CN113061610A - 结合新型冠状病毒（SARS-CoV-2）棘突蛋白S1亚基的核酸适配体及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明提供由SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示的结合新型冠状病毒(SARS‑CoV‑2)棘突蛋白(Spike蛋白，简称S蛋白)的S1亚基(也称为S1蛋白)的核酸适配体及其用途。具体地，本发明的核酸适配体及其衍生物具有能够快速化学合成、分子量小、稳定、易于保存和标记等优点，可以用于检测、诊断、成像以及治疗等方面。

Description

结合新型冠状病毒(SARS-CoV-2)棘突蛋白S1亚基的核酸适配 体及其用途
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种由SEQ ID NO:1或2所示的 可用于结合新型冠状病毒(SARS-CoV-2)棘突蛋白(Spike protein of SARS-CoV-2)的S1亚基(也称S1蛋白)的核酸适配体及其用途。
背景技术
冠状病毒(Coronavirus)是具有外套膜的正链单股RNA病毒，是感 染人和脊椎动物的病原体，可引起多种急慢性疾病。到目前为止，能够使 人类致病的冠状病毒一共有7种，包括SARS冠状病毒和MERS冠状病毒 等。
2020年1月12日，世界卫生组织命名了“2019新型冠状病毒 (2019-nCoV)”，其后在2月11-12日国际病毒分类委员会(International Committee on Taxonomy of Viruses,ICTV)宣布，新型冠状病毒的正式分类 名为严重急性呼吸综合征冠状病毒2(severe acuterespiratory syndrome coronavirus 2，SARS-CoV-2)，世界卫生组织(WHO)同日在日内瓦举办 全球研究和创新论坛上宣布，由这一病毒导致的疾病的正式名称为 “COVID-19”。几种命名均表示同一种，以下以SARS-CoV-2作为新型 冠状病毒简称。SARS-CoV-2可以人传人，对比SARS冠状病毒， SARS-CoV-2致死率低，但传播较快，感染者会出现急性、严重呼吸道疾 病，伴有发热、咳嗽、气短及呼吸困难，严重的病例还会出现肾功能衰竭 和死亡，当前并无有效的治疗药物。SARS-CoV-2的检测方法目前也并不 完善，需依赖特定仪器、特殊实验室和专业技术人员，且检测过程复杂， 不能满足及时检测需求，且存在一定的漏检率。而且SARS-CoV-2由于潜 伏期具有传染性，为了排查很多无症状感染者，迫切需要发展现场、实时、 便捷的家庭检测方法。
研究发现，新型冠状病毒(SARS-CoV-2)进入细胞的受体为ACE2 【参考文献：Zhouet al.DisCoVery of a novel coronavirus associated with the recent pneumoniaoutbreak in humans and its potential bat origin.bioRxiv. 2020】。在分子水平上，冠状病毒的棘突蛋白(Spike protein，简称为S 蛋白)在病毒与受体结合中发挥着重要的作用，S蛋白介导受体结合和膜 融合。S蛋白包含两个亚基，分别是S1和S2，Spike-S1包括有受体结合 区(RBD)，冠状病毒正是通过RBD区与细胞表面受体ACE2结合来感 染细胞，S2亚基是S蛋白结构的“主干”，它包含病毒与膜融合所需的 其它基本元素。目前针对新冠状病毒(SARS-CoV-2)引起的肺炎，相应 的疫苗、小分子药物甚至抗体药物都在开发中。不管是小分子药物、疫苗 或抗体的开发周期都较长，而筛选得到的新型冠状病毒S1蛋白的核酸适配体既可以用于快速建立有效的检测方法，也可能用于新冠肺炎的治疗。
核酸适配体(aptamer)是指通过指数富集的配基系统进化技术(SELEX) 筛选分离得到的DNA或者RNA分子，它可以与其他靶标如蛋白质、金属 离子、小分子、多肽甚至整个细胞进行高亲和力和特异性的结合，因此在 生化分析，环境监测，基础医学，新药合成等方面展示广阔的前景。核酸 适配体与抗体相比分子量小，稳定性更好，易改造修饰，无免疫原性，制 作周期短，可以通过人工合成等优势，免去了动物免疫、饲养、蛋白提取 和纯化等一系列流程。基于核酸适配体的性质，新型冠状病毒 (SARS-CoV-2)的S1蛋白的核酸适配体会具有结构相对稳定，简单，易 于修饰以及短期内可以人工合成的优势。因此，本领域对具有针对新型冠 状病毒(SARS-CoV-2)的S1蛋白的结合亲和力高的核酸适配体存在迫切 需求。
