CN117209595A - 抗非洲猪瘟病毒p72蛋白中和活性单克隆抗体4f10及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种抗非洲猪瘟病毒（ASFV）P72蛋白中和活性抗体4F10及其应用。本发明利用杂交瘤细胞融合技术，成功获得一株特异性针对ASFV P72蛋白的中和活性单克隆抗体（4F10），在体外具有阻止ASFV感染敏感细胞的中和功能，对抗原亲和力强，可应用于抗病毒药物的研究。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种抗非洲猪瘟病毒(ASFV)P72蛋白中和活性单克隆抗体4F10及其应用。
背景技术
非洲猪瘟(African swine fever,ASF)是由非洲猪瘟病毒(African swine fevervirus,ASFV)引起猪的一种急性、高度接触性传染病，其病程短、病死率可达100％。ASFV是一种很难清除的病毒，目前ASF的灭活苗、弱毒苗、亚单位苗和DNA疫苗都不足以保护猪免受ASFV的攻击。人们对有效保护猪群不受ASFV感染的免疫机制及其有效免疫组分知之甚少。因此，除了扩大对ASFV蛋白质组和单个蛋白质功能的理解外，还需在抗体和细胞介导的ASFV免疫反应之间找到适当的平衡，这些对于合理设计靶向疫苗具有非常重要的意义。
ASFV结构蛋白较多，其中P72是主要的结构蛋白之一，该蛋白序列较保守，由B646L基因编码，占病毒颗粒的31～33％，是结构蛋白中含量最多的。P72存在于病毒衣壳的表面，具有较好的免疫原性和抗原性，能够诱导机体产生中和抗体。中和抗体的作用机制主要是改变病毒表面的构型，阻止病毒吸附于易感细胞，使病毒不能穿入易感细胞内进行增殖。筛选针对P72蛋白的中和抗体，将增加我们对猪体液免疫应答的理解和认识，为设计ASFV新型疫苗和有效防控ASF提供理论基础。
发明内容
本发明的目的是提供抗ASFV P72蛋白的中和活性单克隆抗体(4F10)及其应用。本发明以公开号为CN112979765A的发明专利中获得P72蛋白作为免疫源，免疫小鼠，通过细胞融合及亚细胞筛选技术获得具有中和活性的抗P72蛋白的单克隆抗体4F10。
本发明第一方面，提供一种抗ASFV P72蛋白的单克隆抗体4F10，所述单克隆抗体其重链及轻链可变区CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列如下：
重链VH的CDR1：GYTFTDYN；
重链VH的CDR2：INPYNGGT；
重链VH的CDR3：ARYNGDY。
轻链VL的CDR1：KSLLHSNGNTY；
轻链VL的CDR2：RMS；
轻链VL的CDR3：MQHLLEFPLT。
单克隆抗体4F10的重链可变区的氨基酸序列和轻链可变区氨基酸序列分别如SEQID NO:1或SEQ ID NO:2所示。
本发明第二方面提供一种编码所述的抗非洲猪瘟病毒P72蛋白的单克隆抗体4F10的基因，所述单克隆抗体4F10重链可变区的基因核苷酸序列分别如SEQ ID NO:3或SEQ IDNO:4所示。
所述的单克隆抗体4F10重链恒定区为IgG2a型。
所述的单克隆抗体4F10轻链恒定区为Kappa型。
本发明第三方面提供了包含所述单克隆抗体4F10的重链可变区和轻链可变区基因的重组表达载体。
本发明第四方面提供了包含上述重组表达载体的宿主细胞。
所述单克隆抗体4F10具有如下功能中的至少一种：
(1)检测ASFV；
(2)检测ASFV P72蛋白。
本发明第五方面，提供单克隆抗体4F10在以下任一方面中的应用：
(1)用于制备治疗由ASFV感染以及由其感染所致相关疾病的产品；所述产品可为药物或疫苗。
(2)用于制备ASFV检测试剂或试剂盒。
本发明的有益效果为：
