KR102243368B1

KR102243368B1 - 돼지파보바이러스에 특이적인 단일클론항체 및 이의 용도

Info

Publication number: KR102243368B1
Application number: KR1020190045125A
Authority: KR
Inventors: 우인옥; 송재영; 조수동; 이주연; 조인수; 이지현
Original assignee: 대한민국
Priority date: 2019-04-17
Filing date: 2019-04-17
Publication date: 2021-04-23
Also published as: KR20200122465A

Abstract

본 발명은 돼지파보바이러스에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편 및 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하는 돼지파보바이러스 감염 진단용 키트에 관한 것이다. 본 발명의 항체를 이용하여 신속하고 정확하게 돼지파보바이러스 감염 여부를 판단할 수 있다.

Description

돼지파보바이러스에 특이적인 단일클론항체 및 이의 용도{Monoclonal Antibody specific for Porcine Parvovirus and use thereof}

본 발명은 돼지파보바이러스에 특이적인 단일클론항체 및 이의 용도에 관한 것이다.

돼지파보바이러스(Porcine Parvovirus: PPV)는 모돈의 명확한 임상증상 발현이 없는 상태에서 배아 또는 태자에 감염 및 폐사를 특징으로 하는 돼지 번식장애 원인체로 알려져 있다. 돼지파보바이러스는 Parvoviridae과 Parvovirus 속에 속하는 단일가닥 DNA 바이러스이며, 2-3종의 capsid 단백질로 구성되어 있고 직경 20-30 nm, 32 capsomere로 구성되어 있으며 envelope은 없다.

돼지파보바이러스는 전세계적으로 돼지에 상재하는 것으로 알려져 있는데, 가장 흔한 감염 경로는 출생 전 태반감염 또는 출생 후 경구 비강 감염이다. 주로 항체 음성인 모돈의 임신 전반기에 바이러스에 노출되었을 때 발병하며, 이어 태자의 면역능이 형성되기 이전에 태반감염으로 태자를 감염시킨다. 가장 중요한 돼지파보바이러스 감염 증상은 모돈의 번식장애이다. 모돈에서 관찰되는 구체적인 감염증상으로는 불임, 유산, 사산, 신생자돈 사망, 낮은 신생자돈 생존율, 복부둘레 감소 등이다.

현재 사용되고 있는 돼지파보바이러스 감염증 항체진단법으로는 중화시험(Virus Neutralization Test, VNT), 효소면역법(Enzyme Linked Immunosorbent Assay, ELISA), 혈구응집억제반응법(HI) 등이 있다. 현재 시도가축방역사업의 가축혈청검사 및 병성감정을 위해 공급되는 진단액으로 HI(Hemagglutination Inhibition) 진단액이 공급되고 있다. HI 진단법은 동물(guinea pig)의 혈구를 이용하여야 하므로 사용이 번거롭고, 혈구 채취를 위해 동물을 항시 사육해야 하는 어려움이 있어 사용자의 고충이 제기되고 있다. 중화시험법은 clean bench에서 PPV를 배양해야 하며, 결과를 얻기까지 3-4일 소요되는 문제점이 있다. 이러한 문제점을 개선하기 위해 여러 국가에서 ELISA가 개발되어 사용되고 있으나 HI와의 상관성이 저조하며, 국내에서는 개발되어 국산화 되지 못했다.

본 발명자들은 현재 이용되고 있는 돼지파보바이러스 감염 진단 방법의 문제점을 개선하고 이를 대체할 수 있는 정확하고 간편한 돼지파보바이러스 감염 진단 방법을 개발하기 위해 연구 노력하였다. 그 결과, 돼지파보바이러스 감염을 특이적으로 확인할 수 있는 단일클론항체를 개발함으로써 본 발명을 완성하였다.

따라서 본 발명의 목적은 돼지파보바이러스에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 돼지파보바이러스에 특이적으로 결합하는 항체의 중쇄 가변영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 경쇄 가변영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 재조합 벡터로 형질전환 된 숙주세포를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 돼지파보바이러스 감염 진단용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 돼지파보바이러스 감염 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명은 돼지파보바이러스(Porcine Parvovirus: PPV)에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편 및 그 용도에 관한 것이다.

이하 본 발명을 더욱 자세히 설명하고자 한다.

돼지파보바이러스(Porcine parvovirus: PPV)는 외피(non-enveloped)가 없고, 단일 가닥(single-stranded)이며, 약 5 kb 크기의 작은 DNA를 가진 바이러스로 돼지에서 번식장애를 일으키는 원인체 중 하나이다. 1965년 독일에서 처음으로 분리된 이후 현재까지도 유럽과 아시아를 비롯하여 전 세계에 걸쳐 유행하고 있다.

