KR101105833B1 - 구제역바이러스 아시아 １형 항체를 검출하기 위한 진단방법 - Google Patents

구제역바이러스 아시아 １형 항체를 검출하기 위한 진단방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 구제역바이러스 아시아 1형 항체를 검출하기 위한 진단방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 (1) 96웰 마이크로플레이트에 O형, A형, 아시아1형 및 C형의 구제역바이러스 혈청형 공통 항체 70-17을 반응시키는 단계; (2) 상기 플레이트에 부착되지 않은 단클론항체를 세척하여 제거하는 단계; (3) 진단항원으로서 구제역바이러스 아시아1형 유전자재조합 단백질항원을 반응시키는 단계; (4) 상기 플레이트에 부착되지 않은 단백질항원을 세척하여 제거하는 단계; (5) 검사혈청시료를 반응시키는 단계; (6) 상기 플레이트에 부착되지 않은 검사혈청시료를 세척하여 제거하는 단계; (7) 호스레디쉬 페록시다제 효소가 결합된 아시아1형 특이 단클론항체를 경합적으로 반응시키는 단계; (8) 상기 플레이트에 부착되지 않은 단클론항체를 세척하여 제거하는 단계; 및 (9) 효소반응에 의한 발색반응의 흡광도를 측정하여 검사혈청 중의 구제역바이러스 아시아1형 항체 수준을 측정하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 구제역바이러스 아시아1형 항체를 검출하기 위한 진단방법에 관한 것이다.
본 발명의 진단방법은 경합방식의 효소결합면역측정법으로서 소, 돼지, 염소 등 축종에 상관없이 동일한 방식으로 검사할 수 있으며 구제역바이러스 아시아 1형 감염여부를 판정하거나 백신접종시 백신항체역가를 신속하게 측정할 수 있기 때문에 표준검사법인 바이러스중화시험법을 대체할 수 있는 신규 진단법으로의 활용이 가능하며, 또한 기존 진단법과는 달리 생바이러스를 취급하지 않기 때문에 바이러 스 취급에 따른 불의의 사고로 바이러스가 유출되어 질병이 발생할 수 있는 우려를 사전에 차단할 수 있다.
구제역바이러스 아시아1형, 유전자재조합 단백질항원, 단클론항체, 효소결합면역측정법

Description

구제역바이러스 아시아 １형 항체를 검출하기 위한 진단방법{Diagnostic method for the detection of antibodies to foot-and-mouth disease virus type Asia 1}
본 발명은 구제역바이러스 아시아1형 유전자재조합 단백질항원 및 구제역바이러스 아시아1형 특이 단클론항체를 이용하여 구제역바이러스 아시아1형 항체를 검출하기 위한 진단방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 상기 진단방법은 (1) 96웰 마이크로플레이트에 O형, A형, 아시아1형 및 C형의 구제역바이러스 혈청형 공통 항체 70-17을 반응시키는 단계; (2) 상기 플레이트에 부착되지 않은 단클론항체를 세척하여 제거하는 단계; (3) 진단항원으로서 구제역바이러스 아시아1형 유전자재조합 단백질항원을 반응시키는 단계; (4) 상기 플레이트에 부착되지 않은 단백질항원을 세척하여 제거하는 단계; (5) 검사혈청시료를 반응시키는 단계; (6) 상기 플레이트에 부착되지 않은 검사혈청시료를 세척하여 제거하는 단계; (7) 호스레디쉬 페록시다제 효소가 결합된 아시아1형 특이 단클론항체를 경합적으로 반응시키는 단계; (8) 상기 플레이트에 부착되지 않은 단클론항체를 세척하여 제거하는 단계; 및 (9) 효소반응에 의한 발색반응의 흡광도를 측정하여 검사혈청 중의 구제역바이 러스 아시아1형 항체 수준을 측정하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 구제역바이러스 아시아1형 항체를 검출하기 위한 진단방법에 관한 것이다.
구제역은 소, 돼지, 양, 염소 등의 우제류 동물에 감염되는 매우 전염성이 높은 동물전염병이다. 일단 발생시에는 국제교역에 치명적인 영향을 미쳐서 상당한 경제적인 피해를 초래한다. 원인체는 구제역바이러스로서 8500 염기쌍으로 구성된 단일가닥의 RNA를 함유하고 있으며 VP1, VP2, VP3, VP4 네 개의 단백질이 60개씩 모여서 바이러스 외피를 구성한다. 구제역은 7종의 혈청형으로 구분되는데 O형, A형, 아시아1형, C형, 남아프리카지역형(South African territories; SAT) 1, SAT 2, SAT 3이다.
