KR102178813B1 - Dna 구조체를 적용한 간이 키트 - Google Patents

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    • G01N2333/09—Foot-and-mouth disease virus

Abstract

본 발명은 3차원의 DNA 구조체인 덴드라이머(dendrimer)를 적용한 간이 키트에 관한 것으로, 본 발명의 DNA 구조체(dendrimer)는 표지자를 부착할 수 있는 노출된 잔기를 많이 확보하고 있어, 항체 외의 기타 디텍터(detector)를 적용함으로써, 종래의 항원-항체 반응보다 감도를 더욱 증진시킬 수 있다. 또한, 결합할 수 있는 항체의 종류가 한정되지 않기 때문에, 진단 키트 분야에서 활용범위가 광범위한 특징이 있다.

Description

DNA 구조체를 적용한 간이 키트 {Rapid diagnostic kit with DNA structure}
본 발명은 DNA 구조체를 적용한 간이 키트에 관한 것으로, 더욱 구체적으로 3차원의 DNA 구조체인 덴드라이머(dendrimer)를 적용한 간이 키트에 관한 것이다.
덴드라이머(dendrimer)는 중심(core)에서부터 나뭇가지 모양의 일정한 단위구조가 반복적으로 뻗어나오는 고분자로, 미국의 화학자 도널드 토말리아가 1979년부터 4년여의 연구 끝에 합성에 성공하였다. 고분자가 자라는 모양이 마치 나뭇가지가 뻗어나가는 모양과 비슷하다 해서 '덴드라이머'(그리스어로 나무를 뜻하는 덴드론 'dendron'에서 따온 말)라고 이름 지었다.
덴드라이머는 중심이 비어 있고 외부는 다양한 화학단위와 반응할 수 있는 반응기가 존재한다. 분자의 사슬이 일정한 규칙에 따라 중심에서 바깥 방향으로 규칙적으로 3차원으로 퍼진 형태의 분자이다. 직경이 수십 옹스트롬으로 효소 단백질과 비슷한 크기인 것이 많다. 이런 특성으로 인해 주위의 건강한 조직을 다치지 않고도 원하는 의약을 감염부위나 종양부위에 선택적으로 전달할 수 있어 유전적 결함을 치료하는 데 사용된다.
덴드라이머가 자라는 단계를 '세대'라고 하는데, 일정하게 반복되는 단위구조가 추가될 때마다 한 세대가 증가하는 것으로 나타낸다. 이런 합성과정에서 폴리에틸렌이나 폴리프로필렌과 같은 고분자와는 달리 덴드라이머는 분자량이나 표면 작용기를 완벽하게 조절할 수 있다는 장점이 있다. 이러한 장점을 살려서 재료공학이나 의학·약학 등 여러 분야에 응용되고 있으며 점차 그 범위가 확장되는 추세이다.
최근에는 덴드라이머를 이용하면 세포막을 통해 유전물질을 이동시킬 수 있다는 사실이 밝혀지면서 현재 사용 중인 개질(改質) 바이러스를 대체할 수 있을 것으로 주목받고 있다.
한편, 구제역(Foot-and-Mouth Disease, FMD)이란 소, 돼지, 양, 염소 및 사슴 등 우제류에 감염되는 질병으로, 가축 전염병 예방법 제1종 가축전염병에 속하는 세계 동물 보건 기구(OIE, Office International des Epizooties)에서 지정한 중요 가축 전염병이다. 전염성이 매우 강하며 잠복 기간은 2일 내지 14일 정도로 매우 짧은 편이다.
구제역의 원인이 되는 구제역 바이러스(Foot-and- Mouth Disease Virus, FMDV)는 약8.4kb의 포지티브 센스 단일 가닥 RNA(single-stranded positive sense RNA; +ssRNA)로 구성된 RNA 바이러스이다. 이 바이러스는 피코르나바이러스(Picornaviridae) 계통의 일원으로 아프토바이러스속(Aphthovirus)으로 분류된다. 이들은 외피가 없고, VP1, VP2, VP3, VP4 구조단백질과 여러 종류의 비구조 단백질로 구성된 바이러스다. FMDV는 7가지 혈청형 A, O, C, Asia 1, SAT1, SAT2, SAT3으로 분류되며, 이 주요 혈청형은 80여 가지 혈청 아형으로 더 나누어진다.
구제역은 전 세계적으로 다양한 혈청형이 발현한다. 우리나라에서 주로 발생하는 혈청형은 O형과 A형이 있으며, 전 세계적으로 O형이 가장 많이 분리되었고, 그 다음으로 A형이 분리되었다. 한국의 구제역은 1911년 소규모로 발생하기 시작하여 1934년까지는 전국적으로 발생하였으나, 그 이후 발생이 없다가 2000년 다시 발병했다. 이후 20O2년 1회, 2O10년 2회, 2O10년에서 2O11년에 걸쳐 1회, 2O14년 1회, 2O14에서 2O15년에 걸쳐 1회, 2O16년 1회, 2O17년에 1회 발병해 많은 피해를 발생시켰다. 한국에서 발생한 구제역 바이러스의 혈청형은 대부분 O형이나 A형으로 한 혈청씩만 발병하였으나, 2O17년에 O형과 함께 A형이 동시에 다른 지역에서 발병했다.
구제역에 대한 최종적인 확정 진단은 OIE에서 지정한 구제역 국제표준실험실로 수포액, 수포상피세포 및 혈청 등의 가검물 또는 감염동물로부터 분리한 바이러스를 송부하여 확진하게 된다. 한국에서는 이하와 같은 과정을 거치고 있다. 구제역 의심가축이 신고되면 농림축산검역본부에서 농장으로 연구원이 파견되어 샘플을 채취한다. 파견된 연구원은 현장에서 임시 진단키트를 이용하여 채취한 샘플을 통해 빠르게 결과를 진단한다. 이 검사에서 FMDV가 검출되면 샘플을 실험실로 가져와 항체진단과 항원진단을 거쳐 정확히 양성인지, 양성이라면 어떤 혈청형인지를 확인한다. 이러한 과정은 샘플의 이동 및 검사 시간이 필요하나 그동안 가축의 이동이 통제되지 않을 경우 더 큰 확산이 발생할 가능성이 존재한다.
한편, 구제역 발생 및 확산의 원인에는 발생 초기의 대응 미숙, 진단방법의 한계, 진단과 판정의 시간이 과다하게 소요되는 점, 진단시료의 적절성, 방역조직체제 허술함 등을 포함하여 다양한 문제가 존재한다. 실제 2O11년 구제역 확산 당시에도, 구제역 발생 이후, 당시의 문제점들과 더불어 구제역 조기진단을 위한 진단방법 및 구제역 판독과정에서 미흡한 대응으로 문제가 있었다.
현재 우리나라에서 사용하고 있는 진단방법 및 진단키트의 경우 Merial사에 보관이 된 항원을 기초로 생산되거나, 비슷한 혈청형의 바이러스를 항원으로 사용하고 있다. 그러나 구제역 바이러스는 유전적인 변형이 매우 쉽게 일어나기 때문에 수많은 혈청형(아형)이 생성이 될 수 있고, 혈청형이 다른 백신은 그 효능이 낮아 혈청형이 맞는 진단키트의 사용이 중요하다. 다만, 혈청형이 맞는 진단키트의 제조 및 생산은 많은 시간이 소요되므로 발생 당시 바이러스의 혈청형에 대한 조기 진단은 거의 불가능한 실정이다. 구제역과 같이 전염성이 강한 질병을 현장에서 조기에 정확하게 진단하지 못하면 바이러스가 확산되고 피해가 커지게 된다. 의심 신고 후 확진까지 2~3일 소요되는 현재의 상황에서는 전염성 질환의 확산을 방지하는데 어려움이 많다. 따라서, 전염성 질환이 확산 되기 전 질병을 조기에 진단할 수 있는 진단법의 필요성이 요구되는 실정이다.
