KR101996660B1 - 구제역 바이러스 혈청형 Asia1 탐지용 단일클론항체 및 이의 용도 - Google Patents
구제역 바이러스 혈청형 Asia1 탐지용 단일클론항체 및 이의 용도 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 구제역 바이러스 Asia1형에 대한 특이 단일클론항체를 포함하는 구제역 바이러스 Asia1형 탐지용 조성물 및 상기 단일클론항체를 이용한 구제역 바이러스 Asia1형 탐지용 키트에 관한 것으로, 보다 상세하게는 구제역 바이러스 Asia1형에만 특이적으로 결합하는 단일클론항체의 특성을 활용하여 구제역 바이러스 Asia1형 혈청형만을 감별할 수 있는 진단 키트를 개발함으로써 질병의 확산 방지를 위한 신속한 초기 예방 조치를 수행할 수 있다.
Description
본 발명은 구제역 바이러스 혈청형 Asia1 탐지용 단일클론항체, 상기 단일클론항체를 이용한 구제역 바이러스 혈청형 Asia1 탐지 방법 및 상기 단일클론항체를 이용한 구제역 바이러스 혈청형 Asia1 탐지용 키트에 관한 것이다.
구제역 바이러스(Foot and Mouth Disease Virus; 이하, FMDV)는 Picornaviridae, aphthovirus에 속하는 RNA 바이러스로써 전세계적으로 7종의 혈청형(O, A, Asia1, C, SAT1, SAT2, SAT3)과 70여 종의 아형 바이러스가 분포하고 있다. FMDV에 감염된 개체(우제류 등)는 혀, 점막, 발굽 사이에 수포 및 가피를 형성하며 이병율이 높아 OIE에서 List A질병으로 분류하고 있고, 국내에서도 제1종 법정 전염병으로 분류하고 있다.
국내에서는 2000년 이후 2 내지 5년을 주기로 8차례 구제역이 발생하여 막대한 경제적 피해(예를 들어, 2010년 안동에서 발생된 경우 직접적 피해규모 약 3조원 추정)가 초래되었으며, 가장 최근에는 2014년 12월부터 2015년 4월까지 7개 시도에서 약 185건, 2016년도 1월 내지 3월 사이 21건의 구제역이 발생된 바 있다.
현재 구제역 바이러스 항원을 진단하는 방법으로는 크게 유전자 검출 방법과 바이러스 단백질 항원을 검출하는 방법으로 나눌 수 있다. 유전자 검출방법으로는 리얼타임 RT-PCR 또는 일반적인 RT-PCR 등이 있으며, 단백질을 검출하는 방법으로는 항원 효소면역측정법(Antigen detecting Enzyme Linked Immunosorbent Assay, Ag-ELISA), 래피드 키트(immunochromatographic assay) 등을 들 수 있다.
리얼타임 RT-PCR의 경우, 구제역 바이러스 검출 민감도가 가장 높은 방법으로써, 감염의심 시료(혈액, 타액, 정액, 조직 등)를 실험실로 수송하여, 특수 차폐 실험실 내(생물안전3등급 실험실)에서 시료로부터 총 RNA를 채취하여, 형광 검출 리얼타임 PCR 기기로 구제역 바이러스 특이 유전자 증폭을 수행하여, 구제역 양성 여부를 확인하는데 사용되나, RNA 추출부터 리얼타임 PCR을 작동하는 단계까지 상당한 숙련된 연구자가 요구되며, 특수 실험실 및 고가의 시약과 장비가 필요하다.
항원 효소면역측정법의 경우, 구제역 양성을 판정함과 동시에 혈청형까지 분석할 수 있는 방법이나, 특수 차폐 실험실 내에서 인큐베이터(incubator), 플레이트 와셔(plate washer), 리더(reader) 등의 장비가 필요하며, 숙련된 연구자가 요구되며, 3시간 이상의 검사 시간이 소요된다.
현장 진단키트(immunochromatographic assay)의 경우, 니트로셀룰로오즈 막의 모세관력(capillary force)과 금 나노입자 등을 이용한 시그널링을 통해 구성된 진단시스템으로써, 별도의 장비나 숙련도 등이 필요 없으며, 구제역이 발생된 농장에서 이동하지 않고 바로 그 현장 내에서 시료 적용 후 10 내지 15분 이내에 결과 확인이 가능한 장점이 있다. 구제역 임상 축이 발생된 현장에서 채취된 수포시료를 적용하여 구제역 여부를 판단할 수 있는 구제역 공통 신속 진단키트는 기 개발되어 발생 초기에 신속하게 진단할 수 있는 체계를 갖추고 있다.
그러나 구제역 바이러스는 7종의 혈청형으로 뚜렷이 구분되어 혈청형 상호 방어가 되지 않는 특성이 있어, 질병의 확산 방지를 위한 신속한 초기 예방 조치를 위한 적정한 백신 선정을 위해서는, 현장에서 혈청형 분석까지 가능한 혈청형 감별 신속 진단키트 개발이 매우 시급한 실정이며, 혈청형 Asia1을 신속하게 감별할 수 있는 현장 진단키트 개발이 방역 현장에서 우선적으로 필요한 상황이다.
본 발명의 목적은 구제역 바이러스(Foot and Mouth Disease Virus; 이하, FMDV) 혈청형(serotype) Asia1에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 FMDV 혈청형 Asia1에 특이적으로 결합하는 항체의 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 FMDV 혈청형 Asia1에 특이적으로 결합하는 항체의 경쇄 가변영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 중쇄 가변영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 FMDV 혈청형 Asia1에 특이적으로 결합하는 항체의 경쇄 가변영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 중쇄 가변영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 숙주세포를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 FMDV 혈청형 Asia1 탐지용 래피드 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 FMDV 혈청형 Asia1 탐지 방법을 제공하는 것이다.
본 발명은 구제역 바이러스(Foot and Mouth Disease Virus; FMDV) 혈청형(serotype) Asia1에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편 및 그 용도에 관한 것이다.
이하 본 발명을 더욱 자세히 설명하고자 한다.
본 발명의 일 예는 구제역 바이러스(Foot and Mouth Disease Virus; FMDV) 혈청형(serotype) Asia1에 특이적으로 결합하는 단일클론항체에 관한 것이다.
구제역 바이러스는 피코르나바이러스과 아프터바이러스(Aphthovirus)속에 속하며, 여과성 병원체로서 처음 발견된 동물바이러스로서 소 등 우제류 동물에 감염된다. 바이러스의 입자는 직경이 22 내지 28 nm이고, 외피(envelope)가 없이 4종류의 구성 단백질 60분자로 구성된 캡시드(Capsid) 단백질이 5′말단에 VPg 단백질이 공유 결합된 외가닥의 (+)RNA를 둘러싸고 있다.
구제역 바이러스는 7종의 혈청형인 O, A, Asia1, C, SAT1, SAT2 및 SAT3으로 구성되며, 혈청형 간 상호 방어 면역이 형성되지 않는다. 다시 말해서, 감수성 동물에 구제역 바이러스 O형 혈청형에 대한 백신을 접종하여 적정한 방어 면역이 형성되었더라도 다른 구제역 바이러스 혈청형 Asia1 바이러스가 침입하게 되면 방어되지 못하고 구제역이 발생하게 된다.
구제역의 확산 방지를 위한 신속한 초기 예방 조치로서 적정한 백신 선정을 위해서는 현장에서 혈청형 분석까지 가능한 혈청형 감별 신속 진단키트 개발이 매우 시급한 실정이며, 혈청형 Asia1을 신속하게 감별할 수 있는 현장 진단키트 개발이 방역 현장에서 우선적으로 필요한 상황이다.
완전한 항체는 2개의 전장(full length) 경쇄 및 2개의 전장 중쇄를 가지는 구조이며 각각의 경쇄는 중쇄와 이황화 결합으로 연결되어 있다. 항체의 불변 영역은 중쇄 불변 영역과 경쇄 불변 영역으로 나눠지며, 중쇄 불변 영역은 감마(γ), 뮤(μ), 알파(α), 델타(δ) 및 엡실론(ε) 타입을 가지고, 서브클래스로 감마1(γ1), 감마2(γ2), 감마3(γ3), 감마4(γ4), 알파1(α1) 및 알파2(α2)를 가진다. 경쇄의 불변 영역은 카파(κ) 및 람다(λ) 타입을 가진다.
