDS(配列番号6)であり、
LCDR1の配列がKSNQNLLX’SGNRRYZLV(配列番号7、X’はF、YまたはWであり、ZはC、G、SまたはTである)であり、
LCDR2の配列がWASDRSF(配列番号8)であり、
LCDR3の配列がQQHLDIPYT(配列番号9)であり、
前記重鎖可変ドメインは、配列番号13における対応するフレームワーク配列に由来するフレームワーク配列を有し、
前記軽鎖可変ドメインは、配列番号18における対応するフレームワーク配列に由来するフレームワーク配列を有する、
ヒト化抗グロボH抗体、またはその抗原結合フラグメント。 - 配列番号5のXがアスパラギンまたはグルタミンである、
請求項1に記載のヒト化抗グロボH抗体、またはその抗原結合フラグメント。 - 配列番号7のX’がトリプトファンである、
請求項1または2に記載のヒト化抗グロボH抗体、またはその抗原結合フラグメント。 - 配列番号7のZがトレオニンまたはセリンである、
請求項1~3のいずれか一項に記載のヒト化抗グロボH抗体、またはその抗原結合フラグメント。 - 前記重鎖可変ドメインが配列番号20の配列を含み、前記軽鎖可変ドメインが配列番号22の配列を含む、
請求項1に記載のヒト化抗グロボH抗体、またはその抗原結合フラグメント。 - 前記重鎖可変ドメインが配列番号21の配列を含み、前記軽鎖可変ドメインが配列番号23の配列を含む、
請求項1に記載のヒト化抗グロボH抗体、またはその抗原結合フラグメント。 - 請求項1~6のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合フラグメントを含む、
癌を治療または予防するのに使用するための医薬組成物。 - 前記癌が、乳癌、大腸癌、卵巣癌、膵臓癌、肺癌、肝臓癌、または前立腺癌である、
請求項7に記載の医薬組成物。
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