대한민국공개특허 제10-2019-0116282호(2019.10.14)에는, 복수의 숙주를 위한 다중 DNA 구조체의 조립 및 편집을 위한 모듈식 범용 플라스미드 디자인 전략에 관하여 개시되어 있다. 대한민국등록특허 제10-1974890호(2019.04.26)에는, 단일가닥 스캐폴드 DNA 및 적어도 일부분이 상기 스캐폴드 DNA의 적어도 일부분과 상보적인 서열로 이루어진 복수개의 스테이플 DNA를 포함하는 구조체에 관하여 개시되어 있다. 대한민국등록특허 제10-1236203호(2013.02.18)에는, 구제역바이러스 ＳＡＴ 2형 유전자재조합 단백질 항원, 단클론항체 및 이를 이용한 진단방법에 관하여 개시되어 있다. 대한민국등록특허 제10-1105833호(2012.01.06)에는, 구제역바이러스 아시아 １형 항체를 검출하기 위한 진단방법에 관하여 개시되어 있다.
본 발명은 종래의 항원-항체 반응보다 감도를 더욱 증진시킬 수 있는 방법의 일환으로 신규의 DNA 구조체를 개발하여 제공하고자 한다.
본 발명은 서열번호 1의 정방향 단일 가닥(single strain) DNA와 서열번호 2의 역방향 단일 가닥 DNA를 상보적으로 결합시켜 제조한 모노머(monomer) 1과, 서열번호 3의 정방향 단일 가닥(single strain) DNA와 서열번호 4의 역방향 단일 가닥 DNA를 상보적으로 결합시켜 제조한 모노머(monomer) 2를 상보적으로 결합시켜, 모노머 1 및 모노머 2의 결합체를 제작하는 단계 (a); 및 상기 단계 (a)에서 제작한 모노머 1 및 모노머 2의 결합체와, 서열번호 5의 정방향 단일 가닥(single strain) DNA와 서열번호 6의 역방향 단일 가닥 DNA를 상보적으로 결합시켜 제조한 모노머(monomer) 3을 상보적으로 결합시켜 덴드라이머(dendrimer)를 제작하는 단계 (b);를 포함하는 방법으로부터 제조된 DNA 구조체를 제공한다.
한편, 본 발명은 상기한 DNA 구조체에, 구제역 바이러스(Foot and Mouth Disease Virus; FMDV)의 VP1 단백질을 항원으로 인식하는 항체에 서열번호 15의 핵산서열로 이루어진 올리고머(Oligomer)가 결합된 올리고머 결합 항체를 결합시킨 것을 포함하는 구제역 바이러스 검출용 키트를 제공한다.
본 발명의 바이러스 검출용 키트에 있어, 상기 구제역 바이러스(Foot and Mouth Disease Virus; FMDV)의 VP1 단백질을 항원으로 인식하는 항체는, 바람직하게 서열번호 8의 핵산서열, 서열번호 10의 핵산서열, 서열번호 12의 핵산서열 및 서열번호 14의 핵산서열로 이루어진 재조합 항원 중 선택되는 어느 하나를 항원으로 인식하여 제조된 항체인 것이 좋다.
본 발명의 DNA 구조체(dendrimer)는 표지자를 부착할 수 있는 노출된 잔기를 많이 확보하고 있어, 항체 외의 기타 디텍터(detector)를 적용함으로써, 종래의 항원-항체 반응보다 감도를 더욱 증진시킬 수 있다. 또한, 결합할 수 있는 항체의 종류가 한정되지 않기 때문에, 진단 키트 분야에서 활용범위가 광범위한 특징이 있다.
도 1은 모노머 생성을 확인한 결과이다 (M; DNA ladder, M1C: M1 set(M1-F and M1-R), M1A: Monomer 1, M2C: M2 set(M2-F and M2-R), M2A: Monomer 2, M3C: M3 set(M3-F and M3-R), M3A: Monomer 3).
도 2는 덴드라이머 생성을 확인한 결과이다(M1: Monomer 1, M2: Monomer 2, M3: Monomer 3, MW: Molecular Weight, MA1: 1차 덴드라이머 제작, MA2: 2차 덴드라이머 제작, MA3: 3차 덴드라이머 제작, MA3-1: 3차 덴드라이머 제작 재로딩).
도 3은 덴드라이머의 모식도이다.
도 4는 MOPS 완충액을 사용하는 방법에 의한 덴드라이머 구조 안정화를 확인한 결과이다 (M: DNA ladder, 1: MOPS 버퍼 처리한 덴드라이머, 2: MOPS 버퍼 처리후, heat-ammealing 테스트 수행한 덴드라이머).
도 5는 Crosslink 방법에 의한 덴드라이머 구조 안정화를 확인한 결과이다 (M: DNA ladder, 1: MOPS 버퍼 처리한 덴드라이머, 2: UV 처리후, heat-ammealing 테스트 수행한 덴드라이머).
도 6은 본 발명에서 선정한 한국형 구제역바이러스 VP1 항원의 핵산서열을 나타낸다.
도 7은 본 발명에서 개발한 한국형 구제역바이러스 VP1 A형 항원의 코돈 최적화된 서열을 나타낸다.
도 8은 본 발명에서 개발한 한국형 구제역바이러스 VP1 Asia1형 항원의 코돈 최적화된 서열을 나타낸다.
도 9는 본 발명에서 개발한 한국형 구제역바이러스 VP1 O1형 항원의 코돈 최적화된 서열을 나타낸다.
도 10은 본 발명에서 개발한 한국형 구제역바이러스 VP1 O2형 항원의 코돈 최적화된 서열을 나타낸다.
도 11은 본 발명의 재조합 항원 단백질 His-VP1(A형, Asia1형, O1형, O2형)을 이용하여 제작한 단일클론 항체(Monoclonal antibody)와 재조합 항원의 반응성을 확인한 결과이다.
도 12는 항체와 결합한 스트렙트아비딘-골드 파티클(streptavidin-gold particles; 제품 S9059) 전개 시험 결과이다.
도 13은 항체와 결합한 스트렙트아비딘-골드 파티클(streptavidin-gold particles; 제품 S9059) 전개 시험에서 골드 농도를 최적화한 결과이다.
도 14는 신속진단 파일럿 테스트(pilot test)용 키트의 모식도이다.
도 15는 신속진단 파일럿 테스트(pilot test)용 키트의 내부/외부 구성을 나타낸 것이다.
도 16은 신속진단 파일럿 테스트(pilot test)용 키트의 스트립을 보여주는 것이다.
도 17은 신속진단 파일럿 테스트(pilot test)용 키트의 구제역 바이러스 항원별 검출 결과이다.
본 발명은 서열번호 1의 정방향 단일 가닥(single strain) DNA와 서열번호 2의 역방향 단일 가닥 DNA를 상보적으로 결합시켜 제조한 모노머(monomer) 1과, 서열번호 3의 정방향 단일 가닥(single strain) DNA와 서열번호 4의 역방향 단일 가닥 DNA를 상보적으로 결합시켜 제조한 모노머(monomer) 2를 상보적으로 결합시켜, 모노머 1 및 모노머 2의 결합체를 제작하는 단계 (a); 및 상기 단계 (a)에서 제작한 모노머 1 및 모노머 2의 결합체와, 서열번호 5의 정방향 단일 가닥(single strain) DNA와 서열번호 6의 역방향 단일 가닥 DNA를 상보적으로 결합시켜 제조한 모노머(monomer) 3을 상보적으로 결합시켜 덴드라이머(dendrimer)를 제작하는 단계 (b);를 포함하는 방법으로부터 제조된 DNA 구조체를 제공한다.
