CN116144665A - 核酸适配体在特异性识别冠状病毒中的应用 - Google Patents

核酸适配体在特异性识别冠状病毒中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了核酸适配体在特异性识别冠状病毒中的应用。本发明提供了核酸适配体6.8及其截短序列6.8s在检测新型冠状病毒、制备检测新型冠状病毒的产品中的应用，本发明还提供了一种检测新型冠状病毒的方法。本发明提供的核酸适配体能够特异性结合新型冠状病毒，具有较高的敏感性，应用前景广阔。

Description

核酸适配体在特异性识别冠状病毒中的应用
技术领域
本发明属于生物医药领域，具体涉及核酸适配体在特异性识别冠状病毒中的应用。
背景技术
目前临床上广泛应用的冠状病毒的检测方法是RT-PCR法和血清学鉴定。但RT-PCR法使用场景受限，需要专业人员，配备专业仪器，操作较为繁琐，且耗时较长，无法满足即时、便携、居家的现实要求；血清学检测仅限于卫生医疗机构，不适用于疑似病例的确定、密切接触者的快速筛查等。因此亟需一种特异性高、操作简便、即时、经济的冠状病毒的检测方法以应对目前的形势。
发明内容
为弥补现有技术的不足，本发明提供了核酸适配体6.8在识别病毒中的应用。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明的第一方面提供了一种用于检测冠状病毒的核酸适配体，所述核酸适配体包含如SEQ ID NO.1或2中的任一者中所示的核苷酸序列或其变体或截短形式。
进一步，所述变体包含与如SEQ ID NO.1或2中的任一者中所示的核苷酸序列至少50％同源性的核苷酸序列。
进一步，所述核酸适配体包含SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。
进一步，所述核酸适配体的序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示。
本发明的第二方面提供了一种用于检测冠状病毒的核酸适配体，所述核酸适配体包含以下序列中的任意一种：
（1）与本发明第一方面所示的核酸适配体的核苷酸序列进行杂交的序列；
（2）本发明第一方面所示的核酸适配体的核苷酸序列转录的RNA序列。
进一步，所述核酸适配体包含一个或多个修饰核苷酸，和/或一个或多个取代。
进一步，所述修饰核苷酸在独立地选自核糖位置、脱氧核糖位置、磷酸位置和碱基位置的一个或多个位置处包含化学取代或修饰。
本发明的第三方面提供了一种冠状病毒的核酸适配体缀合物，所述核酸适配体缀合物包含在本发明第一方面、第二方面所述的核酸适配体的核苷酸序列上连接用于标记、检测、诊断或治疗的物质。
进一步，所述用于标记的物质包含酶标记、荧光素标记、同位素标记、生物素标记。
进一步，所述用于标记的物质选自生物素标记。
本发明的第四方面提供了一种冠状病毒的核酸适配体衍生物，所述核酸适配体衍生物包含本发明第一方面、第二方面所述的核酸适配体或本发明第三方面所述的核酸适配体缀合物的核苷酸序列的骨架衍生出的硫代磷酸酯骨架、本发明第一方面、第二方面所述的核酸适配体或本发明第三方面所述的核酸适配体缀合物改造成的相应锁核酸或肽核酸。
本发明的第五方面提供了本发明第一方面、第二方面所述的核酸适配体、本发明第三方面所述的核酸适配体缀合物或本发明第四方面所述的核酸适配体衍生物在富集冠状病毒中的应用。