돼지파보바이러스 혈청형 1형이 주로 번식장애와 연관되어 있으며, 대표적인 임상증상으로는 SMEDI 신드롬이라 불리는 사산(stillbirth), 태아 미라화(mummification), 배아 사멸(embryonic death) 그리고 불임(infertility)이 있다. 또한 번식 장애 외에도 피부질환, 설사 그리고 호흡기 장애를 일으키기 때문에 양돈산업에 있어 많은 경제적 손실을 주고 있다.

양돈농가의 생산성 손실을 최소화하고 임신 모돈의 분만율을 높이기 위해 간편하고 효율적으로 돼지파보바이러스 감염 여부를 진단할 수 있는 방법의 개발이 요구된다.

본 발명의 일 양태는 서열번호 1, 서열번호 2 및 서열번호 3으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 중쇄 CDR(complementarity determining region) 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 4, 서열번호 5 및 서열번호 6으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 경쇄 CDR 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 돼지파보바이러스에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편에 관한 것이다.

상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 구성되는 CDR1, 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열로 구성되는 CDR2 및 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열로 구성되는 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역; 및

서열번호 4로 표시되는 아미노산 서열로 구성되는 CDR1, 서열번호 5로 표시되는 아미노산 서열로 구성되는 CDR2 및 서열번호 6으로 표시되는 아미노산 서열로 구성되는 CDR3을 포함하는 경쇄 가변영역을 포함하는 것일 수 있다.

또한, 상기 중쇄 가변 영역은 서열번호 7의 아미노산 서열로 이루어지고, 상기 경쇄 가변 영역은 서열번호 8의 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있다.
상기 단일클론항체는 실시예 1-1에서 확보한 4종의 하이브리도마 클론(2, 3, 4 및 5번) 중 5번 클론에 해당하는 항-PPV 단일클론항체이다.

본 명세서에서 용어 "항체(antibody)"는 돼지파보바이러스에 대한 특이 항체로서, 돼지파보바이러스에 대해 특이적으로 결합하며, 완전한 항체 형태 뿐만 아니라 항체 분자의 항원 결합 단편을 포함한다.

완전한 항체는 2개의 전장(full length) 경쇄 및 2개의 전장 중쇄를 가지는 구조이며 각각의 경쇄는 중쇄와 이황화 결합으로 연결되어 있다. 항체의 불변 영역은 중쇄 불변 영역과 경쇄 불변 영역으로 나눠지며, 중쇄 불변 영역은 감마(γ), 뮤(μ), 알파(α), 델타(δ) 및 엡실론(ε) 타입을 가지고, 서브클래스로 감마1(γ1), 감마2(γ2), 감마3(γ3), 감마4(γ4), 알파1(α1) 및 알파2(α2)를 가진다. 경쇄의 불변 영역은 카파(κ) 및 람다(λ) 타입을 가진다.

상기 항체는 단일클론항체일 수 있다.

본 명세서에서 용어, "단일클론항체"는 상기 항체 분자가 단일 분자로 구성되도록 제조된 것을 의미한다. 단일클론항체는 동일한 에피토프를 갖는 항원에 대해서만 반응하는 특이성을 가지며, 또한 특정 에피토프에 대해서만 친화성을 나타낸다.

본 명세서에서 용어, "중쇄(heavy chain)"는 항원에 특이성을 부여하기 위해 충분한 가변 영역 서열을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 가변 영역 도메인 VH 및 3개의 불변 영역 도메인 CH1, CH2 및 CH3를 포함하는 전장 중쇄 및 이의 단편을 모두 포함하는 의미로 해석된다.

본 명세서에서 용어, "경쇄(light chain)"는 항원에 특이성을 부여하기 위한 충분한 가변영역 서열을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 가변 영역 도메인 VL 및 불변 영역 도메인 CL을 포함하는 전장 경쇄 및 이의 단편을 모두 포함하는 의미로 해석된다.

본 명세서에서 용어, "CDR(complementarity determining region)"은 면역글로불린의 중쇄 및 경쇄의 고가변 영역(hypervariable region)의 아미노산 서열을 의미한다. 중쇄 및 경쇄는 각각 3개의 CDR을 포함할 수 있다(CDRH1, CDRH2, CDRH3 및 CDRL1, CDRL2, CDRL3). 상기 CDR은 항체가 항원 또는 에피토프에 결합하는데 있어서 주요한 접촉 잔기를 제공할 수 있다.

