CN114438090B - 特异性结合布鲁氏菌外膜蛋白Omp31核酸适配体及其用途 - Google Patents

特异性结合布鲁氏菌外膜蛋白Omp31核酸适配体及其用途 Download PDF

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Abstract

本发明提供一条与布鲁氏菌外膜蛋白Omp31具有高亲和力的核酸适配体，该适配体的核苷酸序列如序列表中序列1所示，全长76bp，两端20bp为固定序列，中间36bp由筛选后确定出唯一确定序列。本发明利用SELEX技术，以原核表达的Omp31为靶标蛋白，以羧基磁珠为固相载体，通过9轮筛选及高通量测序，从1015初始DNA文库中，筛选得出本条与靶标具有高亲和力的核酸适配体。核酸适配体相对于抗体，具有易合成保存、成本低廉等优点，为开发新型夹心ELISA检测试剂盒提供了新的思路，对布鲁氏菌的检测和预防具有重要意义。

Description

特异性结合布鲁氏菌外膜蛋白Omp31核酸适配体及其用途
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及特异性结合布鲁氏菌外膜蛋白Omp31核 酸适配体及其用途。
背景技术
布鲁氏菌是胞内寄生的革兰氏阴性球状杆菌，在常温下存活时间可达数月之久，布鲁氏菌具有明显的宿主特异性，同时具有交叉感染的能力，可通过家畜、宠物种布鲁氏菌感染人类，这种由布鲁氏菌引起的人畜共患病被称为布鲁氏菌病，简称布病，是目前世界上流行最广的人畜共患传染病之一，变种较多，感染范围极广。
布鲁氏菌的外膜中有脂多糖、磷脂和蛋白质。布鲁氏菌外膜蛋白位于细菌细 胞膜的最外层，因其具有免疫原性和免疫保护作用一直备受注目。Omp31是布鲁 氏菌的外膜蛋白中极为重要的免疫保护性抗原，也被认为是一种孔道蛋白，具有 高度保守性，在维持细菌外膜结构稳定性中发挥着重要的作用。已有研究证明 Omp31与布鲁氏菌的毒力相关。
布鲁菌病临床症状复杂，引起的发热、流产等病理损害易与某些常见疾病混 淆；医生很难单凭有无病畜接触史来诊断布鲁杆菌感染，给诊断带来了一定的困 难，容易导致误诊，造成慢性感染。另一方面缺乏有效的治疗手段，抗生素的大 量长期使用仍很难见效，且容易引起耐药性问题。因此，布鲁杆菌的疫苗预防和 早期快速诊断对布菌的防控具有重大的现实意义；其中疫苗的免疫效果和布菌诊 断的准确性就显得尤为重要。
适配体又被称为“合成抗体”、“化学抗体”，其化学本质是一条单链寡核酸 分子(ssDNA或RNA)折叠成特定三维结构与靶物质高亲和力和高特异性结合。适 配体的获得是通过指数富集配体的系统进化技术(SELEX)的体外筛选过程。核 酸适配体具有高亲和力、高特异性、可体外合成、可通过修饰改变其功能及药代 动力学特性、无免疫原性、经济等特点。指数富集的配体系统进化技术，是一种 成熟而有效的制备高靶亲和力寡核苷酸的技术。这些SELEX衍生的短的、单链脱 氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)被称为适体(Aptamer)，是针对蛋白质、 细胞、微生物、化合物等多种靶点进行筛选的。它们作为新型抗体，在癌症治疗 学和生物医学研究中具有巨大的潜力。对适体的巨大兴趣刺激了SELEX的不断发 展，自1990年首次应用以来，SELEX经历了多次修改。新的修改使选择过程更高 效、更具成本效益，并且大大减少了耗时。经过数十年的发展，现已可通过SELEX 获得高特异性适体，例如低纳摩尔Kd，多重靶向或核酸酶抗性。这些新获得的功 能对适体在研究，诊断和治疗各个领域的应用产生了巨大影响。生物膜干扰技术 (BLI)原理是一束可见光穿过光纤，在传感器末端的光学膜层的两个界面会形 成两束反射光谱，叠加形成一束干涉光谱，分子结合导致膜层厚度变化，并通过 干涉光谱的位移值而体现，具有无标记、实时监测、浸入即读的三大特点。
生化培养虽然是布鲁菌病检测的金标准，但是该方法存在耗时长，生物安全 等方面诸多局限性，因此用特异性高的血清学检查仍然是主要采用的血清学方法， 如我国主要通过RBPT和SAT相结合的方法进行布鲁菌病的初筛和诊断，评判治 疗效果。但是这两种检测方法都存在一些问题，一是不能区分自然感染和疫苗免 疫接种产生抗体的难题，严重影响了布鲁菌病的检测和疫苗免疫预防策略。二是 RBPT法假阳性率较高，SAT法操作较为繁琐，耗费时间长，容易出现假阴性结果。 M5-90是减毒羊种布鲁杆菌疫苗株，Omp31蛋白为膜孔蛋白，与该弱毒菌苗株毒 力相关，并含有保护性抗原表位，其基因序列在不同的种属之间的同源性高达98％ 以上。因此，利用针对Omp31蛋白的单克隆抗体，可建立布鲁杆菌病原体及布鲁 菌病诊断方法及其诊断试剂，进而解决布鲁菌病鉴别诊断、预防、治疗和预后判断等方面的技术难题。
发明内容
本发明的目的是提供特异性结合布鲁氏菌外膜蛋白Omp31的核酸适配体及其 用途。
本发明提供一种特异性结合布鲁氏菌外膜蛋白Omp31的核酸适配体，该适配 体的核苷酸序列如序列表中序列1所示。
所述的特异性结合布鲁氏菌外膜蛋白Omp31的核酸适配体的二级结构如下：
。
所述的特异性结合布鲁氏菌外膜蛋白Omp31的核酸适配体的5’端或3’端 经修饰物修饰。
所述的修饰物为为生物素或荧光基团。
本发明还提供所述的核酸适配体的应用，为如下一至五中的至少一种：
一、特异性结合布鲁氏菌外膜蛋白Omp31，所述应用为非疾病诊断中的应用；
二、制备特异性结合布鲁氏菌外膜蛋白Omp31的产品；
三、检测布鲁氏菌外膜蛋白Omp31，所述应用为非疾病诊断中的应用；
四、制备检测布鲁氏菌外膜蛋白Omp31的产品。
五、制备治疗布病药物的应用。
本发明还提供一种试剂盒，含有所述的核酸适配体或核酸适配体的衍生物， 所述的核酸适配体或核酸适配体的衍生物为如下一至四中的任一种；
一、如序列表中序列1所示的核苷酸序列；