发明内容
为了克服现有技术的不足，本发明要解决的问题是提供一种分子量小、 化学性质稳定、易于保存和标记的能够以高亲和力结合新型冠状病毒 (SARS-CoV-2)棘突蛋白的核酸适配体及其衍生物，还相应提供所述核 酸适配体的用途。
为了解决上述技术问题，发明人使用体外指数富集的配基系统进化 (SELEX)技术，筛选得到了以高亲和力结合新型冠状病毒(SARS-CoV-2) 棘突蛋白S1的核酸适配体。具体的，本发明人设计并合成了一个随机单 链DNA文库和相应的引物，用来筛选具有分子量小、化学性质稳定、易 于保存和标记的能够以高亲和力结合新型冠状病毒(SARS-CoV-2)棘突 蛋白S1蛋白的核酸适配体，由此筛选得到一些高亲和力结合新型冠状病 毒(SARS-CoV-2)的S1蛋白的核酸适配体，并检测了它们与新型冠状病 毒(SARS-CoV-2)的S1蛋白以及SARS冠状病毒的RBD蛋白(简称为 SARS-RBD蛋白)的结合能力。在此基础上，本发明人完成了本发明。
在一个方面，本发明提供结合新型冠状病毒(SARS-CoV-2)的S1蛋 白的核酸适配体，所述核酸适配体包含以下序列或由以下序列组成：
(1)SEQ ID NO:1-2中任一个所示核苷酸序列，这些序列分别对应核 酸适配体：nCoV-S1-79-27nt，nCoV-S1-268-24nt，
SEQ ID NO:1(nCoV-S1-79-27nt):
GTCTTGCGGGGCGGCGGGTTGAGAGGA
SEQ ID NO:2(nCoV-S1-268-24nt):
GGGGTGGGGTAGTGGTATGGAGCG
(2)与SEQ ID NO:1-2中任一个所示的核苷酸序列具有至少60％、至少 70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少94％、至少96％、 至少98％或至少99％的同源性且结合新型冠状病毒(SARS-CoV-2)的S1 蛋白的核苷酸序列，例如可将SEQ ID NO:1-2中的任一个所示的核苷酸序 列删除部分序列或增加部分序列；或
(3)由(1)或(2)的核苷酸序列转录且结合新型冠状病毒(SARS-CoV-2) 的S1蛋白的RNA序列。
另外，本领域技术人员应该理解，作为对上述技术方案的改进，可对 上述核酸适配体的核苷酸序列上的某一位置进行修饰，例如，磷酸化、甲 基化、氨基化、巯基化、用硫取代氧、用硒取代氧或同位素化等，条件是 这样修饰后得到的核酸适配体序列具有合乎需要的性质，例如，可以具有 与修饰前的母体核酸适配体序列相等或更高的结合新型冠状病毒(SARS-CoV-2)S1蛋白的亲和力，或虽然亲和力没有明显提升但是具有 更高的稳定性。
所以，在一些实施方案中，所述核酸适配体的核苷酸序列被修饰且修 饰后的核酸适配体特异性结合新型冠状病毒(SARS-CoV-2)的S1蛋白， 所述修饰选自磷酸化、甲基化、氨基化、巯基化、用硫取代氧、用硒取代 氧和同位素化中的至少一种。
在另一方面，本发明还提供核酸适配体的缀合物。本领域技术人员应 该理解，作为对上述技术方案的改进，可在上述核酸适配体的核苷酸序列 上连接荧光物质例如FAM、放射性物质、治疗性物质、生物素、地高辛、 纳米发光材料、小肽、siRNA或酶标记等中的至少一种，条件是这样修饰 后得到的核酸适配体序列具有合乎需要的性质，例如，可以具有与修饰前 的母体核酸适配体序列相等或更高的结合新型冠状病毒(SARS-CoV-2) S1蛋白的亲和力，或虽然亲和力没有明显提升但是具有更高的稳定性。
换言之，以上不论是经部分取代或经过修饰后的核酸适配体，都具有 原核酸适配体基本相同或类似的分子结构、理化性质和功能，都可应用于 与新型冠状病毒(SARS-CoV-2)的S1蛋白的结合。
因此，本发明提供核酸适配体的缀合物，其特征在于其为在根据前述 任一项所述核酸适配体的核苷酸序列上连接用于标记、检测、诊断或治疗 的物质，且连接所述物质后的所述核酸适配体的缀合物特异性结合新型冠 状病毒(SARS-CoV-2)的S1蛋白，所述物质是荧光标记物例如FAM、 放射性物质、治疗性物质、生物素、地高辛、纳米发光材料、小肽、siRNA 和酶标记中的至少一种。
此外，作为一个总的技术构思，本发明还提供核酸适配体衍生物，所 述衍生物是由前述任一项技术方案中所述核酸适配体的核苷酸序列的骨 架改造成结合新型冠状病毒(SARS-CoV-2)的S1蛋白的硫代磷酸酯骨架 而得，或者是前述任一项技术方案中所述核酸适配体或核酸适配体的缀合 物改造成的结合新型冠状病毒(SARS-CoV-2)S1蛋白的肽核酸。条件是 所述衍生物都具有与原核酸适配体基本相同或类似的分子结构、理化性质 和功能，且都与新型冠状病毒(SARS-CoV-2)S1蛋白结合。