进一步，所述冠状病毒包括SARS冠状病毒、MERS冠状病毒。
进一步，所述冠状病毒选自SARS冠状病毒。
进一步，所述SARS冠状病毒包括SARS CoV 2冠状病毒和SARS CoV 1冠状病毒。
进一步，所述SARS冠状病毒选自SARS CoV 2冠状病毒。
本发明的第六方面提供了本发明第一方面、第二方面所述的核酸适配体、本发明第三方面所述的核酸适配体缀合物或本发明第四方面所述的核酸适配体衍生物在制备检测冠状病毒的产品中的应用。
进一步，所述产品包含试纸条、试剂盒。
进一步，所述冠状病毒包括SARS冠状病毒、MERS冠状病毒。
进一步，所述冠状病毒选自SARS冠状病毒。
进一步，所述SARS冠状病毒包括SARS CoV 2冠状病毒和SARS CoV 1冠状病毒。
进一步，所述SARS冠状病毒选自SARS CoV 2冠状病毒。
本发明的第七方面提供了本发明第一方面、第二方面所述的核酸适配体、本发明第三方面所述的核酸适配体缀合物或本发明第四方面所述的核酸适配体衍生物在抑制冠状病毒感染或制备治疗冠状病毒肺炎的药物组合物中的应用。
进一步，所述药物组合物还包含药学上可接受的载体。
进一步，所述冠状病毒包括SARS冠状病毒、MERS冠状病毒。
进一步，所述冠状病毒选自SARS冠状病毒。
进一步，所述SARS冠状病毒包括SARS CoV 2冠状病毒和SARS CoV 1冠状病毒。
进一步，所述SARS冠状病毒选自SARS CoV 2冠状病毒。
本发明的第八方面提供了一种检测冠状病毒的方法，所述方法包含将本发明第一方面、第二方面所述的核酸适配体、本发明第三方面所述的核酸适配体缀合物或本发明第四方面所述的核酸适配体衍生物与样品接触，从而检测所述样品中的冠状病毒。
进一步，所述冠状病毒包括SARS冠状病毒、MERS冠状病毒。
进一步，所述冠状病毒选自SARS冠状病毒。
进一步，所述SARS冠状病毒包括SARS CoV 2冠状病毒和SARS CoV 1冠状病毒。
进一步，所述SARS冠状病毒选自SARS CoV 2冠状病毒。
进一步，所述方法为非诊断目的的方法。
本发明的优点和有益效果：
本发明通过ELISA实验及Bli技术证明了核酸适配体6.8及其截短序列6.8s能够特异性识别新冠病毒，且操作简便、迅速，具有广阔的应用前景。
附图说明
图1是ELISA实验中适配体6.8特异性结合新冠病毒图；
图2是ELISA实验中适配体6.8s特异性结合新冠病毒图；
图3是Bli实验中适配体6.8特异性结合新冠病毒图；
图4是适配体6.8与新冠病毒结合的平衡解离常数图。
具体实施方式
下文提供了本说明书中使用的一些术语的定义。除非另有说明，本文中使用的所有技术和科学用语通常具有和本发明所属领域的普通技术人员通常理解的意思相同的意思。
本发明提供了一种用于检测冠状病毒的核酸适配体，所述核酸适配体包含如SEQID NO.1或2中的任一者中所示的核苷酸序列或其变体或截短形式。
所述变体包含与如SEQ ID NO.1或2中的任一者中所示的核苷酸序列至少50％同源性的核苷酸序列。
所述核酸适配体包含SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。
所述核酸适配体的序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示。
