RU2773654C1 - Способ опосредованного контроля полноты инактивации антигена вируса ящура с применением nested обратно-транскриптазной полимеразной цепной реакции с последующим электрофорезом ампликонов в агарозном геле - Google Patents
Способ опосредованного контроля полноты инактивации антигена вируса ящура с применением nested обратно-транскриптазной полимеразной цепной реакции с последующим электрофорезом ампликонов в агарозном геле Download PDFInfo
- Publication number
- RU2773654C1 RU2773654C1 RU2021128361A RU2021128361A RU2773654C1 RU 2773654 C1 RU2773654 C1 RU 2773654C1 RU 2021128361 A RU2021128361 A RU 2021128361A RU 2021128361 A RU2021128361 A RU 2021128361A RU 2773654 C1 RU2773654 C1 RU 2773654C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- pcr
- inactivation
- fmdv
- temperature
- completeness
- Prior art date
Links
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 title claims abstract description 68
- 238000010240 RT-PCR analysis Methods 0.000 title claims abstract description 48
- 239000000427 antigen Substances 0.000 title claims abstract description 45
- 102000038129 antigens Human genes 0.000 title claims abstract description 45
- 108091007172 antigens Proteins 0.000 title claims abstract description 45
- 241000700605 Viruses Species 0.000 title claims abstract description 44
- 229920002287 Amplicon Polymers 0.000 title claims abstract description 36
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 title claims abstract description 15
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 title abstract description 32
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims abstract description 17
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims abstract description 17
- 241000710198 Foot-and-mouth disease virus Species 0.000 claims description 107
- 229960005486 vaccines Drugs 0.000 claims description 36
- 229920000160 (ribonucleotides)n+m Polymers 0.000 claims description 32
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 29
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 24
- BASFCYQUMIYNBI-UHFFFAOYSA-N platinum Chemical compound [Pt] BASFCYQUMIYNBI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 22
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 21
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 20
- 238000000137 annealing Methods 0.000 claims description 18
- 239000002994 raw material Substances 0.000 claims description 17
- 229920000272 Oligonucleotide Polymers 0.000 claims description 16
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 claims description 15
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L MgCl2 Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 13
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 claims description 12
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 claims description 12
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 claims description 11
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 claims description 11
- 229910052697 platinum Inorganic materials 0.000 claims description 11
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 10
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 claims description 10
- 101700011961 DPOM Proteins 0.000 claims description 8
- 101710029649 MDV043 Proteins 0.000 claims description 8
- 101700061424 POLB Proteins 0.000 claims description 8
- 101700054624 RF1 Proteins 0.000 claims description 8
- ZJYYHGLJYGJLLN-UHFFFAOYSA-N Guanidinium thiocyanate Chemical compound SC#N.NC(N)=N ZJYYHGLJYGJLLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 229920001850 Nucleic acid sequence Polymers 0.000 claims description 6
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 claims description 6
- 108010067770 Endopeptidase K Proteins 0.000 claims description 5
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N iso-propanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 239000000463 material Substances 0.000 claims description 5
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 claims description 5
- 230000004913 activation Effects 0.000 claims 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 claims 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 claims 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 15
- 238000001514 detection method Methods 0.000 abstract description 14
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 7
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 26
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 21
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 18
- 230000002458 infectious Effects 0.000 description 16
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 12
- 229920003013 deoxyribonucleic acid Polymers 0.000 description 12
- 229920002676 Complementary DNA Polymers 0.000 description 11
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 11
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 10
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 10
- 238000002123 RNA extraction Methods 0.000 description 10
- 239000000047 product Substances 0.000 description 10
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 10
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 10
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 10
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 9
- 238000011160 research Methods 0.000 description 8
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 7
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 238000007857 nested PCR Methods 0.000 description 7
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 7
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 7
- FDKRWZJDFCVMQQ-UHFFFAOYSA-N 6-[2-aminoethyl(ethyl)amino]-2,3-dihydrophthalazine-1,4-dione Chemical compound O=C1NNC(=O)C=2C1=CC(N(CCN)CC)=CC=2 FDKRWZJDFCVMQQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 102000033147 ERVK-25 Human genes 0.000 description 6
- 208000007212 Foot-and-Mouth Disease Diseases 0.000 description 6
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 6
- 238000011161 development Methods 0.000 description 6
- 238000005755 formation reaction Methods 0.000 description 6
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 6
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 6
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 6
- 230000002194 synthesizing Effects 0.000 description 6
- 241000972773 Aulopiformes Species 0.000 description 5
- 210000002845 Virion Anatomy 0.000 description 5
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 5
- 230000022534 cell killing Effects 0.000 description 5
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 5
- 230000003394 haemopoietic Effects 0.000 description 5
- 230000017074 necrotic cell death Effects 0.000 description 5
- 210000001519 tissues Anatomy 0.000 description 5
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 4
- 208000006265 Renal Cell Carcinoma Diseases 0.000 description 4
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 4
- 235000019441 ethanol Nutrition 0.000 description 4
- ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N formamide Chemical compound NC=O ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 210000003292 kidney cell Anatomy 0.000 description 4
- 230000003612 virological Effects 0.000 description 4
- 108010092799 EC 2.7.7.49 Proteins 0.000 description 3
- 101710003775 ERVK-10 Proteins 0.000 description 3
- 101710037030 ERVK-11 Proteins 0.000 description 3
- 101710009283 ERVK-18 Proteins 0.000 description 3
- 101710009286 ERVK-19 Proteins 0.000 description 3
- 101710035700 ERVK-25 Proteins 0.000 description 3
- 101710038044 ERVK-6 Proteins 0.000 description 3
- 101710014468 ERVK-7 Proteins 0.000 description 3
- 101710014482 ERVK-8 Proteins 0.000 description 3
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N Ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 101710043924 HERVK_113 Proteins 0.000 description 3
- 101710006375 RNASEH1 Proteins 0.000 description 3
- 101700078434 RT67 Proteins 0.000 description 3
- 108020000999 Viral RNA Proteins 0.000 description 3
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 3
- NOWKCMXCCJGMRR-UHFFFAOYSA-N aziridine Chemical compound C1CN1 NOWKCMXCCJGMRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M buffer Substances [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 210000004027 cells Anatomy 0.000 description 3
- 230000003196 chaotropic Effects 0.000 description 3
- 230000000295 complement Effects 0.000 description 3
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- ZRALSGWEFCBTJO-UHFFFAOYSA-N guanidine Chemical compound NC(N)=N ZRALSGWEFCBTJO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 3
- 230000008506 pathogenesis Effects 0.000 description 3
- 230000001717 pathogenic Effects 0.000 description 3
- 244000052769 pathogens Species 0.000 description 3
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 3
- 101700086982 rnh Proteins 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- 230000017613 viral reproduction Effects 0.000 description 3
- 230000001018 virulence Effects 0.000 description 3
- WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K Aluminium hydroxide Chemical compound [OH-].[OH-].[OH-].[Al+3] WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 241000710777 Classical swine fever virus Species 0.000 description 2
- 210000003128 Head Anatomy 0.000 description 2
- 241001144416 Picornavirales Species 0.000 description 2
- 108010012057 RNA Replicase Proteins 0.000 description 2
- 241000711798 Rabies lyssavirus Species 0.000 description 2
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 2
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 2
- 230000000680 avirulence Effects 0.000 description 2
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 2
- 238000007374 clinical diagnostic method Methods 0.000 description 2
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 2
- 239000005549 deoxyribonucleoside Substances 0.000 description 2
- 230000001419 dependent Effects 0.000 description 2
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N edta Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000002255 enzymatic Effects 0.000 description 2
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 238000004020 luminiscence type Methods 0.000 description 2
- 230000002934 lysing Effects 0.000 description 2
- 239000011777 magnesium Substances 0.000 description 2
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 2
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 2
- WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M potassium chloride Chemical compound [Cl-].[K+] WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 230000002797 proteolythic Effects 0.000 description 2
- 239000001397 quillaja saponaria molina bark Substances 0.000 description 2
- 239000002683 reaction inhibitor Substances 0.000 description 2
- 235000019515 salmon Nutrition 0.000 description 2
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 2
- 150000007949 saponins Chemical class 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 2
- 239000001226 triphosphate Substances 0.000 description 2
- 235000011178 triphosphate Nutrition 0.000 description 2
- 125000002264 triphosphate group Chemical class [H]OP(=O)(O[H])OP(=O)(O[H])OP(=O)(O[H])O* 0.000 description 2
- IKHKJYWPWWBSFZ-UHFFFAOYSA-N 4-[[4-(diethylamino)phenyl]-(4-diethylazaniumylidenecyclohexa-2,5-dien-1-ylidene)methyl]benzene-1,3-disulfonate;hydron Chemical compound C1=CC(N(CC)CC)=CC=C1C(C=1C(=CC(=CC=1)S([O-])(=O)=O)S(O)(=O)=O)=C1C=CC(=[N+](CC)CC)C=C1 IKHKJYWPWWBSFZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020003589 5' Untranslated Regions Proteins 0.000 description 1
- 229960000583 Acetic Acid Drugs 0.000 description 1
- 241000710189 Aphthovirus Species 0.000 description 1
- UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N Bromophenol blue Chemical compound C1=C(Br)C(O)=C(Br)C=C1C1(C=2C=C(Br)C(O)=C(Br)C=2)C2=CC=CC=C2S(=O)(=O)O1 UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010006451 Bronchitis Diseases 0.000 description 1