本发明所使用的术语“硫代磷酸酯骨架”具有本领域普通技术人员一 般理解的含义，其是指RNA和DNA核酸适配体的磷酸二酯骨架的非桥键 氧原子可以被一个或两个硫原子取代，分别产生具有硫代磷酸酯或二硫代 磷酸酯键的硫代磷酸酯骨架。已知这样的硫代磷酸酯骨架具有增加的对其 靶标的结合亲和力，以及对核酸酶降解的增强的抗性。
本发明所使用的术语“肽核酸”具有本领域普通技术人员一般理解的 含义，其是指一种人工合成DNA分子类似物，于1991年由Nielsen等首 次报道。用N-2-(氨乙基)-甘氨酸(N-(2-aminoethyl)-glycine)单位代替糖- 磷酸酯骨架作为重复结构单元，合成了以肽键连接的寡核苷酸模拟物，称 为肽核酸。由于肽核酸(PNA)没有如DNA或RNA上的磷酸基团，因此 PNA与DNA之间缺乏电性相斥的现象，使两者之间的结合强度大于DNA 与DNA之间的结合强度。
Figure BDA0002996323950000051
在另一方面，本发明提供前述核酸适配体、其缀合物或其衍生物在由 以下各项组成的组中的任意一项中的用途：
1)定量或定性检测SARS-CoV-2的S1蛋白或RBD蛋白；
2)纯化SARS-CoV-2的RBD蛋白、S1蛋白或Spike蛋白；
3)SARS-CoV-2的S1蛋白或Spike蛋白的成像；
4)结合SARS-CoV-2并将其富集；
5)作为SARS-CoV-2的S1蛋白或Spike蛋白的抑制剂；
6)制备阻断SARS-CoV-2的S1蛋白或Spike蛋白与ACE2蛋白结合 的制剂；
7)制备靶向到SARS-CoV-2Spike-S1蛋白或Spike蛋白的药物；
8)制备用于诊断和治疗SARS-CoV-2感染的肺炎的试剂或药物。
本发明的核酸适配体还能够结合SARS冠状病毒的RBD蛋白，所以 本发明提供前述核酸适配体、其缀合物或其衍生物在由以下各项组成的组 中的任意一项中的用途：
9)定量或定性检测SARS冠状病毒的RBD蛋白；
10)纯化SARS冠状病毒的RBD蛋白；
11)结合SARS冠状病毒并将其富集；
12)作为SARS冠状病毒的RBD蛋白的抑制剂；
13)制备阻断SARS冠状病毒的RBD蛋白与ACE2受体结合的制剂；
14)制备用于诊断或治疗SARS冠状病毒感染的肺炎的试剂或药物。
本发明的核酸适配体还能够结合MERS冠状病毒的RBD蛋白，所以 本发明提供前述核酸适配体、其缀合物或其衍生物在由以下各项组成的组 中的任意一项中的用途：
15)定量或定性检测MERS冠状病毒的RBD蛋白；
16)纯化MERS冠状病毒的RBD蛋白；
17)结合MERS冠状病毒并将其富集；
18)作为MERS冠状病毒的RBD蛋白的抑制剂；
19)制备阻断MERS冠状病毒的RBD蛋白与ACE2受体结合的制剂；
20)制备用于诊断或治疗MERS冠状病毒感染的肺炎的试剂或药物。
在另一个实施方案中，由于本发明的两个适配体结合在SARS-CoV-2 的S1蛋白的不同位置，所以本发明还提供提供前述核酸适配体、其缀合 物或其衍生物在
21)开发用于检测SARS-CoV-2的S1蛋白的方法，如夹心法(优选夹 心ELISA法)中的用途。
本文所使用的，“夹心法”是指通过两个适配体结合同一蛋白的不同 位置来进行检测，例如但不限于夹心ELISA法。在本发明的一个实施方案 中的筛选结合新型冠状病毒SARS-CoV-2S1蛋白的核酸适配体的方法是 在SELEX筛选方法的基础上，在磁珠法筛选的步骤进一步在结合缓冲液 中使用了高血清浓度梯度。
核酸适配体筛选常规条件是在离子缓冲液中进行，而在筛选条件下逐 步添加一定浓度的血清，一方面因为血清中含有丰富的蛋白，可以与磁珠 表面的蛋白竞争性的与文库结合，从而去除那些与靶标S1蛋白结合能力 很弱或者只是吸附上的序列。另一方面，适配体在血清环境中结合靶标， 可以更好的满足后期基于核酸适配体开发的应用的实际检测环境。
在另一方面，本发明提供试剂盒，所述试剂盒包含前述核酸适配体、 其缀合物或其衍生物；优选地，所述试剂盒包含SEQ ID NO:1-2所示的任 意一个或两个核酸适配体、其缀合物或其衍生物；更优选地，所述试剂盒 包含SEQ ID NO:1-2所示的任意一个或两个核酸适配体。
在另一方面，上述任一项的核酸适配体或上述核酸适配体的缀合物或 上述核酸适配体的衍生物在制备试剂盒中的用途。
本发明的有益效果在于：本发明所提供的核酸适配体、其缀合物及其 衍生物能够以较高的亲和力结合新型冠状病毒(SARS-CoV-2)的S1蛋白、 SARS冠状病毒的RBD蛋白以及MERS冠状病毒的RBD蛋白，且分子量 小、化学性质稳定、易于保存和标记。
附图说明