본 명세서에서 용어, "항원 결합 단편"은 면역글로불린 전체 구조에 대한 그의 단편으로, 항원이 결합할 수 있는 부분을 포함하는 폴리펩티드의 일부를 의미한다. 예를 들어, F(ab')₂, Fab', Fab, Fv 또는 scFv일 수 있으나, 이에 한정하지 않는다. 상기 항원 결합 단편 중 Fab는 경쇄 및 중쇄의 가변영역과 경쇄의 불변 영역 및 중쇄의 첫 번째 불변 영역(C_H1)을 가지는 구조로 1개의 항원 결합 부위를 가진다. Fab'는 중쇄 C_H1 도메인의 C-말단에 하나 이상의 시스테인 잔기를 포함하는 힌지 영역(hinge region)을 가진다는 점에서 Fab와 차이가 있다. F(ab')₂ 항체는 Fab'의 힌지 영역의 시스테인 잔기가 디설파이드 결합을 이루면서 생성된다. Fv는 중쇄 가변부위 및 경쇄 가변부위만을 가지고 있는 최소의 항체조각으로 Fv 단편을 생성하는 재조합 기술은 당업계에 널리 공지되어 있다. 이중쇄 Fv(two-chain Fv)는 비공유 결합으로 중쇄 가변부위와 경쇄 가변부위가 연결되어 있고 단쇄 Fv(single-chain Fv)는 일반적으로 펩타이드 링커를 통하여 중쇄의 가변 영역과 단쇄의 가변 영역이 공유 결합으로 연결되거나 또는 C-말단에서 바로 연결되어 있어서 이중쇄 Fv와 같이 다이머와 같은 구조를 이룰 수 있다. 상기 항원 결합 단편은 단백질 가수분해 효소를 이용해서 얻을 수 있고(예를 들어, 전체 항체를 파파인으로 제한 절단하면 Fab를 얻을 수 있고 펩신으로 절단하면 F(ab')₂단편을 얻을 수 있다), 유전자 재조합 기술을 통하여 제작할 수 있다.

상기 항체는 단일클론항체, 이특이적 항체, 비-인간 항체, 키메릭 항체, 단쇄 Fvs(scFV), 단쇄 항체, Fab 단편, F(ab')단편, 다이설파이드-결합 Fvs(sdFV) 및 항-이디오타입(항-Id) 항체, 그리고 상기 항체들의 에피토프-결합 단편을 포함하나 이에 한정되는 것은 아니다.

본 명세서에서 용어, "키메릭"은 항체 또는 항원-결합 부위가 2 개의 상이한 종으로부터 유래한 서열들을 포함하는 것을 의미한다.

상기 돼지파보바이러스에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 돼지파보바이러스를 특이적으로 인식할 수 있는 범위 내에서 첨부한 서열번호에 기재된 아미노산 서열의 변이체를 포함할 수 있다.

예를 들면, 항체의 결합 친화도 및/또는 기타 생물학적 특성을 개선시키기 위하여 항체의 아미노산 서열에 변화를 줄 수 있다. 이러한 변형은, 예를 들어, 항체의 아미노산 서열 잔기의 결실, 삽입 및/또는 치환을 포함한다. 이러한 아미노산의 변이는 아미노산 곁사슬 치환체의 상대적 유사성, 예를 들어, 소수성, 친수성, 전하, 크기와 같은 특성에 기초하여 이루어진다. 예를 들어, 아르기닌, 라이신과 히스티딘은 모두 양전하를 띤 잔기이고, 알라닌, 글리신과 세린은 유사한 크기를 가지며, 페닐알라닌, 트립토판과 티로신은 유사한 모양을 갖는다. 따라서, 상기 고려 사항에 기초하여, 아르기닌, 라이신과 히스티딘; 알라닌, 글리신과 세린; 및 페닐알라닌, 트립토판과 티로신은 생물학적으로 기능 균등물이라 할 수 있다.

한편, 분자의 활성을 전체적으로 변경시키지 않는 단백질에서의 아미노산 교환은 당해 분야에 공지되어 있다. 가장 통상적으로 일어나는 교환은 아미노산 잔기 Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Thy/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu, Asp/Gly 간의 교환이다.

상기 생물학적 균등 활성을 갖는 변이를 고려한다면, 상기 돼지파보바이러스에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 서열번호에 기재된 서열과 실질적인 동일성(substantial identity)을 나타내는 서열도 포함하는 것으로 해석될 수 있다.

상기의 실질적인 동일성은 상기한 서열번호의 아미노산 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 얼라인하고, 당업계에서 통상적으로 이용되는 알고리즘을 이용하여 얼라인된 서열을 분석한 경우에, 최소 60%의 상동성, 최소 70%의 상동성, 최소 80%의 상동성 또는 최소 90%의 상동성을 나타내는 서열일 수 있다.