덴드라이머 상의 결합하지 않고 남은 가닥은 추후 항체 결합이나 바이오틴 결합과정에 이용되고, lateral flow assay 적용 시, 골드 파티클(gold-particle)과 결합할 수 있다. 바이오틴은 상기 방법으로 제작된 DNA 구조체(dendrimer)의 결합되지 않고 남은 단일 가닥 DNA에 붙일 수 있고, 덴드라이머 제작 초기 단일 가닥 DNA를 설계하면서, 역방향 가닥의 5' 말단 부위의 5 base에 바이오틴을 internal label하여 결합할 수도 있다.
본 발명의 덴드라이머는 표지자를 부착할 수 있는 노출된 잔기를 많이 확보하고 있어, 항체 외의 기타 디텍터(detector)를 적용함으로써, 종래의 항원-항체 반응보다 감도를 더욱 증진시킬 수 있다. 또한, 결합할 수 있는 항체의 종류가 한정되지 않기 때문에, 활용범위가 광범위한 특징이 있다. 본 발명에서는 구제역 바이러스 검출용 항체를 결합한 덴드라이머를 예시하고 있으나, 검출하고자 하는 항원의 항체만을 결합하면, 어떠한 항원이라도 검출이 가능하여, 모든 항원의 검출에 본 발명이 이용될 수 있다.
현재 우리나라에서 사용하고 있는 백신은 Merial사(France)의 항원을 분주한 형태이거나 Biogenesis Bago사(Argentina) 및 ARRIAH사(Russia)에서 제조된 O형과 A형 항원이 조합된 백신을 상시 백신으로 사용하고 있다. 구제역 바이러스는 유전적 변형이 매우 쉽게 일어나기 때문에 수많은 혈청형 및 혈청아형이 생성될 수 있고, 혈청형이 다른 백신은 변형된 바이러스에 대해서는 효능이 낮아 혈청형이 부합하는 예방제의 적용이 중요하다. 그러나 자주 변형되는 혈청형에 따른 백신의 제조 및 생산 보급 등에는 많은 시간이 소요되므로, 발생 당시 혈청형 맞춤형의 백신 접종은 거의 불가능한 실정이다. 그렇기 때문에 할 수 있는 최선은 발생 직후 최대한 빠르게 혈청형을 파악하여 백신을 투여하는 것, 발생 후 최대한 빠른 살처분과 가축 이동 통제로 피해를 최소한으로 줄이는 것에 있다.
이에, 본 발명은 상기한 DNA 구조체에, 구제역 바이러스(Foot and Mouth Disease Virus; FMDV)의 VP1 단백질을 항원으로 인식하는 항체에 서열번호 15의 핵산서열로 이루어진 올리고머(Oligomer)가 결합된 올리고머 결합 항체를 결합시킨 것을 포함하는 구제역 바이러스 검출용 키트를 제공한다.
본 발명의 구제역 바이러스 검출용 키트는, 바람직하게 간이 신속 진단 방법에 적용될 수 있는데, 항원 또는 항체를 검사하기 위해 간단하게 사용할 수 있는 간이 신속 진단 방법은 시료가 측방유동(lateral-flow) 방식으로 전개되면서 항원-항체 반응에 따라 결합하여 발색되도록 고안된 제품으로, 현장에서 신속하게 감염 여부를 일차 확인하기 위한 용도로 주로 사용된다.
그러나 비특이적인 반응으로 인해 위음성, 위양성이 발생할 확률이 높고, 간편한 방법이지만 발생 초기 진단 과정에서 오류가 다량 발생하는 문제가 있다. 본 발명의 구제역 바이러스 검출용 키트는, 덴드라이머 상의 결합되지 않은 단일 가닥 DNA에 바이오틴 등의 디덱터(detector)를 추가적으로 결합할 수 있어, 통상의 간이 신속 진단 방법에 사용되는 항체-항원 반응에 비해 더욱 높은 감도로 구제역 바이러스를 검출할 수 있는바, 상기한 문제를 해소할 수 있다.
본 발명의 바이러스 검출용 키트에 있어, 상기 구제역 바이러스(Foot and Mouth Disease Virus; FMDV)의 VP1 단백질을 항원으로 인식하는 항체는, 바람직하게 서열번호 8의 핵산서열, 서열번호 10의 핵산서열, 서열번호 12의 핵산서열 및 서열번호 14의 핵산서열로 이루어진 재조합 항원 중 선택되는 어느 하나를 항원으로 인식하여 제조된 항체인 것이 좋다. 이때, 서열번호 8의 핵산서열은 재조합형 A형 항원 서열을 나타내고, 서열번호 10의 핵산서열은 재조합형 Asia1형 항원 서열을 나타내며, 서열번호 12의 핵산서열은 재조합형 O1형 항원의 서열을 나타내고, 서열번호 14의 핵산서열은 재조합형 O2형 항원 서열을 나타낸다. 이처럼, 본 발명에서는 구제역 바이러스의 다양한 혈청형의 과발현을 유도하기 위하여 대장균 코돈 최적화된 서열을 개발한 것이다. 본 발명에서 개발한 코돈 최적화된 서열은 대장균에서 대량생산이 가능하면서도, 항원결정기(epitope)에 변화를 일으키지 않아, 본 발명의 코돈 최적화된 항원에 대응하는 항체를 개발하였을 시, 야생형의 구제역 바이러스를 매우 높은 감도로 검출할 수 있었다.
이러한 특성에 의해, 본 발명의 키트는 조기에 바이러스를 검출하고, 바이러스 감염을 예방하며, 바이러스의 확산 방지에 유용하게 이용될 수 있다. 바이러스의 혈청형을 정확하고 신속하게 구분할 수 있는 진단법은 적합한 백신을 만드는데 도움이 되며, 감염축을 빠르게 살처분하고 아직 비감염 지역은 적합한 백신을 투여하여 효과적인 질병 통제에 기여할 수 있기 때문이다.
이하, 본 발명의 내용을 하기 실시예를 통해 더욱 상세히 설명하고자 한다. 다만, 본 발명의 권리범위가 하기 실시예에만 한정되는 것은 아니고, 그와 등가의 기술적 사상의 변형까지를 포함한다.
[ 실시예 1: 본 발명의 DNA 구조체 제작]
1) 단일가닥 (single strain) DNA 제작
본 발명의 DNA 구조체 제작에 사용될 단일가닥(single strain) DNA를 제작하였고, 그 서열을 하기 표 1에 나타내었다.
5'→3'
M1-F
(서열번호 1)		 atgcatgcatgcatattcttcatccttcatttcttcatccttcatatgcatgcatgcata
M1-R
(서열번호 2)		 atacgtacgtacgtaatgaaggatgaagaaatgaaggatgaagaaatacgtacgtacgta
M2-F
(서열번호 3)		 tatgcatcgatgcattgcatcgatgcatgcatgcatgcatgcacatatgcatcgatgcat
M2-R
(서열번호 4)		 tacgtagctacgtattgtgcatgcatgcatgcatgcatgcatgcatacgtagctacgtat
M3-F
(서열번호 5)		 atgcatgcatgcataaacatcaatgcaccattgcaacacgcacaatgcatgcatgcata
M3-R
(서열번호 6)		 atacgtacgtacgtatgtgcgtgttgcaatggtgaattgatgttatacgtacgtacgta
각각의 단일 가닥 DNA는 하기 모노머 제작 시, 중간 부분만 상보적 결합할 수 있도록 제작되었다. 즉, 중간 30머(mer)는 상보적으로 결합하고, 양쪽 말단부위 각각 15머(mer)는 상보적이지 않은 염기서열을 배열하여 서로 결합하지 않도록 설계한 것이다.