图1显示利用表面等离子共振(SPR)检测本发明实施例1筛选得到 的富集文库与靶标S1蛋白结合情况。
图2利用表面等离子共振(SPR)检测本发明实施例1筛选得到的核 酸适配体与新型冠状病毒(SARS-CoV-2)S1蛋白的亲和力。
图3利用表面等离子共振(SPR)检测了本发明实施例1筛选的两种 适配体可以结合SARS-RBD蛋白，且这两种核酸适配体不与his小肽以及 BSA蛋白结合。
图4显示本发明实施例1中的2种核酸适配体结合在SARS-CoV-2S1 蛋白的不同位点。
图5显示本发明实施例1中的2种核酸适配体可以阻断SARS-RBD 蛋白与ACE2蛋白的结合。
图6显示利用斑点杂交的方法，证明了本发明中的生物素修饰的适配 体可以用来检测新型冠状病毒S1蛋白和SARS-RBD蛋白的浓度。
具体实施方式
下面参照具体的实施例进一步描述本发明，但是本领域技术人员应该 理解，以下的实施例便于更好的理解本发明，本发明并不限于这些具体的 实施例。
以下实施例中的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例 中所用的实验材料如无特殊说明，均为常规生化试剂，可通过商业途径购 买得到。
实施例1：结合新型冠状病毒(SARS-CoV-2)的S1蛋白的ssDNA 核酸适配体的筛选
1、合成以下序列所示的随机单链DNA文库和引物：
随机单链DNA文库：
SEQ ID NO:3：5’-TCCAGCACTCCACGCATAAC-36N-GTTATGCG TGCGACGGTGAA-3’
其中，“36N”表示36个任意的核苷酸碱基连接而成的序列。该文库 由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。
引物信息如表1，由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。
表1引物及其序列
Figure BDA0002996323950000081
其中，引物名称中的S代表正向引物，引物名称中A代表反向引物， 序列中的19个A表示由19个腺苷酸(A)组成的polyA尾，“Spacer 18” 表示18原子的六乙二醇间臂。在上述3’端引物中所用的“Spacer 18”结 构式如下式所示。
Figure BDA0002996323950000082
引物分别用PBS缓冲液(氯化钙0.1g/L，氯化钾0.2g/L，磷酸二氢钾 0.2g/L，六水氯化镁0.1g/L，氯化钠8g/L，十二水磷酸氢二钠2.8915g/L； PH7.4，25℃)配制成100μM的贮存液，于-20℃保存备用。
2、磁珠法筛选
采用磁珠法筛选，共计筛选5轮，每一轮的筛选流程见表2。
表2新型冠状病毒棘突蛋白适配体筛选流程
轮数 反筛 缓冲溶液
第一轮 偶联his的磁珠 PBS缓冲液
第二轮 偶联his的磁珠 PBS缓冲液
第三轮 偶联his的磁珠 PBS缓冲液；5％血清
第四轮 偶联his的磁珠 PBS缓冲液；10％血清
第五轮 偶联his的磁珠 PBS缓冲液；30％血清
具体筛选方法如下：
1)羧基磁珠固定新型冠状病毒S1蛋白
取50μl羧基磁珠(Invitrogen，DynabeadsTM MyOneTM Carboxylic Acid， #65012)，用200μl超纯水清洗4遍，磁铁垂钓磁珠，去上清。取配置好 的NHS(N-羟基琥珀酰亚胺；0.1M水溶液)和EDC(1-(3-二甲氨基丙基)-3- 乙基碳二亚胺盐酸盐；0.4M水溶液)各100μL，等体积混合，加入到磁珠 中，25℃孵育20分钟活化磁珠表面的羧基，磁珠用PBS缓冲液清洗2遍 后备用。
取20μl的新型冠状病毒(SARS-CoV-2)S1蛋白(购自义翘神州， 40591-VO8H，浓度为0.87mg/ml)，加入pH3.6的10mM醋酸钠80μl混 匀，加入到上述的活化磁珠中。25℃置于垂直混合仪上孵育60分钟，新 型冠状病毒S1蛋白通过蛋白表面的氨基偶联到磁珠表面。
偶联结束，将偶联管置于磁力架上，吸弃上清，取100μl 1M乙醇胺 pH8.5加入到磁珠中，25℃垂直混合仪上孵育10分钟，封闭磁珠表面未 反应的活化位点。置于磁力架上，吸弃封闭液。磁珠用200μl PBS清洗4 遍，标记为MB-S1。
2)反筛与筛选
反筛磁珠制备：将his小肽与磁珠偶联，his小肽由杭州丹港生物科技 有限公司合成，为9个连续的组氨酸，偶联his蛋白的步骤与偶联新型冠 状病毒S1蛋白相同。His小肽的浓度为10mM，用pH4.0的10mM NaAC 溶液稀释，具体的，取20μl his小肽，加入80μl pH4.0的10mM NaAC溶 液混匀。其余步骤一样。偶联完的磁珠标记为MB-his。