在本发明中，冠状病毒是大包膜的正链RNA病毒，分为4个属：α-、β-、γ-和δ冠状病毒。冠状病毒具有所有RNA病毒中最大的基因组（27-32kb），所述基因组包装在被包膜包围的螺旋衣壳内。至少有3种结构蛋白与病毒包膜相关：膜蛋白（M）、包膜蛋白（E）和刺突（糖）蛋白（S）。一些冠状病毒编码血凝素酯酶蛋白（HE）。
其中，冠状病毒包括SARS冠状病毒、MERS冠状病毒。
在本发明的一些实施方案中，冠状病毒选自SARS冠状病毒。
SARS冠状病毒包括SARS-CoV-2冠状病毒和SARS-CoV-1冠状病毒。
在本发明的具体实施方案中，SARS冠状病毒选自SARS-CoV-2冠状病毒。
在本发明中，SARS-CoV-2冠状病毒与新型冠状病毒可以互换使用，SARS-CoV-2冠状病毒包括变体B.1.1.7、B.1525、B.1.351和称为P1的变体。这些变体可以通过刺突蛋白内的突变（例如氨基酸添加、置换和/或缺失）来表征。例如，SARS-CoV-2冠状病毒可能包含在刺突蛋白内具有以下一种或多种突变的任何变体：
1）HV69-70缺失；和/或2）N501Y；和/或3）E484K。
在本发明中，核酸适配体与适配体、适体可互换使用，是指能够特异性结合靶分子的核酸分子。在本发明的实施方案中，核酸适配体只要具有与冠状病毒特异性结合的功能，则其长度没有上限，只要不妨碍核酸适配体功能，则亦可使同序列与不同的碱基序列、核酸适配体连接。但是，考虑到合成的容易度、抗原性的问题等，对于本实施方式中的核酸适配体的长度而言，作为上限，例如为200碱基以下、优选150碱基以下、更优选100碱基以下。
特异性是指本发明涉及的核酸适配体与冠状病毒结合而不结合其它病毒的能力。较之于其他的病毒而言，相对于冠状病毒以至少2倍、至少3倍、至少5倍、至少7倍、优选至少10倍进行结合时，可认为该适配体是特异性的。
在本发明中，核苷酸是指包含糖部分，碱基部分和共价连接的基团（连接基团），如磷酸酯或硫代磷酸酯核苷酸间连接基团的糖苷，并且包括天然存在的核苷酸，如DNA或RNA，和非天然存在的核苷酸，包含修饰的糖和/或碱基部分。
在生物化学领域，通常使用术语“核苷”指包含糖部分和碱基部分的糖苷，并且可以因此在提及核苷酸单元时使用，通过寡核苷酸的核苷酸之间的核苷酸连接共价连接；术语“核苷酸”指核酸单体或单元，并且本身在寡核苷酸的情况下可以指碱基，如“核苷酸序列”，通常是指核碱基序列（即糖骨架和核苷酸间连接的存在是暗含的），在本发明中核苷酸序列与序列可以互换使用。同样，特别是在一种以上核苷间连接基团被修饰的寡核苷酸的情况下，术语“核苷酸”可以是指“核苷”，例如甚至当指定核苷间的连接的存在和性质时，可以使用术语“核苷酸”。
在本发明中，同源性或同一性是指两个核酸适配体之间的序列类似性。同源性和和同一性可各自通过比较，可出于比较目的而比对的各序列中的位置来确定。当所比较的序列中的等效位置由相同碱基占据时，那么分子在那个位置是相同的；当等效位点由相同或类似核酸残基（例如，在空间和/或电子性质方面类似）占据时，那么分子可称为在那个位置是同源的。
在本发明中，截短形式泛指通过核苷酸的缺失而被截短，但仍然具有期望乃至改良的结合特征的核酸适配体。截短形式的长度可根据起始适体的长度而变化，并且如本发明中关于术语核酸适配体所定义。截短形式中的截短可发生在起始适体的固定区或可变区中，或发生在固定区与可变区两者中。
本发明提供了一种用于检测冠状病毒的核酸适配体，所述核酸适配体包含以下序列中的任意一种：
（1）与上述所示的核酸适配体的核苷酸序列进行杂交的序列；