용어, "단일클론항체"는 상기 항체 분자가 단일 분자로 구성되도록 제조된 것을 의미한다. 단일클론항체는 동일한 에피토프를 갖는 항원에 대해서만 반응하는 특이성을 가지며, 또한 특정 에피토프에 대해서만 친화성을 나타낸다.
상기 단일클론항체는 수탁번호 KCTC 18603P인 하이브리도마 세포에서 생산되는 것일 수 있다.
상기 하이브리도마 세포는 당업계에 공지된 방법을 사용하여 제조할 수 있다. 구체적으로, 상기 하이브리도마 세포는 면역원인 FMDV 혈청형 Asia1을 동물에 면역시키고, 상기 피면역 동물로부터 유래된 항체 생산세포인 B 세포를 골수종세포와 융합시켜서 하이브리도마를 제조한 다음, 그 중에서 구제역 바이러스 혈청형 Asia1에 특이적으로 결합하는 단일클론항체를 생산하는 하이브리도마를 선택하는 방법으로 제조할 수 있다.
상기 피면역 동물은 실시예에서 사용된 마우스뿐만 아니라 염소, 양, 모르모트, 래트 또는 토끼와 같은 동물을 사용할 수 있다.
상기 피면역 동물을 면역시키는 방법으로서는 당업계에 이미 공지된 방법을 사용할 수 있다. 예를 들어, 마우스를 면역시키는 경우 1회에 1 내지 100 ㎍의 면역원을 동량의 생리 식염수 및/또는 프로인드 어주번트(Freund's adjuvant) 등의 항원 보조제로 유화시켜, 상기 피면역원 동물의 복부의 피하 또는 복강 내에 2 내지 5주마다 2 내지 6회 접종시키는 방법으로 수행될 수 있다.
피면역 동물을 면역시킨 후에는 최종 면역 3 내지 5일 후 비장 또는 림프절을 적출하여 당업계에서 이미 공지되어 있는 세포 융합법에 따라서, 융합 촉진제의 존재 하에 이들의 조직에 포함되어 있는 B 세포를 골수종세포와 융합시키게 된다. 상기 융합 촉진제는 예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜(PEG)과 같은 물질을 사용할 수 있다.
상기 골수종세포는 예를 들어, P3U1, NS-1, P3x63. Ag 8.653, Sp2/0-Ag14와 같은 마우스 유래 세포, AG1, AG2와 같은 래트 유래 세포를 사용할 수 있으나, 이에 한정하지 않는다.
또한, 상기 당업계에 공지된 세포 융합법은 예를 들어, B세포와 골수종세포를 1:1 내지 10:1의 비율로 혼합시켜, 이에 분자량 1,000 내지 6,000의 PEG를 10 내지 80%의 농도로 첨가하여, 30 내지 37에서 1 내지 10분 동안 배양하는 방법으로 수행될 수 있다.
또한, 상기 FMDV 혈청형 Asia1에 특이적으로 결합하는 단일클론항체를 생산하는 하이브리도마는, 예를 들어, 하이브리도마만이 생존 가능한 HAT 배지 등의 선택 배지에서 배양하고, 하이브리도마 배양 상층액 중의 항체 활성을 ELISA 등의 방법을 이용하여 측정하여 선택할 수 있다.
최종적으로, FMDV 혈청형 Asia1에 특이적으로 결합하는 단일클론항체를 생산하는 하이브리도마는, 예를 들어, FMDV 혈청형 Asia1에 특이적으로 결합하는 단일클론항체를 생산하는 하이브리도마에 대하여, 한계 희석 등의 방법에 의해 클로닝을 반복함으로써 선별될 수 있다.
한편, 상기 단일클론항체는 IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3, IgA, IgM 타입일 수 있으며, 예를 들어, IgG1 타입일 수 있다.
또한, 상기 항체의 경쇄 불변 영역은 λ 또는 κ 형일 수 있다.
본 발명의 다른 일 예는 서열번호 1, 서열번호 2 및 서열번호 3으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 중쇄 CDR(complementarity determining region) 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 5, 서열번호 6 및 서열번호 7로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 경쇄 CDR 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 FMDV 혈청형 Asia1에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편에 관한 것이다.
상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 서열번호 1, 서열번호 2 및 서열번호 3으로 각각 표시되는 중쇄 CDR1(complementarity determining region 1), CDR2(complementarity determining region 2) 및 CDR3(complementarity determining region 3) 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 서열번호 5, 서열번호 6 및 서열번호 7로 각각 표시되는 경쇄 CDR1(complementarity determining region 1), CDR2(complementarity determining region 2) 및 CDR3(complementarity determining region 3) 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;을 포함하는 것일 수 있다.
또한, 상기 중쇄 가변 영역은 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어지고, 상기 경쇄 가변 영역은 서열번호 8의 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있다.
용어 "항체(antibody)"는 FMDV 혈청형 Asia1에 대한 특이 항체로서, FMDV 혈청형 Asia1에 대해 특이적으로 결합하며, 완전한 항체 형태뿐만 아니라 항체 분자의 항원 결합 단편을 포함한다. 완전한 항체에 대한 설명은 상기 언급한 바와 같다.
용어, "중쇄(heavy chain)"는 항원에 특이성을 부여하기 위해 충분한 가변 영역 서열을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 가변 영역 도메인 VH 및 3개의 불변 영역 도메인 CH1, CH2 및 CH3를 포함하는 전장 중쇄 및 이의 단편을 모두 포함하는 의미로 해석된다.
용어, "경쇄(light chain)"는 항원에 특이성을 부여하기 위한 충분한 가변영역 서열을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 가변 영역 도메인 VL 및 불변 영역 도메인 CL을 포함하는 전장 경쇄 및 이의 단편을 모두 포함하는 의미로 해석된다.
용어, "CDR(complementarity determining region)"은 면역글로불린의 중쇄 및 경쇄의 고가변 영역(hypervariable region)의 아미노산 서열을 의미한다. 중쇄 및 경쇄는 각각 3개의 CDR을 포함할 수 있다(CDRH1, CDRH2, CDRH3 및 CDRL1, CDRL2, CDRL3). 상기 CDR은 항체가 항원 또는 에피토프에 결합하는 데 있어서 주요한 접촉 잔기를 제공할 수 있다.
용어, "항원 결합 단편"은 면역글로불린 전체 구조에 대한 그의 단편으로, 항원이 결합할 수 있는 부분을 포함하는 폴리펩티드의 일부를 의미한다. 예를 들어, F(ab')2, Fab', Fab, Fv 또는 scFv일 수 있으나, 이에 한정하지 않는다. 상기 항원 결합 단편 중 Fab는 경쇄 및 중쇄의 가변영역과 경쇄의 불변 영역 및 중쇄의 첫 번째 불변 영역(CH1)을 가지는 구조로 1개의 항원 결합 부위를 가진다. Fab'는 중쇄 CH1 도메인의 C-말단에 하나 이상의 시스테인 잔기를 포함하는 힌지 영역(hinge region)을 가진다는 점에서 Fab와 차이가 있다. F(ab')2 항체는 Fab'의 힌지 영역의 시스테인 잔기가 디설파이드 결합을 이루면서 생성된다. Fv는 중쇄 가변부위 및 경쇄 가변부위만을 가지고 있는 최소의 항체조각으로 Fv 단편을 생성하는 재조합 기술은 당업계에 널리 공지되어 있다. 이중쇄 Fv(two-chain Fv)는 비공유 결합으로 중쇄 가변부위와 경쇄 가변부위가 연결되어 있고 단쇄 Fv(single-chain Fv)는 일반적으로 펩타이드 링커를 통하여 중쇄의 가변 영역과 단쇄의 가변 영역이 공유 결합으로 연결되거나 또는 C-말단에서 바로 연결되어 있어서 이중쇄 Fv와 같이 다이머와 같은 구조를 이룰 수 있다. 상기 항원 결합 단편은 단백질 가수분해 효소를 이용해서 얻을 수 있고(예를 들어, 전체 항체를 파파인으로 제한 절단하면 Fab를 얻을 수 있고 펩신으로 절단하면 F(ab')2 단편을 얻을 수 있다), 유전자 재조합 기술을 통하여 제작할 수 있다.