구제역 검사에 있어서는 확진검사로서는 항원검사가 필수적이나 항원검사시료가 없을 경우에는 혈청학적인 검사를 통해서 감염여부를 확인한다. 특히, 감염 후 숙주동물에서 형성되는 항체를 신속하게 검출하거나 백신접종후에 백신항체가를 정확하게 측정하려면 기존의 비구조단백질 항체검사법이 아닌 구조단백질 항체를 측정하는 검사법이 요구된다.
현재 구조단백질 항체를 검출하는 진단법으로서 국제수역사무국에서는 중화시험법을 표준진단법으로 권장하고 있으나 3일정도가 소요되고 생물안전 차폐실험실에서 실시해야 하는 등 대량의 시료를 검사하기에는 어려움이 있어서 이를 극복하고자 효소결합면역측정법이 개발되었다. Hamblin 등(1986)은 불활화 구제역바이 러스와 토끼 및 기니픽 다클론항체를 사용한 액상블로킹 방식(Liquid-phase blocking)의 효소결합면역측정법(LPB ELISA)을 개발하였으나 진단항원을 생산하려면 생바이러스를 취급해야하고 다클론항체를 사용하기 때문에 생산배치마다 항체역가의 차이가 발생하는 단점이 있다. 특히, 생바이러스를 취급하는 과정에서 바이러스의 유출로 인한 구제역의 야외발생의 위험성이 상존한다. Valarcher 등(2008)에 따르면 1987년과 1988년에 독일에서, 1993년에는 러시아에서 실험실내 구제역바이러스 유출로 구제역이 발생한 예가 있었고, 2007년도 영국에서의 구제역 발생도 실험실에서 취급하던 구제역바이러스가 야외로 유출되어 발생한 사건이었다.
이러한 단점을 극복하고자 엄 등(2004)은 구제역바이러스 O형의 구조단백질전구체인 P1과 단백분해효소인 3C 유전자를 이용한 유전자재조합 단백질 항원을 제작하여 구제역 O형 항체진단법으로 적용하였다. 반면에 Li 등(2008)은 구제역 아시아1형 구조단백질 외피를 유전자재조합 방법으로 제작하여 소에서의 방어효과를 확인하였다. 또한, Cao 등(2009)은 구제역 아시아1형 구조단백질 외피를 유전자재조합 방법으로 제작하여 기니픽에서의 중화항체유도여부를 확인하였다. 그러나 이러한 유전자재조합 단백질 항원을 이용하여 아시아 지역에서 다발하는 구제역 아시아1형의 항체를 신속하게 검출하는 진단법에 대해서는 아직 소개된 예가 없었다.
본 발명의 목적은 진단항원으로서 기존의 불활화바이러스를 유전자재조합 단백질로 대체하여 일반실험실에서 안전하게 제작할 수 있는 형태의 항원을 개발하고 구제역바이러스 아시아 1형에 대해서 특이적으로 결합하는 단클론항체를 선발하여 구제역바이러스 아시아 1형 항체를 신속하게 검출하는 새로운 진단방법을 제공함에 있다.
상기의 과제를 해결하고자, 본 발명은 구제역바이러스 아시아1형 유전자재조합 단백질항원 및 구제역바이러스 아시아1형 특이 단클론항체를 이용한 구제역바이러스 아시아1형 항체를 검출하기 위한 진단방법을 제공하며, 보다 구체적으로는 상기 진단방법은 (1) 96웰 마이크로플레이트에 O형, A형, 아시아1형 및 C형의 구제역바이러스 혈청형 공통 항체 70-17을 반응시키는 단계; (2) 상기 플레이트에 부착되지 않은 단클론항체를 세척하여 제거하는 단계; (3) 진단항원으로서 구제역바이러스 아시아1형 유전자재조합 단백질항원을 반응시키는 단계; (4) 상기 플레이트에 부착되지 않은 단백질항원을 세척하여 제거하는 단계; (5) 검사혈청시료를 반응시키는 단계; (6) 상기 플레이트에 부착되지 않은 검사혈청시료를 세척하여 제거하는 단계; (7) 호스레디쉬 페록시다제 효소가 결합된 아시아1형 특이 단클론항체를 경합적으로 반응시키는 단계; (8) 상기 플레이트에 부착되지 않은 단클론항체를 세척 하여 제거하는 단계; 및 (9) 효소반응에 의한 발색반응의 흡광도를 측정하여 검사혈청 중의 구제역바이러스 아시아1형 항체 수준을 측정하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 구제역바이러스 아시아1형 항체를 검출하기 위한 진단방법을 제공한다.
