JPS62501450A - 抗体の検出のための競合的エリザ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 抗体の検出のための競合的エリザ 背景および概括的説明 本発明Ｖｉ、試験血清中の抗体を検出する特異的なおよび高感度の方法である。

本方法、競合的酵素結合イムノソルベント　アッセイ（エリザ　（ＥＬＩＳＡ） ）は、特にヒトＴ−細胞白血病−リンパ腫ウィルス　タイプｌ［ｌ　（）（ＴＬ Ｖ−Ｉｌｌ）、後天性免疫不全症候群（エイズ）の推定上の病因の検出のために 開発された。しかしながらこの方法は、ＨＴＬＶ科のウィルス、並びに他の抗原 およびそれらの相当する抗体九一般に適用され得る。

多くのイムノアッセイ技術が、抗原および抗体の免疫監視のｆｃめに存在する。

間接的エリザ　アッセイおよび”ウェスタン”エレクトロ　ブロッティング　ア ッセイは、非常に高感度のもののひとつである。しかしながら、これらの方法の 短所のひとつは、全ての正常な血清に存在する非免疫性免疫グロブリンおよびそ の他の血清成分によシ引き起こされるバックグラウンド妨害である。このバック グラウンドは、低レベルの特異的な反応性免疫グロブリンと重なりそしてそれを あいまいにする傾向によシ、試験の感度を低下させ、そして真の陽性を明確にす るために捕捉的な確認の必要を生じる。広範囲に使用される一つのその様な確認 試験は、ウィルス蛋白に対して高感度で、よ＃）特異的でそして情報を提供する “ウェスタン”ブロッティング法であるが、この方法は非常に集中的な作業であ り、解釈が離しく、そして性質上（定量的というよりむしろ）定性的である。

本発明の競合的エリザ　イムノアソ、セイは、血清学的資料を得るための感度、 特異性、便利さを格段に高めている。本方法は、通常の免疫グロブリンのバック グラウンドを減らすこと（・てより特異的な抗体測定の感度全高め金的にヒト特 異抗体を阻止する。

本発明は、特にＨＴＬＶ−ＩＩＩ抗体の検出に適している。

エイズおよびＨＴＬＶ−ｉｌｌ　は血液製剤により伝染することは公知であるか ら、ＨＴＬＶ−ｉｌｌの混入を検出するための方法は、受容者の安全を保柾する ために必要でおる。この様な方法は、可能な限り高感度でそして特異的であるべ きであり、通常の環境において容易に行なわれるべきでもある。ウィルスのマー カー例えば新鮮なまたは培養した血液細胞中の逆転写酵素、ウィルスの抗原また は核酸配列のための試験は、遅くそして大規模のスクリーニングには現在適して いない。一方、つ４　Ａ・ス抗体または抗原のための血清学的試験は、ＨＴ　Ｌ 、　Ｖ〜■に感染した個体が、１種またはそれ以上のＨＴＬＶ−１１１ｆｆ白に 対する抗体に通常血清陽性であるから、この目的のために適してＨＴＬＶ−ＩＩ Ｉは、アメリカン　タイプ　カルチャー　コレクシｍン（Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔ ｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ）に、少なくとも３０年“また は最後の試料要求後５年のどちらかより長い方の期間寄託された。これらの寄託 は下記の通シである： ＡＴＣＣＡ　ＣＲＬ　８６０２　１９８ｄ年８月１５日ＡＴＣＣＡ　４０１２５ ．４０１２６．４０１２７１９８４年７月６０日ＡＴＣＣ屋　ＣＲＬ　８５４５ 　１９８４年４月１９日詳細な開示 酵素結合イムノンルベント　アッセイ（エリザ）は、関連試薬（抗原）を固相支 持体に結合させることにより一般に行なわれる。試験血清は、標識された試薬と 混合し、次に結合させた関連試薬と反応させる。次に結合した試薬と遊離の試薬 を分離するために、試薬は一連の希釈、培養そして洗浄工程を行なう。この方法 は、使用した標識のタイプと共存でき、試験血清中の抗体（または抗原）の′！ ｋを間接的に測定する様に計画された検出工程で終わる。