상기 항체는 단일클론항체, 이특이적 항체, 비-인간 항체, 인간 항체, 인간화 항체, 키메릭 항체, 단쇄 Fvs(scFV), 단쇄 항체, Fab 단편, F(ab')단편, 다이설파이드-결합 Fvs(sdFV) 및 항-이디오타입(항-Id) 항체, 그리고 상기 항체들의 에피토프-결합 단편을 포함하나 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 항체는 인간화 항체(humanized antibody) 또는 인간 항체(human antibody)일 수 있다. 비-인간, 예를 들어, 마우스의 인간화 항체는 마우스의 면역글로불린으로부터 유도되는 최소 서열을 포함하는 키메릭 면역글로불린, 면역글로불린의 쇄 또는 그의 단편, 예를 들어, Fv, Fab, Fab', F(ab')2 또는 항체의 기타 항원-결합 서브서열일 수 있다.
비-인간 항체를 인간화시키는 방법은 당업계에 널리 공지되어 있다. 일반적으로, 인간화 항체는 비-인간인 공급원으로부터 도입된 하나 이상의 아미노산 잔기를 갖는다. 인간화는 필수적으로 설치류 동물의 CDR 또는 CDR 서열을 인간 항체에 상응하는 서열 대신 치환시켜 수행될 수 있다. 따라서, 이러한 인간화 항체는 키메릭 항체이며, 실질적으로 온전한 인간 항체의 가변 영역보다 적은 영역이 비-인간 종으로부터 상응하는 서열에 의해 치환될 수 있다. 예를 들어, 인간화 항체는 일부 CDR 잔기 및 가능하게는 일부 골격(framework, FR) 잔기가 설치류 동물의 항체에 있는 유사 부위로부터의 잔기로 대체된 인간화 항체일 수 있다.
상기 인간 항체는 중쇄 및 경쇄의 가변 및 불변영역의 서열이 인간으로부터 유래한 항체를 의미하며, 인간 항체는 파아지 디스플레이 라이브러리를 포함한 당업자에게 널리 알려진 다양한 기술, 예를 들어, 유전적 재조합 기술과 세포공학 기술을 이용하여 생성될 수 있다.
용어, "키메릭"은 항체 또는 항원-결합 부위가 2개의 상이한 종으로부터 유래한 서열들을 포함하는 것을 의미한다.
상기 FMDV 혈청형 Asia1에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편은, FMDV 혈청형 Asia1을 특이적으로 인식할 수 있는 범위 내에서 첨부한 서열번호에 기재된 아미노산 서열의 변이체를 포함할 수 있다.
예를 들면, 항체의 결합 친화도 및/또는 기타 생물학적 특성을 개선시키기 위하여 항체의 아미노산 서열에 변화를 줄 수 있다. 이러한 변형은, 예를 들어, 항체의 아미노산 서열 잔기의 결실, 삽입 및/또는 치환을 포함한다. 이러한 아미노산의 변이는 아미노산 곁사슬 치환체의 상대적 유사성, 예를 들어, 소수성, 친수성, 전하, 크기와 같은 특성에 기초하여 이루어진다. 예를 들어, 아르기닌, 라이신과 히스티딘은 모두 양전하를 띤 잔기이고, 알라닌, 글리신과 세린은 유사한 크기를 가지며, 페닐알라닌, 트립토판과 티로신은 유사한 모양을 갖는다. 따라서, 상기 고려 사항에 기초하여, 아르기닌, 라이신과 히스티딘; 알라닌, 글리신과 세린; 및 페닐알라닌, 트립토판과 티로신은 생물학적으로 기능 균등물이라 할 수 있다.
한편, 분자의 활성을 전체적으로 변경시키지 않는 단백질에서의 아미노산 교환은 당해 분야에 공지되어 있다. 가장 통상적으로 일어나는 교환은 아미노산 잔기 Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Thy/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu, Asp/Gly 간의 교환이다.
상기 생물학적 균등 활성을 갖는 변이를 고려한다면, 상기 FMDV 혈청형 Asia1에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 서열번호에 기재된 서열과 실질적인 동일성(substantial identity)을 나타내는 서열도 포함하는 것으로 해석될 수 있다.
상기의 실질적인 동일성은, 상기한 서열번호의 아미노산 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 얼라인하고, 당업계에서 통상적으로 이용되는 알고리즘을 이용하여 얼라인된 서열을 분석한 경우에, 최소 60%의 상동성, 최소 70%의 상동성, 최소 80%의 상동성 또는 최소 90%의 상동성을 나타내는 서열일 수 있다.
서열의 비교를 위한 얼라인먼트 방법은 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, NCBI Basic Local Alignment Search Tool (BLAST)를 통해, 인터넷상에서 blastp, blastx, tblastn 및 tblastx와 같은 서열 분석 프로그램을 이용할 수 있다.
본 발명의 또 다른 일 예는 FMDV 혈청형 Asia1에 특이적으로 결합하는 항체의 중쇄 가변 영역 및/또는 경쇄 가변 영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다.
일 양태로서 상기 중쇄 가변 영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 FMDV 혈청형 Asia1에 특이적으로 결합하는 항체의 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 가변 영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드인 것일 수 있다.
상기 중쇄 가변 영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 12의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 것일 수 있다.
일 양태로서 상기 경쇄 가변 영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 FMDV 혈청형 Asia1에 특이적으로 결합하는 항체의 서열번호 8의 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 가변 영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드인 것일 수 있다.
상기 경쇄 가변 영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 16의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 것일 수 있다.
용어, "폴리뉴클레오티드(polynucleotide)"는 단일가닥 또는 이중가닥 형태로 존재하는 디옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드의 중합체이다. RNA 게놈 서열, DNA(gDNA 및 cDNA) 및 이로부터 전사되는 RNA 서열을 포괄하며, 특별하게 다른 언급이 없는 한 천연의 폴리뉴클레오티드의 유사체를 포함한다.
상기 폴리뉴클레오티드는 상기 FMDV 혈청형 Asia1에 특이적으로 결합하는 항체의 중쇄 가변 영역 또는 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열뿐만 아니라, 그 서열에 상보적인(complementary) 서열도 포함한다.
상기 상보적인 서열은 완벽하게 상보적인 서열뿐만 아니라, 실질적으로 상보적인 서열도 포함하며, 이는 당업계에 공지된 엄격 조건(stringent conditions) 하에서, 예를 들어, 상기 구제역 바이러스(Foot and Mouth Disease Virus; FMDV) 혈청형(serotype) Asia1에 특이적으로 결합하는 항체의 중쇄 가변 영역 또는 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 뉴클레오티드 서열과 혼성화될 수 있는 서열을 의미한다.
또한, 상기 중쇄 가변영역 및/또는 경쇄 가변영역의 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 변형될 수 있다. 상기 변형은 뉴클레오티드의 추가, 결실 또는 비보존적 치환 또는 보존적 치환을 포함한다.
상기 FMDV 혈청형 Asia1에 특이적으로 결합하는 항체의 중쇄 가변 영역 및/또는 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 상기 뉴클레오티드 서열에 대하여 실질적인 동일성을 나타내는 뉴클레오티드 서열도 포함하는 것으로 해석된다.
상기의 실질적인 동일성은, 상기 뉴클레오티드 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 얼라인하고, 당업계에서 통상적으로 이용되는 알고리즘을 이용하여 얼라인된 서열을 분석한 경우에, 최소 80%의 상동성, 최소 90%의 상동성 또는 최소 95%의 상동성을 나타내는 서열일 수 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 FMDV 혈청형 Asia1에 특이적으로 결합하는 항체의 경쇄 가변영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 중쇄 가변영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터를 제공하는 것이다.
상기 경쇄 가변영역은 서열번호 8의 아미노산서열로 이루어진 경쇄 가변영역인 것일 수 있으며, 상기 중쇄 가변영역은 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 가변영역인 것일 수 있다.
상기 경쇄 가변영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 16의 뉴클레오티드 서열로 이루어지고, 상기 중쇄 가변영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 12의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 것일 수 있다.
