CN112941078B

CN112941078B - 一种检测新冠病毒SARS-CoV-2 S1蛋白的核酸适体、筛选方法及其用途

Info

Publication number: CN112941078B
Application number: CN202110156273.5A
Authority: CN
Inventors: 江峰; 伍锐; 罗昭锋; 何蕾; 刘延友
Original assignee: Mianyang Youxian District Innovation Technology Industry Technology Research Institute
Current assignee: Mianyang Youxian District Innovation Technology Industry Technology Research Institute
Priority date: 2021-02-04
Filing date: 2021-02-04
Publication date: 2021-09-10
Anticipated expiration: 2041-02-04
Also published as: CN112941078A

Abstract

本发明提供了一种检测新冠病毒SARS‑CoV‑2S1蛋白的核酸适体、筛选方法及其用途，本发明通过体外筛选技术筛选出能和SARS‑CoV‑2S1蛋白特异性结合的核酸适体，所述核酸适体的核苷酸序列为：5′‑TTGAAGTGACGTCCTAGGGGTTTGGCA TCGGGCCTGGCGCTCTGTTCATAGCAGGT‑3′；本发明采用ELAA方法测定核酸适体与不同蛋白的相互作用，结果表明，该核酸适体具有高度的结合性和特异性，能够与SARS‑CoV‑2S1蛋白结合，跟其它病毒无交叉反应；采用蛋白免疫印迹实验测定核酸适体抗病毒作用，结果显示，核酸适体具有很好的中和活性，能够发挥类似抗体的功能。

Description

一种检测新冠病毒SARS-CoV-2 S1蛋白的核酸适体、筛选方法及其用途

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种检测新冠病毒SARS-CoV-2 S1蛋白的核酸适体、筛选方法及其用途。

背景技术

自2020年1月以来，新型冠状病毒(SARS-CoV-2)在全球肆虐，造成了严重的人员死亡和经济损失，截至2021年01月19日，全球死亡人数已超204万。SARS-CoV-2可以人传人，虽然致死率低，但传播较快，感染者会出现急性、严重呼吸道疾病，伴有发热、咳嗽、气短及呼吸困难，严重的病例还会出现肾功能衰竭和死亡，当前并无有效的治疗药物。对于新冠肺炎的预防与治疗，我国国务院历次发布的《新型冠状病毒肺炎防控方案》中，均强调“早发现、早报告、早隔离、早治疗”的措施。新冠肺炎的“早发现”措施，主要依赖于疾病的诊断，目前主要有三种方式，一是核酸诊断方法(如荧光定量PCR)、二是抗原诊断(如胶体金)、三是抗体检测(如ELISA)，但这些检测方法目前并不完善，对加护、设备要求高，需依赖特定仪器、特殊实验室和专业技术人员，且检测过程复杂，不能满足及时检测需求，还存在一定的漏检率。SARS-CoV-2由于潜伏期具有传染性，为了排查很多无症状感染者，迫切需要发展现场、实时、便捷的快速检测方法。

核酸适体(Aptamer)是指通过指数富集的配基系统进化技术(SELEX)筛选分离得到的DNA或者RNA分子，它可以与其它靶标如蛋白质、金属离子、小分子、多肽甚至整个细胞进行高亲和力和特异性的结合，具有分子量小、稳定性好、易改造修饰、无免疫原性、制作周期短、可以通过人工合成等优势，因此，核酸适体在临床诊断和疾病治疗领域中显现出重要的应用价值。

由于核酸适体具有抗体相似的功能，能够中和病毒，发挥抗病毒作用，因此，核酸适体除用于疾病的诊断外，还可作为小分子药物用于疾病的治疗。核酸适体与抗体相比具有分子量小、稳定性更好、无免疫原性、制作周期短、可以通过人工合成等优势，免去了动物免疫、饲养、蛋白提取和纯化等一系列流程，因此较抗体的研究与应用，具有更大的潜力。