文库溶解与变复性处理：取1 OD随机单链核苷酸文库，14000rpm离 心10分钟，将文库离心到管底，用PBS缓冲液溶解至10μM，混匀后分 装到PCR管进行变复性处理。处理过程如下：PCR仪设定程序95℃保持 10分钟，此步骤目的是使折叠的链解开，然后4℃保持5分钟，然后平衡 至室温。将处理后的文库加入到50μl的MB-his磁珠，混匀后在垂直混合 仪上室温孵育一段时间。置于磁力架上，收集上清，标记为pool-，上清 作为单链核酸文库与MB-S1磁珠进行正筛。每一轮磁珠筛选，在进行以 新型冠状病毒S1蛋白为靶标的正筛之前都先用MB-his进行反筛，反筛上 清作为单链核苷酸文库与MB-S1磁珠进行正筛。具体的为：将反筛后的 文库pool-加入到50μl MB-S1磁珠中，在垂直混合仪上25℃孵育40分钟。 置于磁力架上，吸弃上清，保留磁珠，用200μl PBS清洗磁珠4次。最后 在清洗后的磁珠中加入200μlPBS，沸水浴10分钟，收集上清，标记为 elution-S1。
以elution-S1中的核酸分子为模板，用乳浊液PCR(ePCR)进行扩增。 方法如下：将全部模板elution-S1加入2ml PCR mix中混匀，加入4倍体 积的ePCR微液滴生成油，涡旋5分钟制备乳浊液。将乳浊液分成100μl/ 管加入到PCR管中，扩增条件如下：95℃预变性2分钟，95℃变性60秒， 60℃退火60秒，72℃延伸60秒，共25个循环，4℃保存。ePCR微液 滴生成油以及PCR mix购自安徽省昂普拓迈(Aptamy)生物科技有限公司， 货号分别为EPO100和ESE2018。
扩增产物用正丁醇纯化：收集所有的ePCR产物于15ml尖底离心管 中，加入2倍体积的正丁醇，在旋涡混合器上震荡以充分混匀；台式离心 机，9000rpm(转/分钟)于25℃离心10分钟；移弃上相(正丁醇)，得 到浓缩的PCR扩增产物，按体积比1：1加入TBE/尿素变性缓冲液，煮沸 变性10分钟使DNA变性，随后冰浴1分钟，将所有的样品进行尿素变性 聚丙烯酰胺凝胶电泳，400V电压下电泳至溴酚蓝到达胶底部，使带荧光 的FAM标记的正义链与反向的加长的链分开，7M尿素变性聚丙烯酰胺凝 胶配方如下表3。
表3变性聚丙烯酰胺凝胶配方
成分 用量
尿素 3.78g
40％聚丙烯酰胺 1.8ml
5*TBE 1.8ml
ddH2O 2.25ml
10％APS 60μl
TEMED 15μl
切胶回收FAM标记的链：将凝胶取出放在塑料膜上，Ex(nm)：495， Em(nm)：517，检测我们需要的带有FAM标记的ssDNA；用干净的刀片 将目的条带直接切下，将胶条转移至1.5mlEP管中并捣碎，加入1ml ddH2O 后沸水浴10分钟将胶中的ssDNA转移至溶液中，离心去除胶的碎片，留 上清。上清用正丁醇纯化，得到DNA单链用3KD的透析袋透析过夜，即 可作为下一轮筛选的文库；
磁珠法重复筛选5轮，每次操作均以前一次操作中得到的次级文库为 起始核酸文库，文库进行变复性处理之后，与MB-S1磁珠进行孵育。筛 选过程中用SPR检测DNA单链文库对SARS-CoV-2S1蛋白识别能力的变 化，当DNA单链文库对SARS-CoV-2S1蛋白的识别能力满足要求，即筛 选后的DNA单链文库与靶标蛋白的结合能力高于筛选起始投入的文库 (图1)，图中文库0，文库3，文库5分别表示初始文库、第3轮和第5 轮筛选得到的文库，可以看出第五轮得到的文库比第3轮与靶标的亲和力 高，且文库3比文库0高很多，满足测序要求，将所得文库经高通量测序 分析。
3、分析和鉴定筛选后得到的核酸适配体：将得到的富集文库产物经 高通量测序分析后，挑选若干条序列由通用生物系统(安徽)有限公司合 成，并检测亲和力。
在后续检测中，确定了2条序列具有很强的结合能力，将2条序列进 行截短之后分别得到了SEQ ID NO:1或2所示的核酸适配体，且验证后具 有理想的结合SARS-CoV-2S1的亲和力，将它们分别命名为 nCoV-S1-79-27nt和nCoV-S1-268-24nt。
实施例2：表面等离子共振(SPR)检测SARS-CoV-2S1蛋白核酸适 配体nCoV-S1-79-27nt和nCoV-S1-268-24nt与SARS-CoV-2S1蛋白的亲 和力
委托通用生物合成核酸适配体nCoV-S1-79-27nt和nCoV-S1-268-24nt， 将其分别用DPBS缓冲液稀释成500nM。