（2）上述所示的核酸适配体的核苷酸序列转录的RNA序列。
在本发明中，杂交是指通过两个单链核酸之间的互补碱基配对形成双链体结构。杂交可以发生在准确互补的核酸链之间或含有低数目错配的互补核酸链之间。
在本发明中，转录是指DNA序列中的遗传密码被转录成RNA的过程。
进一步，所述核酸适配体包含一个或多个修饰核苷酸，和/或一个或多个取代。
所述修饰核苷酸在独立地选自核糖位置、脱氧核糖位置、磷酸位置和碱基位置的一个或多个位置处包含化学取代或修饰。
在本发明中，所述一个或多个（例如1-20个、1-19个、1-18个、1-17个、1-16个、1-15个、1-14个、1-13个、1-12个、1-11个、1-10个、1-9个、1-8个、1-7个、1-6个、1-5个、1-4个、1-3个或1-2个）修饰核苷酸可经聚乙二醇部分或包含多个（例如1-10个、1-9个、1-8个、1-7个、1-6个、1-5个、1-4个、1-3个或1-2个）聚乙二醇部分的接头取代。在一些情况下，接头可以是六乙二醇（H或PEG6）接头。所述核酸适配体的任何核苷酸均可发生这类取代，只要其基本上不影响所述核酸适配体的活性（例如结合活性或抑制活性）和/或功能即可。
所述修饰核苷酸包含一个或多个独立地选自以下的修饰：2'-位置糖修饰、2'-氨基（2'-NH2）修饰、2'-氟（2'-F）修饰、2'-O-甲基（2'-OMe）修饰、2'-O-（2-甲氧基乙基）（2'-O-MOE）修饰、5-位置修饰嘧啶、胞嘧啶环外胺处的修饰、经5'-溴尿嘧啶取代、经5'-溴脱氧尿苷取代、经5'-溴脱氧胞苷取代、骨架修饰、锁核酸（LNA）、甲基化、3'帽和5'帽。
所述5-位置修饰嘧啶选自5-羧基-2'-脱氧尿苷、5-氨基烯丙基-2'-脱氧尿苷、5-[（3-吲哚基）丙酰胺-N-烯丙基]-2'-脱氧尿苷、5-羧基-2'-脱氧胞苷、5-氨基烯丙基-2'-脱氧胞苷、生物素-16-氨基烯丙基-2'-脱氧胞苷、5-（N-苯甲基羧酰胺）-2'-脱氧尿苷、5-（N-异丁基羧酰胺）-2'-脱氧尿苷、5-（N-萘基甲基羧酰胺）-2'-脱氧尿苷和5-（N-色胺基羧酰胺）-2'-脱氧尿苷。
在本发明中，可以使用对复合靶（complex targets）、活细胞或组织使用Cell-SELEX方法、SELEX方法以获得适配体。
其中，SELEX方法是一种从具有10-14个不同核苷酸序列的寡核苷酸池中选择特异性结合靶分子的寡核苷酸的方法。所使用的寡核苷酸具有约40个残基的随机序列，其侧翼为引物序列。此寡核苷酸池被允许与靶分子混合，并且通过使用过滤器等仅收集结合至靶分子的RNA。通过RT-PCR扩增所收集的寡核苷酸，并且将其作为下一循环的模板。通过重复此操作约10次，获得特异性结合靶分子的适配体。通过增加循环数或使用竞争物质，浓缩并选择显示出对靶分子具有更强结合潜力的适配体。因此，通过调整SELEX的循环数和/或改变竞争性条件，能够在某些情况下获得具有不同的结合力或结合模式的适配体以及具有相同的结合力或结合模式但具有不同碱基序列的适配体。SELEX方法包括通过PCR扩增的过程；通过在过程中使用锰离子等造成突变，可能使SELEX具有更高的多样性。
在本发明的具体实施方案中，使用SELEX方法筛选核酸适配体。
本发明提供了一种冠状病毒的核酸适配体衍生物，所述核酸适配体衍生物包括上述核酸适配体的核苷酸序列的骨架衍生出的硫代磷酸酯骨架或上述核酸适配体改造成的相应锁核酸或肽核酸。