본 발명의 진단방법은 경합방식의 효소결합면역측정법으로서 소, 돼지, 염소 등 축종에 상관없이 동일한 방식으로 검사할 수 있으며 구제역바이러스 아시아 1형 감염여부를 판정하거나 백신접종시 백신항체역가를 신속하게 측정할 수 있기 때문에 표준검사법인 바이러스중화시험법을 대체할 수 있는 신규 진단법으로의 활용이 가능하며, 또한 기존 진단법과는 달리 생바이러스를 취급하지 않기 때문에 바이러스 취급에 따른 불의의 사고로 바이러스가 유출되어 질병이 발생할 수 있는 우려를 사전에 차단할 수 있다.
본 발명은 구제역바이러스 아시아1형 유전자재조합 단백질항원 및 구제역바이러스 아시아1형 특이 단클론항체를 이용하여 구제역바이러스 아시아1형 항체를 검출하기 위한 진단방법을 제공한다.
본 발명에서 상기 유전자재조합 단백질항원은 구제역바이러스 아시아1형 P1 유전자와 3C 유전자를 함유한 베큘로바이러스를 이용하여 곤충세포에서 생산한 단 백질일 수 있다.
또한 본 발명에서 상기 특이 단클론항체는 구제역바이러스 아시아1형 감염개체 또는 백신개체의 혈청내 항체와의 경쟁반응을 하는 융합세포주일 수 있다.
또한 본 발명에서 상기 진단방법은 효소결합면역측정법을 이용한 것일 수 있다.
또한 본 발명에서 상기 진단방법은, (1) 96웰 마이크로플레이트에 O형, A형, 아시아1형 및 C형의 구제역바이러스 혈청형 공통 항체 70-17을 반응시키는 단계; (2) 상기 플레이트에 부착되지 않은 단클론항체를 세척하여 제거하는 단계; (3) 진단항원으로서 구제역바이러스 아시아1형 유전자재조합 단백질 항원을 반응시키는 단계; (4) 상기 플레이트에 부착되지 않은 단백질 항원을 세척하여 제거하는 단계; (5) 검사혈청시료를 반응시키는 단계; (6) 상기 플레이트에 부착되지 않은 검사혈청시료를 세척하여 제거하는 단계; (7) 호스레디쉬 페록시다제 효소가 결합된 아시아1형 특이 단클론항체를 경합적으로 반응시키는 단계; (8) 상기 플레이트에 부착되지 않은 단클론항체를 세척하여 제거하는 단계; 및 (9) 효소반응에 의한 발색반응의 흡광도를 측정하여 검사혈청 중의 구제역바이러스 아시아1형 항체 수준을 측정하는 단계;를 포함할 수 있다.
본 발명은 또한 구제역바이러스 아시아1형 항체를 검출하기 위하여 사용되어지는 융합세포주 FMD-AS-1A31(KCLRF-BP-00216)를 제공한다.
이하 본 발명의 구제역바이러스 아시아1형 항체를 검출하기 위한 진단방법에 대하여 보다 상세하게 설명한다.
본 발명에서는 구제역바이러스 아시아1형 구조단백질전구체 P1과 3C 단백분해효소 유전자를 이용하여 베큘로바이러스 감염 곤충세포에서 진단항원의 인공발현을 시도하였다. 또한, 구제역바이러스 아시아1형에 특이적인 단클론항체를 경쟁반응용 항체로 제작하여 상기의 진단항원과 더불어 구제역 아시아1형 항체를 신속하게 검출하는 새로운 진단방법을 제공하고자 하였다.
본 발명의 발명자들은 구제역바이러스 아시아1형의 구조단백질전구체에 해당하는 P1 유전자와 3C 단백분해효소 부위의 유전자를 하나의 발현벡터에 클로닝한 후에 곤충세포에서 발현하여 진단항원으로 사용하고 경쟁반응용 단클론항체는 바이러스의 중화 에피톱에 해당하는 펩타이드를 합성하여 마우스에 접종후 면역세포와 골수종유래 세포를 세포융합하여 융합세포주 FMD-AS-1A31 를 제작하고 이를 한국세포주은행에 기탁하여 2009년 9월 11일자로 기탁번호 KCLRF-BP-00216를 부여받았다. 상기 기탁된 유전자재조합 단백질 항원과 단클론항체를 이용하여 새로운 형태의 효소결합면역측정법을 개발하였다.