용어, "벡터"는 숙주 세포에서 목적 유전자를 발현시키기 위한 수단을 의미한다. 예를 들어, 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터 및 박테리오파아지 벡터, 아데노바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터 및 아데노-연관 바이러스 벡터와 같은 바이러스 벡터를 포함한다. 상기 재조합 벡터로 사용될 수 있는 벡터는 당업계에서 종종 사용되는 플라스미드 (예를 들면, pSC101, pGV1106, pACYC177, ColE1, pKT230, pME290, pBR322, pUC8/9, pUC6, pBD9, pHC79, pIJ61, pLAFR1, pHV14, pGEX 시리즈, pET 시리즈 및 pUC19 등), 파지 (예를 들면, λgt4λB, λ-Charon, λΔz1 및 M13 등) 또는 바이러스 (예를 들명, SV40 등)를 조작하여 제작될 수 있다.
상기 재조합 벡터에서 상기 중쇄 가변영역 및 경쇄 가변영역의 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 프로모터에 작동적으로 연결될 수 있다. 용어, "작동적으로 연결된(operatively linked)"은 뉴클레오티드 발현 조절 서열(예: 프로모터 서열)과 다른 뉴클레오티드 서열 사이의 기능적인 결합을 의미한다. 따라서, 이에 의해 상기 조절 서열은 상기 다른 뉴클레오티드 서열의 전사 및/또는 해독을 조절할 수 있다.
상기 재조합 벡터는, 전형적으로 클로닝을 위한 벡터 또는 발현을 위한 벡터로서 구축될 수 있다. 상기 발현용 벡터는 당업계에서 식물, 동물 또는 미생물에서 외래의 단백질을 발현하는 데 사용되는 통상의 것을 사용할 수 있다. 상기 재조합 벡터는 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 구축될 수 있다.
상기 재조합 벡터는 원핵 세포 또는 진핵 세포를 숙주로 하여 구축될 수 있다. 예를 들어, 사용되는 벡터가 발현 벡터이고, 원핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 전사를 진행시킬 수 있는 강력한 프로모터 (예컨대, pL λ프로모터, trp 프로모터, lac 프로모터, tac 프로모터, T7 프로모터 등), 해독의 개시를 위한 라이보좀 결합 자리 및 전사/해독 종결 서열을 포함하는 것이 일반적이다. 진핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 벡터에 포함되는 진핵 세포에서 작동하는 복제원점은 f1 복제원점, SV40 복제원점, pMB1 복제원점, 아데노 복제원점, AAV 복제원점 및 BBV 복제원점 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 포유동물 세포의 게놈으로부터 유래된 프로모터 (예: 메탈로티오닌 프로모터) 또는 포유동물 바이러스로부터 유래된 프로모터 (예: 아데노바이러스 후기 프로모터, 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터, SV40 프로모터, 사이토메갈로바이러스 프로모터 및 HSV의 tk 프로모터)가 이용될 수 있으며, 전사 종결 서열로서 폴리아데닐화 서열을 일반적으로 갖는다.
한편, 상기 항체의 중쇄 가변영역 및 경쇄 가변영역을 발현할 수 있는 벡터는 중쇄 가변영역 및 경쇄 가변영역이 하나의 벡터에서 동시에 발현되는 벡터 시스템이거나 또는 중쇄 가변영역 및 경쇄 가변영역을 각각 별도의 벡터에서 발현시키는 시스템 모두 가능하다. 후자의 경우, 두 벡터는 동시 형질전환 (co-transfomation) 및 표적 형질전환 (targeted transformation)을 통하여 숙주 세포로 도입될 수 있다.
본 발명의 또 다른 일 예는 FMDV 혈청형 Asia1에 특이적으로 결합하는 항체의 경쇄 가변영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 중쇄 가변영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 숙주세포에 관한 것이다.
상기 숙주세포는 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 가변영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 및 서열번호 8의 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 가변영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 것일 수 있다.
즉, 상기 숙주세포는 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 가변영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 및 서열번호 8의 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 가변영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 숙주 세포의 게놈 상에 포함하거나, 또는 상기 폴리뉴클레오티드 서열이 포함된 재조합 벡터를 포함하는 것이다.
상기 중쇄 가변 영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 12의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 것일 수 있다.
상기 경쇄 가변 영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 16의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 것일 수 있다.
상기 재조합 벡터를 안정되면서 연속적으로 클로닝 또는 발현시킬 수 있는 숙주 세포는 당업계에 공지된 어떠한 숙주 세포도 이용할 수 있으며, 원핵 세포로는, 예를 들어, E. coli JM109, E. coli BL21, E. coli RR1, E. coli LE392, E. coli B, E. coli X 1776, E. coli W3110, 바실러스 서브틸리스, 바실러스 츄린겐시스와 같은 바실러스 속 균주, 그리고 살모넬라 티피무리움, 세라티아 마르세슨스 및 다양한 슈도모나스 종과 같은 장내균과 균주 등이 있으며, 진핵 세포에 형질 전환시키는 경우에는 숙주 세포로서, 효모(Saccharomyce cerevisiae), 곤충 세포, 식물 세포 및 동물 세포, 예를 들어, Sp2/0, CHO(Chinese hamster ovary) K1, CHO DG44, PER.C6, W138, BHK, COS-7, 293, HepG2, Huh7, 3T3, RIN 및 MDCK 세포주 등이 이용될 수 있다.
상기 폴리뉴클레오티드 또는 이를 포함하는 재조합 벡터의 숙주 세포 내로의 운반은, 당업계에 널리 알려진 운반 방법을 사용할 수 있다. 상기 운반 방법은 예를 들어, 숙주 세포가 원핵 세포인 경우, CaCl2 방법 또는 전기 천공 방법 등을 사용할 수 있고, 숙주 세포가 진핵 세포인 경우에는, 미세 주입법, 칼슘 포스페이트 침전법, 전기 천공법, 리포좀-매개 형질감염법 및 유전자 밤바드먼트 등을 사용할 수 있으나, 이에 한정하지는 않는다.
E. coli 등의 미생물을 이용하는 경우 생산성은 동물세포 등에 비하여 높은 편이나 당화(glycosylation) 문제로 인해 인택트(intact)한 Ig 형태의 항체 생산에는 적당하지 않지만, Fab 및 Fv와 같은 항원 결합 단편의 생산에는 사용될 수 있다.
상기 형질 전환된 숙주 세포를 선별하는 방법은 선택 표지에 의해 발현되는 표현형을 이용하여, 당업계에 널리 알려진 방법에 따라 용이하게 실시할 수 있다. 예를 들어, 상기 선택 표지가 특정 항생제 내성 유전자인 경우에는, 상기 항생제가 함유된 배지에서 형질전환체를 배양함으로써 형질전환체를 용이하게 선별할 수 있다.
본 발명의 또 다른 일 예는 구제역 바이러스(Foot and Mouth Disease Virus; FMDV) 혈청형(serotype) Asia1 에 특이적으로 결합하는 단일클론항체를 생산하는 하이브리도마 세포에 관한 것이다.
상기 하이프리도마 세포는 수탁번호 KCTC 18603P인 것인 하이브리도마 세포일 수 있다.
상기 하이브리도마 세포는 한국생명공학연구원 KCTC(Korean Collection for Type Cultures)에 2017년 09월 11일자로 수탁번호 KCTC 18603P로 기탁하였다.
한편, 기탁된 하이브라도마 세포는 미생물 기탁에 대한 부다페스트 조약의 규정에 따라 보관되고 상기 수탁 번호를 참조하여 일반인들에게 분양이 가능하다. 즉, 기탁물들은 기탁 시료 관리를 위한 가장 최근의 요청 이후 적어도 5년의 기간 동안, 어떤 경우에는 기탁일 이후 적어도 30년의 기간 동안 또는 그 기탁물의 개시를 공표하는 어느 특허의 강제 가능한 시기 동안, 그 기탁물의 생존을 유지하고 오염되지 않도록 모든 주의를 다하여 보관한다.
기탁자에게는 기탁물의 상태 때문에 요청 시 수탁기관이 시료를 분양할 수 없을 경우에는 그 기탁물을 대체해야 하는 의무가 있다. 대상이 되는 기탁물에 대한 일반인의 입수 가능성을 제한하는 모든 제약들은 그 기탁물을 개시하고 있는 특허가 허여되면 완전히 없어지게 된다.
상기 하이브리도마 세포의 제조 방법은 상기한 바와 같다.