2) 모노머(monomer) 제작
상기에서 제작한 단일 가닥 DNA 세트를 서로 상보적으로 결합하였다. 즉, M1-F와 M1-R(M1 set), M2-F와 M2-R(M2 set), M3-F와 M3-R(M3 set)을 각각 상보적으로 결합하여 모노머 1(M1), 모노머 2(M2), 모노머 3(M3)을 제작하였다.
모노머 제작을 위한 어닐링(annealing)은 디스솔루션(dissolution)과 어닐링(annealing)과정으로 진행하였다. 이를 위하여, M1 세트(M1-F와 M1-R), M2 세트(M2-F와 M2-R), M3세트(M3-F와 M3-R)를 각각 다른 튜브(tube)에 담았다. 이때, 정방향 단일 가닥 DNA와 역방향 단일 가닥 DNA는 동량으로 첨가하였다. 각각의 튜브를 thermal cycler에 넣고 95℃에서 5분간 가열한 후, 상온에서 1시간 동안 식혔다(cool down).
이후, 각각의 세트를 어닐링 버퍼(annealing buffer; 10mM Tris, pH7.5/ 50mM NaCl/ 1mM EDTA)에 녹이고, 반응이 끝난 어닐링 반응물(annealing products)을 4℃에서 보관하였다.
실험 결과, 대부분의 단일 가닥이 상보적인 결합을 통해 모노머를 형성하였음을 확인할 수 있었다 (도 1). 도 1은 모노머 생성을 확인한 결과이다 (M; DNA ladder, M1C: M1 set(M1-F and M1-R), M1A: Monomer 1, M2C: M2 set(M2-F and M2-R), M2A: Monomer 2, M3C: M3 set(M3-F and M3-R), M3A: Monomer 3).
2) 덴드라이머 ( dendrimer ) 제작
50℃에서 10분 동안 반응시키는 조건을 제외하고, 상기 어닐링 방법과 동일한 방법으로 덴드라이머를 제작하였다. 덴드라이머 제작을 위해, 우선, 모노머 1과 모노머 2를 결합하여 결합체를 제작하였는데, 이때, 모노머 1의 말단과 모노머 2의 말단이 서로 상보적 결합으로 결합되었다. 이후, 상기 결합체에 모노머 3을 결합하여 덴드라이머를 제작하였다. 이때, 모노머 2와 모노머 3의 말단이 서로 상보적 결합으로 결합되었다 (도 2). 도 2는 덴드라이머 생성을 확인한 결과이다(M1: Monomer 1, M2: Monomer 2, M3: Monomer 3, MW: Molecular Weight, MA1: 1차 덴드라이머 제작, MA2: 2차 덴드라이머 제작, MA3: 3차 덴드라이머 제작, MA3-1: 3차 덴드라이머 제작 재로딩). 덴드라이머가 제대로 제작되었는지 확인을 위해, 아가로오스 젤 전기영동을 3회 반복하여 수행하였다. 다만, 3차 로딩에서 오류가 생겨 3차는 재로딩하였다.
덴드라이머 상의 결합하지 않고 남은 가닥은 추후 항체 결합이나 바이오틴 결합과정에 이용되고, lateral flow assay 적용 시, 골드 파티클(gold-particle)과 결합할 수 있다 (도 3). 도 3은 덴드라이머의 모식도이다.
3) 덴드라이머(dendrimer)의 안정화(cross linking)
상기 실험에 의해 덴드라이머가 제작되었을 때, 보관기간이 경과한 경우에도 덴드라이머를 안정적으로 유지하기 위하여, 하기 여러 실험을 진행하였다. 본 실험에서는 MOPS 완충액을 사용하는 방법과 Crosslink 방법으로 구조를 일정한 각도로 고정시키는 방법을 비교 수행하여, 반응성이 저해되지 않는 방법을 연구하였다.
가. MOPS 완충액을 사용하는 방법
덴드라이머 상의 모노머가 일부분 상보적으로 결합되고, 나머지는 단일 가닥으로 남아있는 상태인 불안정한 구조체의 모양을 보존하기 위하여, MOPS 버퍼(MOPS buffer; 10mM, pH 8.1)에서 1시간 동안 방치하여 이중가닥(double- strand) DNA 부분이 안정적으로 유지되는지를 확인하였다 (도 4). 도 4는 MOPS 완충액을 사용하는 방법에 의한 덴드라이머 구조 안정화를 확인한 결과이다 (M: DNA ladder, 1: MOPS 버퍼 처리한 덴드라이머, 2: MOPS 버퍼 처리후, heat-ammealing 테스트 수행한 덴드라이머).
실험 결과, 모노머들의 불완전한 결합 또는 단일 가닥 DNA의 부분 결합 등 불완전한 구조는 MOPS 버퍼 방치 후, 다시 heating-annealing을 반복하였을 때, 다수 제거되고, 비교적 안정적인 구조체만이 남아있는 것을 확인할 수 있었다.
나. Crosslink 방법
UV-crosslink는 전통적인 DNA 고정방법으로, 덴드라이머 시료가 들어있는 튜브를 trans-illuminator(UV)에 10분간 올려놓고 UV를 조사한 후, 상기 방법과 동일한 방법으로 결과를 확인하였다 (도 5). 도 5는 Crosslink 방법에 의한 덴드라이머 구조 안정화를 확인한 결과이다 (M: DNA ladder, 1: MOPS 버퍼 처리한 덴드라이머, 2: UV 처리후, heat-ammealing 테스트 수행한 덴드라이머).
실험 결과, UV-crosslink는 DNA에서 효과적인 방법이 아닌 것으로 확인되었다.
상기 결과에 의해, 덴드라이머 구조체를 안정하게 장기간 보존하는 방법은 MOPS 완충액을 사용하는 방법으로 확정하였다.
[ 제조예 1: 바이오틴 덴드라이머 결합체(Biotin dendrimer complex)의 제작]
바이오틴 덴드라이머 결합체는 덴드라이머 상의 단일가닥 DNA의 5말단 5 base에 biotin internal label이 되도록 제작하였다.
[ 제조예 2: 올리고가 결합된 항체( oligo -conjugated antibody)의 제작]
1) 재조합 FMDV (Foot-and-Mouth Disease Virus) VP1 서열 합성 및 항원 제작
일차적으로 한국형 구제역바이러스의 VP1 항원(A형, Asia1형, O1형, O2형)의 대표서열을 우선 선정하고자 하였다. 국내에서 등록한 genbank 서열 총 66개의 서열을 단백질 수준에서 염기서열 비교를 하여 혈청형 및 빈도에 따라 각각 A형 (GU441855.1), Asia1형 (JQ070321.1), O1형 (AHO12984.2), O2형 (JQ070321.1)으로 구분하여 선정하였다 (도 6). 도 6은 본 발명에서 선정한 한국형 구제역바이러스 VP1 항원의 핵산서열을 나타낸다.