上に記載したエリザ系は、通常時間がかかり、そしてエイズを試験する場合には 、時おり誤った陽性結果を生じる。本発明において、抗原またはウィルス断片は 固体の支持体に結合されている。結合した断片を次にその結合した断片に結合す る異種抗血清と培養する。試験血清を次に結合した断片に添加し、そして結合し た断片上の吸光度を試験する。５０パ一セント以上の吸光度の抑制（正常なヒト 血清に対して）は、陽性の試験結果と児なされる。下記の記載は、抗原としてＨ ＴＬＶ−Ｉｌｌを使用して、さらに本発明の詳細な説明する。

ＨＴ　Ｌ　Ｖ−■抗原を速度−ゾーン超遠心により情製し、分離し、そして微量 滴定グレートのウェルに被覆する。

試験血清を検査し、そして試譲サンプルを抗原被覆ウェルと共に培養する前に、 付加的な２時間の培養期間を含む確認の中和スクリーニングによ＃）確かめる。

この特別の２時間の培養の間、ウェルなウェル上の１（ＴＬＶ抗原部位と反応し そして該部位を飽和させる）（ＴＬＶ−ｉｌｌに対する未標識のヒツジ抗体（異 種抗血清ンにさらし、この様にしてひき続く工程でウェルに試験血清が付着する のを防いでいる。試験の対照として、付加的な培養期間の間、隣シのウェルを正 常なヒツジ血清にさらす。ヒツジ抗血清の好ましい希釈は１０．０００またはそ れ以上の滴定濃度で１：２である。微ｆｆｉ滴定プレートウェルに被覆された植 物凝集素（ＰＨＡ）−刺激性ヒ）　ＩＪンバ球調製物からの蓋白質と反応性を示 すヒツジ抗血清は、反応性が除去されるまでＰ　Ｈ人リンパ球調製物に吸収され る。この方法で使用されるヒツジ抗血清は、５部の体積の血清あたｆ）１部の体 積の細胞当量の吸収を必要とする。ＨＴＬＶ−［１に対する未標識ヒツジ抗血清 にさらされた試料において、標準の正常なヒツジ血清に対して５０パ一セント以 上の吸光度の抑制は、ＨＴＬＶ−Ｉ［１に対する抗体の存在のために陽性と認め られる結果とみなされる。

ヒツジの内皮に完全フロイント　′アジュバント中の　ウィルス蛋白１７を接種 する（不完全フロイントをその後に使用する）。蛋白画分を、非イオン性界面活 性剤およびα６ＭＮａＣ１，中のシラ糖濃度勾配精製されたＨＴＬＶ−１１１／ Ｈ９ピリオンの破壊により得る。同時に０．０４チパラホルム　アルデヒド中に 固定された１ｊの精良ピリオンを内皮に注入する。滴定濃度が十分に高くなるま で、１ケ月の間をおいて追加免疫接ｉｋ内皮に、筋肉内にまたは静脈内に行なう 。試験に施用する材料を血漿交換法により１回に１リツトル得る。非免疫ヒツジ からの血漿を同じ方法によシ得る。

行なわれるウェスタン　ブロッティング比較分析は３層の免疫パーオキシダーゼ 法を使用する。

上に記載した蛋白画分はＨＴＬＶ−１１１／Ｈ９ピリオンの破壊により得られる が、この分野の当業者は本発明が精製ウィルス蛋白、ファ抗原、およびクローン 化亜属の断片誘導体の使用をも含む（これには限定されない）ことを理解するで あろう。開示に基づいて、多くの他の変更および派生は、この分野の熟練した人 々にはそれ自体自然に示唆されるであろう。これらの変法は、本発明の範囲内で あることを意図されている。