본 발명의 또 다른 일 예는 콘쥬게이트 패드, 샘플패드, 멤브레인 및 흡수 패드를 포함하는 FMDV 혈청형 Asia1 탐지용 래피드 키트에 관한 것이다.
상기 콘쥬게이트 패드는 생물학적 시료, FMDV 혈청형 Asia1에 특이적으로 결합하는 단일클론항체 및 골드나노입자의 결합제(conjugate)를 포함하는 것일 수 있다.
상기 단일클론항체는 서열번호 1, 서열번호 2 및 서열번호 3으로 각각 표시되는 중쇄 CDR1(complementarity determining region 1), CDR2(complementarity determining region 2) 및 CDR3(complementarity determining region 3) 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 서열번호 5, 서열번호 6 및 서열번호 7로 각각 표시되는 경쇄 CDR1(complementarity determining region 1), CDR2(complementarity determining region 2) 및 CDR3(complementarity determining region 3) 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;을 포함하는 것일 수 있다.
또한, 상기 단일클론항체는 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 가변 영역, 서열번호 8의 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 가변영역을 포함하는 것일 수 있다.
또한, 상기 단일클론항체는 수탁번호 KCTC 18603P인 하이브리도마 세포에 의해 생산되는 단일클론항체인 것일 수 있다.
상기 멤브레인은 FMDV 혈청형 Asia1과 특이적으로 결합하는 단일클론항체 및 상기 대조군 항체에 결합하는 항체가 고정된 것일 수 있다.
상기 단일클론항체는 서열번호 1, 서열번호 2 및 서열번호 3으로 각각 표시되는 중쇄 CDR1(complementarity determining region 1), CDR2(complementarity determining region 2) 및 CDR3(complementarity determining region 3) 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 서열번호 5, 서열번호 6 및 서열번호 7로 각각 표시되는 경쇄 CDR1(complementarity determining region 1), CDR2(complementarity determining region 2) 및 CDR3(complementarity determining region 3) 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;을 포함하는 것일 수 있다.
또한, 상기 단일클론항체는 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 가변 영역, 서열번호 8의 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 가변영역을 포함하는 것일 수 있다.
또한, 상기 단일클론항체는 수탁번호 KCTC 18603P인 하이브리도마 세포에 의해 생산되는 단일클론항체인 것일 수 있다.
본 발명에서 구제역 바이러스 항원 진단에 사용하고 있는 면역크로마토그래피법은 일반적으로 항원-항체 반응을 이용하여 임신진단 또는 간염발병 등과 같은 각종 질병의 검사를 가능하게 하는 진단법으로서 모세관 현상이 작용하는 다공성 박막을 고상(solid phase)으로 하고 금 콜로이드 또는 착색 폴리스티렌 나노 입자 등의 유색입자를 측정 라벨로 사용하는 신속 현장진단용 면역검사법의 일종이다.
본 발명의 키트는 FMDV 혈청형 Asia1에 고 친화도를 가지면서 반응하는 단클론 항체를 이용하여 구제역 바이러스에 감염된 동물 개체에서 유래한 다양한 시료에서 FMDV 혈청형 Asia1의 감염을 특이적으로 진단할 수 있게 한다.
본 발명의 또 다른 일 예는 구제역 바이러스(Foot and Mouth Disease Virus; FMDV) 혈청형(serotype) Asia1의 탐지 방법에 관한 것이다.
본 발명은 구제역 바이러스 탐지용 단일클론항체, 상기 단일클론항체를 포함하는 구제역 바이러스 탐지용 조성물 및 상기 단일클론항체를 이용한 구제역 바이러스 탐지용 키트에 관한 것이다. 구제역 바이러스는 7종의 혈청형으로 뚜렷이 구분되어 상호 방어가 되지 않는 특성이 있어 구제역 양성 판정 후 추가적인 혈청형 진단 과정이 필요하다. 본 발명을 통해 개발된 FMDV Asia1 특이 단일클론항체를 이용하여 구제역 혈청형 Asia1을 조기에 신속하게 감별할 수 있는 현장 진단 키트를 개발하였으며, 이를 통해 적합한 구제역 백신 선정 등 구제역 확산 방지를 위한 보다 신속한 초기 예방 조치 수행이 가능해 질 것으로 판단된다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 간접효소면역측정법의 원리를 보여주는 모식도이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 FMDV 혈청형 Asia1에 특이적인 단일클론항체의 반응성 및 FMDV 혈청형 O 및 A에 대한 교차반응결과이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 단일클론항체 매칭 테스트(matching test)의 반응원리를 보여주는 모식도이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 FMDV 혈청형 Asia1 탐지용 면역크로마토그래피 스트립의 FMDV 혈청형 Asia1 에 대한 반응성 및 FMDV 혈청형 O, A에 대한 교차반응성 결과이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 스트립의 구조를 나타내는 그림이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따라 FMDV Asia1 shamir주의 최저검출한계 측정 비교 결과를 보여주는 사진이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 FMDV 혈청형 Asia1에 특이적인 단일클론항체의 반응성 및 FMDV 혈청형 O 및 A에 대한 교차반응결과이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 단일클론항체 매칭 테스트(matching test)의 반응원리를 보여주는 모식도이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 FMDV 혈청형 Asia1 탐지용 면역크로마토그래피 스트립의 FMDV 혈청형 Asia1 에 대한 반응성 및 FMDV 혈청형 O, A에 대한 교차반응성 결과이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 스트립의 구조를 나타내는 그림이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따라 FMDV Asia1 shamir주의 최저검출한계 측정 비교 결과를 보여주는 사진이다.
이하, 본 발명을 하기의 실시예에 의하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐이며, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 하이브리도마의 제작 및 단일클론항체 생산, 성능 평가
1-1. 면역원 준비
FMDV Asia1 (Shamir)을 BHK21 세포에 접종 후 37℃에서 24시간 배양을 통해 증폭된 FMDV Asia1를 수거하였다. 그 다음, 바이너리 에칠렌이민(Binary Ethylenimine; BEI)을 0.003 N 농도로 처리한 후 37℃에서 24시간 동안 진탕배양하여 불활화 후, 티오황산나트륨(sodium thiosulfate) 0.002 N을 첨가하여 중화시킨다. 불활화 배양 상층액에 PEG6000(Poly Ethylene Glycol; PEG)과 염화나트륨(sodium chloride; NaCl)을 각각 7.5%, 2.3% 첨가하고 24시간 동안 4℃에서 stirring incubation한다. PEG6000 처리 상층액은 11,000 rpm에서 20분간 원심 분리한 후 pellet을 TN buffer(pH 7.6)로 다시 현탁시켰다. 11,000 rpm에서 20분간 다시 원심 분리하여 상층액을 설탕 밀도 기울기 원심 분리법(sucrose density gradient centrifugation)으로 초원심 분리(30,000 rpm, 4시간)하여 순도 높은 FMDV Asia1 분획을 수득하였다.
1-2. 면역화
1-1에서 수득한 불활화된 FMDV Asia1을 이용하여 실험동물(balb/c mouse)에 면역(immunization)을 실시하였다. 구체적으로, 항원으로서 불활화 FMDV Asia1(shamir strain)을 0.25 mg/ml 농도로 준비하고, 재조합단백질 200 μl와 Freund's Adjuvant(FA) 200 μl를 혼합하여 마우스(㈜오리엔트바이오) 복강에 2주 간격으로 1-3차 면역을 실시하였다. 퓨전 면역 검사를 위해 3차 면역 1주 후, 마우스 혈청을 이용하여 간접(indirect) ELISA 검사를 실시하였다. 최종 부스팅을 위해 불활화 FMDV Asia1 (Shamir) 100 μl를 복강으로 면역하고 4일 후 세포융합에 사용하였다.