在本发明中，硫代磷酸酯骨架是指RNA和DNA核酸适配体的磷酸二酯骨架的非桥键氧原子可以被一个或两个硫原子取代，分别产生具有硫代磷酸酯或二硫代磷酸酯键的硫代磷酸酯骨架。已知这样的硫代磷酸酯骨架具有增加的对其靶标的结合亲和力，以及对核酸酶降解的增强的抗性。
肽核酸或PNA是指是指这样的合成DNA类似物：其中正常的磷酸二酯主链被N-（2-氨基乙基）甘氨酸链或其它可选的氨基酸链替换。它的核苷碱基以相同的AT（U）和G-C方式补充DNA或RNA（Nielsen，等人，Science 254: 1497-1500（1991）；Hanvey，等人，Science258: 1481-1485（1992）；和Egholm , 等人，Nature 365: 566-568（1993））。所述人工主链使PNA对核酸酶具有抗性。
在本发明中指代这样的寡核苷酸：其骨架由通过肽键结合的N-（2-氨基乙基）-甘氨酸重复单元构成，其中不同含氮碱基通过亚甲基键（-CH2-）和羰基（-（C＝O）-）结合于主链。是指含有连接核糖单糖的2'-O和4 '-C原子的亚甲基桥的核酸类似物。
锁核酸或LNA在本发明中是指具有连接2’和4’位碳的桥的化学修饰的之间有RNA核苷酸。这类核苷酸保持了碱基配对的特异性并增加了配对叠加，从而形成具有明显更高熔点的更稳定双螺旋。
本发明提供了上述核酸适配体、上述核酸适配体缀合物或上述核酸适配体衍生物在制备检测冠状病毒的产品中的应用。
所述产品包括试纸条、试剂盒。
在本发明中，试剂盒除包括本发明的核酸适配体外，还可以包括括缓冲液、标记试剂和/或说明书等。
本发明提供了上述核酸适配体、上述核酸适配体缀合物或上述核酸适配体衍生物在抑制冠状病毒感染中的应用。
在本发明中，抑制是指抑制冠状病毒的能力为至少为20%，30%，40%，50%，60%，70%，75%，80%，85%，90%，95%，或更大的总体降低的能力。
本发明提供了上述核酸适配体、上述核酸适配体缀合物或上述核酸适配体衍生物在制备治疗冠状病毒肺炎的药物组合物中的应用。
在本发明中，涉及的抑制冠状病毒感染或治疗冠状病毒肺炎优选的包括核酸适配体的缀合物，更优选的是指核酸适配体的核苷酸序列上连接用于治疗的物质，治疗的物质指具有药用、药理、身心和治疗作用的物质，包括但不限于纳米颗粒、RNA药物、siRNA、合成的或生物学生产的药物。
治疗通常涉及治疗和理疗人或动物（例如，在兽医应用中），其中实现一些期望的治疗效果，例如抑制疾病进展，并包括降低进展率、停止进展率、减轻疾病症状、改善疾病和治愈疾病。也包括作为预防性手段（即，预防）的治疗。例如，术语“治疗”也包括对尚未发生疾病但是有发生疾病的危险的病人的应用。本发明中的治疗是指施用治疗有效量的如本发明公开的核酸适配体、核酸适配体缀合物或核酸适配体衍生物，能够抑制冠状病毒的感染或者减少或抑制冠状病毒肺炎的症状。
治疗有效量涉及当根据期望的治疗方案给药时，对产生一些期望的治疗效果有效，与合理的收益/风险比率匹配的化合物或材料，包含化合物的组合物或剂型的量。本发明的治疗有效量是指核酸适配体、核酸适配体缀合物或核酸适配体衍生物足以减少或抑制冠状病毒的感染和/或冠状病毒肺炎的症状的量。
本发明的药物组合物还包括药学上可接受的载体。
药学上可接受的是指在合理的医学判断的范围内，适合用于与人和动物的组织接触而没有过度的毒性、刺激、过敏反应或其他问题或并发症，与合理的益处/风险比相称的那些化合物、材料、组合物和/或剂型。