本発明は、好ましくは微量滴定ウェルを含む限定されない不溶性の多孔性表面ま たは固体基質；不溶性表面または基質に結合されるべき抗原または抗体を含む試 薬；試験血清：表面に結合した抗原または抗体に特異的に結合して飽和させる異 種抗血清：およびこの分野の熟練【、７た人にζづ２公知である生物げ的に適当 な洗浄％培養および精製試薬を含む試験キットの使用により行なわれても良い。

実施例１ エイズ血漿を実験的に接種したチンパンジーの特異抗体の検出 ３匹のチンパンジー（ＣＨ１３２％Ｃ！４１１４％ＣＨｔ易）にエイズ血漿を、 そして１匹（ＣＨ１４０）　に正常なヒト血漿だけを接種した。各々の動物から 隔週に血ｙを採取し、そして血清をＨＴＬＶ−ｐｉ抗体の標準間接エリザ試験（ （おいて分析した。５以上のＰ／！（値を多くにより陽性の反応性を示すことと みなす。この規準によ＃）４匹全ての動物は、受動的に移動したＨ　Ｔ　Ｌ　Ｖ −ｍ抗体反応性に陽性だった。ＣＨ１１４およびＣＨ２Ｒ３は、エイズ血漿注入 後６ないし８週目に始まるＨ　Ｔ　Ｔ、　Ｖ−ｉｌｌ抗体の活発な製造をも示し た。ヒツジ抗ＨＴ　Ｌ　Ｖ　−ＩＩＩを使用する抗体ブロッキング法を行った場 合には、正常なヒト血漿を注入した動物（ＣＨ１４０）が誤まった陽性反応（免 疫または非免疫ヒツジ抗血清でのブロッキングに相違Ｕ、ない）を示し１、そし てＨＴＬＶ−ＩＩＩに対する抗体には陰性であることが解った。

確認試験は、残りの試料の全てが受動的に移動されたか、または能動的に製造さ れたかのどちらかであるＨＴＬＶ−１ｊ抗体に特異的に陽性であることを示した 。付加的な陽性および陰性のヒト対照血清もまた試験し妥当な予期した結果を得 た（表１）。

表　１ 抗ＨＴＬＶ−ＤＩ血清のヒツジ抗ＨＴＬＶ−１［１層異種抗血清での′ｍ認）゛ ロッキング ０２、ニ−Ｗ嗣−−−−□１−−−―鳴−一部胛−−−−−−−−岬一呻轡−２ ＋＋＋、−一部一一一一一一一−０”０　−−−−螢　−―−エイズ接種後のナ ンバ／ジー１３２ 受動抗体　１＆３１　６．９６ 工イズ接種後のチノパンツ−１１４ 受動抗体　１８．２５　７．８４ 能動抗体　〉２０４．５１ エイズ接種後のチノパンツ−１３３ 受動抗体　１１３４　５．０７ 能動抗体　）２０　１２．１１ 対照物接種後のチノパンツ−１４０ 受動抗体　？、　１６　９．１６ 陽性対照血清　＞２０　９．１６ 陽性対照血清　１１．２５　五３９ 実施例２ 間接的エリザ、ウェスタンブロッティングおよび競合的エリザ法による抗体検出 の感度の比較２つの陽性エイズ血清を正常な陰性血清中に順次５倍に希釈した。

希釈剤として陰性血清の使用は、一定の陰性のバックグラウンドを与えた。各々 の陽性の一組中の陽性抗体の出発濃度がほぼ等しくなる様に条件を調整した。さ らに誤まった陽性の血清が、正常の限界を越えて３倍および１０倍のＩ、Ｇ濃度 を与える正常な陰性ヒトＩ、Ｇを有する正常な陰性血清をスパイキング（ｓｐｉ ｋｉｎｇ）することによシ生じた。表２中の結果は、５よシ大きいＰ／Ｎの普通 の規準を用いて、１ウエスタン＃プロツテイングは標準間接的エリザよりおおよ そ１０倍高感度である一方、本試験は“ウェスタン”ブロッティング法よりおお よそ１０倍高感度であることを示す。′″誤まった陽性″血清は、間接的エリザ 法により陽性と測定されたが、“ウェスタン′プロッティング法およびこの競合 的エリザ法の両方によシ陰性と測定された。