1-3. 세포융합 및 하이브리도마 제조
면역화된 마우스 몸통 좌측에 위치한 비장(spleen)을 적출하여 DMEM(Dulbecco's modified Eagle's medium) 배지에 부유시켰다. 적출한 비장을 메쉬로 갈아서 세포를 분리하고, 배양배지 DMEM과 혼합하여 비장세포 현탁액을 제조하였다. 그 다음, 상기 현탁액을 1,200 rpm에서 5분 동안 원심 분리하여 상층액을 제거하고, 비장세포와 골수세포주(SP2/0 Ag14 (ATCC, USA))를 1:5의 세포 수 비율로 혼합한 후, 1,200 rpm에서 5분 동안 원심 분리하여 세포를 침전시켜 상층액은 제거하였다. 원심 분리된 세포를 천천히 분산시킨 후 폴리에틸렌 글리콜 1500(PEG1500, Roche) 1.0 ml을 처리하고, 37℃에서 1분 동안 유지시킨 후 DMEM 1ml을 첨가하였다. 그 다음, DMEM 10 ml을 1분 동안 서서히 첨가하고, 37℃의 물에서 5분 동안 반응시킨 후 50.0 ml로 맞추고, 1,200 rpm에서 5분 동안 원심 분리하였다. 세포침전물을 분리배지(HAT배지)에 1 X 105 내지 2 X 105 cells/ml 농도로 재현탁시키고, 96웰 플레이트에 0.1 ml씩 분주한 후 37℃ 이산화탄소 배양기에서 배양하여 하이브리도마 세포를 제조하였다.
1-4. 하이브리도마 세포의 선별
상기 제조한 하이브리도마 세포군 중에서 FMDV Asia1에 특이적으로 반응하는 하이브리도마 세포를 선별하기 위하여 ELISA 분석 방법을 사용하였다.
구체적으로, 목적으로 하는 불활화 FMDV Asia1(Shamir)을 96웰 마이크로플레이트의 한 웰당 각각 100 μl(0.5 μg/ml)씩 가하여 플레이트 표면에 부착시키고, 반응하지 않은 항원은 세척하여 제거하였다. 그 다음, 0.1% casein-PBS blocking 용액을 웰 당 100 μl씩 분주한 후 37℃에서 2시간 동안 반응 후 인산 완충용액-트윈20(0.05% tween-20 (v/v)이 포함되어있는 인산완충용액, pH 7.4)(이하 PBS-T)로 3회 세척하였다.
그 다음, 하이브리도마 세포의 배양액을 각 웰에 100 μl씩을 가하여 1시간 동안 실온에서 반응시킨 후, PBS-T 용액으로 3회 세척하여 반응하지 않은 배양액을 제거하였다. 여기에 염소 항-마우스 IgG-호스레디쉬 퍼옥시다제(Goat anti-mouse IgG-HRP)를 가하여 1시간 동안 실온에서 반응시킨 다음, PBS-T로 3회 세척하였다. 세척한 후 퍼옥시다제의 기질용액(TMB)을 가하여 반응시키고, 황산 0.5 M를 플레이트 각 웰에 50 μl씩 분주한 뒤 Sunrise ELISA reader(Tecan)를 이용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하여 목적으로 하는 항원에 반응성이 높은 항체를 분비하는 하이브리도마 세포주들을 선별하였다.
선별된 하이브리도마 세포주를 제한 희석하여 클로닝을 진행하여 단일클론화 하였고, 이후 위와 같은 방법으로 목적 항체를 분비하는 하이브리도마 세포주를 선별하였다.
표 1에서 확인할 수 있듯이, 불활화 FMDV Asia1에 반응하는 13종의 단일클론항체가 선발되었다(표 1).
| No | Clone name | Isotype |
| 1 | 10F55 | IgG1, k |
| 2 | 10F71 | IgG1, k |
| 3 | 6H72 | IgG2b, k |
| 4 | 7F74 | IgG2a, k |
| 5 | 8G48 | IgG2a, k |
| 6 | 5D36 | IgG2a, k |
| 7 | 5D39 | IgG2a, k |
| 8 | 5D50 | IgG2a, k |
| 9 | 4B54 | IgG1, k |
| 10 | 4B59 | IgG1, k |
| 11 | 9H28 | IgG1, k |
| 12 | 8H8 | IgG1, k |
| 13 | 8H21 | IgG1, k |
1-5. 복수제작 및 정제
FMDV 혈청형 Asia1에 특이적으로 반응하는 13종 하이브리도마를 이용하여 생산된 복수(ascitic fluids)를 0.45 μm filter 후 protein G column(GE, Sweden)에 바인딩 시켰으며, elution buffer(100 mM glycin HClr, pH 2.8)를 이용하여 단일클론항체만 elution 한 후 dialysis(MWCO 12,000-14,000)를 통해 PBS(pH 7.0)로 버퍼 교환하였다. 정제된 단일클론항체는 -70℃에 보관하였다.
1-6. FMDV 혈청형 Asia1 특이 단클론항체 선별(교차반응성 평가)
FMDV 혈청형 Asia1에 특이적으로 반응하는 단클론항체를 선별하기 위하여 ELISA 분석 방법을 사용하였다.
구체적으로, 목적으로 하는 불활화 FMDV Asia1(Shamir strain)와 교차반응성을 확인하기 위해 불활화 FMDV O(Manisa strain), 불활화 FMDV A (Iraq strain)을 각각 96웰 마이크로플레이트의 한 웰당 각각 100 μl(0.5 μg/ml)씩 가하여 플레이트 표면에 부착시키고, 반응하지 않은 항원은 세척하여 제거하였다. 0.1% casein-PBS blocking 용액을 웰 당 100 μl씩 분주한 후 37℃에서 2시간 동안 반응 후 인산 완충용액-트윈20(0.05% tween-20(v/v)이 포함되어있는 인산완충용액, pH 7.4)(이하 PBS-T)로 3회 세척하였다.
그 다음, 하이브리도마 세포의 배양액을 각 웰에 100 μl씩을 가하여 1시간 동안 실온에서 반응시킨 후, PBS-T 용액으로 3회 세척하여 반응하지 않은 배양액을 제거하였다. 여기에 염소 항-마우스 IgG-호스레디쉬 퍼옥시다제(Goat anti-mouse IgG-HRP)를 가하여 1시간 동안 실온에서 반응시킨 다음, PBS-T로 3회 세척하였다. 세척한 후 퍼옥시다제의 기질용액(TMB)을 가하여 반응시키고, 황산 0.5 M를 플레이트 각 웰에 50 μl씩 분주한 뒤 Sunrise ELISA reader(Tecan)를 이용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하여 항원에 대한 반응성 및 교차반응성을 측정하였다.
도 2에서 FMDV 혈청형 Asia1에 특이적인 단일클론항체의 반응성 및 FMDV 혈청형 O 및 A에 대한 교차반응결과를 확인할 수 있다.
실시예
2.
FMDV
Asia1
항원진단용
래피드키트
제작을 위한
단클론항체
matching test
2-1. 니트로셀룰로오스 막에 단일클론항체 부동화(immobilization)
총 13종의 단클론항체중 FMDV Asia1과 반응성이 높은 10종의 정제된 단일클론항체를 각각 니트로셀룰로스 막(Millipore, 독일)에 2 mg/ml의 농도로 분주(1 μl/cm, test line)하고, 염소 항-마우스 IgG(goat anti-mouse IgG, Arista biological, USA)를 2 mg/ml의 농도로 분주(1 μl/cm, control line) 후 제습환경(습도 20% 이하)에서 18시간 부동화 하였다.
2-2. 금 나노입자-단일클론항체 접합체
상기 7종의 정제된 단일클론항체를 각각 약 40 nm의 콜로이드성 금(colloidal gold, 525 nm, O.D 1.0, ㈜메디안디노스틱)에 단일클론항체 7 μg/ml의 농도로 커플링 하였으며, BSA(Bovine Serum Albumin)으로 블록킹하여, 단일클론항체가 축합되어있는 금 접합체를 제작하였다(O.D 7.0, 13 μl 소요 / test strip).
2-3. 검체 희석버퍼 (specimen dilution buffer)
준비된 FMDV 배양액을 희석하기 위한 검체 희석버퍼는 0.4% tween-20, 50 mM sodium tetraborate 12H2O, pH 9.0으로 제작하였다.
2-4. 단일클론항체 매칭 테스트(matching test)
capture 단일클론항체와 conjugate 단일클론항체가 FMDV와 함께 sandwich 항원-항체 복합체를 형성할 경우 conjugate 단일클론항체와 축합되어있는 금 나노입자에 의해서 붉은색 검사선(test line)이 형성되며, capture 항체 또는 conjugate 항체 중 FMDV와 반응하지 않을 경우 검사선이 형성되지 않는다.