서열의 비교를 위한 얼라인먼트 방법은 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, NCBI Basic Local Alignment Search Tool(BLAST)를 통해, 인터넷 상에서 blastp, blastx, tblastn 및 tblastx와 같은 서열 분석 프로그램을 이용할 수 있다.

본 발명의 또 다른 일 양태는 돼지파보바이러스에 특이적으로 결합하는 항체의 중쇄 가변 영역 및/또는 경쇄 가변 영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 중쇄 가변 영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 돼지파보바이러스에 특이적으로 결합하는 항체의 서열번호 7의 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 가변 영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드인 것일 수 있다.

상기 중쇄 가변 영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 9의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 것일 수 있다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 경쇄 가변 영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 돼지파보바이러스에 특이적으로 결합하는 항체의 서열번호 8의 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 가변 영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드인 것일 수 있다.

상기 경쇄 가변 영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 10의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 것일 수 있다.

본 명세서에서 용어, "폴리뉴클레오티드(polynucleotide)"는 단일가닥 또는 이중가닥 형태로 존재하는 디옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드의 중합체이다. RNA 게놈 서열, DNA(gDNA 및 cDNA) 및 이로부터 전사되는 RNA 서열을 포괄하며, 특별하게 다른 언급이 없는 한 천연의 폴리뉴클레오티드의 유사체를 포함한다.

상기 폴리뉴클레오티드는 상기 돼지파보바이러스에 특이적으로 결합하는 항체의 중쇄 가변 영역 또는 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열 뿐만 아니라, 그 서열에 상보적인(complementary) 서열도 포함한다.

상기 상보적인 서열은 완벽하게 상보적인 서열 뿐만 아니라, 실질적으로 상보적인 서열도 포함하며, 이는 당업계에 공지된 엄격 조건(stringent conditions) 하에서, 예를 들어, 상기 돼지파보바이러스에 특이적으로 결합하는 항체의 중쇄 가변 영역 또는 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 뉴클레오티드 서열과 혼성화 될 수 있는 서열을 의미한다.

또한, 상기 중쇄 가변영역 및/또는 경쇄 가변영역의 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 변형될 수 있다. 상기 변형은 뉴클레오티드의 추가, 결실 또는 비보존적 치환 또는 보존적 치환을 포함한다.

상기 돼지파보바이러스에 특이적으로 결합하는 항체의 중쇄 가변 영역 및/또는 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 상기 뉴클레오티드 서열에 대하여 실질적인 동일성을 나타내는 뉴클레오티드 서열도 포함하는 것으로 해석된다.

상기의 실질적인 동일성은 상기 뉴클레오티드 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 얼라인하고, 당업계에서 통상적으로 이용되는 알고리즘을 이용하여 얼라인된 서열을 분석한 경우에, 최소 80%의 상동성, 최소 90%의 상동성 또는 최소 95%의 상동성을 나타내는 서열일 수 있다.

본 발명의 또 다른 일 양태는 서열번호 7의 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 가변영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 및 서열번호 8의 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 가변영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터에 관한 것이다.

상기 중쇄 가변영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 9의 뉴클레오티드 서열로 이루어지고, 상기 경쇄 가변영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 10의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 것일 수 있다.

본 명세서에서 용어, "벡터"는 숙주세포에서 목적 유전자를 발현시키기 위한 수단을 의미한다. 예를 들어, 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터 및 박테리오파아지 벡터, 아데노바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터 및 아데노-연관 바이러스 벡터와 같은 바이러스 벡터를 포함한다. 상기 재조합 벡터로 사용될 수 있는 벡터는 당업계에서 종종 사용되는 플라스미드(예를 들면, pSC101, pGV1106, pACYC177, ColE1, pKT230, pME290, pBR322, pUC8/9, pUC6, pBD9, pHC79, pIJ61, pLAFR1, pHV14, pGEX 시리즈, pET 시리즈 및 pUC19 등), 파지(예를 들면, λgt4λB, λ-Charon, λΔz1 및 M13 등) 또는 바이러스(예를 들면, SV40 등)를 조작하여 제작될 수 있다.

상기 재조합 벡터에서 상기 중쇄 가변영역 및 경쇄 가변영역의 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 프로모터에 작동적으로 연결될 수 있다. 용어, "작동적으로 연결된(operatively linked)"은 뉴클레오티드 발현 조절 서열(예: 프로모터 서열)과 다른 뉴클레오티드 서열 사이의 기능적인 결합을 의미한다. 따라서, 이에 의해 상기 조절 서열은 상기 다른 뉴클레오티드 서열의 전사 및/또는 해독을 조절할 수 있다.