- 101700024612 CTRL Proteins 0.000 description 1
- 101700027702 CYSD1 Proteins 0.000 description 1
- 101700028762 CYSD2 Proteins 0.000 description 1
- 210000000234 Capsid Anatomy 0.000 description 1
- 102000005927 Cysteine Proteases Human genes 0.000 description 1
- 108010005843 Cysteine Proteases Proteins 0.000 description 1
- 102000016615 EC 2.7.7.49 Human genes 0.000 description 1
- 241001466953 Echovirus Species 0.000 description 1
- 241000991587 Enterovirus C Species 0.000 description 1
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 1
- 229920001320 Leader sequence (mRNA) Polymers 0.000 description 1
- 102000004895 Lipoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108090001030 Lipoproteins Proteins 0.000 description 1
- 206010029719 Nonspecific reaction Diseases 0.000 description 1
- 102000011931 Nucleoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108010061100 Nucleoproteins Proteins 0.000 description 1
- 101700014647 PCR1 Proteins 0.000 description 1
- 101700036361 PCR2 Proteins 0.000 description 1
- 108091005771 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 108010010677 Phosphodiesterase I Proteins 0.000 description 1
- 241000709664 Picornaviridae Species 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 101800001491 Protease 3C Proteins 0.000 description 1
- 241000205160 Pyrococcus Species 0.000 description 1
- 230000004570 RNA-binding Effects 0.000 description 1
- 102100003989 SLC10A3 Human genes 0.000 description 1
- 101710017897 SLC10A3 Proteins 0.000 description 1
- 102100010794 SLC26A1 Human genes 0.000 description 1
- 101710028993 ST3GAL4 Proteins 0.000 description 1
- 102100015668 ST3GAL4 Human genes 0.000 description 1
- 241001493546 Suina Species 0.000 description 1
- 241000282898 Sus scrofa Species 0.000 description 1
- 239000008049 TAE buffer Substances 0.000 description 1
- 108009000088 Translation Factors Proteins 0.000 description 1
- 239000007984 Tris EDTA buffer Substances 0.000 description 1
- 102000016350 Viral Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010067390 Viral Proteins Proteins 0.000 description 1
- 208000001756 Virus Disease Diseases 0.000 description 1
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000000890 antigenic Effects 0.000 description 1
- 238000004166 bioassay Methods 0.000 description 1
- 238000005460 biophysical method Methods 0.000 description 1
- 230000036760 body temperature Effects 0.000 description 1
- 238000004422 calculation algorithm Methods 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 239000003054 catalyst Substances 0.000 description 1
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 description 1
- 230000001413 cellular Effects 0.000 description 1
- 229920002083 cellular DNA Polymers 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 238000010835 comparative analysis Methods 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- -1 cyclic amine Chemical class 0.000 description 1
- 230000000120 cytopathologic Effects 0.000 description 1
- 238000007405 data analysis Methods 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing Effects 0.000 description 1
- 230000004059 degradation Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 229940079920 digestives Acid preparations Drugs 0.000 description 1
- 238000006471 dimerization reaction Methods 0.000 description 1
- 201000009910 diseases by infectious agent Diseases 0.000 description 1
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 1
- 229940079593 drugs Drugs 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 229940071106 ethylenediaminetetraacetate Drugs 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 1
- 102000034448 gene-regulatory proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091006088 gene-regulatory proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000002068 genetic Effects 0.000 description 1
- 239000012362 glacial acetic acid Substances 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 1
- 125000004435 hydrogen atoms Chemical group [H]* 0.000 description 1
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 1
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 230000000937 inactivator Effects 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 238000003771 laboratory diagnosis Methods 0.000 description 1
- 101710026800 lyc Proteins 0.000 description 1
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 1
- BAVYZALUXZFZLV-UHFFFAOYSA-N methylamine Chemical compound NC BAVYZALUXZFZLV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IZXGZAJMDLJLMF-UHFFFAOYSA-N methylaminomethanol Chemical compound CNCO IZXGZAJMDLJLMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000006011 modification reaction Methods 0.000 description 1
- 238000004264 monolayer culture Methods 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- QJGQUHMNIGDVPM-UHFFFAOYSA-N nitrogen group Chemical group [N] QJGQUHMNIGDVPM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001323 posttranslational Effects 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 235000019833 protease Nutrition 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 230000000717 retained Effects 0.000 description 1
- 239000003161 ribonuclease inhibitor Substances 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 230000002269 spontaneous Effects 0.000 description 1
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 230000014621 translational initiation Effects 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 1
Images
Abstract
Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к способу опосредованного контроля полноты инактивации антигена вируса ящура с применением nested обратно-транскриптазной полимеразной цепной реакции с последующим электрофорезом ампликонов в агарозном геле. Полноту инактивации антигена вируса ящура определяют методом nested ОТ-ПЦР с использованием двух систем оригинальных праймеров: 5'NTR-F1 и 3D-R1 (амплификация участка генома вируса ящура размером 7289 п.н.), 5'NTR-F2 и 3D-R2 (амплификация участка генома вируса ящура размером 7244 п.н.). Детекцию результатов опосредованного контроля полноты инактивации вируса ящура осуществляют в потоке ультрафиолетового света при длине волны 312 нм после проведения горизонтального электрофореза. При наличии флуоресцирующих ампликонов, полученных в ПЦР2 с использованием второй системы оригинальных праймеров, образец вирулентен, при отсутствии светящихся ПЦР2-продуктов образец инактивирован. Предлагаемое изобретение позволяет одновременно исследовать до 89 проб антигена вируса ящура, позволяет в 7,2 раз быстрее по сравнению с культуральным методом и с высокой степенью достоверности опосредованно определять полноту инактивации антигена вируса ящура. 6 з.п. ф-лы, 3 ил., 12 табл., 6 пр.
Description
Изобретение относится к области биотехнологии, средствам молекулярной диагностики и производству противоящурных вакцин, а именно к способу опосредованного контроля полноты инактивации антигена вируса ящура с применением nested обратно-транскриптазной полимеразной цепной реакции (nested ОТ-ПЦР) с последующим горизонтальным электрофорезом ампликонов в агарозном геле.
Ящур - высококонтагиозное вирусное заболевание парнокопытных животных, которое относится к категории трансграничных инфекций [1]. Возбудитель принадлежит к порядку Picornavirales, семейству Picornaviridae, роду Aphthovirus [2, 3]. Характерной особенностью вируса ящура является наличие 7 типов: А, О, С, Asia-1, SAT-1, SAT-2, SAT-3. В пределах каждого типа существует множество генетических вариантов вируса [3,4].
Вирион вируса ящура имеет диаметр около 23-25 нм, геном представлен одноцепочечной позитивной РНК, состоящей приблизительно из 8500 н.о. с одной большой открытой рамкой считывания длиной около 7000 н.о., которая состоит из 1А-, 1В-, 1С-, 1D-, 2А-, 2В-, 2С-, 3А-, 3В-, 3С-, 3D-генов. Весь геном возбудителя ящура характеризуется высокой степенью вариабельности нуклеотидов, за исключением 2В-гена, а также генов, кодирующих неструктурные белки и 5'-нетранслируемой области (5'-NTR), которые стабильны для всех вакцинных штаммов вируса ящура. Обнаружение генов, кодирующих неструктурные белки или 5'-NTR позволяет детектировать вирус в исследуемом материале [5-11].
Инактивация вируса ящура может достигаться за счет влияния различных физических и химических факторов. Так, при увеличении температуры прогревания до 45°С уменьшается относительное процентное содержание 146S компонента при сохранении титра инфекционной активности вируса ящура на уровне контрольного образца, хранящегося при температуре 4°С, что свидетельствует о разрушении неинфекционных 146S частиц. Температура 55-60°С вызывает спонтанный распад полных вирионов и резкое снижение титра инфекционной активности вируса ящура. Воздействие ультрафиолетовых лучей инактивирует вирус через 5-10 минут. Солнечный свет при температуре 5-6°С обезвреживает вирус через 5-7 дней, при 16-18°С - через 3-4 дня, при 37°С - через 40 часов [1, 2].
Вирус инактивируют различными химическими агентами: 0,5-1,0% раствор фенола при температуре плюс 4°С через 8 недель, при температуре плюс 18-20°С - через 10-14 дней, при температуре плюс 37°С - через 3 суток; 2% раствор формалина при температуре плюс 4°С - через 2 часа; 45-70% раствор этилового спирта при температуре плюс 4°С - через 1-2 ч [2].
При производстве цельновирионных инактивированных вакцин против ящура особое внимание уделяется вопросу безопасности изготовленного препарата. Технология изготовления данных вакцин обязательно предусматривает проведение исследования на отсутствие вирулентного вируса ящура в сырье [4]. В соответствии с требованиями Всемирной организации по охране здоровья животных при производстве вакцин против ящура для получения инактивированного антигена применяют инактиванты первого порядка, бинарный этиленимин/этиленимин (BEI/EI) (Bahnemann, 1990), в частности 1,2-аминоэтилэтиленимин (АЭЭИ) [4, 12].
Данный химический агент представляет собой циклический амин, который вступает в реакцию замещения водорода в N-H-связи вирусной РНК с сохранением цикла инактиванта. Данный процесс приводит к деградации нуклеиновой кислоты вируса, а также формированию соединений, подобных 7-(2-аминоэтил)гуанидину [12], в результате этого утрачивается вирулентность возбудителя, но при этом сохраняется антигенные свойства частицы вируса.
АЭЭИ вызывает потерю инфекционных свойств вируса ящура за счет многочисленных делеций и повреждений вирусной РЕК, присоединения новых функциональных групп к нуклеотидам, и даже разрушения вирусного генома до фрагментов [12, 13]. В результате процессы обратной транскрипции, трансляции и процессинга белков вируса и, как следствие, репродукции и сборки вириона in vivo и in vitro становятся невозможными. Разрывы в 1D-, 1В-, 1С-, 1А-генах приводят к прекращению процесса синтеза важнейших белков вируса ящура VP1, VP2, VP3, VP4, соответственно, которые являются структурными и отвечают за формирование икосаэдрического капсида, состоящего из 60 копий, каждая из которых представлена четырьмя указанными протеинами. Повреждения в 5'-NTR нуклеиновой кислоты вируса ящура препятствуют синтезу регуляторных белков, а в 3'-NTR -структур, отвечающих за терминацию процесса репликации. При разрушениях в области L-гена блокируется синтез первоначального полипептида, следовательно, не происходит посттрансляционный процессинг с образованием L-, Р1-, Р2- и Р3-белков. Кроме того, по причине отсутствия L-белка не протекают протеолитический процесс индуцирования расщепления факторов трансляции вирусной РНК. При повреждениях в 2А-, 2В, 2С-, 3А-, 3В-генах не формируются неструктурные белки, выполняющие ферментативные функции при сборке вирионов. Нуклеотидные разрушения в 3С- и 3D-генах не позволяют синтезировать 3С-протеазу и 3D-белок (РНК-зависимую-РНК-полимеразу). Таким образом, при одном из указанных серьезных повреждений вирус ящура утрачивает свои вирулентные свойства. Этот феномен можно определить с помощью молекулярно-биологического исследования.