본 발명의 진단방법은 경합방식의 효소결합면역측정법으로서 소, 돼지, 염소 등 축종에 상관없이 동일한 방식으로 검사할 수 있으며 구제역바이러스 아시아1형 감염여부를 판정하거나 백신접종시 백신항체역가를 신속하게 측정할 수 있기 때문에 표준검사법인 바이러스중화시험법과 기존의 LPB ELISA를 대체할 수 있는 신규 진단법으로서의 활용이 가능하다.
본 발명의 진단방법은 경합방식의 효소결합면역측정법으로서 소, 돼지, 염소 등 축종에 상관없이 동일한 방식으로 검사할 수 있으며 구제역바이러스 아시아 1형 감염여부를 판정하거나 백신접종시 백신항체역가를 신속하게 측정할 수 있기 때문에 표준검사법인 바이러스중화시험법을 대체할 수 있는 신규 진단법으로의 활용이 가능하며, 또한 기존 진단법과는 달리 생바이러스를 취급하지 않기 때문에 바이러스 취급에 따른 불의의 사고로 바이러스가 유출되어 질병이 발생할 수 있는 우려를 사전에 차단할 수 있다. 결과적으로 유전자재조합 단백질 진단항원을 이용함으로써 일반실험실에서도 손쉽게 구제역바이러스 아시아1형 진단항원을 생산할 수 있어서 긴급방역상황에서 신속한 진단액 공급이 가능하고 궁극적으로 구제역의 국내유입을 차단하여 국내 축산업의 보호에 기여할 수 있다.
본 발명은 진단항원으로서 기존의 불활화바이러스를 유전자재조합 단백질로 대체하여 일반실험실에서 안전하게 제작할 수 있는 형태의 항원을 개발하고 구제역바이러스 아시아 1형에 대해서 특이적으로 결합하는 단클론항체를 선발하여 구제역바이러스 아시아 1형 항체를 신속하게 검출하는 새로운 진단방법에 관한 것이다.
이하 본 발명의 실시예 및 실험예를 설명한다. 다만, 이하의 실시예 등은 본 발명을 더욱 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 권리범위를 이에 한정하고자 하는 것은 아니다.
<실시예 1> 유전자재조합 구제역바이러스 아시아1형 단백질 발현 및 확인
구제역바이러스 아시아1형(As/MOG/05; GeneBank 번호 EF614458)을 감염시킨 IBRS-2 세포에서 RNeasy extraction 키트(Qiagen사)를 사용하여 바이러스 RNA를 추출하였다. 상보적인 DNA는 Random hexamer와 AccuPower RT premix(바이오니아)를 사용하여 제작하였고, cDNA를 주형으로 nPfu DNA polymerase(Enzynomics사)를 적용하여 유전자를 증폭하였다. P1 유전자의 순방향 프라이머는 5' GAA GGG ATC CAT GGG AGC CGG GCA ATC AGT CCG 3'이고 역방향 프라이머는 5' TAG GAC TAG TTA CAA AGT CTG TTT CTC AGG TGC 3'이다 단백분해효소인 3C 유전자의 순방향 프라이머는 5' GAT TCT CGA GAT GAG CGG TGC CCC CCC GAC CGA C 3'이고 역방향 프라이머는 5' AAC AGC ATG CTA CTC ATG GTG TGG TTC AGG GTC 3'이다. 유전자 증폭기를 사용하여 상기의 프라이머에 대한 유전자를 증폭하였고 조건은 다음과 같다. 즉, 95℃에서 2분간 변성을 시키고 나서 95℃30초, 55℃ 30초, 72℃ 2분을 기본 사이클로 해서 35회 반복하였다. 마지막에는 72℃에서 10분간 연장증폭하였다. 증폭한 유전자는 전이벡터인 pFastBacDual 벡터(Invitrogen사)에 삽입하였다. 이렇게 제작된 전이벡터는 배큘로바이러스 유전자 bacmid DNA를 함유하고 있는 대장균에 형질전환하고 이를 곤충세포(Sf9)에 주입하여 재조합배큘로바이러스를 제작하였다.