구체적으로, FMDV 배양액 30 μl를 각각의 단일클론항체 금 접합체가 포함된 검체 희석버퍼 30 μl와 혼합 후 각각의 단일클론항체가 분주되어있는 스트립에 5분간 반응시켰다.
도 3에서 확인할 수 있듯이, 배양액 내에 FMDV와 반응이 있을 경우 capture mAb - FMDV - 금 접합체 mAb의 sandwich antigen-antibody 복합체가 형성되어 붉은색 검사선이 형성되고, capture mAb 또는 금 접합체 mAb 중 어느 한 종이라도 배양액 내 FMDV와 반응성이 없을 경우 검사선에서 항원-항체 복합체가 형성되지 않기 때문에 붉은색 검사선이 형성되지 않음을 확인하였으며, 총 5종의 capture & conjugate pair를 선정하였다.
총 5종의 capture & conjugate pair(FMDV Asia1 에 특이적인 단클론 항체 4종)는 표 2와 같다.
| Pair No. | Capture | Conjugate | ||
| mAb No. | Clone name | mAb No. | Clone name | |
| 1 | 15 | 5D39 | 11 | 10F71 |
| 2 | 18 | 8G48 | 11 | 10F71 |
| 3 | 15 | 5D39 | 15 | 5D39 |
| 4 | 18 | 8G48 | 15 | 5D39 |
| 5 | 18 | 8G48 | 20 | 9H28 |
실시예 3. 면역크로마토그래피(Immunochromatographic) 스트립 제작 및 평가
상기 항체 matching test를 통해 최종 선발된 5D39(capture & conjugate용) 클론을 이용하여 FMDV 혈청형 Asia1 특이적 항원진단용 현장진단키트를 제작하였다.
3-1. 단일클론항체를 이용한 래피드 현장진단 키트 제조 및 성능평가
1) Capture 분주 및 고정
항 마우스 IgG(Arista, 2 mg/ml, 대조선 용 항체)와 마우스 항 FMDV Asia1 단일클론항체(5D39 (KCTC 18603P), 2 mg/ml, 검사선 용 항체)에 각각 0.5% 수크로즈(Sigma)와 0.1% NaN3(Sigma)를 첨가하여 분주용 항체용액을 제조하였다. Plastic backing card(PJ상사)에 니트로셀룰로오스 멤브레인(Millipore)을 접합시킨 후, 대조선(control line)으로써 항 마우스 IgG(anti-mouse IgG)를, 검사선(test line)으로써 5D39 단일클론항체를 각각 bed speed 10 cm/sec, 분주 부피 0.9 μl/cm로 분주하였다. 항체가 분주된 니트로셀룰로오스 멤브레인을 제습 캐비닛(습도 20% 이하)에서 24시간 이상 건조하여 항체를 고정시켰다.
2) 금 접합체 제조
금 접합체는 항체와 금 입자(40 nm)가 결합한 결합체를 뜻하며, 접합체 제조를 위해 흡착 방법을 이용하여 다음과 같이 제조를 하였다.
구체적으로, 정제 완료된 5D39 항체(1 mg/ml)를 준비하고, 금 용액(40 nm 콜로이드성 금(colloidal gold))은 분광 광도계(Spectrophotometer)를 이용하여 525 nm 파장에서 OD값 1.0 및 pH는 9.0으로 보정하여 준비하였다. 그 후, 항체 농도가 5 μg/ml이 되도록 금 용액(colloidal gold, pH 9.0) 10 ml에 5D39 항체를 첨가하고 37℃, 20분간 반응시켰다. 금 입자 표면에 항체가 반응하지 못한 부분을 블로킹하기 위해 소혈청 알부민(Bovine Serum Albumin)을 1% 농도가 되도록 첨가하고 37℃에서 20분간 반응시킨 후 원심 분리하였다(12,000 rpm, 10분). 원심 분리 후 상층액을 버리고, 1% BSA 용액으로 금접합체를 세척하고 다시 12,000 rpm, 10분 원심 분리한 후 상층액을 제거하였다. 초기 금 용액 부피의 약 1/10(1 ml)이 되도록 1% BSA 용액 1 ml을 첨가하여 금접합체를 현탁한 후, 분광 광도계를 이용하여 525 nm 파장에서 OD값을 측정하였다(O.D 10.0).
금접합체는 안정성을 확보하기 위해 자당, 카세인, BSA 및 NaN3를 첨가하여 유리 섬유(glass fiber)에 건조하였다. 구체적으로, 자당(sucrose) 5%(w/v), 카세인 0.1%(w/v), BSA 1%(w/v), NaN3 0.1%의 농도가 되도록 첨가한 후, 금 접합체를 분광 광도계(525 nm) OD 값 7로 보정한 후 유리 섬유 패드에 분주(1 ml/5 mm x 300 mm)하여 제습공간(습도 20%)에서 건조하였다.
3) 스트립의 제조
스트립은 샘플패드(Ahlstrom), 금접합체 패드(Ahlstrom), 멤브레인(Millipore) 및 흡수패드(Ahlstrom)를 중첩되게 하여 일정한 방향으로 흘러가면서 capture와 반응하도록 하는 형태를 갖는다. 멤브레인에 항체가 고정이 되면 금접합체 패드, 샘플패드와 흡수패드를 각각 정해진 위치에 중첩되도록 붙이고 로터리 슬릿터(rotary slitter)를 이용하여 4 mm 간격으로 절단하였다. 완성된 스트립을 하우징에 넣어 조립하고 알루미늄 파우치에 실리카겔과 밀봉하여 포장하였다.
4) 검출 용액 제조
50 mM Borax buffer(pH 9.0)에 Tween-20 (Sigma) 0.4%(v/v), NaN3 0.01%(w/v) 가 되도록 검출 용액을 제조하였다.
5) 사용 방법 및 결과 판정 방법
희석 튜브에 희석 버퍼와 테스트하고자 하는 샘플을 50 μl:50 μl(1:1)로 잘 섞어 혼합용액을 제조한 후 혼합용액 100 μl를 래피드 현장진단키트의 검체투입구에 적하한다. 10분 후 육안으로 결과를 판정하였다.
육안으로 보았을 때, 대조선과 검사선 위치에 붉은색 선이 나타나면 양성, 대조선에만 붉은색 선이 나타나면 음성으로 판정하고, 대조선에 붉은색 선이 나타나지 않는 경우 재실험하였다.
시험예 1. 최저검출한계 측정
FMDV serotype Asia1 3종(Shamir, Cambodia9/80, Mongolia/05)을 단계희석하여 최저검출한계를 측정하였다. FMDV Asia1 에 대한 capture-conjugate pair 5종의 최저검출한계 평가하였다. 그 결과, 표 3 및 표 4에서 확인할 수 있듯이, 단클론항체 5D39, 10F7, 8G48로 이루어진 candidate(pair no. 1, 2, 3)에서 우수한 최저검출한계를 나타냈다.
| Type | Strain | Titer (TCID50/ml) |
| Asia | Shamir | 4.74 ⅹ106 |
| Cam9/80 | 2.00 ⅹ106 | |
| MOG/05 | 3.26 ⅹ106 |
| Pair No. | FMDV Asia | ||
| Shamir | Cam 9/80 | MOG/05 | |
| 1 (5D39/10F7) |
4.74 104 | 2.00 105 | 3.26 104 |
| 2 (8G48/10F7) |
4.74 104 | 2.00 105 | 3.26 104 |
| 3 (5D39/5D39) |
4.74 104 | 2.00 105 | 3.26 104 |
| 4 (8G48/5D39) |
4.74 104 | 2.00 105 | 3.26 105 |
| 5 (8G48/9H28) |
4.74 106 | - | 3.26 105 |
시험예 2. FMDV Asia1 항원진단용 래피드키트의 성능 비교
선발된 pair no. 1(5D39 capture & 10F7 gold conjugate), pair no.2(8G48 capture & 10F7 gold conjugate), pair no. 3(5D39 capture & 5D39 conjugate)를 이용하여 FMDV Asia1 항원진단용 래피드키트를 제작하여 타사키트(PBM 社, Pirbright Institute) 및 realtime RT-PCR과 성능을 비교평가하였다.