药学上可接受的载体包括但不限于稀释剂、粘合剂、表面活性剂、致湿剂、吸附载体、润滑剂、填充剂、崩解剂、赋形剂、助溶剂。
其中，稀释剂包括但不限于乳糖、氯化钠、葡萄糖、尿素、淀粉、水等；粘合剂如淀粉、预胶化淀粉、糊精、麦芽糖糊精、蔗糖、阿拉伯胶、明胶、甲基纤维素、羧甲基纤维素、乙基纤维素、聚乙烯醇、聚乙二醇、聚乙烯比咯烷酮、海藻酸及海藻酸盐、黄原胶、羟丙基纤维素和羟丙基甲基纤维素。
表面活性剂包括但不限于聚氧化乙烯山梨聚糖脂肪酸酯、十二烷基硫酸钠、硬脂酸单甘油酯、十六烷醇。
吸附载体包括但不限于淀粉、乳糖、斑脱土、硅胶、高岭土和皂粘土。
润滑剂包括但不限于硬脂酸锌、单硬脂酸甘油酯、聚乙二醇、滑石粉、硬脂酸钙和镁、聚乙二醇、硼酸粉末、氢化植物油、硬脂富马酸钠、聚氧乙烯单硬脂酸酯、单月桂蔗糖酸酯、月桂醇硫酸钠、月桂醇硫酸镁、十二烷基硫酸镁。
填充剂包括但不限于甘露醇（粒状或粉状）、木糖醇、山梨醇、麦芽糖、赤藓糖、微晶纤维素、聚合糖、偶合糖、葡萄糖、乳糖、蔗糖、糊精、淀粉、海藻酸钠、海带多糖粉末、琼脂粉末、碳酸钙和碳酸氢钠等；崩解剂如交联乙烯吡咯烷酮、羧甲基淀粉钠、低取代羟丙基甲基、交联羧甲基纤维素钠、大豆多糖。
赋形剂包括但不限于单糖、二糖类、环糊精和多糖类这样的糖（具体没有限制，包括葡萄糖、蔗糖、乳糖、棉子糖、甘露醇、山梨糖醇、肌醇、糊精、麦芽糊精、淀粉和纤维素）、金属盐（例如磷酸钠或磷酸钙、硫酸钙、硫酸镁）、柠檬酸、酒石酸、甘氨酸、低/中/高分子量的聚乙二醇（PEG）、普兰尼克（Pluronic）或它们的组合。
助溶剂包括但不限于药学上可接受的无机酸或有机酸、无机碱或有机 碱，也可以是广义的路易斯酸或碱，可以含有一种或者几种，可以是盐酸、磷酸、丙酸、醋酸、乳酸、枸橼酸、酒石酸、硼酸、多羟基羧酸如葡萄糖醛酸、葡萄糖酸、乳糖酸、苹果酸、苏糖酸、 葡庚糖酸、2,5-二羟基苯甲酸、酸式氨基酸，如门冬氨酸、谷氨酸等中的一种或者几种。
本发明所述的药物组合物可口服给药、非胃肠道给药、通过吸入喷雾给药、局部给药、直肠给药、鼻给药、颊给药、阴道给药或通过植入的贮药装置给药。
其中，非胃肠道包括皮下、皮内、静脉内、肌内、关节内、动脉内、滑膜内、胸骨内、鞠内、损伤部位内、和颅内注射或输注技术。只要能达到目标组织，本发明所述药物组合物可以通过任何途径给予受体。
口服给药的剂型包括但不限于固体制剂（包括片剂、丸剂、舌下片剂、胶囊剂、滴剂、锭剂）、颗粒剂、粉剂、散剂、液剂。此外，固体制剂可以根据需要采用实施该领域中公知的包衣的剂型，例如糖衣片、明胶包衣片、肠溶片、薄膜包衣片、双层片、多层片。
本发明的药物组合物的剂型为不会使有效成分失活的形式，只要是在给药后能够在生物体内发挥其药理作用的形式，就没有特别限定。一般是因给药方法和/或处方条件而异。
需要说明的是，上述各剂型的具体形状、大小只要在各剂型中均处于该领域公知的剂型范围内即可，没有特别限定。
本发明的药物组合物还可以以脂质体递送系统的形式施用，例如小单层囊泡、大单层囊泡和多层囊泡。脂质体可以由多种磷脂例如胆固醇、硬脂胺或磷脂酰胆碱构成。
下面结合具体实施例进一步阐述此发明。应理解的是，在此描述的特定实施方式通过举例的方式来表示，并不作为对本发明的限制。在不偏离本发明范围的情况下，本发明的主要特征可以用于各种实施方式。
实施例1核酸适配体特异识别灭活新冠病毒颗粒
1.1 实验材料
灭活新冠病毒颗粒：科兴疫苗公司提供。
1.2实验方法
1.2.1核酸适配体的合成