本发明利用细胞融合和亚细胞筛选技术，成功获得一株特异性针对ASFV P72蛋白的、具有中和活性的单克隆抗体。该单克隆抗体在体外具有阻止ASFV感染敏感细胞的中和功能，且对P72蛋白的亲和力强，为进一步探究P72蛋白的功能提供了可靠的研究工具。
本发明提供的单克隆抗体，可以利用常规基因工程或蛋白质工程的方法获得，避免了杂交瘤细胞长期冻存抗体丢失，同样也有利于抗体在基因和蛋白水平上进行优化，进而提高抗体的特异性和亲和力。
本发明制备的单克隆抗体能够特异性识别并中和ASFV，因此，该抗体为探究ASFV致病机制的研究、早期检测试剂盒和治疗性抗体或疫苗的开发提供了新的原材料。
附图说明
图1为P72蛋白免疫后ELISA检测小鼠抗体效价；
1～3：1、2和3号免疫鼠，NC：阴性对照。
图2为IFA鉴定单克隆抗体的反应性；
A.4F10单克隆抗体；
B.SP2/0细胞培养液。
图3为Westernblot鉴定4F10单克隆抗体的反应性；
M：蛋白Marker，WT：ASFV接毒组；Mock：未接毒对照组；GAPDH为内参对照。
图4为亚类鉴定结果。
图5为腹水纯化后SADS-PAGE鉴定；
M：蛋白Marker，4F10：纯化后腹水。
图6为4F10抗体纯化后效价的检测；
NC：纯化后无关单克隆抗体腹水。
图7为红细胞吸附试验鉴定4F10单克隆抗体的中和活性；
Mock：未接毒组；Mouseserum-WT：鼠阴性血清与ASFV混合组；1640-WT：1640培养基与ASFV混合组；4F10-WT：4F10与ASFV混合组。
图8为qPCR鉴定4F10单克隆抗体的中和活性；
图9为可变区PCR扩增结果；
A.重链可变区PCR扩增结果。M：DL2000 marker；VH：4F10重链可变区PCR扩增。
B.轻链κ可变区PCR扩增结果。M：DL2000 marker；VH：4F10轻链可变区PCR扩增。
具体实施方式
下面通过具体实施方式对本发明进行更加详细的说明，以便于对本发明技术方案的理解，但并不用于对本发明保护范围的限制。
实施例1抗ASFVP72蛋白单克隆抗体的筛选及鉴定
1.动物免疫
选取6W龄雌性BALB/c小鼠3只，将纯化的P72重组蛋白(由清华大学向烨教授馈赠，制备方法参考申请公布号为CN112979765A的发明专利申请)按30μg/只的量免疫小鼠。首次免疫，将P72蛋白与弗氏完全佐剂等体积混匀后进行乳化，采用多点皮下注射小鼠(背部一个点，腹部两个点)。每隔2W进行加强免疫，共免疫四次，加强免疫是将P72重组蛋白和弗氏不完全佐剂等体积混匀进行乳化，免疫方法同首次免疫。四免后7d尾部采血测定抗体效价。
2.ELISA方法检测多克隆抗体效价
将纯化的P72蛋白用包被液稀释成1μg/mL，按照50μL/孔加入ELISA板，37℃包被1h，用PBST(K2HPO4 0.26g、Na2HPO4·12H2O 2.89g、NaCl 8.50g、Tween-20 0.5mL，加水定容至1L)洗四次后，加入5％脱脂奶粉37℃封闭1h。将阳性血清和阴性血清用PBST倍比稀释，稀释梯度从1:1000至1:2048000，稀释12个梯度，37℃作用30min，PBST洗四次后，加入HRP标记的山羊抗鼠IgG(1:20000稀释)，PBST洗四次后，TMB显色，置酶标仪上测定OD450。
结果如图1所示，血清稀释至1:2 048000时，1、2和3号免疫鼠OD450仍大于未免疫鼠血清(NC组)，说明该抗体效价能达到1:2 048000以上。
3.单克隆抗体的制备
取一只P72蛋白免疫小鼠的脾细胞与SP20细胞按照5:1的比例混合后，在融合剂PEG作用下进行细胞融合。融合后的细胞铺于96孔细胞板中，在37℃、CO2培养箱中培养。待杂交瘤细胞铺满细胞板底部1/10，吸取上清进行ELISA检测(ELISA包被方法同2.ELISA方法检测多克隆抗体效价)。ELISA鉴定为阳性的孔再经间接免疫荧光试验(IFA)验证。选取ELISA和IFA阳性孔，采用有限稀释法对筛选到的阳性杂交瘤细胞进行亚克隆。在倒置显微镜下观察，标出只有单个克隆生长的孔，取上清，利用上述ELISA和IFA方法进行抗体检测。阳性细胞进入下一轮的亚克隆，共进行三次。