二、将序列1所示的核酸适配体删除或增加一个或几个核苷酸，得到与所述 核酸适配体具有相同功能的核酸适配体的衍生物；
三、将序列1所示的核酸适配体进行核苷酸取代或修饰，得到与所述核酸适 配体具有相同功能的核酸适配体的衍生物；
四、将一至三中任一所示的核酸适配体的一端或中间接上信号分子和/或活 性分子和/或功能基团和/放射性核素，得到与所述核酸适配体具有相同功能的核 酸适配体的衍生物。
本发明的有益效果至少包括：
本发明以成功表达出布鲁氏菌外膜蛋白Omp31为前提，利用SELEX技术，成 功地筛选得出与布鲁氏菌外膜蛋白具有特异性结合的核酸适配体Aptamer4，经试 验验证此条Aptamer4只与靶标蛋白结合，具有很强的特异性。这为开发新型夹 心ELISA检测试剂盒提供了新的思路，对布鲁氏菌的检测和预防具有重要意义。
本发明提供的适配体序列具有很强的实用性，为特异性检测布病的探针的研 发及其应用提供了有效方法和基础。
附图说明
图1为每一筛选轮数保留率结果图；
图2为每一轮筛选文库变性聚丙烯酰胺电泳结果图；
图3为Mfold预测Aptamer1二级结构图；
图4为Mfold预测Aptamer4二级结构图；
图5为检测BSA与Aptamer是否结合实时峰值监测结果；
图6为检测Omp31与Aptamer是否结合实时峰值监测结果。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以 下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。 本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各 种修改和替换。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例， 并参照附图，对本发明作进一步的详细说明。
核酸适配体是从寡聚核苷酸文库中筛选得到的可高亲和力高选择性识别目 标分子的单链核酸分子。作为核酸类的亲和配体，核酸适配体在分析检测领域的 应用具有很多优点，如合成制备方便，热稳定性高，易于引入功能团如荧光染料 标记等。核酸适配体在亲和力和选择性方面都可以和免疫抗体相媲美，核酸适配 体的分析方法可以克服免疫分析中免疫抗体的在稳定性和制备等方面的一些局 限，显示出潜力，核酸适配体的应用也受到广泛的关注，在分析传感领域显示出 很大的潜力和应用前景。
本申请基于本领域的现状，经过大量的实验探究和反复的实践验证，终于发 现序列如SEQ ID NO.1所示的核酸适配体与布鲁氏菌外膜蛋白Omp31具有很强的 亲和力。本发明通过从数据库中下载Omp31基因的核苷酸序列，以Pet28a为原 核表达载体，以原核表达的Omp31为靶标蛋白，以羧基磁珠为固相载体，利用 SELEX技术，通过9轮富集筛选，从1015初始DNA文库中，最终筛选获得了与靶 标具有高亲和力的核酸适配体序列，如表2(高通量测序获得前十丰度序列)中 Aptamer4所示。
表2
本发明的实施例中所述的特异性结合布鲁氏菌外膜蛋白Omp31的核酸适配体 的5’端或3’端经修饰物修饰。所述的修饰物为为生物素或荧光基团。
本发明的实施例中制备含有所述的核酸适配体或核酸适配体的衍生物的试 剂盒，所述的核酸适配体或核酸适配体的衍生物为如下一至四中的任一种；
一、如序列表中序列1所示的核苷酸序列；
二、将序列1所示的核酸适配体删除或增加一个或几个核苷酸，得到与所述 核酸适配体具有相同功能的核酸适配体的衍生物；
三、将序列1所示的核酸适配体进行核苷酸取代或修饰，得到与所述核酸适 配体具有相同功能的核酸适配体的衍生物；
四、将一至三中任一所示的核酸适配体的一端或中间接上信号分子和/或活 性分子和/或功能基团和/放射性核素，得到与所述核酸适配体具有相同功能的核 酸适配体的衍生物。
本发明的实施例中将核酸适配体用于如下五种方式：
一、特异性结合布鲁氏菌外膜蛋白Omp31，所述应用为非疾病诊断中的应用；
二、制备特异性结合布鲁氏菌外膜蛋白Omp31的产品；
三、检测布鲁氏菌外膜蛋白Omp31，所述应用为非疾病诊断中的应用；
四、制备检测布鲁氏菌外膜蛋白Omp31的产品。
五、制备治疗布病药物的应用。
以下实施例中以本发明设计的文库筛选过程及亲和力测定为例进行效果说 明。
实施例1.设计并合成初始文库
设计并合成了初始文库。文库序列全长76bp，两端20bp为固定序列，中间 36bp为完全随机序列。文库序列信息如表1所示。扩增时引物序列正义链修饰了 6-FAM荧光小分子，反义链引物修饰了加长的PolyA序列，序列信息如表1中 ePCR-S25-FAM、ePCR-A25-polyA所示。通过核酸变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离单双链，在 紫外灯照射下，切胶回收由FAM修饰的这条链，作为下一轮筛选的初始文库。
表1
Primer name Sequence(5’-3’)
Library TTCAGCACTCCACGCATAGC-N36-CCTATGCGTGCTACCGTGAA
ePCR-S25-FAM FAM-TTCAGCACTCCACGCATAGC
ePCR-A25-polyA AAAAAAAAAAAAAAAAAAA-spacer18-TTCACGGTAGCACGCATAGG
qPCR-S25 TTCAGCACTCCACGCATAGC
qPCR-A25 TTCACGGTAGCACGCATAGG
实施例2.文库稳定性的评估和筛选
每一轮的筛选过程为反筛、正筛、荧光定量PCR测定Ct值、乳浊液PCR扩 增下一轮筛选模板、核酸变性聚丙烯酰胺凝胶电泳、切胶回收目的链、正丁醇浓 缩、过夜透析，得到下一轮文库筛选模板。通过每一轮正筛反筛后，通过荧光定 量PCRCt值结果对筛选保留率进行计算。初始文库每十倍稀释，从10nM稀释到 0.1pM，制作标准曲线。计算公式如下：保留率＝保留摩尔质量/投入摩尔质量。 随着筛选轮数的增加，正筛文库保留率持续增加，反筛文库保留率反而下降。具 体每轮保留率结果见图1所示。每一轮文库的稳定性结果见图2所示。