1.将SARS-CoV-2S1蛋白偶联到CM5芯片表面的第2通道，具体方法如 下：先用50mMNaOH清洗芯片，进样20μl，流速10μl/分钟，然后用将 等体积的EDC(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐；0.4M水溶液) 和NHS(N-羟基琥珀酰亚胺；0.1M水溶液)两个试剂混合后进样50μl活化 芯片，流速5μl/分钟。将SARS-CoV-2S1蛋白用pH4.5的10mM醋酸钠稀 释至终浓度为50μg/mL后进样，进样体积50μL，流速5μL/分钟， SARS-CoV-2S1蛋白偶联量为9000Ru。进样完成后，进乙醇胺封闭芯片， 流速5μL/分钟，进样50μL。第1通道按照上述处理，只是不进行偶联蛋 白的步骤，活化和封闭的步骤完全一样，作为对照通道。
2.检测：使用表面等离子共振仪(GE Healthcare，型号：Biacore T200)设 定检测参数，步骤1中稀释好的2种适配体样品依次流过1、2、3、4通 道，每一个适配体的程序如下：进样30μL/分钟，时间3分钟，解离30μL/ 分钟，时间2分钟，再生1M NaCl 30μL/分钟，时间1分钟，将稀释好的 2种核酸适配体依次进样。
适配体与SARS-CoV-2S1蛋白的亲和力检测数据见图2，每一条曲线 是通道2差减通道1之后的曲线，KD值分别如下表4所示，说明了对应 的核酸适配体与靶标蛋白S1蛋白的结合能力。这些数据说明核酸适配体 nCoV-S1-79-27nt和nCoV-S1-268-24nt用SPR仪均检测到与SARS-CoV-2 S1蛋白有很强的结合。
表4
Figure BDA0002996323950000121
Figure BDA0002996323950000131
实施例3：表面等离子共振(SPR)检测核酸适配体nCoV-S1-79-27nt 和nCoV-S1-268-24nt与SARS冠状病毒的RBD蛋白的亲和力
与实施例2中将Spike-S1蛋白固定到SPR芯片进行测试的方法相同。 将SARS-RBD蛋白(义翘神州，40150-V08B2)偶联到芯片表面的4通道， 偶联量为6000RU；将his小肽(杭州丹港生物科技有限公司)偶联到第3 通道，偶联量为500RU。将BSA蛋白偶联到2通道，偶联量为4000RU， 1通道与实施例2中的对照通道一样处理，作为对照通道。使用表面等离 子共振仪(GE Healthcare，型号：Biacore T200)设定检测参数，将实施例2 步骤1中稀释好的2种适配体样品依次进样，每种依次流过1、2、3、4 通道，每一个适配体的程序如下：进样30μL/分钟，时间3分钟，解离30μL/ 分钟，时间2分钟，再生1M NaCl 30μL/分钟，时间1分钟。
适配体nCoV-S1-79-27nt和nCoV-S1-268-24nt与SARS冠状病毒的 RBD蛋白结合的亲和力检测数据见图3，KD值分别如下表5所示，这些 数据说明核酸适配体nCoV-S1-79-27nt和nCoV-S1-268-24nt用SPR仪均检 测到与SARS冠状病毒的RBD蛋白有很强的结合，而与对照蛋白his以及 BSA没有结合或者结合很弱。说明实施例1筛选所得的2种核酸适配体，既能和SARS-CoV-2的Spike-S1蛋白结合，也能和SARS-RBD结合。
表5
核酸适配体 与SARS冠状病毒RBD蛋白亲和力KD(nM)
SEQ ID NO:1(nCoV-S1-79-27nt): 5.59
SEQ ID NO:2(nCoV-S1-268-24nt): 5.43
实施例4：利用表面等离子共振(SPR)检测本发明实施例1筛选得 到的2种核酸适配体与SARS-CoV-2的S1蛋白的结合位点的结合情况
利用表面等离子共振(SPR)，使用实施例2步骤1中得到的芯片， 将实施例2中通用生物合成的2条核酸适配体分别稀释到500nM。适配体 1结合区：将nCoV-S1-79-27nt进样5分钟，解离3分钟，流速为30ul/min。 然后是适配体2结合区：将nCoV-S1-79-27nt和nCoV-S1-268-24nt的混合 物进样5分钟，解离3分钟。同样的方法，适配体2结合区换成单独的nCoV-S1-79-27nt作为对照。结果如图4左所示，可见两次进核酸适配体 样品的信号均有明显的提升，可以说明nCoV-S1-79-27nt和 nCoV-S1-268-24nt结合在S1蛋白的不同的位点。
同样的实验方法，顺序颠倒过来，结果如图4右所示，也验证了 nCoV-S1-79-27nt和nCoV-S1-268-24nt结合在不同的位点。
实施例5：nCoV-S1-79-27nt和nCoV-S1-268-24nt抑制SARS-RBD与 ACE2结合
1.取出1个新的AR2G传感芯片(Amine Reactive Second-Generation (AR2G)Biosensors，Fortebio)，放置在PH 7.4的DPBS缓冲buffer里面 预湿10分钟。