상기 재조합 벡터는 전형적으로 클로닝을 위한 벡터 또는 발현을 위한 벡터로서 구축될 수 있다. 상기 발현용 벡터는 당업계에서 식물, 동물 또는 미생물에서 외래의 단백질을 발현하는데 사용되는 통상의 것을 사용할 수 있다. 상기 재조합 벡터는 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 구축될 수 있다.

상기 재조합 벡터는 원핵세포 또는 진핵세포를 숙주로 하여 구축될 수 있다. 예를 들어, 사용되는 벡터가 발현 벡터이고, 원핵세포를 숙주로 하는 경우에는, 전사를 진행시킬 수 있는 강력한 프로모터(예컨대, p_L ^λ프로모터, trp 프로모터, lac 프로모터, tac 프로모터, T7 프로모터 등), 해독의 개시를 위한 라이보좀 결합 자리 및 전사/해독 종결 서열을 포함하는 것이 일반적이다. 진핵세포를 숙주로 하는 경우에는, 벡터에 포함되는 진핵세포에서 작동하는 복제원점은 f1 복제원점, SV40 복제원점, pMB1 복제원점, 아데노 복제원점, AAV 복제원점 및 BBV 복제원점 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

또한, 포유동물 세포의 게놈으로부터 유래된 프로모터(예: 메탈로티오닌 프로모터) 또는 포유동물 바이러스로부터 유래된 프로모터(예: 아데노바이러스 후기 프로모터, 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터, SV40 프로모터, 사이토메갈로바이러스 프로모터 및 HSV의 tk 프로모터)가 이용될 수 있으며, 전사 종결 서열로서 폴리아데닐화 서열을 일반적으로 갖는다.

한편, 상기 항체의 중쇄 가변영역 및 경쇄 가변영역을 발현할 수 있는 벡터는 중쇄 가변영역 및 경쇄 가변영역이 하나의 벡터에서 동시에 발현되는 벡터 시스템이거나 또는 중쇄 가변영역 및 경쇄 가변영역을 각각 별도의 벡터에서 발현시키는 시스템 모두 가능하다. 후자의 경우, 두 벡터는 동시 형질전환(co-transformation) 및 표적 형질전환(targeted transformation)을 통하여 숙주세포로 도입될 수 있다.

본 발명의 또 다른 일 양태는 상기 재조합 벡터로 형질전환 된 숙주세포에 관한 것이다.

상기 재조합 벡터를 안정되면서 연속적으로 클로닝 또는 발현시킬 수 있는 숙주세포는 당업계에 공지된 어떠한 숙주세포도 이용할 수 있으며, 원핵세포로는 예를 들어, E. coli JM109, E. coli BL21, E. coli RR1, E. coli LE392, E. coli B, E. coli X 1776, E. coli W3110, 바실러스 서브틸리스, 바실러스 츄린겐시스와 같은 바실러스 속 균주, 그리고 살모넬라 티피무리움, 세라티아 마르세슨스 및 다양한 슈도모나스 종과 같은 장내균과 균주 등이 있으며, 진핵세포에 형질 전환시키는 경우에는 숙주세포로서, 효모(Saccharomyce cerevisiae), 곤충세포, 식물세포 및 동물세포, 예를 들어, Sp2/0, CHO(Chinese hamster ovary) K1, CHO DG44, PER.C6, W138, BHK, COS-7, 293, HepG2, Huh7, 3T3, RIN 및 MDCK 세포주 등이 이용될 수 있다.

상기 폴리뉴클레오티드 또는 이를 포함하는 재조합 벡터의 숙주세포 내로의 운반은 당업계에 널리 알려진 운반 방법을 사용할 수 있다. 상기 운반 방법은 예를 들어, 숙주세포가 원핵세포인 경우, CaCl₂ 방법 또는 전기 천공 방법 등을 사용할 수 있고, 숙주세포가 진핵세포인 경우에는 미세 주입법, 칼슘 포스페이트 침전법, 전기 천공법, 리포좀-매개 형질감염법 및 유전자 밤바드먼트 등을 사용할 수 있으나, 이에 한정하지는 않는다.

E. coli 등의 미생물을 이용하는 경우 생산성은 동물세포 등에 비하여 높은 편이나 당화(glycosylation) 문제로 인해 인택트(intact)한 Ig 형태의 항체 생산에는 적당하지 않지만, Fab 및 Fv와 같은 항원 결합 단편의 생산에는 사용될 수 있다.