合成6.8、6.8s和无关对照序列-A20S，通过公司合成使6.8、6.8s和A20s的5’端标记上Bio，具体序列如表1所示。
表 1 适配体序列
Figure SMS_1
1.2.2 ELISA实验
1）将一定量的灭活新冠病毒颗粒（或灭活HINI病毒颗粒）融于pH 9.7的碳酸盐缓冲液中，按照100μl/孔加入到酶联条中，4℃包被过夜；
2）弃包被液，每孔加入100μl含2% BSA封闭液，室温封闭60min；
3）将一定浓度的Bio-6.8和无关对照序列Bio-A20S；或Bio-6.8和其截短序列6.8s溶解于合适体积的缓冲液中（50mM HEPES，100 mM NaCl，2 mM MgCl2，5 mM KCl，1 mMCaCl2），于100℃变性5min后立即置于冰上充分冷却；
4）将经过变性处理后的Bio-6.8和无关对照序列（Bio-A20S文库）；或Bio-6.8和其截短序列6.8s加入酶联条中，使核酸适配体与包被的灭活病毒颗粒共同孵育37℃ 30min；
5）弃去孔内液体，每孔用200μl的洗涤液洗涤，重复洗涤3次，最后一次洗涤后要把孔内液体完全甩干；
6）每孔加入100μl按照1:100稀释好的HRP酶，室温孵育40min，弃去孔内液体，洗板5次，方法同上；
7）每孔加入100μl TMB显色底物，37℃避光显色，当有明显颜色变化时，加10 μl终止液，酶联仪读数。
1.2.3 Bli技术
将100nM Bio标记的适配体6.8溶解于缓冲液中（50mM HEPES，100 mM NaCl，2 mMMgCl2，5 mM KCl，1 mM CaCl2），与带有链霉亲和素蛋白的探针相结合，随后分别与10ug/ml灭活新冠病毒颗粒溶液（上样液溶解）结合，最后用上样液解离。整个上样、结合、解离过程均在分子相互作用仪中进行。
1.2.4平衡解离常数（KD值）的测定
灭活新冠病毒颗粒包被在微孔板中（1ug/孔），将生物素标记的适配体6.8配制成浓度为0.78nM，1.56nM，3.125nM，6.25nM，12.5nM，25nM和100nM，随后分别加入至包被了SARS-CoV2病毒颗粒的孔中结合，根据OD450nm吸光度值绘制曲线。
1.3实验结果
结果如图1所示，ELISA实验证明6.8特异识别灭活新冠病毒颗粒，而不结合其它灭活病毒颗粒（HINI病毒）；6.8s特异识别灭活新冠病毒颗粒（图2）。
Bli技术证明6.8特异识别灭活新冠病毒颗粒（图3）。
6.8与灭活新冠病毒颗粒结合的平衡解离常数KD值，约为20.9nM（图4），相关数值如表2所示。
表 2 平衡解离常数计算数值
Figure SMS_2
上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。

Claims (10)

1.一种用于检测冠状病毒的核酸适配体，其特征在于，所述核酸适配体包含如SEQ IDNO.1或2中的任一者中所示的核苷酸序列或其变体或截短形式；
优选的，所述变体包含与如SEQ ID NO.1或2中的任一者中所示的核苷酸序列至少50％同源性的核苷酸序列；
优选的，所述核酸适配体包含SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列；
优选的，所述核酸适配体的序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示。
2.一种用于检测冠状病毒的核酸适配体，其特征在于，所述核酸适配体包含以下序列中的任意一种：