表　２ 間接的エリザ、競合的エリザおよびウェスタンプロット法によるＨ　Ｔ　Ｌ　Ｖ 　−ＩＩＩ抗体検出の感度の比較８１４２１　誤シ＋　１２．（Ｓｏ　＋　１３ ０−−８１４２２　誤り　＋　１五２３＋１７０−−１．１１．１１，１や、１ ２１．７６１７．１．１ｏ、４１１、ユ１．１２．　−喘鴫−胛−――帽−―火 施例、ろ 正常な供血者ｊ？よびエイズ危険性供血者の血清中のＨＴＬＶ−１部抗体の検出 のだめの間接的エリザ、゛ウェスタン″ブロッティングおよび競合的エリザ法の 比較平均＋１５標準偏差以上のＰ／Ｎ　（３以上のＰ、ＩＮ　）のＨＴＬＶ−１ １１抗体反応性ヲ４１する１１’１．Ｌ　Ｙｎの間接的エリザ　スクリーニング により血清を試験した。こｉｌらの試料？、確認されたＨ　Ｔ　Ｔ、　Ｖ−Ｉｌ ｌ蛋白バンドと反応性の血Ｔ＃を離郷するためｉ／（″ウニスタン“ブロクう一 イング法により次に確認した。同じ群の血面金競金的エリザ法金使用して再試験 １．７だ。陰性の正常供血者卦上び陽性の徴候同性愛男性（エイズ−危険性〕の ２種の試験の間には完全な一致があった。さらに゛ウェスタン“プロッティング による疑わしい５人の供血者は、競合的エリザ試験により陽性２人および陰注ぐ 人にわけられた。２４８人の“ウェスタン１プロット陰性エイズ−危険性血清の ２人がわずかに陽性であり、そして１ウエスタン′プロツトにより費ゎしかった １０試料は競合的エリザ試験ｅこより全て陰性だった０表５を参照。

表　３ ウェスタンプロットおよび競合的エリザの比較試験結果：正常供血者および徴候 性同性愛男性ウェスタン　プロット　陰性　３５２　５５２　０　０陽性　ｏ　 ＮＡ　ＮＡ　ＮＡ ？　５　Ｍ　２０ 徴候性同性愛男性 ウェスタン　プロット　陰性　２４８　２４６　０　２陽ｉＪ　６５　０　６５ 　０ ？　１０　１０　０　０ アフリカの供血者の間のｆ（ＴＬＶ−１抗体の分布血清抗体を検出するために間 接的エリザ微量試験が使用された。手短かに、ＨＴＬＶｔ−１を速度ゾーン超遠 心により精製し、破壊しそして微量滴定プレー・トのウェルに被覆した。試験血 清、対照陽性血清および対照陰性ヒト血清の部分（５／Ｊ）　？ｆ−２（１％熱 熱不活化化正常ヤギ血清１００μλ金含ウェル中４℃で一晩培養し、ヒ）　Ｉ、 Ｇに５対するパーオキシダーゼ標識したヤギ抗血清との反応後４９０　ｎｍで吸 光度の測定によυ走部した。正常対照レベルの２倍の吸光度を有する血清を、ス クリ・−ニング試験と同じ手順を含むが試験試料を抗原被覆つｊニルと培養する 前に付加的な２時間の培養期間金倉む確認中和によ、φまず確認した。この特別 な２時間の培養の間中、ウェルをウェル上のＨＴＬＶ抗原部位、と反応し、およ び該部位を飽和させた［−１’、ｌ”ＬＶ−ｉに対する未標識ヒツジ抗体にさら し、この毬に試験血清が引き統〈工程においでウェルに付着することを防止し、 ている。試験の対照として、隣りのウェルを付加的培養期間中正常なヒツジ血清 にさらした。