因此，筛选针对新型冠状病毒SARS-CoV-2的结合亲和力高的核酸适体，开发出一种快速诊断方法，对新冠病毒的诊断和治疗具有重要的意义。

发明内容

本发明主要解决的技术问题是提供一种检测新冠病毒SARS-CoV-2 S1蛋白的核酸适体、筛选方法及其用途，该核酸适体(即本发明中的Zz37-56n)具有高度特异性、分子量小、化学性质稳定、易于保存和能够特异性结合SARS-CoV-2S1蛋白。

SARS-CoV-2(2019nCoV)包含4种结构蛋白，分别是核衣壳蛋白(N蛋白)、包膜蛋白(E蛋白)、膜蛋白(M蛋白)和刺突蛋白(S蛋白)，冠状病毒表面的刺突蛋白(S蛋白)与宿主细胞受体的结合是入侵第一步，是冠状病毒主要的免疫原性抗原。S蛋白划分成S1区和S2区，S1区域包含受体结合域(RBD)，S2区域含有两个七肽重复区(HR1和HR2)，认为S1区域负责与细胞受体结合，而S2区域负责膜融合，S1亚单位在病毒感染细胞的初期，与宿主细胞上的受体作用，使病毒与细胞发生结合，感染细胞，因此，发展SARS-CoV-2病毒S1蛋白的识别分子，对SARS-CoV-2 S1蛋白抗原的检测方法具有重要的价值；但是，与N蛋白相比，S蛋白表达更难，纯化得到的S蛋白不纯，使后期识别S蛋白的核酸适体灵敏度低，且S蛋白表达需要实验周期较长，给研发带来了很大的阻碍，在筛选过程中，得到的富集文库产物经测序分析后，序列数量庞大，很难筛选得到结合能力强的序列。

为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：

本发明提供了一种核酸适体，所述核酸适体可可特异性结合SARS-CoV-2 S1蛋白，其核苷酸序列为：

5′-TTGAAGTGACGTCCTAGGGGTTTGGCATCGGGCCTGGCGCTCTGT

TCATAGCAGGT-3′。

本发明还提供了一种上述核酸适体的筛选方法，包括如下内容：

(1)合成随机单链DNA文库和引物；

(2)磁珠法筛选；

(3)高通量测序分析、鉴定得到特异性核酸适体。

将得到的富集文库产物经高通量测序分析后，挑选若干条序列由通用生物合成，检测亲和力。在后续检测中，发明人意外的发现，有1条序列具有很强的结合能力，将该条序列进行截短之后得到了本发明所示的核酸适体(Zz37-56n)，具有理想的结合SARS-CoV-2S1蛋白的亲和力。

在本发明的具体实施方式中，所述引物为：

F:5'-CTACGGTGCCTTGAAGTGAC-3′

R:5'-CCTGGAAGTGACCTGCTATG-3′。

在本发明的具体实施方式中，所述磁珠法筛选包括如下内容：

①采用羧基磁珠固定病毒蛋白；

②将组氨酸小肽与磁珠偶联制备反筛磁珠；

③将随机单链核苷酸文库溶解、变复性处理后，先用MB-his进行反筛，反筛上清与MB-NP磁珠进行正筛；

④将正筛得到的上清进行E-PCR，纯化扩增产物。

磁珠法重复筛选6轮，每次操作均以前一次操作中得到的次级文库为起始核酸文库。

在本发明的具体实施方式中，所述①中，病毒蛋白通过蛋白表面的氨基偶联到磁珠表面。

在本发明的具体实施方式中，所述②中组氨酸小肽为9个连续的组氨酸。

在本发明的具体实施方式中，所述特异性核酸适体结合病毒蛋白的检测下限≤1ng/ml。

本发明还提供了一种检测或诊断试剂盒，包括上述的核酸适体。

本发明还提供了上述核酸适体在制备SARS-CoV-2病毒S1蛋白的检测试剂盒或SARS-CoV-2病毒S1蛋白诊断试剂中的用途。

本发明筛选得到的特异性强的核酸适体可与化学试剂制备成检测或诊断SARS-CoV-2病毒S1蛋白的试剂盒，所述化学试剂不影响核酸适体的特异性和灵敏性，包括但不限于免疫吸附剂、酶标记的抗原、酶的底物、阴性对照品、阳性对照品，参考标准品、结合物和标本的稀释液、洗涤液等。