实施例3：高通量测序
参考NexteraIndex-Kitadapterprimer(Illumina)建库完成上机序列，根 据筛选文库两端固定序列，设计建库PCR引物，进行四次PCR，构建高通量测序 文库。建库PCR引物序列信息如下：
第一次PCR：
P5-PCR1-F：TTCAGCACTCCACGCATAGC
P7-PCR1-R：TTCACGGTAGCACGCATAGG
第二次PCR：
P5-PCR2-F：
TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGTTCAGCACTCCACGCATAGC
P7-PCR2-R：
GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGTTCACGGTAGCACGCATAGG
第三次PCR(两端引物随机组合，保证区分即可)：
P5-1：
AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACATCGATCGTCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAG
P5-2：
AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACGCATGCATTCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAG
P5-3：
AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACCGTATCGATCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAG
P7-1：
CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGACTGACTGTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACA G
P7-2：
CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATACGTACGTGTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACA G
P7-3：
CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATATCGATCGGTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACA G
P7-4：
CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCATGTCAGGTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACA G
高通量测序后，对结果进行分析，得出前十丰度序列，具体序列信息见表2。
实施例4.选定序列与Omp31蛋白的亲和力测定
利用BLI技术，使用Octet系统，首先验证Aptamer与反筛蛋白BSA是否存 在结合。操作过程如下：使用氨基偶联传感器将BSA蛋白固定，缓冲液冲洗，确 定蛋白与传感器稳定结合，随后将Aptamer流过蛋白，若存在结合，实时监测会 观察到明显的峰值变化，若不存在结合，则没有峰值。如图5所示，为检测反筛 蛋白BSA与Aptamer过程中的结果图，实验结果说明，所筛选得出的Aptamer与 反筛蛋白不存在结合。
其次，验证Aptamer与正筛蛋白Omp31的结合力，操作流程见上描述，具体 结果见图6，为检测正筛蛋白Omp31与Aptamer过程中的结果图，实验结果说明， 所筛选得出的Aptamer与Omp31存在高亲和力。
实施例5.选定序列与其他大肠杆菌原核表达出的蛋白的亲和力测定
为了证明选定的Aptamer与靶标蛋白的结合具有特异性，我们选择了多个其 他蛋白，包括：pcv4、BSA、抗人蛋白的抗体mAb。采用上述同样的操作流程进行 亲和力测定。结果显示，选定的Aptamer4与除了靶标之外的其余蛋白并不存在 结合，具有良好的特异性。
本发明利用SELEX技术进行Omp31核酸适配体的筛选，通过九轮反筛加正筛， 获得了与布鲁氏菌外膜蛋白Omp31有亲和力的核酸适配体。经实验验证，本发明 提供的核酸适配体序列与Omp31蛋白具有高亲和力。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述， 但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显 而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于 本发明要求保护的范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 吉林大学重庆研究院
<120> 特异性结合布鲁氏菌外膜蛋白Omp31核酸适配体及其用途
<130> 2021
<160> 1
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 76
<212> DNA
<213> 人工序列（artificial sequence）
<400> 1
ttcagcactc cacgcatagc catttgtcgc accgggtcgt aagattgggc gtgatgccta 60
tgcgtgctac cgtgaa 76