상기 형질전환 된 숙주세포를 선별하는 방법은 선택 표지에 의해 발현되는 표현형을 이용하여, 당업계에 널리 알려진 방법에 따라 용이하게 실시할 수 있다. 예를 들어, 상기 선택 표지가 특정 항생제 내성 유전자인 경우에는 상기 항생제가 함유된 배지에서 형질전환체를 배양함으로써 형질전환체를 용이하게 선별할 수 있다.

본 발명의 또 다른 일 양태는 상기 숙주세포를 배양하는 단계; 및 상기 배양된 세포에서 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 회수하는 단계를 포함하는 돼지파보바이러스(Porcine Parvovirus: PPV)에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 제조하는 방법에 관한 것이다.

상기 세포는 배지에서 배양할 수 있으며, 시판용 배지 등을 종류에 제한 없이 배양 배지로서 사용할 수 있다.

공지된 기타 필수 보충물이 적절한 농도로 포함될 수 있다. 배양 조건, 예를 들어, 온도, pH 등이 발현을 위해 선별된 세포에 대해 이미 공지되어 있으며, 통상의 기술자가 적절히 선택할 수 있다.

상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 회수는 예를 들어 원심분리 또는 한외여과에 의해 불순물을 제거하고, 그 결과물을 예를 들어 친화 크로마토그래피 등을 통해 정제할 수 있다. 추가의 정제 기술, 예를 들어 음이온 또는 양이온 교환 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 히드록실아파타이트 크로마토그래피 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 또 다른 일 양태는 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하는 돼지파보바이러스 감염 진단용 조성물에 관한 것이다.

상기 설명한 바와 같이 본 발명의 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 돼지파보바이러스에 특이적으로 면역반응성을 나타내어 돼지파보바이러스를 용이하게 검출할 수 있으므로, 이를 바이러스 진단 시약의 항체로 적용하면 돼지파보바이러스의 감염을 효과적으로 진단할 수 있는 키트가 될 수 있다.

본 발명의 돼지파보바이러스 감염 진단용 조성물에는 항체의 활성 유지 및 항원-항체 결합을 확인하기 위한 보조물질 등 통상의 바이러스 검출용 조성물에 포함될 수 있는 첨가물이 더 포함될 수 있다.

본 발명의 돼지파보바이러스 감염 진단용 조성물에는 검사대상의 시료를 채취 또는 진단 시약을 적용하기 위한 도구, 항원-항체 결합을 확인하기 위한 시약 또는 장치 등 항체를 사용하여 생물학적 시료로부터 바이러스의 존재유무를 확인하는 통상의 진단용 조성물에 포함될 수 있는 도구, 장치 또는 시약이 더 포함될 수 있다.

상기 진단용 조성물에 포함될 수 있는 도구/시약으로는 적합한 담체, 검출 가능한 신호를 생성할 수 있는 표지 물질, 용해제, 세정제, 완충제, 안정화제 등이 포함되나 이로 제한되지 않는다. 표지 물질이 효소인 경우에는 효소활성을 측정할 수 있는 기질 및 반응 정지제를 포함할 수 있다. 적합한 담체로는, 이에 한정되지는 않으나, 가용성 담체, 예를 들어 당 분야에 공지된 생리학적으로 허용되는 완충액, 예를 들어 PBS, 불용성 담체, 예를 들어 폴리스티렌, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리에스테르, 폴리아크릴로니트릴, 불소 수지, 가교덱스트란, 폴리사카라이드, 라텍스에 금속을 도금한 자성 미립자와 같은 고분자, 기타 종이, 유리, 금속, 아가로오스 및 이들의 조합일 수 있다.

본 발명의 또 다른 일 양태는 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 사용하여 돼지의 생물학적 시료로부터 돼지파보바이러스의 항원 단백질을 검출하는 단계를 포함하는 돼지파보바이러스 감염 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법에 관한 것이다.

상기 돼지파보바이러스의 항원 단백질 검출은 항원-항체 반응을 통해 실시될 수 있다.

상기 항원-항체 반응은 조직면역염색, 방사능면역분석법(RIA), 효소 면역분석법(ELISA), 웨스턴블럿(Western Blotting), 면역침전분석법(Immunoprecipitation Assay), 면역확산분석법(Immunodiffusion Assay), 보체고정분석법(Complement Fixation Assay), FACS(Fluorescence-activated cell sorter) 및 단백질칩(protein chip)분석법으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 방법을 이용할 수 있고, 예를 들어, 효소면역분석법(ELISA)을 이용하여 실시할 수 있다.

상기 생물학적 시료는 돼지의 조직, 세포, 전혈, 혈청, 혈장, 분변, 타액, 객담, 뇌척수액 또는 뇨일 수 있고, 예를 들어, 돼지의 혈청일 수 있다.