(1)与权利要求1所示的核酸适配体的核苷酸序列进行杂交的序列；
(2)权利要求1所示的核酸适配体的核苷酸序列转录的RNA序列。
3.根据权利要求1或2所述的核酸适配体，其特征在于，所述核酸适配体包含一个或多个修饰核苷酸，和/或一个或多个取代；
优选的，所述修饰核苷酸在独立地选自核糖位置、脱氧核糖位置、磷酸位置和碱基位置的一个或多个位置处包含化学取代或修饰。
4.一种冠状病毒的核酸适配体缀合物，其特征在于，所述核酸适配体缀合物包含在权利要求1-3任一项所述的核酸适配体的核苷酸序列上连接用于标记、检测、诊断或治疗的物质；
优选的，所述用于标记的物质包含酶标记、荧光素标记、同位素标记、生物素标记；
优选的，所述用于标记的物质选自生物素标记。
5.一种冠状病毒的核酸适配体衍生物，其特征在于，所述核酸适配体衍生物包含权利要求1-3任一项所述的核酸适配体或权利要求4所述的核酸适配体缀合物的核苷酸序列的骨架衍生出的硫代磷酸酯骨架、权利要求1-3任一项所述的核酸适配体或权利要求4所述的核酸适配体缀合物改造成的相应锁核酸或肽核酸。
6.权利要求1-3任一项所述的核酸适配体、权利要求4所述的核酸适配体缀合物或权利要求5所述的核酸适配体衍生物在富集冠状病毒中的应用；
优选的，所述冠状病毒包括SARS冠状病毒、MERS冠状病毒；
优选的，所述冠状病毒选自SARS冠状病毒；
优选的，所述SARS冠状病毒包括SARS-CoV-2冠状病毒和SARS-CoV-1冠状病毒；
优选的，所述SARS冠状病毒选自SARS-CoV-2冠状病毒。
7.权利要求1-3任一项所述的核酸适配体、权利要求4所述的核酸适配体缀合物或权利要求5所述的核酸适配体衍生物在制备检测冠状病毒的产品中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述产品包含试纸条、试剂盒；
优选的，所述冠状病毒包括SARS冠状病毒、MERS冠状病毒；
优选的，所述冠状病毒选自SARS冠状病毒；
优选的，所述SARS冠状病毒包括SARS-CoV-2冠状病毒和SARS-CoV-1冠状病毒；
优选的，所述SARS冠状病毒选自SARS-CoV-2冠状病毒。
9.权利要求1-3任一项所述的核酸适配体、权利要求4所述的核酸适配体缀合物或权利要求5所述的核酸适配体衍生物在抑制冠状病毒感染或制备治疗冠状病毒肺炎的药物组合物中的应用；
优选的，所述药物组合物还包含药学上可接受的载体；
优选的，所述冠状病毒包括SARS冠状病毒、MERS冠状病毒；
优选的，所述冠状病毒选自SARS冠状病毒；
优选的，所述SARS冠状病毒包括SARS-CoV-2冠状病毒和SARS-CoV-1冠状病毒；
优选的，所述SARS冠状病毒选自SARS-CoV-2冠状病毒。
10.一种检测冠状病毒的方法，其特征在于，所述方法包含将权利要求1-3任一项所述的核酸适配体、权利要求4所述的核酸适配体缀合物或权利要求5所述的核酸适配体衍生物与样品接触，从而检测所述样品中的冠状病毒；
优选的，所述冠状病毒包括SARS冠状病毒、MERS冠状病毒；
优选的，所述冠状病毒选自SARS冠状病毒；
优选的，所述SARS冠状病毒包括SARS-CoV-2冠状病毒和SARS-CoV-1冠状病毒；
优选的，所述SARS冠状病毒选自SARS-CoV-2冠状病毒。
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