도 6에서 확인할 수 있듯이, FMDV Asia1(shamir)을 이용해 바이러스 역가별 검출한계를 비교한 결과, realtime RT-PCR은 102 TCID50/ml, ELISA(Pirbright)는 104 TCID50/ml, 타사 상용화 래피드키트(PBM 社)는 105 TCID50/ml, pair no. 1, 2, 3로 제작된 래피드키트의 경우 104 TCID50/ml 의 최저검출한계를 나타냈다.
도 6에서 QIA-RAPID AS-1는 pair no. 1으로 제작된 래피드 키트, QIA-RAPID AS-2는 pair no. 2으로 제작된 래피드 키트, QIA-RAPID AS-3은 pair no. 3으로 제작된 래피드 키트, Antigen-ELISA는 ELISA(Pirbright, OIE 표준검사법), PBM은 동일한 원리로 상용화된 타사 래피드 키트(PBM 社)이다.
본 발명을 위해 pair no. 1, 2, 3로 제작된 래피드 키트는 ELISA(Pirbright, OIE표준진단법)과 동일하거나 높은 민감도를 나타냈으며, 동일한 원리로 상용화된 타사 래피드키트(PBM 社) 보다 약 10배 민감한 결과를 나타냈다.
<110> MEDIAN Diagnostics Inc.
REPUBLIC OF KOREA(Animal and Plant Quarantine Agency)
<120> Monoclonal Antibodies for detecting Foot and Mouth Disease Virus
serotype Asia1 and using the same
<130> PN170328
<160> 16
<170> KopatentIn 2.0
<210> 1
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HCDR 1_5D39
<400> 1
Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr Val
1 5
<210> 2
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HCDR 2_5D39
<400> 2
Ile Asn Ser Gly Asp Tyr Tyr Thr
1 5
<210> 3
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HCDR 3_5D39
<400> 3
Ala Arg Thr Phe Asp His Tyr Gly Met Asp Tyr
1 5 10
<210> 4
<211> 118
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 5D39 Heavy chain V-region
<400> 4
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Val Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Thr Ile Asn Ser Gly Asp Tyr Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Val Ser Ser Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Thr Phe Asp His Tyr Gly Met Asp Tyr Trp Gly Arg Gly Thr
100 105 110
Ser Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 5
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> LCDR 1_5D39
<400> 5
Gln Ile Ile Ser Asp Tyr
1 5
<210> 6
<211> 3
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> LCDR 2_5D39
<400> 6
Tyr Ala Ser
1
<210> 7
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> LCDR 3_5D39
<400> 7
Gln Asn Gly His Ser Phe Pro Tyr Thr
1 5
<210> 8
<211> 107
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 5D39 Light chain V-region
<400> 8
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Ser Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ile Ile Ser Asp Tyr
20 25 30
Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser His Glu Ser Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Lys Tyr Ala Ser Gln Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Arg Ser Gly Ser Asp Phe Thr Leu Ser Ile Asn Ser Val Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Gln Asn Gly His Ser Phe Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 9
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HCDR 1_5D39
<400> 9
ggattcactt tcagtaacta tgtc 24
<210> 10
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HCDR 2_5D39
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attaatagcg gtgattatta cacc 24
<210> 11
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HCDR 3_5D39
<400> 11
gcaagaactt ttgatcacta tggtatggat tac 33
<210> 12
<211> 355
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 5D39 Heavy chain V-region
<400> 12
gaagtgcagt tggtggagtc tgggggaggc ttagtgaagc ctggagggtc cctgaaactc 60
tcctgtgcag cctctggatt cactttcagt aactatgtca tgtcttgggt tcgccagact 120
ccggagaaga ggctggagtg ggtcgcaacc attaatagcg gtgattatta cacctactat 180
ccagacagtg tgaagggtcg attcaccgtc tccagcgaca atgccaagaa caccctttac 240
ctgcaaatga gcagtctgag gtctgaggac acggccatgt attattgtgc aagaactttt 300
gatcactatg gtatggatta ctggggtcga ggaacctcag tcaccgtctc ctcag 355
<210> 13
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> LCDR 1_5D39
<400> 13
cagattatta gcgactac 18
<210> 14
<211> 9
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> LCDR 2_5D39
<400> 14
tatgcttcc 9
<210> 15
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> LCDR 3_5D39
<400> 15
caaaatggtc acagctttcc gtacacg 27
<210> 16
<211> 322
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 5D39 Light chain V-region
<400> 16
gacattgtga tgactcagtc tccagccacc ctgtctgtga ctccaggaga tagagtctct 60
ctttcctgca gggccagcca gattattagc gactacttac actggtatca acaaaaatca 120
catgagtctc caaggcttct catcaaatat gcttcccaat ccatctctgg gatcccctcc 180
aggttcagtg gcagtcgatc agggtcagat ttcactctca gtatcaacag tgtggaacct 240
gaagatgttg gagtgtatta ctgtcaaaat ggtcacagct ttccgtacac gttcggaggg 300
gggaccaagc tggaaataaa ac 322
Claims (13)
- 수탁번호 KCTC18603P 하이브리도마 세포에서 생산되는 구제역 바이러스(Foot and Mouth Disease Virus; FMDV) 혈청형(serotype) Asia1에 특이적으로 결합하는 단일클론항체.
- 제 1 항에 있어서, 상기 단일클론항체는 IgG1 타입인 것인, 단일클론항체.
- 삭제
- 서열번호 1, 서열번호 2 및 서열번호 3으로 각각 표시되는 중쇄 CDR1(complementarity determining region 1), CDR2(complementarity determining region 2) 및 CDR3(complementarity determining region 3) 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및
서열번호 5, 서열번호 6 및 서열번호 7로 각각 표시되는 경쇄 CDR1(complementarity determining region 1), CDR2(complementarity determining region 2) 및 CDR3(complementarity determining region 3) 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;
을 포함하는 구제역 바이러스(Foot and Mouth Disease Virus; FMDV) 혈청형 Asia1 탐지용 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
- 제 4 항에 있어서, 상기 중쇄 가변 영역은 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어지고, 상기 경쇄 가변 영역은 서열번호 8의 아미노산 서열로 이루어진 것인, 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
- 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 가변영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 및 서열번호 8의 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 가변영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터.
- 제 6 항에 있어서, 상기 중쇄 가변영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 12의 뉴클레오티드 서열로 이루어지고, 상기 경쇄 가변영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 16의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 것인 재조합 벡터.
- 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 가변영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 및 서열번호 8의 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 가변영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 숙주세포.
- 구제역 바이러스(Foot and Mouth Disease Virus; FMDV) 혈청형(serotype) Asia1에 특이적으로 결합하는 단일클론항체를 생산하는 수탁번호 KCTC18603P인 하이브리도마 세포.
- 콘쥬게이트 패드, 샘플패드, 멤브레인 및 흡수 패드를 포함하고,
상기 콘쥬게이트 패드는 생물학적 시료, FMDV 혈청형 Asia1에 특이적으로 결합하는 단일클론항체 및 골드나노입자의 결합체(conjugate)를 포함하는 것이며,
상기 멤브레인은 FMDV 혈청형 Asia1과 특이적으로 결합하는 단일클론항체 및 대조군 항체에 결합하는 항체가 고정된 것이고,
상기 단일클론항체는 서열번호 1, 서열번호 2 및 서열번호 3으로 각각 표시되는 중쇄 CDR1(complementarity determining region 1), CDR2(complementarity determining region 2) 및 CDR3(complementarity determining region 3) 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및
서열번호 5, 서열번호 6 및 서열번호 7로 각각 표시되는 경쇄 CDR1(complementarity determining region 1), CDR2(complementarity determining region 2) 및 CDR3(complementarity determining region 3) 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;을 포함하는 것인,
FMDV 혈청형 Asia1 탐지용 래피드 키트.
- 삭제
- 제 10 항에 있어서, 상기 단일클론항체는 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 가변 영역, 서열번호 8의 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 가변영역을 포함하는 것인, FMDV 혈청형 Asia1 탐지용 래피드 키트.
- 제 10 항에 있어서, 상기 단일클론항체는 수탁번호 KCTC18603P인 하이브리도마 세포에 의해 생산되는 단일클론항체인 것인, FMDV 혈청형 Asia1 탐지용 래피드 키트.
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