Полноту инактивации верифицируют с использованием метода на остаточное содержание вирулентного вируса ящура в чувствительной клеточной линии почки свиньи СП по факту развития цитопатического действия [4, 14]. Существенными недостатками указанного метода являются: длительная процедура анализа, связанная с репродукцией вируса (не менее 3 суток для каждого из трех пассажей); субъективность при оценке результатов исследования; высокая стоимость культуры клеток и затраты на ее поддержание.
Проблемой является отсутствие чувствительного и специфичного вспомогательного экспресс-способа контроля полноты инактивации антигена вируса ящура с целью устранения вышеуказанных недостатков.
Данная проблема была решена благодаря разработке нового способа опосредованного контроля полноты инактивации антигена вируса ящура в сырье для вакцин с применением nested ОТ-ПЦР, предполагающей применением двух систем праймеров, детектирующих протяженные участки в 5'NTR- - 3D-генах вируса с размерами 7289 и 7244 п.о., соответственно, с последующим электрофорезом ампликонов в агарозном геле, с помощью которого возможно выявлять неповрежденный участок нуклеиновой кислоты вируса ящура до процесса инактивации и определять отсутствие вирулентного вируса ящура после воздействия инактивантами. Данная возможность позволит для подтверждения результатов культурального метода проводить контроль полноты инактивации антигена вируса ящура, который используется для изготовления инактивированных вакцин для домашних и сельскохозяйственных животных.
В связи с этим целесообразно разработать способ контроля полноты инактивации антигена вируса ящура с применением молекулярно-биологического исследования, который является более быстрым, менее затратным методом и отличается при этом высокой степенью надежности. Так, для определения остаточной вирулентности вирусов классической чумы свиней, инфекционного бронхита кур, эховирусов и др. в последние годы стали применять обратно-транскриптазную полимеразную цепную реакцию (ОТ-ПЦР) с последующей детекцией продуктов реакции с помощью горизонтального электрофореза, а также биофизический метод с применением рестрикционного и электрофоретического анализа (Закутский Н.И., Луницин А.В., 2016) [15]. Для контроля полноты инактивации антигена вируса ящура в вирионных вакцинах данный метод ранее не применялся. Для работы с РНК-содержащим вирусом ящура было решено взять за основу ОТ-ПЦР с последующим электрофорезом.
В настоящее время данный метод применяют только для проведения диагностики ящура, типирования и молекулярно-эпидемиологических исследований вируса, а также для дифференциации штаммов с применением типоспецифических праймеров (Vangrysperre and De Clerq (1996), Callahan et al., (2002), Reid et al., (2003)) [4, 16-18]. Данный метод отличается высокой чувствительностью и специфичностью, объективностью анализа данных и быстротой проведения исследования. За счет оптимизации условий постановки анализа и разработке штаммоспецифичных оригинальных праймеров, позволяющих детектировать большеразмерные фрагменты, подборе необходимых контролей, можно проводить анализ степени повреждения вирусного генома и, как следствие, исследование полноты инактивации антигена вируса ящура.
Для контроля полноты инактивации антигена вируса ящура в сырье для вакцины используют перевиваемую монослойную клеточную линию почки свиньи СП (прототип). По сравнению с прототипом предлагаемый способ на основе метода nested ОТ-ПЦР с последующей детекцией ампликонов в горизонтальном электрофорезе отличается высокими диагностическими показателями, является более экономичным, позволяет одновременно исследовать несколько десятков проб инактивированного вируссодержащего материала для вакцины, а время проведения анализа сократить до 10 ч. Исходя их этого, актуально применять метод nested ОТ-ПЦР с последующим электрофорезом ампликонов в агарозном геле для контроля полноты инактивации антигена вируса ящура при изготовлении инактивированных вакцин.
Сущность изобретения заключается в новом подходе по контролю полноты инактивации антигена вируса ящура в сырье для инактивированных вакцин с применением nested ОТ-ПЦР с последующим горизонтальным электрофорезом ампликонов в агарозном геле.
Заявляемый способ основан на проведении выделения нуклеиновой кислоты вируса ящура до и после процесса инактивации с помощью хаотропного агента (гуанидинизотиоцианата), денатурирующего белок и протеиназы К; проведении nested ОТ-ПЦР с применением двух систем оригинальных разработанных праймеров, детектирующих протяженный участок 5'NTR- - 3D-генов вируса ящура с размерами 7289 и 7244 п.о., соответственно, с последующей детекцией ампликонов в горизонтальном электрофорезе. В результате проведенного исследования оценивают наличие или отсутствие продуктов ПЦР в виде светящихся полос в потоке ультрафиолетового света при длине волны 312 нм. На основании полученных треков ампликонов делают заключение о целостности участков генома вируса ящура и, как следствие, о полноте инактивации антигена.
Ключевым элементом заявляемого способа является выделение нуклеиновой кислоты до и после процесса инактивации с применением хаотропного агента в сочетании с протеиназой К, а также проведение nested ОТ-ПЦР с использованием двух оригинальных систем праймеров, позволяющих амплифицировать 2 продолжительных участков ДНК с размерами 7289 и 7244 п.о., соответственно, детектирование полученных ампликонов с помощью горизонтального электрофореза и установление зависимости между разрушением продолжительного участка нуклеиновой кислоты вируса ящура и авирулентностью антигена после воздействия применяемых инактивантов.
Сопоставительный анализ с прототипом позволяет сделать вывод, что новизна и изобретательский уровень заявляемого изобретения заключается в применении экстрагирования РНК вируса ящура с помощью хаотропного агента и протеиназы К до и после инактивации, проведении nested ОТ-ПЦР с использованием двух оригинальных систем праймеров для опосредованного контроля полноты инактивации антигена вируса ящура, применяемого для изготовления инактивированных вакцин.
Сведений об аналогах предлагаемого способа опосредованного контроля полноты инактивации антигена вируса ящура в сырье для инактивированных вакцин авторами не обнаружено. Возможность применения метода ОТ-ПЦР с проведением горизонтального электрофореза в иной модификации и с другими праймерами описана для оценки полноты инактивации вируса классической чумы свиней и бешенства [15, 19]. Сущность изобретения отражена на графических изображениях: Фиг. 1 - Дизайн праймеров для амплификации большеразмерных фрагментов кДНК вируса ящура в nested ОТ-ПЦР (rev/compl - обратный комплементарный праймер, А - прямые праймеры, Б - обратные праймеры).
Фиг. 2 - Электрофореграмма по результатам контроля полноты инактивации антигена вируса ящура в сырье для вакцин (Примечание: 1 - ПКОвыд-е РНК (положительный контрольный образец на этапе выделения РНК - исходный не инактивированный вирус ящура), 2 - ПКОПЦР (положительный контрольный образец на этапе ПЦР - проверенная комплементарная (кДНК) не инактивированного вируса ящура), 3 - ВКОвыд-е РНК (внутренний контрольный образец на этапе выделения РНК - исходный не инактивированный вирус инфекционного некроза гемопоэтической ткани лососевых рыб), 4 - ВКОПЦР (внутренний контрольный образец на этапе ПЦР - проверенная кДНК не инактивированного вируса инфекционного некроза гемопоэтической ткани лососевых рыб), 5 - ОКО (отрицательный контрольный образец, контроль фона - деионизированная вода), 6 - ОИКОвыд-е РНК (отрицательный инактивированный контрольный образец на этапе выделения РНК - инактивированная суспензия вируса ящура), 7 - ОИКОПЦР (отрицательный инактивированный контрольный образец на этапе ПЦР - проверенная кДНК вируса ящура, выделенная из инактивированной суспензии).
Фиг. 3 - Кинетика инактивации вируса ящура штамма О/Забайкальский/16 с помощью 0,025% раствора АЭЭИ при температуре плюс 37±0,5°С.
При проведении контроля полноты инактивации антигена вируса ящура использовали следующие контрольные образцы:
- ПКОвыд-е РНК - положительный контрольный образец на этапе выделения РНК - исходный не инактивированный вирус ящура;
- ПКОПЦР - положительный контрольный образец на этапе ПЦР - проверенная комплементарная (кДНК) не инактивированного вируса ящура;
- ВКОвыд-е РНК - внутренний контрольный образец на этапе выделения РНК - исходный не инактивированный вирус инфекционного некроза гемопоэтической ткани лососевых рыб;
- ВКОПЦР - внутренний контрольный образец на этапе ПЦР - проверенная кДНК не инактивированного вируса инфекционного некроза гемопоэтической ткани лососевых рыб;
- ОКО - отрицательный контрольный образец, контроль фона - деионизированная вода;
- ОИКОвыд-е РНК - отрицательный инактивированный контрольный образец на этапе выделения РНК - инактивированная суспензия вируса ящура;
- ОИКОПЦР - отрицательный инактивированный контрольный образец на этапе ПЦР - проверенная кДНК вируса ящура, выделенная из инактивированной суспензии.