IFA试验：将1×104个MA104细胞铺于96孔细胞板中，待细胞铺满单层后，接种0.1MOI ASFV。接种后48h，用4％的多聚甲醛室温固定细胞30min，用0.01mol/L PBS(K2HPO40.26g、Na2HPO4·12H2O 2.89g、NaCl 8.50g加水定容至1L，pH7.4)洗3次；然后用0.1％TritonX-100通透，室温作用10min，PBS洗3次；随后孵育杂交瘤细胞上清和抗鼠FITC标记的山羊抗鼠IgG，反应完毕后置荧光显微镜下观察结果。
4.单克隆抗体特异性鉴定
经过三次亚克隆后，将获得的单个细胞株分泌的细胞上清进行IFA和westernblot检测。IFA鉴定结果显示，4F10细胞上清作用ASFV感染的MA104细胞能够检测到特异性的绿色荧光信号(图2A)，而SP2/0细胞上清液作用ASFV感染细胞未见荧光信号(图2B)。收集病毒感染和未感染的MA104细胞，细胞裂解后进行SDS-PAGE，随后将蛋白胶转移至NC膜上，进行werstern blot验证。4F10细胞上清作为一抗，室温作用1h，抗鼠HRP-IgG作为二抗，室温作用1h，每次作用完后用PBST洗4次，然后进行曝光显色。Westernblot结果显示，4F10细胞上清能识别病毒感染细胞中的P72蛋白，说明4F10细胞上清能特异性识别P72蛋白(图3)。
5.单克隆抗体亚类鉴定
按照Southern Biotech公司的SBA ClonotypingTM System/HRP抗体亚类鉴定试剂盒操作说明对所获得的4F10细胞上清中的单抗进行抗体亚类鉴定。结果如图4所示，该单抗重链恒定区为IgG2a型，轻链恒定区为Kappa型。
6.腹水的制备、纯化及效价检测
6.1腹水的制备
取10～12W的Balb/c小鼠，每只小鼠腹腔注射弗氏不完全佐剂0.5mL，1W后每只小鼠腹腔注射5×105个“3.单克隆抗体的制备”中制备得到的阳性杂交瘤细胞(0.2mL)，7～10天后，鼠体腹腔明显隆起，采集腹水，分装，-80℃保存。
6.2腹水的纯化
按照PIERCE公司NAbTM Protein G Spin Purification Kit进行亲和层析纯化，后经SDS-PAGE电泳鉴定纯度，由图5可以得出，腹水纯化后得到的单克隆抗体的重链约为55KD，轻链约25KD，将该单克隆抗体命名为4F10。
6.3腹水效价检测
将腹水纯化得到的单克隆抗体4F10用PBST按照40ng/μL进行倍比稀释，共稀释12个梯度，稀释后的抗体50μL/孔加入P72蛋白包被的ELISA板，37℃作用30min；PBST洗四次后，加入HRP标记的山羊抗鼠IgG(1:20000稀释)，37℃作用30min，PBST洗四次后；TMB显色，置酶标仪上测定OD450。
结果如图6所示，单抗4F10稀释至0.078125ng/μL时，其OD450仍大于无关单抗组(NC组)，说明该抗体效价能达到0.078125ng/μL以上。
实施例2抗ASFV P72蛋白单克隆抗体4F10的中和活性的鉴定
2.1红细胞吸附实验
为了验证单克隆抗体4F10是否具有中和活性，进行了红细胞吸附试验，其具体操作步骤如下：
(1)1％猪红细胞的准备：无菌采取健康猪血至肝素抗凝管中，充分混匀。取1mL抗凝血，用9mL 0.01mol/L pH7.4无菌PBS重悬后，500g离心5min，弃上清；取9mL 0.01mol/LpH7.4无菌PBS重悬红细胞，重复洗涤4次，直至上清层变得澄清。弃上清，用0.01mol/LpH7.4无菌PBS配成体积分数为1％的猪红细胞。