本发明还提供了上述核酸适体在制备治疗和/或预防SARS-CoV-2病毒的产品中的用途。

本发明所述核酸适体可以特异性结合SARS-CoV-2病毒中的S1蛋白，起到病毒中和作用，从而发挥抗病毒效应。

本发明的有益效果是：本发明通过体外筛选技术筛选出能和SARS-CoV-2 S1蛋白特异性结合的核酸适体，命名为Zz37-56nt，能跟SARS-CoV-2 S1蛋白特异性结合，跟猪德尔塔冠状病毒和流行性腹泻病毒、日本乙型脑炎病毒、流感病毒无交叉反应，具有高度的结合性和特异性，结合SARS-CoV-2 S1蛋白的下限达到1ng/ml以下，实用性强，可用于SARS-CoV-2的快速病原诊断，也可作为小分子药物，用于SARS-CoV-2的治疗使用。

附图说明

图1为固定文库筛选的流程图；

图2为S1蛋白的蛋白表达图；

图3为6轮磁珠法重复筛选的保留率验证结果。

图3中，每一轮筛选得到的与靶标或者反筛靶标结合的文库的分子数与投入的总文库序列数的比例，称之为保留率。

具体实施方式

下面对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所做出的所有其他实施例，都属于本发明的保护范围。

本发明实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，所用的实验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂公司购买得到。

实施例1特异性结合SARS-CoV-2 S1蛋白的核酸适体的筛选

试剂：羧基磁珠(Invitrogen,Dynabeads^TMMyOne^TMCarboxylic Acid，#65012)、引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成、SARS-CoV-2 S1蛋白(购自义翘神州，40591-V08H)、his小肽由杭州丹港生物科技有限公司合成、ePCR微液滴生成油以及PCR mix购自安徽省昂普拓迈(Aptamy)生物科技有限公司，货号分别为EPO100和ESE2018。

1、合成随机单链DNA文库和引物

随机单链DNA文库：两端引物各20个碱基，中间随机区域36个碱基。5'-CTACGGTGCCTTGAAGTGACNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNCATAGCAGGTCACTTCCAGG-3'。该文库由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。特异性引物：

F:5'-CTACGGTGCCTTGAAGTGAC-3′

R:5'-CCTGGAAGTGACCTGCTATG-3′。

引物分别用DPBS缓冲液(氯化钙0.1g/L，氯化钾0.2g/L，磷酸二氢钾0.2g/L，六水氯化镁0.1g/L，氯化钠8g/L，十二水磷酸氢二钠2.8915g/L；PH7.4，25℃)配制成100μM的贮存液，于-20℃保存备用。

2、磁珠法筛选

采用磁珠法筛选，共计筛选6轮(筛选流程见图1)，具体筛选方法如下：

(1)羧基磁珠固定SARS-CoV-2 S1蛋白

取50μl，用200μl超纯水清洗4遍，磁铁垂钓磁珠，去上清。取配置好的NHS(N-羟基琥珀酰亚胺；0.1M水溶液)和EDC(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐；0.4M水溶液)，等体积混合，加入到磁珠中，25℃孵育20分钟活化磁珠表面的羧基，磁珠用PBS缓冲液清洗1遍后备用。

取20μl浓度为0.75mg/ml的SARS-CoV-2 S1蛋白(图2)，与80μl pH4.5的10mMNaAC混匀，加入到上述的活化磁珠中，置于垂直混合仪上25℃孵育60min，SARS-CoV-2 S1蛋白通过蛋白表面的氨基偶联到磁珠表面。SARS-CoV-2S1蛋白的氨基酸序列见序列表。

偶联结束，将偶联管置于磁力架上，吸弃上清，取100μl 1M乙醇胺pH8.5加入到磁珠中，25℃垂直混合仪上孵育10min，封闭磁珠表面未反应的活化位点，置于磁力架上，吸弃封闭液，磁珠用200μl PBS清洗4遍，标记为MB-NP。