세포배양 플라스크에서 배양한 곤충세포에 재조합 배큘로바이러스를 접종한 후에 세포변형이 관찰되면 냉동 및 융해를 3회반복하여 세포를 파쇄하고 10,000 x g 30분 원심분리하여 상층액을 취하여 진단항원으로 사용하였다. 단백질 발현여부를 확인하기 위하여 형광항체법을 실시하였다. 슬라이드에 구제역바이러스 아시아1형을 접종한 후에 세포변성이 관찰되면 인산완충용액으로 3회 세척후 건조하고나서 아세톤과 메탄올을 동량으로 혼합한 액으로 세포를 10분간 고정하였다. 이후에 인 산완충용액으로 세척한 후에 VP1 펩타이드 혈청으로 37℃에서 1시간 반응시켰다. 다시 인산완충용액으로 세척한 후에 FITC 결합된 항마우스 항체를 이차항체로 1시간동안 반응시켜서 형광여부를 관찰하였다. 그 결과, 도 1 (가)에서 보는 바와 같이 VP1 펩타이드 항혈청을 이용한 형광항체법에서 양성반응성이 확인되었다.
재조합단백질이 성공적으로 발현되었음을 확인하였기 때문에 또 다른 확인방법으로서 웨스턴블롯팅을 적용하였다. 즉, 단백질 샘플을 Xcell SureLock mini-cell 장치(Invitrogen사)를 이용하여 NuPAGE Novex Bis-Tris gels(Invitrogen사)에서 사용자 매뉴얼에 따라서 전기영동을 실시하였다. 분리된 단백질들을 nitrocellulose membrane에 전이하였고 샘플희석용액 [Tris-buffered saline containing 0.05% Tween 20 (TBST) & 5% skim milk] 으로 실온에서 1시간동안 블록킹한 후에 구제역바이러스 아시아1형 VP1 펩타이드에 대한 토끼항체를 샘플희석용액으로 1:100 희석하여 1시간동안 반응시켰다. 세척액(Tris-buffered saline containing 0.05% Tween 20) 으로 3회세척 후에 alkaline phosphatase가 결합된 염소 항토끼 항체를 샘플희석용액으로 1:1,000 희석하여 첨가하였다. 실온에서 1시간동안 반응시킨 후에 세척액으로 5회 세척하였고, 발색은 BCIP/NBT 용액으로 실시하였다. 도 1 (나)와 같이 구조단백질전구체인 P1 밴드는 전혀 없고 뚜렷한 VP1 밴드만 나타났기 때문에 3C 단백분해효소에 의해서 P1이 절단되었음을 확인하였다. 따라서 앞선 형광항체법에서의 반응성이 P1이 아닌 VP1 단백질에 의한 반응성임을 확인하였다. 또한 발현양상을 일자별로 비교해 보았을 때 재조합베큘로바이러스를 접종한지 4일째부터 밴드가 확인되었으며 실험종료일인 7일째까지 일정한 세기를 나 타내었다.
<실시예 2> 유전자재조합 단백질 항원의 면역원성 평가
유전자재조합 단백질 진단항원을 두 마리의 돼지에 IMS1313 아주번트 (Seppic사)와 혼합하여 2회 근육접종하였다. 접종 후 14일째에 추가 접종하였고 1회접종 후 14일째, 2회접종 후 13일째와 20일째에 채혈하여 진단법에 따른 역가차이를 비교하였다(이하 표 1 참조). 비교결과 한개체에서만 45배수준의 낮은 중화역가를 나타내었다. #51번 돼지에서는 본 발명의 진단법이 중화시험법보다는 6-8배 그리고 LPB ELISA에서는 3-4배 정도 우수하게 항체를 검출하였다. #71번 돼지에서는 본 발명의 진단법이 LPB ELISA와는 대등하였고 중화시험법보다는 4배정도 항체를 우수하게 검출하였다.
[표 1] 유전자재조합 단백질 항원의 돼지에서의 면역원성 평가 및 진단법간 역가 비교
개체번호 혈청 중화시험법a LPB ELISAb 본 발명의
진단법c
#51 면역전 <16 <45 <10
1회접종 14일째 <16 <45 <10
2회접종 13일째 45 (1.0)d 90 (2.0) 60 (6.0)
2회접종 13일째 22 (0.5) 45 (1.0) 40 (4.0)
#71 면역전 <16 <45 <10
1회접종 14일째 <16 <45 <10
2회접종 13일째 22 (0.5) 64 (1.5) 20 (2.0)
2회접종 13일째 <16 45 (1.0) 10 (1.0)
(상기 표 1에서, a. 중화시험법 역가 (양음성 판정기준 역가는 45배임), b LPB ELISA 역가 (양음성 판정기준 역가는 45배임), c. 양성으로 판정된 최종 혈청희 석배수임 (표준 혈청희석배수 1:10 기준), d. 중화시험법과 LPB ELISA는 45배기준이고, 본 발명의 진단법은 혈청희석배수 1:10을 기준으로 한 배수(fold)역가이다.)