(2)取1支液氮罐冻存的PAM细胞，37℃水浴锅快速解冻后，500g离心5min，弃掉上清，细胞用1mL含10％ FBS和2％双抗的RPMI-1640培养基重悬，以1×105个/孔铺于96孔细胞培养板，37℃恒温培养24h。
(3)将野生型ASFV(2×106TCID50/mL)与健康鼠血清(mouse serum)、1640培养基和4F10抗体(1mg/mL)分别等体积混匀，37℃孵育2h后，接种(2)中细胞继续培养24h。健康鼠血清(mouseserum)及1640培养基与ASFV混合组作为阳性对照；未接毒组为空白细胞对照。
(4)猪红细胞经0.01mol/L pH7.4无菌PBS稀释至1×107个/mL，取100μL加入24孔细胞培养板；37℃培养2～3d后，经倒置荧光显微镜观察ASFV的红细胞吸附情况，拍照记录并保存。
实验结果如图7所示，与健康鼠血清(mouseserum)和1640培养基与ASFV混合组相比，单克隆抗体4F10处理后，玫瑰花环状样结构的数量显著减少，说明单克隆抗体4F10可有效地抑制ASFV的复制。
2.2荧光定量PCR(qPCR)
为了进一步验证单克隆抗体4F10中和ASFV的能力，利用qPCR试验，检测了不同抗体处理后ASFV的基因组拷贝数。将步骤2.1中的细胞在-80℃下反复冻融3次，取200μL按照QiagenDNA试剂盒提取说明书提取DNA，以此为模板进行qPCR。反应体系为20μL包括：PremixEx TaqTM(Probe qPCR)(2×)10μL；上游引物((10μM)0.5μL；下游引物(10μM)0.5μL；检测样品DNA3μL；荧光探针：0.5μL；ddH2O:4.5μL。上游引物：5’-CTGCTCATGGTATCAATCTTATCGA-3’；下游引物：5’-GATACCACAAGATCAGCCGT-3’(参照文献：King DP,Reid SM,Hutchings GH,Grierson SS,Wilkinson PJ,Dixon LK,Bastos AD,Drew TW.Development of a TaqManPCR assay with internal amplification control for the detection of Africanswine fever virus.J Virol Methods.2003Jan；107(1):53-61.)。将pMT18-P72进行10倍比稀释后作为标准品，绘制标准曲线。反应条件为：预变性95℃30s，为第一步循环；95℃5s，60℃30s为第二步40个循环，所述第二步每个循环的延伸结束时进行荧光信号检测。
根据标准曲线计算病毒拷贝数，结果如图8所示，与健康鼠血清(mouse serum)和1640培养基与ASFV混合组相比，单克隆抗体4F10处理ASFV组病毒拷贝数显著降低且差异极显著，进一步说明单克隆抗体4F10抑制了ASFV的复制。
实施例3抗ASFV P72蛋白单克隆抗体4F10可变区基因PCR扩增与序列测定
提取单克隆抗体4F10杂交瘤细胞RNA，利用Oligo-dt或随机引物分别将其逆转录合成cDNA(PrimeScript II 1st Strand cDNA Synthesis Kit，TAKARA，6210A)。
抗体可变区基因采用套式PCR扩增。首先以上述cDNA为模板，利用第一轮鼠源抗体IgG及κ轻链引物扩增抗体可变区基因，然后以第一轮产物为模板，利用第二轮鼠源抗体IgG及κ轻链引物扩增抗体可变区基因。PCR反应体系为：PrimeSTAR Max Premix(2×)25μL，P1和P2各1μL，cDNA 1μL，ddH2O补至50μL。反应程序为：98℃预变性2min；98℃变性10s，55℃退火30s，72℃延伸30s，30个循环；72℃延伸10min。抗体可变区基因扩增的引物参照文献(vonBoehmer,L.,Liu,C.,Ackerman,S.,Gitlin,A.D.,Wang,Q.,Gazumyan,A.,Nussenzweig,M.C.,2016.Sequencing and cloning of antigen-specific antibodies from mousememory B cells.Nature protocols 11,1908-1923.)。