(2)反筛与筛选

反筛磁珠制备：将his小肽(为9个连续的组氨酸)与磁珠偶联，偶联his蛋白的步骤与偶联SARS-CoV-2 S1蛋白相同。His小肽的浓度为10mM，用pH3.6的10mM NaAC溶液稀释，具体的，取20μl his小肽，加入80μl pH3.6的10mM NaAC溶液混匀。其余步骤一样。

文库溶解与变复性处理：取1OD随机单链核苷酸文库，14000rpm离心10min，将文库离心到管底，用PBS缓冲液溶解至10μM，混匀后分装到PCR管进行变复性处理，处理过程如下：

PCR仪设定程序95℃保持10min，此步骤目的是使折叠的链解开，然后4℃保持5min，然后平衡至室温。将处理后的文库加入到50μl的MB-his磁珠，混匀后在垂直混合仪上室温孵育一段时间，置于磁力架上，收集上清，标记为pool-，上清作为单链核酸文库与MB-NP磁珠进行正筛。每一轮磁珠筛选，在进行以SARS-CoV-2 S1蛋白为靶标的正筛之前都先用MB-his进行反筛，反筛上清作为单链核苷酸文库与MB-NP磁珠进行正筛，具体为：

将反筛后的文库pool-加入到50μl MB-NP磁珠中，在垂直混合仪上25℃孵育40min，置于磁力架上，吸弃上清，保留磁珠，用200μl PBS清洗磁珠4次，最后将清洗后的磁珠加入200μlPBS，沸水浴10min，收集上清，标记为elution-NP。以elution-NP中的核酸分子为模板，用乳浊液PCR(ePCR)进行扩增，方法如下：

将全部模板elution-NP加入2ml PCR mix中混匀，加入4倍体积的ePCR微液滴生成油，涡旋制备乳浊液。将乳浊液分成100μl/管加入到PCR管中，扩增条件如下：95℃预变性2min，95℃变性60sec，60℃退火60sec，72℃延伸60sec，共25个循环，4℃保存。

扩增产物用正丁醇纯化：收集所有的ePCR产物于15ml尖底离心管中，加入2倍体积的正丁醇，在旋涡混合器上震荡以充分混匀；台式离心机，9000rpm(转/分钟)于25℃离心10min；移弃上相(正丁醇)，得到浓缩的PCR扩增产物，按体积比1：1加入TBE/尿素变性缓冲液，煮沸变性10min使DNA变性，随后冰浴1min，将所有的样品进行尿素变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，400V电压下电泳至溴酚蓝到达胶底部，使带荧光的FAM标记的正义链与反向的加长的链分开。

切胶回收FAM标记的链：将凝胶取出放在塑料膜上，Ex(nm)：495，Em(nm)：517检测我们需要的带有FAM标记的ssDNA；用干净的刀片将目的条带直接切下，将胶条转移至1.5mlEP管中并捣碎，加入1ml ddH2O后沸水浴10min将胶中的ssDNA转移至溶液中，离心去除胶的碎片，留上清。上清用正丁醇纯化，得到DNA单链用3KD的透析袋透析过夜，即可作为下一轮筛选的文库。

磁珠法重复筛选6轮，每次操作均以前一次操作中得到的次级文库为起始核酸文库，文库进行变复性处理之后，添加相应浓度的血清，调整相应的氯化钠的浓度，然后与偶联好蛋白的磁珠进行孵育。筛选过程中用SPR检测DNA单链文库对SARS-CoV-2 S1蛋白识别能力的变化，当DNA单链文库对SARS-CoV-2 S1蛋白的识别能力满足要求，即筛选后的DNA单链文库与靶标蛋白的结合能力高于筛选起始投入的文库，将所得文库经高通量测序分析。6轮磁珠法重复筛选的保留率验证结果见图3，其中第6轮文库的富集程度很高，且正筛保留率高过反筛保留率，可以进行次级文库的亲和力检测。