본 발명은 돼지파보바이러스에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편 및 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하는 돼지파보바이러스 감염 진단용 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 항체를 이용하여 신속하고 정확하게 돼지파보바이러스 감염 여부를 판단할 수 있다.

도 1a는 돼지파보바이러스 감염 세포와 돼지파보바이러스에 대한 단일클론항체(양성대조군) 9A8를 반응시켜 염색하여 돼지파보바이러스 감염을 확인한 결과이다.
도 1b는 돼지파보바이러스 감염 세포와 음성대조군 항체(음성 마우스 혈청)를 반응시켜 염색하여 돼지파보바이러스 감염을 확인한 결과이다.
도 1c는 돼지파보바이러스 감염 세포와 실시예 1에서 얻은 돼지파보바이러스 단일클론항체 2번을 반응시켜 염색하여 돼지파보바이러스 감염을 확인한 결과이다.
도 1d는 돼지파보바이러스 감염 세포와 실시예 1에서 얻은 돼지파보바이러스 단일클론항체 3번을 반응시켜 염색하여 돼지파보바이러스 감염을 확인한 결과이다.
도 1e는 돼지파보바이러스 감염 세포와 실시예 1에서 얻은 돼지파보바이러스 단일클론항체 4번을 반응시켜 염색하여 돼지파보바이러스 감염을 확인한 결과이다.
도 1f는 돼지파보바이러스 감염 세포와 실시예 1에서 얻은 돼지파보바이러스 단일클론항체 5번을 반응시켜 염색하여 돼지파보바이러스 감염을 확인한 결과이다.

이하, 본 발명을 하기의 실시예에 의하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐이며, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 돼지파보바이러스(Porcine Parvovirus: PPV) 특이적인 단일클론항체

1-1. 항체 제작

재조합 단백질 돼지파보바이러스 VP2(PPV-82)로 면역화된 balb/c 마우스의 비장(spleen)을 적출하여 splenocytes를 얻은 후 myeloma cell(SP2/0AG14)과 fusion하였으며, HAT selection 후 cloning을 통해 4종(2, 3, 4 및 5번)의 하이브리도마 클론을 확보하였다.

1-2. PPV 감염 확인

PK-15 세포에 돼지파보바이러스 VRI-1주를 감염시키고 세포를 고정한 후 하이브리도마 상층액에서 수득한 돼지파보바이러스 단일클론항체 2, 3, 4 또는 5번을 반응시킨 다음 DAB 염색 후 확인한 결과, 4종의 단일클론항체를 통해 돼지파보바이러스 감염이 특이적으로 확인되었다(도 1c 내지 도 1f).

양성대조군으로 사용한 돼지파보바이러스 단일클론항체 9A8은 수탁번호 KCTC18632P의 하이브리도마에 의해 생산되는 단일클론항체로 서열번호 11의 아미노산 서열로 이루어진 CDR1, 서열번호 12의 아미노산 서열로 이루어진 CDR2 및 서열번호 13의 아미노산 서열로 이루어진 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역; 및

서열번호 14의 아미노산 서열로 이루어진 CDR1, 서열번호 15의 아미노산 서열로 이루어진 CDR2 및 서열번호 16의 아미노산 서열로 이루어진 CDR3을 포함하는 경쇄 가변영역을 포함한다.

실시예 1-1에서 확보한 4종의 하이브리도마 클론(2, 3, 4 및 5번) 가운데 5번 클론이 돼지파보바이러스 감염 확인을 위한 DAB 염색에서 가장 선명하고 정확한 결과(도 1f)를 나타내 이를 본 발명의 단일클론항체로 선별하고 항체 서열을 분석함으로써 본 발명을 완성하였다.