Из суспензии исследуемого образца, а также из ПКОвыд-е РНК, ВКОвыд-е РНК, ОКО и ОИКОвыд-е РНК выделяют нуклеиновую кислоту в процессе лизиса белков и липопротеинов, очистки нуклеиновой кислоты от примесей и ее концентрирования. Данный метод выделения РНК позволяет достичь высокой стандартизации в процедуре экстракции и получить из образцов высокоочищенные препараты нуклеиновой кислоты. Представленная ниже модифицированная методика адаптирована к процессу получения высокоочищенного элюата нуклеиновой кислоты вируса ящура. Лизис проводят с применением раствора, содержащего 50% 6М раствора гуанидинизотиоцианата (ГТЦ) и 50% протеиназы К. Данную смесь добавляют в количестве 0,9 мл к 0,1 мл исследуемой суспензии. Полученную смесь инкубируют при температуре 20±2°С в течение 20 минут для полного диссоциирования полипептидных и нуклеопротеидных комплексов. При этом нуклеиновая кислота сохраняет свою целостность благодаря высокой ингибирующей активности ГТЦ в отношении РНКаз. Полученный лизат очищают от конгломератов с помощью центрифугирования при 14000 об/мин в течение 10 минут. Супернатант переносят в центрифужную пробирку с 0,2 мл хлороформа и инкубируют содержимое в течение 5 минут с перемешиванием на вортексе. Смесь после инкубирования фракционируют при 14000 об/мин в течение 10 минут при температуре 4-8°С. В результате центрифугирования происходит разделение содержимого пробирки на три фракции: 1) нижняя фракция, содержащая комплекс связанных денатурированных полипептидов; 2) средняя фракция, включающая в свой состав белки и клеточную ДНК; 3) верхняя фракция, представляющая собой элюат РНК [13]. Верхнюю фракцию полностью отбирают, не затрагивая остальные, и переносят элюат в новую центрифужную пробирку с 0,3 мл 100%-ого изопропилового спирта для преципитации с целью концентрирования РНК. Смесь инкубируют в течение 10 минут при температуре 20±2°С, затем центрифугируют при 14000 об/мин в течение 5 минут при температуре 20±2°С. Супернатант удаляют, оставляя осадок РНК, к которому добавляют 0,3 мл 80%-ого этилового спирта. Содержимое перемешивают, инкубируют 3 минуты и осаждают при 14000 об/мин в течение 5 минут при температуре 20±2°С. Надосадок удаляют, осадок РНК высушивают в потоке воздуха комнатной температуры в течение 5 минут. К высушенному осадку добавляют 0,1 мл буфера ТЕ (10 мМ трис(оксиметил)аминометан, 1 мМ этилендиамин-тетраацетат, рН 7,0-7,3), свободного от РНКаз и ионов Mg2+, прогревают содержимое пробирки при температуре 60±2°С в течение 3-5 минут и отбирают в отдельную пробирку элюат РНК.
На следующем этапе исследования полученные экстракты РНК исследуют в nested ОТ-ПЦР. Для постановки реакции готовят ОТ-смесь с использованием набора реагентов для обратной транскрипции с гексамерами Applied Biosystems™ GeneAmp™. Рецептура приготовления смеси для обратной транскрипции представлена в таблице 1.
Для проведения обратной транскрипции РНК вирусов ящура и внутреннего контрольного образца (вируса инфекционного некроза гемопоэтической ткани лососевых) применяют хлорид магния с концентрацией 5 мМ на реакцию. В качестве буферного раствора используют Buffer II в количестве 1х на реакцию. Для формирования нуклеотидных цепей продуктов реакции применяют дезоксирибонуклеозидтрифосфаты с концентрацией каждого в ОТ-смеси по 1,0 мМ. В качестве универсальных праймеров применяют Random Hexamers с концентрацией 2,5 мкМ. В качестве катализатора обратной транскрипции используют ревертазу Maxima Н Minus (Thermo Scientific) (2,5 ед./мкл). Для защиты ферментативного процесса от РНКаз применяют RNase Inhibitor с активностью 1 ед. на мкл реакционной смеси. Содержание деионизированной воды составляет 1/20 от объема реакционной смеси. Количество элюата РНК составляет 1/10 от объема смеси. Объем реакционной ОТ-смеси компонентов для проведения одной реакции вместе с элюатом вирусной РНК составляет 20 мкл. Обратную транскрипцию проводят при температуре 50°С в течение 25 мин за 1 цикл (таблица 1).
В данной реакции используется указанная ревертаза Maxima Н Minus, которая обладает РНК-зависимой и ДНК-зависимой полимеразной активностью, но не обладает активностью РНКазы Н из-за мутации в РНКазном Н-домене M-MuLV ревертазы. Данный фермент применяли благодаря значительно улучшенной термостабильности, в 50 раз большей технологичности, устойчивости и повышенной скорости синтеза по сравнению с M-MuLV ревертазы дикого типа. Активность РНКазы Н позволяет ферменту вырабатывать очень длинные РНК-транскрипты до 20 т.п.н. Благодаря высокой термостабильности фермент сохраняет полную активность в течение всей реакции обратной транскрипции и генерирует высокие выходы кДНК. Температура реакции при использовании данного фермента может быть увеличена до 65°С для эффективной транскрипции РНК и для улучшения специфичности с использованием ген-специфических праймеров. Чрезвычайно высокая технологичность фермента Maxima Н Minus приводит к повышенной устойчивости к обычным ингибиторам реакции, таким как гуанидин, формамид и этанол [20]. Кроме того, благодаря использованию данного фермента повышается чувствительность реакции.
Перед постановкой nested ПЦР осуществляли предварительный прогрев смеси при температуре 95°С в течение 5 мин для активации ДНК-полимеразы Platinum High Fidelity и инактивации ревертазы Maxima Н Minus (таблица 2).
Nested ПЦР состояла из двух этапов: ПЦР1 и ПЦР2. ПЦР1 включала в себя следующие подэтапы: денатурацию, отжиг праймеров системы №1, элонгацию. Денатурацию проводили при температуре 95°С в течение 10 с, отжиг олигонуклеотидов системы №1 - при температуре 60°С в течение 30 с, элонгацию - при температуре 72°С в течение 7,5 мин, поскольку размер ампликона составлял 7289 п.н. Количество циклов амплификации - 35. ПЦР2 также включала в себя следующие подэтапы: денатурацию, отжиг праймеров системы №2, элонгацию. Денатурацию проводили при температуре 95°С в течение 10 с, отжиг праймеров системы №2 - при температуре 55°С в течение 30 с, элонгацию - при температуре 72°С в течение 7,5 мин, поскольку размер ампликона составлял 7244 п.н. Количество циклов амплификации - 25 (таблица 2). Продолжительность nested ОТ-ПЦР составляла около 8 ч 45 мин.
Рецептура приготовления ПЦР1 и ПЦР2-смеси представлена в таблице 3. Компонентный состав обеих реакций одинаковый, за исключением праймеров. Для ПЦР1 применяли систему оригинальных праймеров №1, для ПЦР2 - систему оригинальных праймеров №2 (дизайн представлен на фиг. 1). Праймеры применяли в концентрации по 5 пМ на реакцию с внесением в смесь по 0,1 мкл. Для формирования нуклеотидных цепей продуктов реакции применяют дезоксирибонуклеозидтрифосфаты с концентрацией в смеси по 2,00 мМ. В качестве основы используют Thermo Scientific™ 10Х DreamTaq™ Buffer, содержание которого составляет 10% от общего объема реакционной смеси. DreamTaq™ Buffer специально оптимизирован для ПЦР с использованием ДНК-полимеразы DreamTaq™. Буфер содержит как KCl, так и (NH4)2SO4 для обеспечения высокой специфичности отжига праймеров в широком диапазоне концентраций MgCl2. В реакционную смесь добавляют 4,0 мМ хлорида магния. В качестве фермента применяют ДНК-полимеразу Platinum High Fidelity (Invitrogene) (10 e.a.).
Высокоточная полимераза Platinum® Taq DNA High Fidelity идеально подходит для амплификации большеразмерных фрагментов ДНК (до 15000 п.н.), когда требуются высокая точность и выход ампликонов. Высокая точность обеспечивается смесью ДНК-полимеразы Platinum® Taq и коррекционной полимеразы Pyrococcus species GB-D с 3'→5'-экзонуклеазной активностью. Следует отметить, что данная полимераза проявляется точностью, которая на порядок выше по сравнению с Taq-ДНК-полимеразой [21].
На завершающем этапе исследования проводят детекцию ампликонов ДНК с помощью горизонтального электрофореза в 1,0%-ном агарозном геле, содержащем 0,0005% бромистого этидия. В расплавленный гель агарозы добавляют 0,0005% бромистого этидия. Полученные после реакции образцы в соотношении 5:1 подкрашивают смесью ксиленового голубого и бромфенолового синего с добавлением 15% глицерина для визуализации процесса электрофореза. Разделение молекул ампликонов под влиянием градиента напряжения применяют стандартный ТАЕ-буфер, содержащий ЭДТА, трис (оксиметиламинометан) и ледяную уксусную кислоту. Электрофорез проводят при силе тока 90А в течение 15-20 минут. Движение ПЦР-продуктов осуществляется от отрицательно заряженного катода к положительному аноду. Бромистый этидий интеркалирует между азотистыми основаниями ампликона и в трансиллюминаторе в потоке ультрафиолетового света при длине волны 312 нм флуоресцирует, что обеспечивает детекцию результатов анализа в виде наличия или отсутствия светящихся полос. Результаты электрофореза документируют с помощью видеосистемы «Взгляд» в цветном исполнении.