3、分析和鉴定多次筛选后得到的核酸适体

将得到的富集文库产物经高通量测序分析后，挑选若干条序列由通用生物合成，检测亲和力。在后续检测中，确定了1条序列具有很强的结合能力，将该条序列进行截短之后得到了本发明所示的核酸适体，且验证后具有理想的结合SARS-CoV-2 S1蛋白的亲和力，将它命名为Zz37-56n。Zz37-56n的核苷酸序列为：5′-TTGAAGTGACGTCCTAGGGGTTTGGCATCGGGCCTGGCGCTCTGTTCATAGCAGGT-3′(序列表2)。

实施例2核酸适体Zz37-56n在SARS-CoV-2诊断方法中的应用

试剂：核酸适体Zz37-56nt由生工生物工程(上海)股份有限公司合成和修饰，SARS-CoV-2 S1蛋白购自义翘神州(货号40591-V08H)(序列表1)，猪德尔塔冠状病毒、猪流行腹泻病毒、日本乙型脑炎病毒、流感病毒均由四川农业大学猪病研究中心提供，病毒信息如表1：

表1本发明中使用的病毒信息

采用酶联核酸适体(Enzyme Linked Aptamer Assay,ELAA)方法测定核酸适体与蛋白之间的相互作用：将特定已知蛋白包被酶标板，加入生物素(biotin)标签的核酸适体进行反应，通过生物素和链霉亲和素的特异性相互作用，biotin可以结合HRP-Streptavidin(辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素)，HRP催化四甲基联苯胺(TMB)底物显色，根据OD(Optical density)的比值确定结果。

1、ELAA的操作步骤

含有SARS-CoV-2 S1蛋白或其它病毒蛋白的样品经包被缓冲液梯度稀释以后，包被空白酶标板，4℃过夜包被夜；PBST洗涤3次，每孔加入100μl biotin标签的核酸适体Zz37-56nt或者biotin(阴性对照)，37℃作用60min，轻轻震荡；PBST洗涤3次，加入HRP-Streptavidin抗体(1:1000稀释)，37℃作用60min，轻轻震荡；PBST洗涤3次，加入HRP显色底物TMB 100μl，室温15min避光反应；加入100μl 2N的硫酸终止液；OD450检测吸光度。

2、研究结果

将S1蛋白包被96孔板，对5个修饰的核酸适体进行了检测，表2结果显示，核酸适体1(Zz37-56nt)的结合性最好，S/N值6.26，可用作后期实验。

表2筛选出的5个核酸适体的ELAA检测结果

备注：S/N：S为Sample(样本)的简写，N为Negative(阴性对照)的简写，通常采用S/N≥2.1为阳性判定标准。S/N值越大，效果越明显。

接下来，将稀释成不同浓度的SARS-CoV-2 S1蛋白包被酶标板，测试核酸适体Zz37-56nt的灵敏性，结果如表3显示，SARS-CoV-2 S1蛋白以1ng/ml包被酶标板，结果也为阳性。

表3核酸适体Zz37-56n跟不同浓度SARS-CoV-2 S1蛋白结合的检测结果

备注：S/N：S为Sample(样本)的简写，N为Negative(阴性对照)的简写，通常采用S/N≥2.1为阳性判定标准。OD450值≤0.2，且S/N值≥2.1即为阳性。S/N值越大，效果越明显。

最后，将猪德尔塔冠状病毒(10^6.5TCID₅₀/ml)、流行性腹泻病毒(10^7.5TCID₅₀/ml)、日本乙型脑炎病毒(10^7.0TCID₅₀/ml)、流感病毒(10^6.5TCID₅₀/ml)包被酶标板，测试核酸适体Zz37-56nt的特异性，结果显示，这4种病毒均与Zz37-56nt无反应，结果均为阴性(表4)。

表4核酸适体Zz37-56n跟不同病毒蛋白结合的检测结果

备注：S/N：S为Sample(样本)的简写，N为Negative(阴性对照)的简写，通常采用S/N≥2.1为阳性判定标准。OD450值≤0.2，且S/N值≥2.1即为阳性。S/N值越小，表示相互间的反应越弱，特异性越好。