상기에서 개발한 한국형 구제역 바이러스 VP1 단백질 유전자는 대장균에서 과발현을 유도하기 위하여 대장균(E. coli) 코돈(codon) 최적화 서열로 변환하여 합성하였다 (표 2, 도 7 내지 10). 도 7은 본 발명에서 개발한 한국형 구제역바이러스 VP1 A형 항원의 코돈 최적화된 서열을 나타내고, 도 8은 본 발명에서 개발한 한국형 구제역바이러스 VP1 Asia1형 항원의 코돈 최적화된 서열을 나타내며, 도 9는 본 발명에서 개발한 한국형 구제역바이러스 VP1 O1형 항원의 코돈 최적화된 서열을 나타내고, 도 10은 본 발명에서 개발한 한국형 구제역바이러스 VP1 O2형 항원의 코돈 최적화된 서열을 나타낸다.
코돈 최적화된 서열
항원 서열
A형 (GU441855.1) 단백질 서열
(서열번호 7)		 MTTATGESAD PVTTTVENYG GETQVQRRHH TDVSFIMDRF VQIKPVSPTH VIDLMQTHQH GLVGAMLRAA TYYFSDLEIV VNHTGRLTWV PNGAPEAALD NTSNPTAYHK APFTRLALPY TAPHRVLATV YNGTSRYSAP ATRRGDLGSL AARLAAQLPA SFNYGAVRAT EIQELLVRMK RAELYCPRPL LAVEVTSQDR HKQKIIAPAK QLL
핵산 서열
(서열번호 8)		 atgaccaccg cgaccggtga atctgctgat ccggttacta ccactgttga aaactatggt ggtgaaaccc aggttcagcg tcgtcatcac actgatgttt ctttcatcat ggatcgtttc gttcagatta aaccagtttc accaactcac gtaattgatc tgatgcagac tcatcagcat ggtttagttg gcgcgatgtt acgtgctgct acttattatt tctctgattt agaaattgtt gttaatcata ccggtcgttt aacctgggtt ccgaacggcg caccggaagc ggcgctggat aacacttcta acccgaccgc gtaccacaaa gctccgttta ctcgtttagc tctgccatat actgcgccgc accgtgttct ggcaaccgtg tataacggta cctctcgtta ttctgcgccg
gctactcgcc gcggcgatct gggtagcctg gcagcacgtc tggctgctca gctgccagct tcttttaact acggcgctgt tcgtgcaacc gaaatccagg aattattagt gcgtatgaaa cgtgcagaac tgtattgccc gcgtccgctg ctggctgttg aagtgacctc tcaggatcgt cacaaacaaa aaattatcgc accggctaaa cagctgctgt aa
Asia1형 (JQ070321.1) 단백질 서열
(서열번호 9)		 MTTTTGESAD PVTTTVENYG GETQTARRLH TDVAFVLDRF VKLTQPKSTQ TLDLMQIPSH TLVGALLRSA TYYFSDLEVA LVHTGPVTWV PNGAPKTALD NHTNPTAYQK QPITRLALPY TAPHRVLSTV YNGKTTYGGE PPRRGDLAAL ARRVSNRLPT SFNYGAVKAD TITELLIRMK RAETYCPRPL LALDTTQDRR KQEIIAPEKQ TL
핵산 서열
(서열번호 10)		 atgaccacca ccaccggtga gtccgcggac ccggtcacca ccaccgttga aaactacggc ggtgaaaccc agaccgcccg tcgtctgcac accgacgttg cattcgttct ggaccgcttc gttaaactga cccagccaaa aagcacccag accctggacc tgatgcagat cccgagccac accctggttg gtgctctgct gcgttctgca acttattact tttctgattt agaagttgcg ctggttcaca ctggtccggt tacttgggtt cctaatggtg ctccgaaaac tgcactggat aatcacacca acccgaccgc ttaccaaaaa cagccgatta cccgtctggc actgccgtat actgcaccgc atcgtgttct gagcactgtt tataacggta aaaccactta tggtggtgaa
ccgccgcgtc gtggtgatct ggcagcgtta gcacgtcgtg ttagcaaccg tctgccgacc tctttcaact atggtgcggt taaagctgat actattaccg aattactgat tcgtatgaaa cgtgctgaaa cctattgtcc gcgtccgctg ctggcactgg ataccaccca ggatcgtcgt aaacaggaaa tcatcgcgcc ggaaaaacag accctgtaa
O1형 (AHO12984.2) 단백질 서열
(서열번호 11)		 MTTSTGESAD PVTATVENYG GETQVQRRQH TDVSFILDRF VKVTPKDQIN VLDLMQIPAH TLVGALLRTA TYYFADLEVA VKHEGNLTWV PNGAPEAALD NTTNPTAYHK APLTRLALPY TAPHRVLATV YNGNCKYGES PVTNLRGDLQ VLTQKAARTL PTSFNYGAIK ATRVTELLYR MKRAETYCPR PLLAIHPSEA RHKQKIVAPV KQLL
핵산 서열
(서열번호 12		 atgaccacct ctaccggtga aagcgctgat ccggttaccg ctaccgttga aaactatggt ggtgaaaccc aggttcagcg tcgtcagcac accgatgttt ctttcattct ggatcgtttt gttaaagtta ccccgaaaga tcagattaac gttctggatt taatgcagat cccggctcat accctggttg gtgctctgct gcgtaccgcg acctactact tcgctgatct ggaagttgct gttaaacacg aaggtaactt aacctgggtt ccgaacggtg caccggaagc agcactggat aacaccacta acccgaccgc ttatcataaa gcgccgctga ctcgtctggc tctgccgtat accgcgccgc atcgtgtttt agctactgtt tataacggta attgtaaata cggtgaatct
ccggttacca acctgcgtgg tgatctgcag gttctgactc agaaagcggc tcgtaccctg ccaacctctt ttaattatgg cgcgattaaa gcaacccgtg ttactgaact gctgtatcgt atgaaacgtg ctgaaaccta ttgcccgcgt ccgctgctgg ctatccaccc gtctgaagcg cgtcataaac agaaaatcgt tgctccggtt aaacagctgc tgtaa
O2형 (JQ070321.1) 단백질 서열
(서열번호 13)		 MTTSTGESAD PVTATVENYG GETQVQRRHH TDVSFILDRF VKVTPKDSIN VLDLMQTPSH TLVGALLRTA TYYFADLEVA VKHEGDLTWV PNGAPEAALD NTTNPTAYHK APLTRLALPY TAPHRVLATV YNGNCKYAGG SLPNVRGDLQ VLAQKAARPL PTSFNYGAIK ATRVTELLYR MKRAETYCPR PLLAVHPSAA RHKQKIVAPV KQSL
핵산 서열
(서열번호 14)		 atgaccacca gcaccggtga atctgcggat ccggttaccg cgaccgttga aaactacggt ggtgaaaccc aggttcagcg tcgtcaccat accgatgtta gctttatcct ggatcgtttc gttaaagtta ctccaaaaga ttctattaac gttctggatc tgatgcagac tccgtctcat accttagttg gtgctctgct gcgtaccgca acttactatt tcgctgattt agaagttgca gttaaacatg aaggtgatct gacctgggtt ccgaacggtg ctccggaagc agctttagat aacaccacta acccgaccgc atatcacaaa gcaccgctga cccgtttagc tctgccgtat accgctccgc atcgtgttct ggctaccgtt tataacggca actgtaaata cgcaggtggt
agcctgccga acgttcgtgg tgatctgcag gtgctggctc agaaagctgc tcgtccgctg ccgacctctt ttaactatgg cgctattaaa gctacccgtg ttaccgaact gctgtatcgt atgaaacgtg ctgaaaccta ttgcccgcgt ccgctgttag ctgttcatcc gtctgctgca cgtcataaac agaaaatcgt tgcgccggtt aaacagtctc tgtaa
VP1 단백질의 항체 제작을 위한 항원 단백질을 준비하기 위해, 상기에서 합성한 VP1 유전자(A형, Asia1형, O1형, O2형)를 대장균 발현 벡터에 클로닝하였다. 추후 단백질 정제를 위해 N-말단에 6×히스티딘(histidine)이 태깅(tagging)된 VP1(A형, Asia1형, O1형, O2형) 단백질로 발현시키고, 제한효소 처리와 전기영동, 시퀀싱(sequencing)을 통해 본 발명의 VP1 유전자와 주항원 부위를 포함하는 유전자가 포함된 벡터를 선별하였다. 선별된 벡터는 대장균 균주 BL21(DE3)에 형질전환하여 발현 및 정제를 거쳐 항원 단백질을 수득하였다.