Проводят интерпретацию полученных данных. Предложены критерии интерпретации данных nested ОТ-ПЦР при контроле полноты инактивации антигена вируса ящура в сырье для вакцин. Важным условием качественно проведенных исследований являются результаты испытания контрольных образцов. Если ПКОвыд-е РНК, ПКОПЦР, ВКОвыд-е РНК, ВКОПЦР после всех стадий исследования в горизонтальном электрофорезе дают положительный результат (наличие ампликонов), а ОКО, ОИКОвыд-е РНК, ОИКОПЦР - отрицательный результат (отсутствие ампликонов), то в таком случае стадии выделения РНК, обратной транскрипции и nested ПЦР проведены верно, и можно учитывать результаты исследуемых проб. Если в треке исследуемой пробы обнаружены светящиеся продукты ПЦР2, то анализируемый участок нуклеиновой кислоты вируса ящура не поврежден, следовательно, данный образец считается не инактивированным или не полностью инактивированным. Если во всех треках свечение ампликона отсутствует, то данный участок нуклеиновой кислоты вируса ящура поврежден, тем самым, репликация вируса невозможна, и антиген считается авирулентным (фиг. 2). Иными словами, на основании отсутствия ПЦР-продуктов исследуемой пробы по сравнению с положительными контролями позволяет сделать заключение о разрушении нуклеиновой кислоты вируса ящура в инактивированных суспензиях и, как следствие, об отсутствии вирулентного вируса. В том случае, если обнаружены несоответствия в результатах анализа контролей, требуется повторно провести исследование.
Пример 1. Расчет олигонуклеотидных праймеров для детекции протяженного участка 5'NTR- - 3D-генов вируса ящура при постановке nested ОТ-ПЦР.
Расчет олигонуклеотидных праймеров проводили на основании нуклеотидных полногеномных последовательностей генома вируса ящура, полученных в рамках исследований в ФГБУ «Федеральный центр охраны здоровья животных» (ФГБУ «ВНИИЗЖ»).
В качестве гомологичных участкам 5'NTR- и 3D-генов вируса ящура олигонуклеотидных праймеров использовали:
первая система праймеров №1:
5'NTR-F1 (5'-GCCTGGTCTTTCCAGGTCTA-3'),
3D-R1 (5'-CGGCGAGTCCTGCCACGGA-3'),
вторая система праймеров №2:
5'NTR-F2 (5'-GAGGGGTGACACTTTGTA-3'),
3D-R2 (5'-CTTCTCCTGTATGGTCCCA-3').
Олигонуклеотиды для кДНК-матрицы подбирали в соответствии с рядом общих правил, которые отражены в работах В. Deiman и R. Sooknanan [22, 23]. Указанная система праймеров позволяла амплифицировать ПЦР-продукты генома вируса ящура в ПЦР1 с размером 7289 п.н., в ПЦР2 (nested) - 7244 п.н. Информация о дизайне оригинальных праймеров представлена в таблице 4 и на фиг. 1.
Длины 5'NTR-F1- и 3D-R1-, 5'NTR-F2- и 3D-R2-праймеров составляют 20 и 19, 18 и 19 и.о., что соответствует требованиям (15-30 н.о.) [22, 23]. Молекулярный вес 5'NTR-F1- и 3D-R1-, 5'NTR-F2- и 3D-R2-праймеров равен 6075,0 и 5814,8, 5594,7 и 5705,7 соответственно. Процентное содержание G и С в праймерах составляет 55 и 74, 50 и 53%, соответственно, что является допустимым. На 5'-конце праймеров и зонда отмечается преобладание G и С, а на 3'-конце - А и Т. Отсутствуют 4 и более подряд одинаковых нуклеотидов в цепи праймеров и зонда. При анализе нуклеотидных последовательностей олигонуклеотидов установили, что для праймеров не характерно образование «шпилек», а также не выявлено 3'-комплементарности и сайтов, отжигающих сами на себя. Расчет вероятности образования «шпилек» и димеров олигонуклеотидов проводили при условии, что минимальное количество пар оснований, необходимых для димеризации - 5, а для образования «шпилек» - 4.
Проведено определение температур плавления (Tm) для олигонуклеотидных праймеров, пользуясь методом ближайших соседей и учитывающим концентрацию солей в буферном растворе. Физические, термодинамические константы и расчет температур плавления разработанных олигонуклеотидных праймеров представлены в таблице 5.
Из нее следует, что энтропия, энергия Гиббса и энтальпия для 5'NTR-F1-праймера составили 164,7 ккал/моль, 25,9 ккал/моль, 431,3 кал/(°K×моль), соответственно. Энтропия, энергия Гиббса и энтальпия для 3D-R1-праймера составили 174,8 ккал/моль, 30,3 ккал/моль, 449,7 кал/(°K×моль), соответственно. Энтропия, энергия Гиббса и энтальпия для 5'NTR-F2-праймера составили 148,3 ккал/моль, 21,7 ккал/моль, 392,2 кал/(°K×моль), соответственно. Энтропия, энергия Гиббса и энтальпия для 3D-R2-праймера составили 153,4 ккал/моль, 23,5 ккал/моль, 402,8 кал/(°K×моль), соответственно. Данные значения необходимы для расчета температур плавления представленных олигонуклеотидов. Tm при использовании алгоритма ближайших соседей для прямого и обратного праймеров для ПЦР1 и ПЦР2 составили 53 и 60, 46 и 49°С, соответственно. Температура отжига олигонуклеотидов (Та) должна быть примерно на 1-5°С ниже Tm. Исходя из полученных данных, она должна находиться в диапазоне 55-65°С для ПЦР1 и 48-59°С для ПЦР2.
При использовании метода, учитывающего концентрации солей Tm для прямого и обратного праймеров для ПЦР1 и ПЦР2 составили 60 и 66, 54 и 57°С, соответственно. Температура отжига олигонуклеотидов (Та) должна быть примерно на 1-5°С ниже Tm и, исходя из полученных данных, она должна находиться в диапазоне 49-56°С для ПЦР1 и 41-48°С для ПЦР2.
Экспериментально было выявлено, что температура отжига рассматриваемых олигонуклеотидов для ПЦР1 составляет 58 и 62°С, для ПЦР2 - 56 и 54. Для проведения ОТ-ПЦР было решено проводить гибридизацию праймеров с участками 5'NTR - и 3D-генов вируса ящура при температурах 60°С для ПЦР1 и 55°С для ПЦР2.
Последовательности разработанных праймеров проверили на наличие нежелательных совпадений с другими последовательностями нуклеиновых кислот с использованием Банка данных последовательности нуклеиновых кислот вируса ящура [4]. Последовательности олигонуклеотидных праймеров также проанализировали на наличие внутренних вторичных структур с помощью программы сворачивания нуклеиновых кислот с помощью программы Mfold. Выявлено, что для разработанных олигонуклеотидов нежелательных совпадений с другими последовательностями нуклеиновых кислот, а также наличия внутренних вторичных структур не обнаружено.
Таким образом, проведен расчет олигонуклеотидных праймеров для детекции протяженного участка 5'NTR - 3D-генов вируса ящура при постановке nested ОТ-ПЦР.
Пример 2. Подбор условий проведения nested ОТ-ПЦР при разработке метода опосредованного определения полноты инактивации антигена вируса ящура в сырье для вакцин.
Для разработки высокочувствительного и специфичного метода опосредованного определения полноты инактивации антигена вируса ящура в сырье для вакцин с помощью nested ОТ-ПЦР, а также увеличения скорости проведения реакции амплификации для детекции большеразмерного фрагмента 5'NTR-3D-генов вируса ящура требовалось подобрать условия проведения реакции. Исследовали следующие пробы: не инактивированные суспензии вируса ящура штаммов А/Забайкальский/13 и О/Забайкальский/16 с титрами инфекционной активности 7,0 lg ТЦД50/мл (пробы №1 и 2), а также эти суспензии после инактивации с помощью АЭЭИ в концентрации 0,010% в течение 12 ч при температуре 37±0,5°С (пробы №3 и 4). Данные образцы анализировали в монослойной клеточной линии СП, подтвердив, что первые две пробы были не инактивированными, а вторые две получили статус инактивированного антигена. Из данных проб выделили нуклеиновую кислоту с помощью 6М раствора ГТЦ и изопропанола по методике, представленной выше. С полученными элюатами провели ОТ-ПЦР с применением тест-системы, отраженной в работах Vangrysperre W., De Clercq K. (1996) для выявления высоко консервативного 2В-гена вируса ящура [16]. Анализ проводили в трех повторностях. Результаты, полученные при исследовании, представлены в таблице 6, из которой видно, что имеющаяся тест-система не позволяет идентифицировать по небольшому участку 2В-гена вируса статус пробы в отношении полноты инактивации. В итоге предложено использовать две системы олигонуклеотидных праймеров, которые позволяют амплифицировать большеразмерный участок нуклеиновой кислоты вируса ящура с nested ОТ-ПЦР.
С целью достижения высоких диагностических показателей предложенного способа исследования полноты инактивации антигена вируса ящура в сырье для вакцин подбирали оптимальные концентрации компонентов nested ОТ-ПЦР.
Для поиска оптимальной концентрации хлорида магния применяли эмпирический подход. Проводили nested ОТ-ПЦР с последующим горизонтальным электрофорезом со следующими количествами хлорида магния в смеси для реакции: 1,0; 2,0; 3,0; 4,0; 5,0 мМ. Исследования проводили в трех повторностях. Полученные данные отражены в таблице 7.
Из данных проведенного исследования видно, что при анализе с не инактивированным материалом оптимальной является концентрация хлорида магния 4,0 мМ. Для анализа полноты инактивации было решено использовать реакционные смеси с данным количеством катионов Mg2+.
Осуществляли подбор оптимальной концентрации двух разработанных систем олигонуклеотидных праймеров. Для анализа использовали следующие количества праймеров: 2,5; 5,0; 7,5 и 10,0 пМ/реакция. Постановку реакций проводили в трех повторностях. Результаты исследования отражены в таблице 8, из которой видно, что при повышении количеств «затравочных» олигонуклеотидов отмечалось снижение чувствительности реакции. При концентрации каждого из праймеров по 2,5 пМ/реакция снижалась чувствительность реакции и пробы с титром инфекционной активности 2,00 lg ТЦД50/мл и ниже не были идентифицированы. Обнаружено, что оптимальная концентрация олигонуклеотидных праймеров составляла по 5 пМ/реакция.