通过灵敏性和特异性研究表明，核酸适体Zz37-56nt具有高亲力和灵敏性，仅与SARS-CoV-2 S1蛋白发生反应，检测蛋白的下限为1ng/ml以下；核酸适体Zz37-56nt不与日本乙型脑炎病毒、流感病毒、动物冠状病毒(猪德尔塔冠状病毒和猪流行性腹泻病毒)发生反应，具有较高的特异性。

实施例3核酸适体Zz37-56n在SARS-CoV-2抗病毒研究中的应用将含有梯度稀释的SARS-CoV-2 S1蛋白和对照蛋白进行蛋白印迹实验(Western Blot)，核酸适体能够特异性的与SARS-CoV-2 S1蛋白结合，与抗体的功能类似，发挥抗病毒作用。

1、蛋白印迹实验的操作步骤

将SARS-CoV-2 S1蛋白进行梯度稀释(10μg、1μg、0.1μg、0.01μg)后与对照蛋白BSA(10μg)进行聚丙烯酰胺凝胶电泳；凝胶电转移，使蛋白转移到醋酸纤维素膜上；用1％BSA室温封闭60min，PBST洗涤3次；用biotin标签的核酸适体Zz37-56nt或S1蛋白抗体，分别室温孵育60min，PBST洗涤3次；加入HRP-Streptavidin抗体(用于核酸适体)或者HRP-羊抗兔IgG二抗(用于S1蛋白抗体)，室温孵育60min，PBST洗涤3次；用增强的化学发光试剂盒(ECL)显色并扫描拍照。

2、研究结果

研究结果如表5显示，与S1蛋白抗体相似，核酸适体Zz37-56n能特异性结合醋酸纤维素膜上不同浓度(10μg、1μg、0.1μg、0.01μg)的SARS-CoV-2 S1蛋白，出现目的条带；而核酸适体Zz37-56n和S1蛋白抗体一样，不结合对照蛋白BSA，无特异性性条带。研究结果表明，核酸适体Zz37-56n具有很好的中和活性，能够发挥类似抗体的功能。

表5核酸适体Zz37-56n与不同浓度SARS-CoV-2 S1蛋白的Western Blot结果

备注：“+”结果为阳性，出现目的条带。

实施例4检测试剂盒的制备

将实施例1中得到的核酸适体Zz37-56n，制备成检测SARS-CoV-2病毒S1蛋白的试剂盒。

实施例5诊断试剂盒的制备

将实施例1中得到的核酸适体Zz37-56n，制备成SARS-CoV-2病毒S1蛋白的诊断试剂盒。

以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的保护范围，凡是利用本发明的说明书所作的等效流程或等效结构的变换，或直接、或间接运用在其他相关的技术领域，均应同理包括在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 绵阳市游仙区创新科技产业技术研究院