2.从-20℃冰箱取出0.4M EDC和0.1M NHS试剂，常温解冻，按照 1:1的比例混合，混匀之后立即活化传感芯片，活化时间900秒。
3.取5ul 0.6mg/ml的SARS-RBD加入195ul的PH 5.0的醋酸钠溶液 稀释成15ug/ml，用DPBS将ACE2蛋白稀释成20ug/ml。
4.将醋酸钠稀释的SARS-RBD偶连到AR2G传感芯片上，偶联完毕 后，用PH 8.5乙醇胺盐酸封闭芯片表面上多余的活化位点。时间为300s。
5.将实施例2中通用生物合成的2条核酸适配体分别稀释到500nM， 检测程序如下：基线维持60秒，结合适配体180秒，解离120秒。然后 结合ACE2蛋白180秒，得到一个结合ACE2的曲线1。然后解离120秒， 用10mM NaOH再生60秒，稳定30秒后，基线维持60秒，然后结合ACE2 蛋白180秒，得到一个结合ACE2蛋白的曲线2。实验结束，比较曲线1 与曲线2，见图5。由图5可以看出，nCoV-S1-79-27nt(左图)和 nCoV-S1-268-24nt(右图)对ACE2与SARS-RBD的结合有很好的抑制作 用。
实施例6：基于核酸适配体nCoV-S1-79-27nt和nCoV-S1-268-24nt的 斑点杂交实验检测SARS-CoV-2的S1蛋白和SARS冠状病毒的RBD蛋 白
1取2块8cm×2cm的硝酸纤维素膜(购自Millipore)，将SARS-CoV-2 的S1蛋白分别用PBS稀释成0.5mg/ml，0.05mg/ml，将SARS冠状病毒的RBD蛋白和对照蛋白BSA也稀释成0.5mg/ml。点样1.5ul到硝酸纤维素 膜上，自然风干40分钟。
2.待干燥后，用10％小牛血清在室温封闭3小时，封闭结束后用 PBST(PBS含0.5‰tween20)清洗3次，吸净。
3.用生物素修饰实施例2中通用生物合成的核酸适配体 nCoV-S1-79-27nt稀释到1uM然后将稀释后的核酸适配体与硝酸纤维素膜 上的蛋白在摇床室温孵育2小时。
5.孵育结束后用PBST洗三次，清洗时放置在摇床上，每次10分钟。
6.加入用PBST按照1:10000稀释的HRP-标记的链霉抗生物素蛋白 (购自碧云天，货号A0303)，室温摇床孵育30分钟。
7.PBST洗3次，清洗时放置在摇床上，每次10分钟。
8.以A液：B液＝1:1(v/v)的比例加入显色液(BeyoECL Star特超 敏ECL化学发光试剂盒，购自碧云天，货号P0018A，A液和B液为试剂 盒自带溶液)，在室温显色1分钟。
9.成像系统观察拍照：使用仪器为GE医疗生命科学部的 ImageQuantTM LAS 4000数字成像系统。
核酸适配体nCoV-S1-268-24nt的检测方法同上nCoV-S1-79-27nt，步 骤1的蛋白浓度分别为：将SARS-CoV-2的S1蛋白分别用PBS稀释成 0.3mg/ml，0.03mg/ml，将SARS冠状病毒的RBD蛋白和对照蛋白BSA稀 释成0.5mg/ml。点样1.5ul到硝酸纤维素膜上，自然风干40分钟。其余步 骤均一样。
结果如图6所示，与对照蛋白BSA的斑点相比，实验组显色明显， 这说明生物素修饰的nCoV-S1-79-27nt和nCoV-S1-268-24nt均可以用于膜 杂交SARS-CoV-2的S1蛋白和SARS冠状病毒的RBD蛋白的检测，并且 不结合对照蛋白BSA。
实施例7：表面等离子共振(SPR)检测SARS-CoV-2S1蛋白核酸适 配体nCoV-S1-79-27nt和nCoV-S1-268-24nt与MERS-RBD蛋白的亲和力
1.委托通用生物合成核酸适配体nCoV-S1-79-27nt和 nCoV-S1-268-24nt，将其分别用DPBS缓冲液稀释成500nM。
2.将MERS-RBD蛋白偶联到CM5芯片表面的第2通道，具体方法 如下：先用50mMNaOH清洗芯片，进样20μl，流速10μl/分钟，然后用 将等体积的EDC(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐；0.4M水溶 液)和NHS(N-羟基琥珀酰亚胺；0.1M水溶液)两个试剂混合后进样50μl 活化芯片，流速5μl/分钟。将MERS-RBD蛋白用pH4.5的10mM醋酸钠 稀释至终浓度为50μg/mL后进样，进样体积50μL，流速5μL/分钟， SARS-CoV-2S1蛋白偶联量为7000Ru。进样完成后，进乙醇胺封闭芯片， 流速5μL/分钟，进样50μL。第1通道按照上述处理，只是不进行偶联蛋 白的步骤，活化和封闭的步骤完全一样，作为对照通道。