Проводили исследования по подбору оптимального температурно-временного режима для nested ОТ-ПЦР. Реакцию обратной транскрипции осуществляли с использованием высокоточной ревертазы Maxima Н Minus при температуре 50°С в течение 25 мин. Денатурацию молекулы ДНК проводят, как правило, при 90-96°С, синтез ДНК - при 68-72°С, когда скорость работы высокоточной ДНК-полимеразы Platinum High Fidelity (Thermo FS) составляет более 100 нуклеотидов/с [21]. Для высокоэффективного и быстрого прохождения реакции амплификации требовалось подобрать оптимальную температуру отжига олигонуклеотидных праймеров для ПЦР1 и ПЦР2. Для осуществления ПЦР1 гибридизацию праймеров осуществляли при следующих температурах: 56, 58, 60, 62°С, для ПЦР2 - 53, 55, 57, 59°С. Результаты по подбору оптимальной температуры при проведении реакции для представленных олигонуклеотидов отражены в таблице 9.
По результатам анализа видно, что сопоставимые данные электрофореза отмечались при выборе температурного режима отжига праймеров системы №1 в диапазоне 56-60°С. Идентичные данные электрофореза отмечались при выборе температурного режима отжига праймеров системы №2 в диапазоне 53-55°С. При снижении температуры повышается концентрация гибридизованных праймеров, однако, есть вероятность увеличения количества неспецифических продуктов реакции. Для данного подэтапа для гибридизации олигонуклеотидов системы №1 оптимальной температурой считали 60°С, для системы №2 - 55°С.
Таким образом, nested ОТ-ПЦР для исследования полноты инактивации антигена вируса ящура проводили при температурно-временных показателях, отраженных в таблице 10.
Обратную транскрипцию проводили при температуре 50°С в течение 25 мин, что допустимо при использовании ревертазы Maxima Н Minus (Thermo Scientific). Температура реакции при использовании данного фермента может быть увеличена до 65°С для эффективной транскрипции РНК и для улучшения специфичности с использованием ген-специфических праймеров. Чрезвычайно высокая технологичность фермента Maxima Н Minus приводит к повышенной устойчивости к обычным ингибиторам реакции, таким как гуанидин, формамид и этанол. Кроме того, благодаря использованию данного фермента повышается чувствительность реакции.
Перед постановкой nested ПЦР осуществляли предварительный прогрев смеси при температуре 95°С в течение 5 мин для активации ДНК-полимеразы Platinum High Fidelity и инактивации ревертазы Maxima Н Minus.
Nested ПЦР состояла из двух этапов. ПЦР1 включала в себя следующие подэтапы: денатурацию, отжиг праймеров системы №1, элонгацию. Денатурацию проводили при температуре 95°С в течение 10 с, отжиг олигонуклеотидов системы №1 - при температуре 60°С в течение 30 с, элонгацию - при температуре 72°С в течение 7,5 мин, поскольку размер ампликона составлял 7289 п.н. Количество циклов амплификации - 35. ПЦР2 также включала в себя следующие подэтапы: денатурацию, отжиг праймеров системы №2, элонгацию. Денатурацию проводили при температуре 95°С в течение 10 с, отжиг праймеров системы №2 - при температуре 55°С в течение 30 с, элонгацию - при температуре 72°С в течение 7,5 мин, поскольку размер ампликона составлял 7244 п.н. Количество циклов амплификации - 25. Продолжительность nested ОТ-ПЦР составляла около 8 ч 45 мин.
Для элонгации ДНК применяли высокоточную полимеразу Platinum® Taq DNA High Fidelity, которая идеально подходит для амплификации большеразмерных фрагментов ДНК (до 15000 п.н.), когда требуются высокая точность и выход ампликонов. После реакции проводили горизонтальный электрофорез в 1,0%-ном агарозном геле.
Таким образом, подобраны оптимальные характеристики для проведения nested ОТ-ПЦР для опосредованного контроля полноты инактивации антигена вируса ящура в сырье для вакцины.
Пример 3. Разработка этапов исследования при проведении метода опосредованного контроля полноты инактивации антигена вируса ящура с применением nested ОТ-ПЦР с последующим электрофорезом ампликонов в агарозном геле.
Проводили исследования по разработке метода опосредованного контроля полноты инактивации антигена вируса ящура при производстве вакцин для ветеринарии с применением nested ОТ-ПЦР. Для этого выделяли РНК вируса ящура до и после процесса инактивации, проводили синтез кДНК в реакции обратной транскрипции и nested ПЦР, предполагающую использование системы оригинальных праймеров, детектирующих протяженный участок 5'NTR- - 3D-генов вируса ящура с размерами 7289 и 7244 п.н. в ПЦР1 и ПЦР2, соответственно, с последующей детекцией ампликонов методом горизонтального электрофореза. По итогам анализа оценивали наличие или отсутствие продуктов полимеразной цепной реакции в виде светящихся полос в потоке ультрафиолетового света при длине волны 312 нм. На основании полученных треков ампликонов делали заключение о целостности участков генома вируса ящура и, как следствие, о полноте инактивации антигена. Время проведения всего исследования составляет 10 ч, что в 7,2 раз меньше по сравнению с 72 ч, которые затрачиваются на контроль полноты инактивации в клеточной линии почки свиньи СП.
При проведении контроля полноты инактивации антигена вируса ящура использовали следующие контрольные образцы, представленные выше.
Предложены критерии интерпретации данных nested ОТ-ПЦР при контроле полноты инактивации антигена вируса ящура в сырье для вакцин. Важным условием качественно проведенных исследований являются результаты испытания контрольных образцов. Если ПКОвыд-е РНК, ПКОПЦР, ВКОвыд-е РНК, ВКОПЦР после всех стадий исследования в горизонтальном электрофорезе дают положительный результат - наличие ампликонов, а ОКО, ОИКОвыд-е РНК, ОИКОПЦР - отрицательный результат - отсутствие ампликонов, то в таком случае стадии выделения РНК, обратной транскрипции и nested ПЦР проведены верно, и можно учитывать результаты исследуемых проб. Если в треке исследуемой пробы обнаружены светящиеся продукты ПЦР2, то анализируемый участок нуклеиновой кислоты вируса ящура не поврежден, следовательно, данный образец считается не инактивированным или не полностью инактивированным. Если во всех треках свечение ампликона отсутствует, то данный участок нуклеиновой кислоты вируса ящура поврежден, тем самым, репликация вируса невозможна, и антиген считается авирулентным (фиг. 2). Иными словами, на основании отсутствия ПЦР-продуктов исследуемой пробы по сравнению с положительными контролями позволяет сделать заключение о разрушении нуклеиновой кислоты вируса ящура в инактивированных суспензиях и, как следствие, об отсутствии вирулентного вируса. В том случае, если обнаружены несоответствия в результатах анализа контролей, требуется повторно провести исследование.
Таким образом, проведена разработка этапов исследования при проведении метода опосредованного контроля полноты инактивации антигена вируса ящура с применением nested ОТ-ПЦР и представлена интерпретация данных с помощью горизонтального электрофореза ампликонов в агарозном геле.
Пример 4. Исследование полноты инактивации суспензии вируса ящура штамма О/Забайкальский/16 после воздействия АЭЭИ.
Исследовали процесс инактивации вируса ящура штамма О/Забайкальский/16 в течение 24 ч 1,2-аминоэтилэтиленимином с помощью nested ОТ-ПЦР в сравнении с культуральным методом. Для работы использовали не инактивированную суспензию вируса ящура с титром инфекционной активности в культуре клеток СП 8,25 lg ТЦД50/МЛ. Суспензию вируса сразу после его культивирования подвергали процессу инактивации с применением АЭЭИ (рН 8,2-8,6) с концентрацией 0,025% при температуре 37±0,5°С в течение 24 ч. Водородный показатель вирусной суспензии поддерживали в диапазоне 7,2-7,6. Суспензию подвергали тщательному перемешиванию в течение 3-5 минут через каждый час. Параллельно исследовали вирус ящура того же штамма, не подвергнутый инактивации, экспозиция которого проводилась при той же температуре и в тот период времени. Исследование проводили в 5 повторностях.
Для определения времени полной инактивации после добавления химического агента через 2, 4, 7, 8, 12, 20 и 24 ч в стерильных условиях производили отбор проб. Полученные образцы исследовали на наличие инфекционной активности вируса ящура в монослойной культуре клеток СП, а также с помощью предложенного способа. Результаты исследования отобранных суспензий вируса ящура отражены в таблице 11 и на фиг. 3. Выведена формула для графика инактивации вируса ящура штамма О/Забайкальский/16 в указанных условиях в виде линейного уравнения:
ТВЯ=-1,1662×tинактивации+8,1814,
где: ТВЯ - титр инфекционной активности вируса ящура,
tинактивации - время инактивации. Из полученных данных видно, что по итогам nested ОТ-ПЦР контроль инактивации (вирус ящура, не подвергнутый инактивации, экспозиция при температуре 37±0,5°С в течение 24 ч) сохранил вирусную кДНК без повреждений в участке длиной 7244 п.н. Полная инактивация вируса ящура штамма О/Забайкальский/16 1,2-аминоэтилэтиленимином с концентрацией 0,025% при температуре плюс 37±0,5°С достигалась через 7 ч. Эти данные получены с помощью культурального метода (фиг. 3) и подтверждены в nested ОТ-ПЦР.
Таким образом, способ опосредованного контроля полноты инактивации вируса ящура с помощью nested ОТ-ПЦР не уступает по своей эффективности культуральному методу и позволяет существенно сократить время и материальные затраты на проведение исследования.
Пример 5. Получение вакцины и исследование ее авирулентности на животных.
Полученную инактивированную суспензию вируса ящура штамма О/Забайкальский/16 концентрировали в 14 раз с помощью тангенциальной установки фильтрации и с полученным концентратом проводили получение сорбированной инактивированной противоящурной вакцины с использованием гидроокиси алюминия и сапонина. Количество гидроокиси алюминия составляло 11000-15000 мкг/мл, сапонина - 500-1500 мкг/мл, поддерживающей среды - до 1000000 мкг/мл.