2) 항체 제작 및 확인
제작한 재조합 항원 단백질 His-VP1(A형, Asia1형, O1형, O2형)을 이용하여 단일클론 항체(Monoclonal antibody)를 제작하였다.
완성된 항체는 ELISA를 통해 반응성 및 항체의 역가를 확인하였다 (도 11). 도 11은 본 발명의 재조합 항원 단백질 His-VP1(A형, Asia1형, O1형, O2형)을 이용하여 제작한 단일클론 항체(Monoclonal antibody)와 재조합 항원의 반응성을 확인한 결과이다.
실험 결과, 모든 항체가 1:50000 이상의 높은 ELISA 역가를 보였기 때문에, 제조한 항체를 사용하여 다음 단계인 단클론 항체-올리고머(oligomer) 결합물의 컨쥬게이션(conjugation)을 진행하였다.
(3) 항체 컨쥬게이션 (Antibody conjugation)
Thunder-Link® PLUS oligo Antibody Conjugation kit를 사용하여, 우선 oligo activation raggent vial에 100㎕의 올리고머(서열번호 15: 5'-tatgcatgcatgcat-amino-3') 첨가 후, 혼합하여 상온에서 30분 동안 방치함으로써, 올리고머를 엑티베이션(activation)시켰다. 이후, antibody activation reagent vial에 100㎕의 항체(1㎎/㎖)를 첨가한 후, 혼합하여 상온에서 30분 동안 방치함으로써, 항체를 엑티베이션(activation)시켰다. 그 후, de-salting 칼럼을 사용하여, 항체-올리고머 반응산물을 정제하였고, 항체와 올리고머의 비율은 1:10을 사용하였다.
[ 실시예 2: 구제역 진단용 키트 제작]
1) 구제역 진단용 키트의 제작
구제역 진단용 키트를 제작하기 위하여, 상기 제조예 1의 바이오틴 덴드라이머 결합체(Biotin dendrimer complex)와 상기 제조예 2의 올리고가 결합된 항체(oligo-conjugated antibody)를 혼성(hybridization)하였다.
이를 위하여, 바이오틴 덴드라이머 결합체(Biotin dendrimer complex)와 올리고가 결합된 항체(oligo-conjugated antibody)를 혼합한 후, 50℃에서 1시간 동안 반응시킨 후 상온에서 시켰다(cool down).
2) lateral flow assay
상기에서 제작한 복잡한 구조체(dendrimer)의 구제역 항체가 신속진단 키트에 적용 가능한지를 확인하기 위하여, 하기와 같이 lateral flow assay를 시행하였다.
가. 항체와 결합한 스트렙트아비딘 -골드 파티클 ( streptavidin -gold particles; 제품 S9059) 전개 시험
일반적인 POCT 스트립(strip) 구조에서 항체와 결합한 스트렙트아비딘-골드 파티클의 전개정도를 테스트하기 위해, 스트렙트아비딘-골드 파티클 2.5㎖를 1.5×1.5㎠ 필터에 골고루 떨어뜨리고, 가로/세로 5개씩 잘라 총 25개로 만들었다. 즉, 잘라진 필터(0.3×0.3㎠)에는 250㎕의 스트렙트아비딘-골드 파티클이 도포되는 것이다. 이러한 시스템에서 최종 흡수패드(오른쪽)까지 전개가 되는지를 확인하였다 (도 12). 도 12는 항체와 결합한 스트렙트아비딘-골드 파티클(streptavidin-gold particles; 제품 S9059) 전개 시험 결과이다.
실험 결과, 골드 파티클 패드에서 흡수패드까지 전개방향 및 골드 파티클 양에 이상이 없었다.
나. 골드 농도의 최적화
덴드라이머- 골드 파티클 (dendrimer-gold particle) 농도를 0.3×0.3㎠ 필터당 250㎕에서~1000㎕까지 테스트하였다. 이를 위해, 1.5×1.5㎠ 필터에 2.5㎖, 5㎖, 10㎖를 점적하였다. 각 테스트 라인의 항체량은 각각 1㎍을 사용하였다 (도 13). 도 13은 항체와 결합한 스트렙트아비딘-골드 파티클(streptavidin-gold particles; 제품 S9059) 전개 시험에서 골드 농도를 최적화한 결과이다.
실험 결과, 덴드라이머-골드 파티클의 양과 감도에 차이가 거의 없었다. 250㎕는 포화량으로 추정된다.
3) 신속진단 파일럿 테스트(pilot test)용 키트의 제작
골드입자와 항체 결합체 패드는, 덴드라이머 구조체와 항체가 결합된 결합체를 10㎚ 크기의 골드나노파티클(gold nano particle)과 반응시키고, 1% BSA로 블롯킹(blocking) 하였다. 상기 시료를 글라스 피버 페이퍼(glass fiber filter)에 침지하고, 건조한 후 사용하였다 (도 14 내지 16). 도 14는 신속진단 파일럿 테스트(pilot test)용 키트의 모식도이고, 도 15는 신속진단 파일럿 테스트(pilot test)용 키트의 내부/외부 구성을 나타낸 것이다.
전개부위는, 니트로셀룰로오스 멤브레인(nitrocellulose membrane) 뒷면에 플라스틱 필름을 부착하여 멤브레인을 고정시켰다. 항체 1㎍씩 테스트 부위와 콘트롤 부위에 적용하고 건조한 후 사용하였다 (도 16). 도 16은 신속진단 파일럿 테스트(pilot test)용 키트의 스트립을 보여주는 것이다.
키트의 효능을 확인하기 위하여, 합성항원 4가지 타입에 대해 POCT 키트를 테스트하였다. 이를 위해, 각 스트립에 A형, O1형, O2형, Asia1형의 단항체를 테스트 라인에 표지한 시작품 준비하였다 (도 17). 도 17은 신속진단 파일럿 테스트(pilot test)용 키트의 구제역 바이러스 항원별 검출 결과이다.
실험 결과, 제조항원의 검출은 각 혈청혈 별로 양성반응을 보임을 확인할 수 있었다.