<실시예 3> 구제역바이러스 아시아1형 단클론항체를 생산하는 융합세포주 제작
As/MOG/05의 VP1 138번부터 158번 아미노산에 해당하는 부위의 펩타이드 (E ESSRRGDLAALARRVNNRLP)를 펩트론(대전, 대한민국)에서 제작하였다. 펩타이드 합성후에는 KLH에 결합하였고 이를 마우스에 4회 복강접종하였고 5회째 정맥주사한 후에 슬와임파절(Popliteal lymph node)을 채취하여 세포융합에 사용하였다.
세포융합은 폴리에틸렌글리콜을 사용하는 일반적인 방법으로 다음과 같이 실시하였다. 상기 채취한 림프구를 무혈청 배지(Serum Free Medium)로 세척한 후, 마우스 골수종 유래세포주(SP2/0-Ag14 mouse myeloma cell line)와 5:1 비율로 혼합한 후 폴리에틸렌글리콜 1500을 첨가하여 융합하였다. 융합이 완료된 세포는 증식배지[D-MEM, HAT(Hypoxanthine Aminopterin Thymidine), 10% 우태아혈청]에 적당히 희석한 후 미리 마우스 복강세포가 배양되어 있는 96웰 마이크로플레이트에 100 ㎕씩 분주하여 37℃, 5% 이산화탄소 배양기 내에서 배양하였다.
구제역바이러스 아시아1형에 대한 단클론항체를 생산하는 융합세포주의 선발은 다음과 같이 실시하였다. 상기 세포융합의 결과로 융합세포가 증식한 웰의 배양 상층액을 수거하여 펩타이드 항원을 이용한 간접 효소결합면역측정법을 실시하여 양성반응을 보이는 웰의 융합세포들을 마우스 복강세포가 배양된 96웰 플레이트에 웰당 0.8개의 세포가 포함되도록 첨가하고 단일클론(clone)이 형성될 때까지 배양하였다. 구제역바이러스 아시아1형에 대한 항체를 생산하면서 단 하나의 클론만이 증식하는 웰을 선발하였다. 이렇게 선발된 융합세포주를 발브씨 마우스의 복강에 접종하여 생성시킨 복수를 채취하여 IgG 항체만을 ImmunoPure IgG 정제 키트(Pierce, 미국)로 정제하여 실험에 사용하였다.
최종선발한 단클론항체인 FMD-AS-1A31은 IgG1이고 몽골분리주인 As/MOG/05 (도 2의 가) 뿐만 아니라 캄보디아 분리주인 CAM 9/80 구제역바이러스 아시아1형과도 형광항체법에서 반응성을 확인하였다(도 2의 나). 상기 단클론항체인 FMD-AS-1A31를 한국세포주은행에 기탁하여 2009년 9월 11일자로 기탁번호 KCLRF-BP-00216를 부여받았다.
<실시예 4> 유전자재조합 단백질 항원과 아시아1형 특이 단클론항체를 이용한 효소결합면역측정법 구축 및 유효성 평가
유전자재조합 단백질 항원과 단클론항체 FMD-AS-1A31을 이용하여 구제역바이러스 아시아1형 항체를 검출하기 위한 효소결합면역측정법은 다음과 같다.