扩增完成后进行1％琼脂糖凝胶电泳，单克隆抗体4F10的重链、κ轻链可变区基因大小约为300bp(图9)，切胶回收目的片段。将回收的目的片段插入pMD-18T载体中，进行序列测定。将测序结果与抗体基因库(IMGT)进行比对分析，测序结果证实扩增得到的序列为单克隆抗体的重链可变区和轻链可变区的DNA。
具体的，编码鼠抗ASFV P72蛋白单克隆抗体4F10的重链可变区的DNA序列如SEQID NO:3所示；编码鼠抗ASFV P72蛋白单克隆抗体4F10的轻链可变区的DNA序列如SEQ IDNO:4所示。
鼠抗ASFV P72蛋白单克隆抗体4F10的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示；鼠抗ASFV P72蛋白单克隆抗体4F10的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。单克隆抗体4F10重链及轻链可变区CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列如下表1所示。
表1单克隆抗体4F10重链及轻链可变区CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列
| —— | CDR1 | CDR2 | CDR3 |
| 重链VH | GYTFTDYN | INPYNGGT | ARYNGDY |
| 轻链VL | KSLLHSNGNTY | RMS | MQHLLEFPLT |
以上所述之实施例，只是本发明的较佳实施例而已，并非限制本发明的实施范围，故凡依本发明专利范围所述的构造、特征及原理所做的等效变化或修饰，均应包括于本发明申请专利范围内。
Claims (7)
1.抗非洲猪瘟病毒P72蛋白的单克隆抗体4F10，其特征在于，所述单克隆抗体4F10的重链可变区包括氨基酸序列为GYTFTDYN的CDR1、氨基酸序列为INPYNGGT的CDR2、氨基酸序列为ARYNGDY的CDR3；
所述单克隆抗体4F10的轻链可变区包括氨基酸序列为KSLLHSNGNTY的CDR1、氨基酸序列为RMS的CDR2、氨基酸序列为MQHLLEFPLT的CDR3。
2.根据权利要求1所述的抗非洲猪瘟病毒P72蛋白的单克隆抗体4F10，其特征在于，所述单克隆抗体4F10的重链可变区的氨基酸序列和轻链可变区氨基酸序列分别如SEQ IDNO:1、SEQ ID NO:2所示。
3.编码权利要求1所述的抗非洲猪瘟病毒P72蛋白的单克隆抗体4F10的基因。
4.根据权利要求3所述的基因，其特征在于，所述单克隆抗体4F10的重链可变区和轻链可变区的基因序列分别如SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4所示。
5.包含权利要求3所述基因的重组表达载体。
6.包含权利要求5所述的重组表达载体的宿主细胞。
7.权利要求1或2所述单克隆抗体4F10、权利要求3或4所述的基因、权利要求5所述的重组表达载体、权利要求6所述的宿主细胞在以下任一方面中的应用，其特征在于，
（1）在制备治疗由非洲猪瘟病毒感染以及由其感染所致相关疾病的产品中的应用；所述产品为药物或疫苗；
（2）在制备非洲猪瘟检测试剂或试剂盒中的应用。
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