<110> Dowgene <120> Rapid diagnostic kit with DNA structure <130> YP-19-159 <160> 15 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> M1-F <400> 1 atgcatgcat gcatattctt catccttcat ttcttcatcc ttcatatgca tgcatgcata 60 60 <210> 2 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> M1-R <400> 2 atacgtacgt acgtaatgaa ggatgaagaa atgaaggatg aagaaatacg tacgtacgta 60 60 <210> 3 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> M2-F <400> 3 tatgcatcga tgcattgcat cgatgcatgc atgcatgcat gcacatatgc atcgatgcat 60 60 <210> 4 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> M2-R <400> 4 tacgtagcta cgtattgtgc atgcatgcat gcatgcatgc atgcatacgt agctacgtat 60 60 <210> 5 <211> 59 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> M3-F <400> 5 atgcatgcat gcataaacat caatgcacca ttgcaacacg cacaatgcat gcatgcata 59 <210> 6 <211> 59 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> M3-R <400> 6 atacgtacgt acgtatgtgc gtgttgcaat ggtgaattga tgttatacgt acgtacgta 59 <210> 7 <211> 213 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> This comes from Foot and Mouth Disease Virus type A. <400> 7 Met Thr Thr Ala Thr Gly Glu Ser Ala Asp Pro Val Thr Thr Thr Val 1 5 10 15 Glu Asn Tyr Gly Gly Glu Thr Gln Val Gln Arg Arg His His Thr Asp 20 25 30 Val Ser Phe Ile Met Asp Arg Phe Val Gln Ile Lys Pro Val Ser Pro 35 40 45 Thr His Val Ile Asp Leu Met Gln Thr His Gln His Gly Leu Val Gly 50 55 60 Ala Met Leu Arg Ala Ala Thr Tyr Tyr Phe Ser Asp Leu Glu Ile Val 65 70 75 80 Val Asn His Thr Gly Arg Leu Thr Trp Val Pro Asn Gly Ala Pro Glu 85 90 95 Ala Ala Leu Asp Asn Thr Ser Asn Pro Thr Ala Tyr His Lys Ala Pro 100 105 110 Phe Thr Arg Leu Ala Leu Pro Tyr Thr Ala Pro His Arg Val Leu Ala 115 120 125 Thr Val Tyr Asn Gly Thr Ser Arg Tyr Ser Ala Pro Ala Thr Arg Arg 130 135 140 Gly Asp Leu Gly Ser Leu Ala Ala Arg Leu Ala Ala Gln Leu Pro Ala 145 150 155 160 Ser Phe Asn Tyr Gly Ala Val Arg Ala Thr Glu Ile Gln Glu Leu Leu 165 170 175 Val Arg Met Lys Arg Ala Glu Leu Tyr Cys Pro Arg Pro Leu Leu Ala 180 185 190 Val Glu Val Thr Ser Gln Asp Arg His Lys Gln Lys Ile Ile Ala Pro 195 200 205 Ala Lys Gln Leu Leu 210 <210> 8 <211> 642 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> This comes from Foot and Mouth Disease Virus type A. <400> 8 atgaccaccg cgaccggtga atctgctgat ccggttacta ccactgttga aaactatggt 60 ggtgaaaccc aggttcagcg tcgtcatcac actgatgttt ctttcatcat ggatcgtttc 120 gttcagatta aaccagtttc accaactcac gtaattgatc tgatgcagac tcatcagcat 180 ggtttagttg gcgcgatgtt acgtgctgct acttattatt tctctgattt agaaattgtt 240 gttaatcata ccggtcgttt aacctgggtt ccgaacggcg caccggaagc ggcgctggat 300 aacacttcta acccgaccgc gtaccacaaa gctccgttta ctcgtttagc tctgccatat 360 actgcgccgc accgtgttct ggcaaccgtg tataacggta cctctcgtta ttctgcgccg 420 gctactcgcc gcggcgatct gggtagcctg gcagcacgtc tggctgctca gctgccagct 480 tcttttaact acggcgctgt tcgtgcaacc gaaatccagg aattattagt gcgtatgaaa 540 cgtgcagaac tgtattgccc gcgtccgctg ctggctgttg aagtgacctc tcaggatcgt 600 cacaaacaaa aaattatcgc accggctaaa cagctgctgt aa 642 <210> 9 <211> 212 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> This comes from Foot and Mouth Disease Virus type Asial. <400> 9 Met Thr Thr Thr Thr Gly Glu Ser Ala Asp Pro Val Thr Thr Thr Val 1 5 10 15 Glu Asn Tyr Gly Gly Glu Thr Gln Thr Ala Arg Arg Leu His Thr Asp 20 25 30 Val Ala Phe Val Leu Asp Arg Phe Val Lys Leu Thr Gln Pro Lys Ser 35 40 45 Thr Gln Thr Leu Asp Leu Met Gln Ile Pro Ser His Thr Leu Val Gly 50 55 60 Ala Leu Leu Arg Ser Ala Thr Tyr Tyr Phe Ser Asp Leu Glu Val Ala 65 70 75 80 Leu Val His Thr Gly Pro Val Thr Trp Val Pro Asn Gly Ala Pro Lys 85 90 95 Thr Ala Leu Asp Asn His Thr Asn Pro Thr Ala Tyr Gln Lys Gln Pro 100 105 110 Ile Thr Arg Leu Ala Leu Pro Tyr Thr Ala Pro His Arg Val Leu Ser 115 120 125 Thr Val Tyr Asn Gly Lys Thr Thr Tyr Gly Gly Glu Pro Pro Arg Arg 130 135 140 Gly Asp Leu Ala Ala Leu Ala Arg Arg Val Ser Asn Arg Leu Pro Thr 145 150 155 160 Ser Phe Asn Tyr Gly Ala Val Lys Ala Asp Thr Ile Thr Glu Leu Leu 165 170 175 Ile Arg Met Lys Arg Ala Glu Thr Tyr Cys Pro Arg Pro Leu Leu Ala 180 185 190 Leu Asp Thr Thr Gln Asp Arg Arg Lys Gln Glu Ile Ile Ala Pro Glu 195 200 205 Lys Gln Thr Leu 210 <210> 10 <211> 639 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> This comes from Foot and Mouth Disease Virus type Asial. <400> 10 atgaccacca ccaccggtga gtccgcggac ccggtcacca ccaccgttga aaactacggc 60 ggtgaaaccc agaccgcccg tcgtctgcac accgacgttg cattcgttct ggaccgcttc 120 gttaaactga cccagccaaa aagcacccag accctggacc tgatgcagat cccgagccac 180 accctggttg gtgctctgct gcgttctgca acttattact tttctgattt agaagttgcg 240 ctggttcaca ctggtccggt tacttgggtt cctaatggtg ctccgaaaac tgcactggat 300 aatcacacca acccgaccgc ttaccaaaaa cagccgatta cccgtctggc actgccgtat 360 actgcaccgc atcgtgttct gagcactgtt tataacggta aaaccactta tggtggtgaa 420 ccgccgcgtc gtggtgatct ggcagcgtta gcacgtcgtg ttagcaaccg tctgccgacc 480 tctttcaact atggtgcggt taaagctgat actattaccg aattactgat tcgtatgaaa 540 cgtgctgaaa cctattgtcc gcgtccgctg ctggcactgg ataccaccca ggatcgtcgt 600 aaacaggaaa tcatcgcgcc ggaaaaacag accctgtaa 639 <210> 11 <211> 214 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> This comes from Foot and Mouth Disease Virus type O1. <400> 11 Met Thr Thr Ser Thr Gly Glu Ser Ala Asp Pro Val Thr Ala Thr Val 1 5 