96웰 마이크로플레이트에 구제역바이러스 혈청형 공통 단클론항체 70-17을 탄산완충용액(Carbonate buffer, pH 9.6)에 200배 희석하여 96웰 마이크로플레이트(Maxisorp)에 50㎕/well 씩 분주하여 4℃에서 16시간 정치하였다. 이튿날, 코팅한 마이크로플레이트를 세척액[0.05% 트윈 20(Tween 20)이 함유된 10mM 인산완충용 액(phosphate buffered buffer)]으로 3회 세척하여 부착되지 않은 단클론항체를 세척하여 제거하고 나서 구제역바이러스 아시아1형 유전자재조합 단백질 항운을 블로킹용액(10mM 인산완충용액에 0.05% 트윈 20 및 5% 탈지유 첨가한 용액)으로 1:8로 희석하여 50㎕/well씩 분주한 다음 37℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 세척액으로 3회 세척하여 부착되지 않은 단백질 항원을 세척하여 제거하고 나서 검사혈청을 블로킹용액으로 1:10 희석하여 50㎕/well씩 분주한 다음 37℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 세척액으로 다시 3회 세척하여 항원에 결합하지 않은 혈청내 항체를 제거한 후, 호스레디쉬 페록시다제 효소가 결합된 아시아1형 특이 단클론항체인 FMD-AS-1A31를 블로킹용액으로 2㎍/ml 농도로 희석하여 50㎕/well씩 분주한 다음 37℃에서 1시간동안 반응시켰다. 세척액으로 5회 세척하고 나서, 발색제로서 오피디(O-Phenylenediamine) 용액과 0.015% 과산화수소수를 첨가하여 15분 내외로 반응시켰다. 혈청이 배제된 대조군의 흡광도가 1.2 내외의 값을 보일 것으로 추정되는 시점에서 1.25N 황산용액을 50㎕/well 첨가하여 발색반응을 정지시킨 다음, 492nm에서 흡광도를 측정하였다.
최종결과는 혈청없이 단클론항체만을 첨가한 웰의 흡광도 대비 검사웰의 흡광도 억제도를 환산하여 분석하였다. 상기 반응의 결과판정에서 단클론항체 대조웰의 흡광도보다 50% 이상 반응이 저해된 웰, 즉 반응저해도(Percentage Inhibition, PI)가 50% 이상인 경우 구제역바이러스 아시아1형 항체 양성반응으로 판정하였다.
반응저해도 (%) = 100 × [(대조웰 흡광도 - 검사혈청 흡광도)/대조웰 흡광 도] 이때, 대조웰 흡광도는 혈청없이 단크론항체만 포함한 웰의 흡광도이다(이와 관련된 모식도를 도 3에 나타내었다.).
<실험예 1> 음성혈청을 이용한 양음성판정기준 설정 및 특이도 평가
국내에서 사육중인 돼지 560두, 소 640두, 염소 560두를 대상으로 본 발명의 효소결합면역측정법을 적용한 결과 정규분포를 가정하여 99% 신뢰구간에서의 양음성판정기준으로서 평균값 + 3 × 표준편차를 산출하여 50%를 설정하였다(도 4 참조). 이를 기준으로 돼지혈청에서는 99.3%, 소혈청에서는 99.7%, 염소혈청에서는 100%의 특이도를 나타내었다. 따라서 총 1,760두 중 6두에서 비특이 양성반응을 보였기 때문에 결과적으로 99.7% 특이도를 나타내었다(이하 표 2 참조).
[표 2]
축종 검사혈청수 검사결과 특이도 (%)
양성판정수 음성판정수
돼지 560 4 556 99.3
소 640 2 638 99.7
염소 560 0 560 100.0
총계 1760 6 1754 99.7
<실험예 2> 실험접종후 채혈한 염소혈청에 대한 진단법의 유효성 평가
구제역바이러스 3가백신(O Manisa, A22 IRQ, Asia 1 Shamir) 접종 후, 몽골주 구제역바이러스 아시아1형(As/MOG/05; GeneBank 번호 EF614458)을 공격접종한 염소유래의 혈청에서 본 발명의 진단법과 기존 진단법을 비교한 결과, LPB ELISA에 비해서 2번 및 3번 염소혈청에서는 본 발명의 진단법이 1.5배가량 민감도가 우세하 였고 중화시험에 비해서는 모든 개체에 있어서 본 발명의 진단법이 1.5배에서 3배정도 우세하였다(도 5 참조).
<실험예 3> LPB ELISA 양성대조혈청에 대한 진단법의 유효성 평가
본 실험에서는 본 발명의 진단항원과 동일한 유래의 몽골주 구제역바이러스를 사용하였기 때문에 본 발명의 진단법이 LPB ELISA보다 민감도가 우세하게 나타났을 가능성이 있다. 따라서 LPB ELISA 키트에 포함된 양성대조혈청(LPB ELISA 항원과 동일한 지역인 이스라엘 발생주 접종혈청임)을 대상으로 본 발명의 진단법과 LPB ELISA간의 민감도를 비교하였다. 오히려 본 발명의 진단법이 강양성혈청에서는 4배정도 그리고 약양성혈청에서는 2배정도의 높은 검출율을 나타내었다(이하 표 3 참조). 따라서 본 발명의 진단법은 혈청유래의 지역에 상관없이 LPB ELISA를 대체할 수 있는 가능성을 제시하였다.