Полученную вакцину исследовали на остаточную инфекционность путем введения крупному рогатому скоту. Для проверки вакцины использовали 2 головы КРС в возрасте 18-24 мес.весом не менее 250 кг. Животные были не ниже средней упитанности, клинически здоровые и не иммунные к ящуру, полученные из благополучных по ящуру зон страны, где иммунизация животных против ящура не проводилась в течение последних двух лет. Препарат вводили каждой из двух голов КРС интрадермолингвально в количестве 2,0 см3 (по 0,1 см3 в 20 точек). Наблюдение за животными вели в течение 14 сут. В течение этого срока у животных ежедневно утром измеряли температуру тела. У КРС через 12-18 ч после введения вакцины наблюдали повышение температуры до 40,1°С, что допустимо.
В период наблюдения у животных не появились клинические признаки ящура, а после окончания контроля на безвредность при патологоанатомическом исследовании не было обнаружено изменений, характерных для ящура. Иными словами, на животных была доказана безвредность вакцины и отсутствие живого вируса ящура в готовом препарате. Таким образом, разработанный способ опосредованного контроля полноты инактивации антигена вируса ящура с помощью nested ОТ-ПЦР с последующей детекцией ампликонов в горизонтальном электрофорезе.
Пример 6. Определение диагностических показателей метода опосредованного контроля полноты инактивации антигена вируса ящура в сырье для вакцин.
Проводили определение следующих диагностических показателей способа опосредованного контроля полноты инактивации антигена вируса ящура в сырье для вакцин с помощью nested ОТ-ПЦР: диагностической чувствительности (DSe), диагностической специфичности (DSp), k-критерия (индекс Каппа Коэна), прогностичности положительного результата (PPV), прогностичности отрицательного результата (NPV), диагностической точности (DAc). Для определения чувствительности предложенного способа исследовали 578 образцов суспензий вируса ящура, которые являлись заведомо положительными (вирулентными) по данным исследованиям культуральным методом в клеточной линии СП (титр инфекционной активности составлял 1,00-8,25 lg ТЦД50/мл). Постановку анализа проводили, как отражено выше в примере. При интерпретации результатов исследования положительными считали пробы, которые содержали живой вирус ящура по данным культурального метода, отрицательными - пробы, в которых живой вирус ящура отсутствовал. В результате проведения nested ОТ-ПЦР определили, что из 578 истинно положительных образцов суспензий 576 определены в качестве положительных, 2 - в качестве ложноотрицательных (титр инфекционной активности 1,00 lg ТЦД50/мл). Для исследования диагностической специфичности метода тестировали 550 образцов суспензий антигена вируса ящура, которые по результатам культурального метода были авирулентными. В результате исследования в nested ОТ-ПЦР определили, что из 550 истинно отрицательных суспензий 549 определены в качестве отрицательных, 1 - в качестве ложноположительной. Иными словами, количество истинно положительных проб (а) - 578, количество ложноотрицательных (b) - 2, количество ложноположительных проб (с) - 1, количество истинно отрицательных (d) - 550.
Пользуясь представленными выше статистическими методами анализа определили, что диагностическая чувствительность (DSe) составила 99,84% (в 95%-ном доверительном интервале: 99,12-100,0%), диагностическая специфичность (DSp) - 99,67% (в 95%-ном доверительном интервале: 98,82-99,96%), k-критерий (индекс Каппа Коэна) - 0,995, прогностичность положительного результата (PPV) - 99,68% (в 95%-ном доверительном интервале: 98,75-99,92%), прогностичность отрицательного результата (NPV) - 99,84% (в 95%-ном доверительном интервале: 98,85-99,98%), диагностическая точность (DAc) - 99,76% (в 95%-ном доверительном интервале: 99,30-99,95%) (таблица 12).
Основным преимуществом предлагаемого изобретения является возможность одновременного исследования большого количества проб (до 89) для опосредованного контроля полноты инактивации антигена вируса ящура в сырье для инактивированных вакцин в течение 10 ч, что в 7,2 раз быстрее по сравнению с классическим культуральным методом. В качестве гомологичных участкам 5'NTR- и 3D-генов вируса ящура олигонуклеотидных праймеров используют две системы праймеров:
система праймеров для ПЦР1:
5'NTR-F1 (5'-GCCTGGTCTTTCCAGGTCTA-3'),
3D-R1 (5'-CGGCGAGTCCTGCCACGGA-3'), которая позволяет амплифицировать фрагмент размером 7289 п.н., и
система праймеров для ПЦР2:
5 NTR-F2 (5'-GAGGGGTGACACTTTGTA -3'),
3D-R2 (5'-CTTCTCCTGTATGGTCCCA-3'), которая позволяет амплифицировать фрагмент размером 7244 п.н.
В данном изобретении предлагается применение nested ОТ-ПЦР с использованием высокоточной ревертазы Maxima Н Minus и ДНК-полимеразы Platinum High Fidelity с подобранными временными и температурными режимами проведения анализа, с последующим горизонтальным электрофорезом ампликонов в агарозном геле, с помощью которого возможно выявлять неповрежденный продолжительный участок генома вируса ящура (по итогам ПЦР2 - 7244 п.н.) до процесса инактивации и определять отсутствие вирулентного вируса ящура после воздействия инактивантами.
Результаты предложенного метода коррелируются с данными в клеточной линии почки свиньи СП. Предлагаемый способ характеризуется высокими диагностическими показателями, в частности, диагностическая чувствительность (DSe) составила 99,84% (в 95%-ном доверительном интервале: 99,12-100,0%), диагностическая специфичность (DSp) - 99,67% (в 95%-ном доверительном интервале: 98,82-99,96%), k-критерий (индекс Каппа Коэна) - 0,995, прогностичность положительного результата (PPV) - 99,68% (в 95%-ном доверительном интервале: 98,75-99,92%), прогностичность отрицательного результата (NPV) - 99,84% (в 95%-ном доверительном интервале: 98,85-99,98%), диагностическая точность (DAc) - 99,76% (в 95%-ном доверительном интервале: 99,30-99,95%).
Источники информации, принятые во внимание при составлении описания изобретения к заявке на выдачу патента РФ на изобретение «Способ контроля полноты инактивации антигена вируса ящура с применением nested обратно-транскриптазной полимеразной цепной реакции с последующим электрофорезом ампликонов в агарозном геле»:
1. Ящур / Пер. с нем. Г.А. Сурковой; Под ред. и с предисл. канд. вет. наук П.В. Малярца. - Москва: Колос, 1971. - 432 с.
2. Пономарев А.П., Узюмов В.Л., Груздев К.Н. Вирус ящура: структура, биологические и физико-химические свойства. Владимир: Фолиант. - 2006. - 250 с.
3. Таксономия микроорганизмов. [Электронный ресурс] / URL: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/guide/taxonomy/ (Дата обращения: 16.04.2021).
4. OIE. Manual of diagnostic tests and vaccines for terrestrial animals. - 7th ed. - Paris, 2018. - Vol. 1, Chap. 2.1.8.
5. Fry E.E., Stuart D.I., Rowlands D.J. The structure of foot-and-mouth disease virus // Curr Top Microbiol Immunol. - 2005. - №288. - P. 1-101. doi: 10.1007/3-540-27109-0_4. PMID: 15648175.
6. Allaire, M., Chernaia, M.M., Malcolm, B.A. and James, M.N. Picornaviral 3C cysteine proteinases have a fold similar to chymotrypsin-like serine proteinases // Nature. - 1994. - №369. - P. 72-76.
7. Beckman, M.T. and Kirkegaard, K. (1998) Site size of cooperative single-stranded RNA binding by poliovirus RNA- dependent RNA polymerase // J. Biol. Chem. - 1998. - №273. - P. 6724-6730.
8. Baranowski E., Sevilla N., Verdaguer N., Ruiz-Jarabo С.M. (1998) Multiple virulence determinants of foot-and-mouth disease virus in cell culture // J. Virol. - 1998. - №72. - P. 6362-6372.
9. Falk M.M. FMDV protease 3C inducing specific proteolitic cleavage of host cell histon H3 / M.M. Falk, P.R. Crigera, J.E. Bergmann // J. Virol. - 1990. - V. 64, N. 2.-P. 748-756.
10. Luz N. A cellular 57 kD protein binds to two region of the internal translation initiation site of FMDV / N. Luz, E. Beck // FEBS. - 1990. - V. 269, N. 2. - P. 311-314.
11. Belsham G.J. Translation and replication of FMDV RNA // Curr Top Microbiol Immunol. - 2005. - V.288. - P. 43-70.
12. Ethyleneimine [Электронный ресурс]. - URL: http://www.cdc.gov/niosh/npg/npgd0274.html (Дата обращения: 21 декабря 2020 г.).
13. Волков А.И., Жарский И.М. Большой химический справочник. Мн.: 2005-608 с.
14. Alexandersen, S. The pathogenesis and diagnosis of foot and mouth disease / S. Alexandersen, Z. Zhang, A.L. Donaldson // J. Compr. Pathol. - 2003 - V. 129. - P. 268-282.
15. Закутский, Н.И. Экспресс-метод технологического контроля полноты инактивации ДНК-содержащих вирусов при изготовлении убитых вакцин. / Н.И. Закутский, С.Ж. Цыбанов, А.В. Луницин, С.Г. Юрков // Ветеринария. - 2016. - №11. - С. 58-61.
16. Vangrysperre W. & De Clerco K. (1996). Rapid and sensitive polymerase chain reaction based detection and typing of foot-and-mouth disease virus in clinical samples and cell culture isolates, combined with a simultaneous differentiation with other genomically and/or symptomatically related viruses // Arch. Virol. - 1996. - №141. - P. 331-344.