10 15 Glu Asn Tyr Gly Gly Glu Thr Gln Val Gln Arg Arg Gln His Thr Asp 20 25 30 Val Ser Phe Ile Leu Asp Arg Phe Val Lys Val Thr Pro Lys Asp Gln 35 40 45 Ile Asn Val Leu Asp Leu Met Gln Ile Pro Ala His Thr Leu Val Gly 50 55 60 Ala Leu Leu Arg Thr Ala Thr Tyr Tyr Phe Ala Asp Leu Glu Val Ala 65 70 75 80 Val Lys His Glu Gly Asn Leu Thr Trp Val Pro Asn Gly Ala Pro Glu 85 90 95 Ala Ala Leu Asp Asn Thr Thr Asn Pro Thr Ala Tyr His Lys Ala Pro 100 105 110 Leu Thr Arg Leu Ala Leu Pro Tyr Thr Ala Pro His Arg Val Leu Ala 115 120 125 Thr Val Tyr Asn Gly Asn Cys Lys Tyr Gly Glu Ser Pro Val Thr Asn 130 135 140 Leu Arg Gly Asp Leu Gln Val Leu Thr Gln Lys Ala Ala Arg Thr Leu 145 150 155 160 Pro Thr Ser Phe Asn Tyr Gly Ala Ile Lys Ala Thr Arg Val Thr Glu 165 170 175 Leu Leu Tyr Arg Met Lys Arg Ala Glu Thr Tyr Cys Pro Arg Pro Leu 180 185 190 Leu Ala Ile His Pro Ser Glu Ala Arg His Lys Gln Lys Ile Val Ala 195 200 205 Pro Val Lys Gln Leu Leu 210 <210> 12 <211> 645 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> This comes from Foot and Mouth Disease Virus type O1. <400> 12 atgaccacct ctaccggtga aagcgctgat ccggttaccg ctaccgttga aaactatggt 60 ggtgaaaccc aggttcagcg tcgtcagcac accgatgttt ctttcattct ggatcgtttt 120 gttaaagtta ccccgaaaga tcagattaac gttctggatt taatgcagat cccggctcat 180 accctggttg gtgctctgct gcgtaccgcg acctactact tcgctgatct ggaagttgct 240 gttaaacacg aaggtaactt aacctgggtt ccgaacggtg caccggaagc agcactggat 300 aacaccacta acccgaccgc ttatcataaa gcgccgctga ctcgtctggc tctgccgtat 360 accgcgccgc atcgtgtttt agctactgtt tataacggta attgtaaata cggtgaatct 420 ccggttacca acctgcgtgg tgatctgcag gttctgactc agaaagcggc tcgtaccctg 480 ccaacctctt ttaattatgg cgcgattaaa gcaacccgtg ttactgaact gctgtatcgt 540 atgaaacgtg ctgaaaccta ttgcccgcgt ccgctgctgg ctatccaccc gtctgaagcg 600 cgtcataaac agaaaatcgt tgctccggtt aaacagctgc tgtaa 645 <210> 13 <211> 214 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> This comes from Foot and Mouth Disease Virus type O2. <400> 13 Met Thr Thr Ser Thr Gly Glu Ser Ala Asp Pro Val Thr Ala Thr Val 1 5 10 15 Glu Asn Tyr Gly Gly Glu Thr Gln Val Gln Arg Arg His His Thr Asp 20 25 30 Val Ser Phe Ile Leu Asp Arg Phe Val Lys Val Thr Pro Lys Asp Ser 35 40 45 Ile Asn Val Leu Asp Leu Met Gln Thr Pro Ser His Thr Leu Val Gly 50 55 60 Ala Leu Leu Arg Thr Ala Thr Tyr Tyr Phe Ala Asp Leu Glu Val Ala 65 70 75 80 Val Lys His Glu Gly Asp Leu Thr Trp Val Pro Asn Gly Ala Pro Glu 85 90 95 Ala Ala Leu Asp Asn Thr Thr Asn Pro Thr Ala Tyr His Lys Ala Pro 100 105 110 Leu Thr Arg Leu Ala Leu Pro Tyr Thr Ala Pro His Arg Val Leu Ala 115 120 125 Thr Val Tyr Asn Gly Asn Cys Lys Tyr Ala Gly Gly Ser Leu Pro Asn 130 135 140 Val Arg Gly Asp Leu Gln Val Leu Ala Gln Lys Ala Ala Arg Pro Leu 145 150 155 160 Pro Thr Ser Phe Asn Tyr Gly Ala Ile Lys Ala Thr Arg Val Thr Glu 165 170 175 Leu Leu Tyr Arg Met Lys Arg Ala Glu Thr Tyr Cys Pro Arg Pro Leu 180 185 190 Leu Ala Val His Pro Ser Ala Ala Arg His Lys Gln Lys Ile Val Ala 195 200 205 Pro Val Lys Gln Ser Leu 210 <210> 14 <211> 645 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> This comes from Foot and Mouth Disease Virus type O2. <400> 14 atgaccacca gcaccggtga atctgcggat ccggttaccg cgaccgttga aaactacggt 60 ggtgaaaccc aggttcagcg tcgtcaccat accgatgtta gctttatcct ggatcgtttc 120 gttaaagtta ctccaaaaga ttctattaac gttctggatc tgatgcagac tccgtctcat 180 accttagttg gtgctctgct gcgtaccgca acttactatt tcgctgattt agaagttgca 240 gttaaacatg aaggtgatct gacctgggtt ccgaacggtg ctccggaagc agctttagat 300 aacaccacta acccgaccgc atatcacaaa gcaccgctga cccgtttagc tctgccgtat 360 accgctccgc atcgtgttct ggctaccgtt tataacggca actgtaaata cgcaggtggt 420 agcctgccga acgttcgtgg tgatctgcag gtgctggctc agaaagctgc tcgtccgctg 480 ccgacctctt ttaactatgg cgctattaaa gctacccgtg ttaccgaact gctgtatcgt 540 atgaaacgtg ctgaaaccta ttgcccgcgt ccgctgttag ctgttcatcc gtctgctgca 600 cgtcataaac agaaaatcgt tgcgccggtt aaacagtctc tgtaa 645 <210> 15 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligomer for binding antibody. <220> <221> 3'UTR <222> (15) <223> binded amino group. <400> 15 tatgcatgca tgcat 15

Claims (3)

  1. 서열번호 1의 정방향 단일 가닥(single strain) DNA와 서열번호 2의 역방향 단일 가닥 DNA를 상보적으로 결합시켜 제조한 모노머(monomer) 1과, 서열번호 3의 정방향 단일 가닥(single strain) DNA와 서열번호 4의 역방향 단일 가닥 DNA를 상보적으로 결합시켜 제조한 모노머(monomer) 2를 상보적으로 결합시켜, 모노머 1 및 모노머 2의 결합체를 제작하는 단계 (a); 및
    상기 단계 (a)에서 제작한 모노머 1 및 모노머 2의 결합체와, 서열번호 5의 정방향 단일 가닥(single strain) DNA와 서열번호 6의 역방향 단일 가닥 DNA를 상보적으로 결합시켜 제조한 모노머(monomer) 3을 상보적으로 결합시켜 덴드라이머(dendrimer)를 제작하는 단계 (b);를 포함하는 방법으로부터 제조된 DNA 구조체.
  2. 제1항의 DNA에 구조체에, 구제역 바이러스(Foot and Mouth Disease Virus; FMDV)의 VP1 단백질을 항원으로 인식하는 항체에 서열번호 15의 핵산서열로 이루어진 올리고머(Oligomer)가 결합된 올리고머 결합 항체를 결합시킨 것을 포함하는 구제역 바이러스 검출용 키트.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 구제역 바이러스(Foot and Mouth Disease Virus; FMDV)의 VP1 단백질을 항원으로 인식하는 항체는,
    서열번호 8의 핵산서열, 서열번호 10의 핵산서열, 서열번호 12의 핵산서열 및 서열번호 14의 핵산서열로 이루어진 재조합 항원 중 선택되는 어느 하나를 항원으로 인식하여 제조된 항체인 것을 특징으로 하는 구제역 바이러스 검출용 키트.

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YOUGEN LI 등. nature materials. VOL. 3, pp. 38-42(2004.01.) *
대한민국등록특허 제10-1974890호(2019.04.26)에는, 단일가닥 스캐폴드 DNA 및 적어도 일부분이 상기 스캐폴드 DNA의 적어도 일부분과 상보적인 서열로 이루어진 복수개의 스테이플 DNA를 포함하는 구조체에 관하여 개시되어 있다.

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