[표 3]
혈청 본 발명의 진단법 LPB ELISA
구제역 아시아1형 강양성혈청 160a(16)b 180c(4)b
구제역 아시아1형 약양성혈청 10(4) 90(2)
(상기 표 3에서, a 양성으로 판정된 최종 혈청희석배수임(표준 혈청희석배수 1:10 기준), b 괄호안의 수치는 LPB ELISA는 45배기준이고 본 발명의 진단법은 혈청희석배수 1:10을 기준으로 한 배수(fold)역가이고, c 양성으로 판정된 최종 혈청희석배수임(표준 혈청희석배수 1:10 기준))
<실험예 4> 백신접종혈청에 대한 진단법의 유효성 평가
전 세계적으로 널리 사용되는 3가백신을 접종하여 혈청내 유도되는 항체를 검출하는 능력을 평가하기위하여 2000년 국내에서 구제역 발생시 3가백신을 접종 후에 채혈한 혈청 68점을 대상으로 본 발명의 진단법과 기존 진단법인 LPB ELISA간의 민감도를 평가한 결과, LPB ELISA는 2점을 음성으로 판정한 반면에 본 발명의 진단법은 4개를 음성으로 판정하였다(도 6 참조). 그러나, 대부분의 음성판정 혈청들의 반응억제도가 판정기준치인 50% 부근의 수치를 보였기 때문에 전체적으로는 LPB ELISA와 대등한 수준을 나타내었고 결과적으로 LPB ELISA를 대체하는 진단법으로서의 가능성을 확인하였다.
본 발명의 진단방법은 구제역바이러스 아시아 1형 감염여부를 판정하거나 백신접종시 백신항체역가를 신속하게 측정할 수 있게 할 수 있는 신속한 진단법으로서, 구제역바이러스를 예방하여 가축의 건강상태를 양호하게 유지시키며, 이를 통하여 국가의 축산업에 일조를 할 것으로 기대된다.
도 1은 토끼유래 VP1 항혈청을 이용하여 형광항체법으로 재조합단백질 발현을 확인한 결과(가)와, 재조합베큘로바이러스의 곤충세포 접종후 일자별로 측정한 웨스턴블롯 결과(나)이다.
도 2는 형광항체법으로 구제역바이러스 몽골주(As/MOG/05) 아시아1형(가)과 캄보디아주(CAM9/80) 아시아1형(나)의 감염세포에서의 단클론항체(FMD-AS-1A31) 반응성을 관찰한 결과이다.
도 3은 유전자재조합 단백질 항원과 단클론항체를 이용한 본 발명의 진단법에 대한 모식도이다.
도 4는 국내에서 사육중인 돼지 560두, 소 640두, 염소 560두를 대상으로 본 발명의 효소결합면역측정법으로 측정한 결과를 반응저해도(%) 분포도로 표시(점선은 양음성판정기준) 한 도면이다.
도 5는 구제역바이러스 백신접종후 몽골주 아시아1형 바이러스를 공격접종한 염소유래의 혈청에서 본 발명의 진단법과 기존 진단법을 비교한 결과이다.
도 6은 국내 백신접종축 유래 혈청(68점)에 대한 기존진단법인 LPB ELISA(가)와 본 발명의 검사결과(나) 간의 민감도를 비교한 결과이다.
<110> National Veterinary Reasearch and Qurantine Service Jenobiotech <120> Diagnostic method for the detection of antibodies to foot-and-mouth disease virus type Asia 1 <160> 4 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> the forward primer of P1 genes <400> 1 gaagggatcc atgggagccg ggcaatcagt ccg 33 <210> 2 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> the reverse primer of P1 genes <400> 2 taggactagt tacaaagtct gtttctcagg tgc 33 <210> 3 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> the forward primer of 3C genes <400> 3 gattctcgag atgagcggtg cccccccgac cgac 34 <210> 4 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> the reverse primer of 3C genes <400> 4 aacagcatgc tactcatggt gtggttcagg gtc 33

Claims (6)

  1. 삭제
  2. 구제역바이러스 아시아1형 P1 유전자와 3C 유전자를 함유한 베큘로바이러스를 이용하여 곤충세포에서 생산한 단백질임을 특징으로 하는 구제역바이러스 아시아1형 유전자재조합 단백질항원; 및 구제역바이러스 아시아1형 특이 단클론항체;를 이용한 구제역바이러스 아시아1형 항체를 검출하기 위한 진단방법.
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 삭제
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