17. Callahan J.D., Brown F., Csorio F. Use of a portable real-time reverse transcriptase-polymerase chain reaction assay for rapid detection of foot-and-mouth disease virus / Callahan J.D., Brown F., Csorio F.A. et al. // J. Am. Vet. Med. Assoc. - 2002. - №220. - P. 1636-1642.
18. Reid S. M. Evaluation of automated RTPCR to accelerate the laboratory diagnosis of foot-and-mouth disease virus // J. Virol. Methods. - 2003. - №107. - P. 129-139.
19. Патент РФ №2746588, 02.11.2020 Способ опосредованного определения полноты инактивации антигена вируса бешенства с применением обратно-транскриптазной полимеразной цепной реакции с последующим электрофорезом ампликонов в агарозном геле // Заявка 2020136034, Бюл. №11 / Доронин М.И., Борисов А.В., Михалишин Д.В., Шульпин М.И., Чупин С.А., Назаров Н.А.
20. Maxima H Minus Reverse Transcriptase [Электронный ресурс] / URL: https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/EP0752#/EP0752
(Дата обращения: 12.03.2021).
21. Platinum® Taq DNA g/product/11304011#/11304011/ (Дата обращения: 14.03.2021). High Fidelity [Электронный ресурс] / URL: https://www.thermofisher.com/order/catalo
22. Deiman В., van Aarle P., tech. - 2002. - Vol. 20. - P. 163-179.
23. Sooknanan R., van Gemen Sillekens P. Characteristics and applications of nucleic acid sequence based amplification // Mol. BioВ., Malek L. Nucleis acid sequence-based amplification // Molecular methods for virus detection-London: Academic press, 1995. - P. 261-285.
Claims (18)
1. Способ опосредованного контроля полноты инактивации антигена вируса ящура в сырье для вакцины с применением nested обратно-транскриптазной полимеразной цепной реакции с последующим горизонтальным электрофорезом в агарозном геле, отличающийся тем, что применяют праймеры со следующими последовательностями нуклеотидов:
- система праймеров для ПЦР1: 5'NTR-F1 и 3D-R1 - амплификация участка генома вируса ящура размером 7289 п.н.:
5'-GCCTGGTCTTTCCAGGTCTA-3',
5'-CGGCGAGTCCTGCCACGGA-3' соответственно,
- система праймеров для ПЦР2: 5'NTR-F2 и 3D-R2 - амплификация участка генома вируса ящура размером 7244 п.н.:
5'-GAGGGGTGACACTTTGTA-3',
5'-CTTCTCCTGTATGGTCCCA-3' соответственно,
что, тем самым, позволяет устанавливать наличие ампликонов нужного размера - наличие вирулентного вируса ящура либо отсутствие ампликона в агарозном геле - отсутствие вирулентного вируса ящура в сырье при изготовлении противоящурных инактивированных вакцин.
2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что основан на проведении элюирования нуклеиновой кислоты вируса ящура до и после процесса инактивации с помощью гуанидинизотиоцианата, протеиназы К и изопропилового спирта.
3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что для проведения обратной транскрипции РНК вируса ящура применяют высокоточную ревертазу Maxima Н Minus в количестве 2,5 ед./мкл, для проведения nested ОТ-ПЦР используют высокоточную и эффективную ДНК-полимеразу Platinum High Fidelity в концентрации 2,5 ед./мкл.
4. Способ по п. 1, отличающийся тем, что для проведения реакции nested ОТ-ПЦР применяют хлорид магния с концентрацией 4,0 мМ и олигонуклеотидные праймеры в количестве 5 пМ на реакцию.
5. Способ по п. 1, отличающийся тем, что nested ОТ-ПЦР проводят с соблюдением следующих режимов:
- обратная транскрипция: температура 50°С в течение 25 мин;
- активация ДНК-полимеразы Platinum High Fidelity: температура 95°С в течение 1 мин;
- ПЦР1: денатурация: температура 95°С в течение 30 с, отжиг олигонуклеотидов: температура 60°С в течение 30 с, элонгация: температура 72°С в течение 7,5 мин;
- ПЦР2: денатурация: температура 95°С в течение 30 с, отжиг олигонуклеотидов: температура 55°С в течение 30 с, элонгация: температура 72°С в течение 7,5 мин.
6. Способ по п. 1, отличающийся тем, что является экономичным, позволяет одновременно исследовать до 89 проб вируссодержащего материала для вакцин, а время проведения анализа сократить до 10 часов.
7. Способ по п. 1, отличающийся тем, что его диагностическая чувствительность составляет 99,84% (в 95%-ном доверительном интервале: 99,12-100,0%), диагностическая специфичность - 99,67% (в 95%-ном доверительном интервале: 98,82-99,96%), k-критерий (индекс Каппа Коэна) - 0,995, прогностичность положительного результата - 99,68% (в 95%-ном доверительном интервале: 98,75-99,92%), прогностичность отрицательного результата - 99,84% (в 95%-ном доверительном интервале: 98,85-99,98%), диагностическая точность - 99,76% (в 95%-ном доверительном интервале: 99,30-99,95%).
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2773654C1 true RU2773654C1 (ru) | 2022-06-07 |
Family
ID=
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2753969C1 (ru) * | 2021-04-05 | 2021-08-24 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Федеральный центр охраны здоровья животных" (ФГБУ "ВНИИЗЖ") | Способ опосредованного определения полноты инактивации антигена вируса ящура в сырье для вакцины с применением обратно-транскриптазной полимеразной цепной реакции в режиме реального времени при амплификации большеразмерного фрагмента |
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2753969C1 (ru) * | 2021-04-05 | 2021-08-24 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Федеральный центр охраны здоровья животных" (ФГБУ "ВНИИЗЖ") | Способ опосредованного определения полноты инактивации антигена вируса ящура в сырье для вакцины с применением обратно-транскриптазной полимеразной цепной реакции в режиме реального времени при амплификации большеразмерного фрагмента |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| FRY E.E. et al. The structure of foot-and-mouth disease virus, Curr Top Microbiol Immunol. - 2005. - N 288, p. 1-101. doi: 10.1007/3-540-27109-0_4. PMID: 15648175. BARANOWSKI E. et al. Multiple virulence determinants of foot-and-mouth disease virus in cell culture, J. Virol., 1998, N 72, p. 6362-6372. * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN106947838B (zh) | 非洲猪瘟病毒非结构基因实时荧光lamp检测引物组、试剂盒及检测方法 | |
| Koutna et al. | Identification of spring viraemia of carp virus (SVCV) by combined RT-PCR and nested PCR | |
| Putri et al. | Pathotypic characterization of Newcastle disease virus isolated from vaccinated chicken in West Java, Indonesia | |
| CN104328222B (zh) | 反转录pcr检测和分型登革病毒的试剂盒及其检测方法 | |
| CN111286559B (zh) | 检测非洲猪瘟病毒的引物、探针及试剂盒 | |
| Ashmi et al. | Molecular characterization of canine distemper virus from Tamil Nadu, India | |
| CN108778324A (zh) | 罗非鱼的正黏样病毒 | |
| CN111394515B (zh) | 一种用于检测犬细小病毒的lamp引物组、荧光可视化快速试剂盒及方法 | |
| JP2023521391A (ja) | 複合試料における単一ウイルスハプロタイプの定性的及び定量的な決定 | |
| RU2360971C1 (ru) | Способ и тест-система для обнаружения днк вируса африканской чумы свиней с помощью специфических олигонуклеотидных праймеров в полимеразной цепной реакции | |
| RU2773654C1 (ru) | Способ опосредованного контроля полноты инактивации антигена вируса ящура с применением nested обратно-транскриптазной полимеразной цепной реакции с последующим электрофорезом ампликонов в агарозном геле | |
| AU2017203670A1 (en) | High resolution melt genotyping of IBV, CSFV and NDV | |
| Haegeman et al. | Characterisation of the discrepancy between PCR and virus isolation in relation to classical swine fever virus detection | |
| RU2511440C2 (ru) | Способ количественного определения фиксированного вируса бешенства штамма "москва 3253" | |
| RU2607025C1 (ru) | Синтетические олигонуклеотидные праймеры и способ выявления РНК атипичного пестивируса крупного рогатого скота | |
| CN111500774B (zh) | 一种流行性出血病病毒及血清型鉴定rt-pcr试剂盒 | |
| TWI302570B (en) | Canine distemper virus isolated in korea and recombinant vaccine using the same | |
| CN109536644B (zh) | 用于鉴别犬瘟热病毒野毒株与疫苗株的as-pcr引物及其应用 | |
| Lim et al. | Enhanced detection and serotyping of foot‐and‐mouth disease virus serotype O, A, and Asia1 using a novel multiplex real‐time RT‐PCR | |
| Tran et al. | Detection and molecular characterization of virulent Newcastle disease virus (subgenotype VII. 2) in broiler chickens in Northern Vietnam | |
| RU2822037C1 (ru) | Способ дифференциации генома вакцинного штамма "ВНИИЗЖ" от полевых изолятов вируса бешенства методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени с анализом пиков температур плавления ампликонов и применением асимметричного красителя SYBR Green | |
| RU2809224C1 (ru) | Способ опосредованного определения титра инфекционной активности альфа-коронавируса собак производственного штамма РИЧ в сырье для вакцины методом ОТ-ПЦР в режиме реального времени | |
| RU2823779C1 (ru) | Способ дифференциации вакцинного штамма "РВ-97" от полевых изолятов вируса бешенства по данным максимума графика производной сигмоидной функции при амплификации участка N-гена вирусной кДНК с использованием красителя SYTO 16 | |
| RU2731716C1 (ru) | Набор для дифференциации пестивирусов крупного рогатого скота и способ дифференциации пестивирусов крупного рогатого скота | |
| RU2811995C1 (ru) | Способ опосредованного определения титра инфекционной активности вируса бешенства в сырье для изготовления аттенуированной антирабической вакцины с применением технологии алгебраического анализа дифференциала второго порядка максимальной точки d CP MAX логистической кривой ПЦР |