3.检测：使用表面等离子共振仪(GE Healthcare，型号：Biacore T200) 设定检测参数，步骤1中稀释好的2种适配体样品依次流过1、2、3、4 通道，每一个适配体的程序如下：进样30μL/分钟，时间3分钟，解离30μL/ 分钟，时间2分钟，再生1M NaCl 30μL/分钟，时间1分钟，将稀释好的 2种核酸适配体依次进样。
4.适配体与MERS-RBD蛋白的亲和力检测数据说明核酸适配体 nCoV-S1-79-27nt和nCoV-S1-268-24nt用SPR仪均检测到与MERS-RBD 蛋白有很强的结合。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并 不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内， 根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本 发明的保护范围之内。
Figure IDA0002996324000000011
Figure IDA0002996324000000021

Claims (6)

1.结合SARS-CoV-2的S1蛋白的核酸适配体，所述核酸适配体包含以下序列或由以下序列组成：
(1)SEQ ID NO:1-2中任一个所示的核苷酸序列，
(2)与SEQ ID NO:1-2中任一个所示的核苷酸序列具有至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少94％、至少96％、至少98％或至少99％的同源性且结合SARS-CoV-2的S1蛋白的核苷酸序列；或
(3)由(1)或(2)的核苷酸序列转录且结合SARS-CoV-2的S1蛋白的RNA序列。
2.根据权利要求1所述的核酸适配体，所述核酸适配体的核苷酸序列被修饰且修饰后的核酸适配体结合SARS-CoV-2的S1蛋白，所述修饰选自磷酸化、甲基化、氨基化、巯基化、用硫取代氧、用硒取代氧和同位素化中的至少一种。
3.核酸适配体的缀合物，其为在根据权利要求1或2所述核酸适配体的核苷酸序列上连接用于标记、检测、诊断或治疗的物质，且连接所述物质后的所述核酸适配体的缀合物结合SARS-CoV-2的S1蛋白，所述物质是荧光标记物例如FAM、放射性物质、治疗性物质、生物素、地高辛、纳米发光材料、小肽、siRNA和酶标记中的至少一种。
4.核酸适配体的衍生物，其是将权利要求1或2所述的核酸适配体或权利要求3所述的核酸适配体的缀合物的核苷酸序列的骨架改造成结合SARS-CoV-2的S1蛋白的硫代磷酸酯骨架而得，或者是由权利要求1或2所述的核酸适配体或权利要求3所述的核酸适配体的缀合物改造成的结合SARS-CoV-2的S1蛋白的肽核酸。
5.权利要求1或2所述的核酸适配体或权利要求3所述的核酸适配体的缀合物或权利要求4所述的核酸适配体的衍生物在由以下各项组成的组中的任意一项中的用途：
1)定量或定性检测SARS-CoV-2的S1蛋白或RBD蛋白；
2)纯化SARS-CoV-2的RBD蛋白、S1蛋白或Spike蛋白；
3)SARS-CoV-2的S1蛋白或Spike蛋白的成像；
4)结合SARS-CoV-2并将其富集；
5)作为SARS-CoV-2的S1蛋白或Spike蛋白的抑制剂；
6)制备阻断SARS-CoV-2的S1蛋白或Spike蛋白与ACE2蛋白结合的制剂；
7)制备靶向到SARS-CoV-2Spike-S1蛋白或Spike蛋白的药物；
8)制备用于诊断和治疗SARS-CoV-2感染的肺炎的试剂或药物；
9)定量或定性检测SARS冠状病毒的RBD蛋白；
10)纯化SARS冠状病毒的RBD蛋白；
11)结合SARS冠状病毒并将其富集；
12)作为SARS冠状病毒的RBD蛋白的抑制剂；
13)制备阻断SARS冠状病毒的RBD蛋白与ACE2受体结合的制剂；
14)制备用于诊断或治疗SARS冠状病毒感染的肺炎的试剂或药物；
15)定量或定性检测MERS冠状病毒的RBD蛋白；
16)纯化MERS冠状病毒的RBD蛋白；
17)结合MERS冠状病毒并将其富集；
18)作为MERS冠状病毒的RBD蛋白的抑制剂；
19)制备阻断MERS冠状病毒的RBD蛋白与ACE2受体结合的制剂；
20)制备用于诊断或治疗MERS冠状病毒感染的肺炎的试剂或药物；或
21)开发用于检测SARS-CoV-2的S1蛋白的方法，如夹心法(优选夹心ELISA法)。
6.试剂盒，所述试剂盒包含权利要求1或2所述的核酸适配体或权利要求3所述的核酸适配体的缀合物或权利要求4所述的核酸适配体的衍生物。
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