<110> REPUBLIC OF KOREA(Animal and Plant Quarantine Agency) <120> Monoclonal Antibody specific for Porcine Parvovirus and use thereof <130> PN190027 <160> 16 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH CDR1 <400> 1 Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ala 1 5 <210> 2 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH CDR2 <400> 2 Ile Ser Ser Gly Gly Ser Tyr Thr 1 5 <210> 3 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH CDR3 <400> 3 Ala Arg His Asp Tyr Asp Asp Val Leu Phe Ala Tyr 1 5 10 <210> 4 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL CDR1 <400> 4 Ser Ser Val Ser Tyr 1 5 <210> 5 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL CDR2 <400> 5 Ser Thr Ser 1 <210> 6 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL CDR3 <400> 6 Gln Gln Arg Ser Ser Tyr Pro Phe Thr 1 5 <210> 7 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH AA SEQ <400> 7 Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Thr Ile Ser Ser Gly Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg His Asp Tyr Asp Asp Val Leu Phe Ala Tyr Trp Gly Leu Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ala 115 <210> 8 <211> 106 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL AA SEQ <400> 8 Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met 20 25 30 His Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Thr Ser Pro Lys Leu Trp Ile Tyr 35 40 45 Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Met Glu Ala Glu 65 70 75 80 Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Ser Tyr Pro Phe Thr 85 90 95 Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 9 <211> 357 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VH DNA SEQ <400> 9 gaggtgaagc tggtggaatc tgggggaggc ttagtgaagc ctggagggtc cctgaaactc 60 tcctgtgcag cctctggatt cactttcagt agctatgcca tgtcttgggt tcgccagact 120 ccggagaaga ggctggagtg ggtcgcaacc attagtagtg gtggtagtta cacctactat 180 ccagacagtg tgaaggggcg attcaccatc tccagagaca atgccaagaa caccctgtac 240 ctgcaaatga gcagtctgag gtctgaggac acggccatgt attactgtgc aagacatgat 300 tacgacgacg tcctgtttgc ttactggggc ctagggactc tggtcactgt ctcagca 357 <210> 10 <211> 318 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VL DNA SEQ <400> 10 caaattgttc tcacccagtc tccagcaatc atgtctgcat ctccagggga gaaggtcacc 60 ataacctgca gtgccagctc aagtgtaagt tacatgcact ggttccagca gaagccaggc 120 acttctccca aactctggat ttatagcaca tccaacctgg cttctggagt ccctgctcgc 180 ttcagtggca gtggatctgg gacctcttac tctctcacaa tcagccgaat ggaggctgaa 240 gatgctgcca cttattactg ccagcaaagg agtagttacc cattcacgtt cggctcgggg 300 acaaagttgg aaataaaa 318 <210> 11 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HCDR1_PPV 9A8 <400> 11 Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Tyr 1 5 <210> 12 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HCDR2_PPV 9A8 <400> 12 Ile Asn Pro Thr Asn Gly Val Thr 1 5 <210> 13 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HCDR3_PPV 9A8 <400> 13 Thr Arg Glu Gly Asn Tyr Gly Tyr Tyr Ala Met Asp Asp 1 5 10 <210> 14 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LCDR1_PPV 9A8 <400> 14 Lys Ser Val Ser Thr Ser Gly Tyr Ser Tyr 1 5 10 <210> 15 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LCDR2_PPV 9A8 <400> 15 Leu Val Ser 1 <210> 16 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LCDR3_PPV 9A8 <400> 16 Gln His Ile Arg Glu Leu Thr 1 5

Claims

서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 구성되는 CDR1(complementarity determining region 1), 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열로 구성되는 CDR2(complementarity determining region 2) 및 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열로 구성되는 CDR3(complementarity determining region 3)을 포함하는 중쇄 가변영역; 및
서열번호 4로 표시되는 아미노산 서열로 구성되는 CDR1, 서열번호 5로 표시되는 아미노산 서열로 구성되는 CDR2 및 서열번호 6으로 표시되는 아미노산 서열로 구성되는 CDR3을 포함하는 경쇄 가변영역을 포함하는 돼지파보바이러스(Porcine Parvovirus: PPV)에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
제 1 항에 있어서, 상기 중쇄 가변 영역은 서열번호 7의 아미노산 서열로 이루어지고, 상기 경쇄 가변 영역은 서열번호 8의 아미노산 서열로 이루어진 것인, 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
서열번호 7의 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 가변영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 서열번호 8의 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 가변영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터.
제 3 항에 있어서, 상기 중쇄 가변영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 9의 뉴클레오티드 서열로 이루어지고, 상기 경쇄 가변영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 10의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 것인 재조합 벡터.
제 3 항의 재조합 벡터로 형질전환 된 숙주세포.
제 5 항의 숙주세포를 배양하는 단계; 및
상기 배양된 세포에서 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 회수하는 단계를 포함하는 돼지파보바이러스(Porcine Parvovirus: PPV)에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 제조하는 방법.
제 1 항의 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하는 돼지파보바이러스 감염 진단용 조성물.
제 1 항의 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 사용하여 돼지의 생물학적 시료로부터 돼지파보바이러스의 항원 단백질을 검출하는 단계를 포함하는, 돼지파보바이러스 감염 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법.
제 8 항에 있어서, 상기 생물학적 시료는 돼지의 조직, 세포, 전혈, 혈청, 혈장, 분변, 타액, 객담, 뇌척수액 또는 뇨인 것인, 돼지파보바이러스 감염 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법.