ヒツジ抗血清を１：２の希釈で使用し、該抗血清は１０へ０００またはそれ以上 の滴定濃度を士し−（いた。微量滴定プレートウェルに被覆された植物凝集素（ ｆ）ＨＡ）−刺激性ヒトリンパ球調製物からの蛋白質と反応性を示すヒツジ抗血 清は、反応性が除去される１でＰ　Ｉ−Ｉ　Ａ　＋）ンバ球調製物に吸収された 。これらの試験で使用されたヒツジ抗血清は％終点に到達するまで３部の体積の 血清あたり１部の体積の細胞当量での吸収を心安とした。

１４ＴＴ、Ｖ−１に対する未標識ヒツジ抗血清ｔ゛乙さらさｉ″Ｌｆｃ試料中の ５０パ一セント以上の吸光度の抑制は、櫓準正常ヒト血清に対して、ＨＴＴ、Ｖ −１に対する抗体が存在する陽性引Ｖ３結果とみなされた。Ｍ’ｉ　Ｆｉ２試験 を誤った血清をＰ　１１　Ａ−刺激性正常ヒ）　ＩＪンバ球から調水した界面活 性剤分離性細胞質ゾルに、」、−よび１−ＩＴＬＶ−１滅生細胞に吸収し、セし てＨＴＬＶ〜Ｉへの結合を再試験１．．２ｆｒ−・つ・イルス陽性および陰性細 胞調製物の間の違いが５０パ一セント以上だった場合には、試料を陽性と測定し た。陽性血清の滴定濃度を連続希釈、滴定白砂の退行分析および同じグレートの ウェル中で試験しｆｃｌ：２０希釈液の参照の陰性対照血清に対して同等の結果 を与える希釈液に溶解することによシ決定した。表ＡＶＣおいて、Ｒは陰性対照 に対する試料の比率である；全ての群はＨの対数−正常分布に従った。

国際調査報告

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. １．抗原被覆ウェルを形成するために、微量滴定プレートを精製抗原で被覆し、 該抗原と反応性の特異的異種抗血清を調製し、該抗原被覆ウエルを該異種抗血清 と共に培養し、試験血清を抗原被覆ウェル中で培養し、そして各ウェルの試験血 清中の抗体の吸収量を試験することを特徴とする試験試料中の抗体の検出方法。
2. ２．抗原が精製ＨＴＬＶ−ＩＩＩ抗原であり、そして異種抗血清が未標識のヒツ ジ抗ＨＴＬＶ−ＩＩＩであることを特徴とする請求の範囲第１項記載の方法。
3. ３．抗原が精製ＨＴＬＶ−Ｉであり、そして異種抗血清がヒツジ抗ＨＴＬＶ−Ｉ であることを特徴とする請求の範囲第１項記載の方法。
4. ４．微量滴定ウェルを精製ＨＴＬＶ−ＩＩＩ抗原で被覆し、該抗原をヒツジ抗Ｈ ＴＬＶ−ＩＩＩと共に培養し、試験血清を該ウェルに添加し、 該ウェルのＨＴＬＶ−ＩＩＩ抗体の存在をスクリーニングすることを特徴とする 試験試料中のＨＴＬＶ−ＩＩＩ抗体の検出方法。
5. ５．微量滴定ウェルを含む不溶性の表面または支持体、該支持体に結合し得る試 薬、 試験血清、 該試薬に特異的に結合し、そして該試薬を飽和させる異種抗血清、および 洗浄、精製および培養試薬からなることを特徴とするイムノアッセイに使用する ための試験キット。
6. ６．微量滴定ウェルを含む不溶性の表面または支持体、該支持体に結合したＨＴ ＬＶ−ＩＩＩ断片、該ＨＴＬＶ−ＩＩＩ断片に特異的に結合する異種抗血清、お よび 試験血清からなることを特徴とするＨＴＬＶ−ＩＩＩ抗体を検出するための試験 キット。