Claims (6)

1.特异性结合布鲁氏菌外膜蛋白Omp31的核酸适配体，其特征在于：该适配体的核苷酸序列如序列表中序列1所示。
2.如权利要求1所述的特异性结合布鲁氏菌外膜蛋白Omp31的核酸适配体，其特征在于：所述的核酸适配体二级结构如下，
。
3.如权利要求1所述的特异性结合布鲁氏菌外膜蛋白Omp31的核酸适配体，其特征在于：所述的核酸适配体的5’端或3’端经修饰物修饰。
4.如权利要求3所示的特异性结合布鲁氏菌外膜蛋白Omp31的核酸适配体，其特征在于：所述的修饰物为为生物素或荧光基团。
5.如权利要求1所述的特异性结合布鲁氏菌外膜蛋白Omp31的核酸适配体的应用，其特征在于，为如下一至五中的至少一种：
一、特异性结合布鲁氏菌外膜蛋白Omp31，所述应用为非疾病诊断中的应用；
二、制备特异性结合布鲁氏菌外膜蛋白Omp31的产品；
三、检测布鲁氏菌外膜蛋白Omp31，所述应用为非疾病诊断中的应用；
四、制备检测布鲁氏菌外膜蛋白Omp31 的产品；
五、制备治疗布病药物的应用。
6.一种试剂盒，其特征在于：含有如权利要求1所述的特异性结合布鲁氏菌外膜蛋白Omp31的核酸适配体，所述的适配体的核苷酸序列如序列表中序列1所示。
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