<120> 一种检测新冠病毒SARS-CoV-2 S1蛋白的核酸适体、筛选方法及其用途

<130> 2

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 671

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 1

Val Asn Leu Thr Thr Arg Thr Gln Leu Pro Pro Ala Tyr Thr Asn Ser

1 5 10 15

Phe Thr Arg Gly Val Tyr Tyr Pro Asp Lys Val Phe Arg Ser Ser Val

20 25 30

Leu His Ser Thr Gln Asp Leu Phe Leu Pro Phe Phe Ser Asn Val Thr

35 40 45

Trp Phe His Ala Ile His Val Ser Gly Thr Asn Gly Thr Lys Arg Phe

50 55 60

Asp Asn Pro Val Leu Pro Phe Asn Asp Gly Val Tyr Phe Ala Ser Thr

65 70 75 80

Glu Lys Ser Asn Ile Ile Arg Gly Trp Ile Phe Gly Thr Thr Leu Asp

85 90 95

Ser Lys Thr Gln Ser Leu Leu Ile Val Asn Asn Ala Thr Asn Val Val

100 105 110

Ile Lys Val Cys Glu Phe Gln Phe Cys Asn Asp Pro Phe Leu Gly Val

115 120 125

Tyr Tyr His Lys Asn Asn Lys Ser Trp Met Glu Ser Glu Phe Arg Val

130 135 140

Tyr Ser Ser Ala Asn Asn Cys Thr Phe Glu Tyr Val Ser Gln Pro Phe

145 150 155 160

Leu Met Asp Leu Glu Gly Lys Gln Gly Asn Phe Lys Asn Leu Arg Glu

165 170 175

Phe Val Phe Lys Asn Ile Asp Gly Tyr Phe Lys Ile Tyr Ser Lys His

180 185 190

Thr Pro Ile Asn Leu Val Arg Asp Leu Pro Gln Gly Phe Ser Ala Leu

195 200 205

Glu Pro Leu Val Asp Leu Pro Ile Gly Ile Asn Ile Thr Arg Phe Gln

210 215 220

Thr Leu Leu Ala Leu His Arg Ser Tyr Leu Thr Pro Gly Asp Ser Ser

225 230 235 240

Ser Gly Trp Thr Ala Gly Ala Ala Ala Tyr Tyr Val Gly Tyr Leu Gln

245 250 255

Pro Arg Thr Phe Leu Leu Lys Tyr Asn Glu Asn Gly Thr Ile Thr Asp

260 265 270

Ala Val Asp Cys Ala Leu Asp Pro Leu Ser Glu Thr Lys Cys Thr Leu

275 280 285

Lys Ser Phe Thr Val Glu Lys Gly Ile Tyr Gln Thr Ser Asn Phe Arg

290 295 300

Val Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn Leu

305 310 315 320

Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val Tyr

325 330 335

Ala Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser Val

340 345 350

Leu Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val Ser

355 360 365

Pro Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp Ser

370 375 380

Phe Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln Thr

385 390 395 400

Gly Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr Gly

405 410 415

Cys Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly Gly

420 425 430

Asn Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys Pro

435 440 445

Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr Pro

450 455 460

Cys Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser Tyr

465 470 475 480

Gly Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val Val

485 490 495

Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly Pro

500 505 510

Lys Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys Cys Val Asn Phe Asn Phe

515 520 525

Asn Gly Leu Thr Gly Thr Gly Val Leu Thr Glu Ser Asn Lys Lys Phe

530 535 540

Leu Pro Phe Gln Gln Phe Gly Arg Asp Ile Ala Asp Thr Thr Asp Ala

545 550 555 560

Val Arg Asp Pro Gln Thr Leu Glu Ile Leu Asp Ile Thr Pro Cys Ser

565 570 575

Phe Gly Gly Val Ser Val Ile Thr Pro Gly Thr Asn Thr Ser Asn Gln

580 585 590

Val Ala Val Leu Tyr Gln Asp Val Asn Cys Thr Glu Val Pro Val Ala

595 600 605

Ile His Ala Asp Gln Leu Thr Pro Thr Trp Arg Val Tyr Ser Thr Gly

610 615 620

Ser Asn Val Phe Gln Thr Arg Ala Gly Cys Leu Ile Gly Ala Glu His

625 630 635 640

Val Asn Asn Ser Tyr Glu Cys Asp Ile Pro Ile Gly Ala Gly Ile Cys

645 650 655

Ala Ser Tyr Gln Thr Gln Thr Asn Ser Pro Arg Arg Ala Arg Ala

660 665 670

<210> 2

<211> 56

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 2

ttgaagtgac gtcctagggg tttggcatcg ggcctggcgc tctgttcata gcaggt 56

Claims

1.一种核酸适体，其特征在于，所述核酸适体可特异性结合SARS-CoV-2 S1蛋白，其核苷酸序列为：

5′-TTGAAGTGACGTCCTAGGGGTTTGGCATCGGGCCTGGCGCTCTGTTCATAGCAGGT-3′。

2.一种检测或诊断试剂盒，其特征在于，包括如权利要求1所述的核酸适体。

3.权利要求1所述核酸适体在制备SARS-CoV-2病毒S1蛋白的检测试剂盒或SARS-CoV-2病毒S1蛋白诊断试剂中的用途。