CN111849994B - SARS-CoV-2 S蛋白或RBD蛋白的核酸适配体及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种SARS‑CoV‑2 S蛋白或RBD蛋白的核酸适配体，所述的核酸适配体包括如SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：8所示的核苷酸序列。本发明的核酸适体能够提供SARS‑CoV‑2 S蛋白或RBD蛋白的快速、精准检测，同时适配体与血管紧张素转换酶(ACE2)有竞争作用，高效阻断SARS‑CoV‑2 S蛋白或RBD蛋白和ACE2结合，从而抑制病毒感染细胞，可作为药物用于防御和治疗SARS‑CoV‑2相关疾病，成为抗病毒的潜在药物。满足家庭、社区等多种应用场景的筛查需求，减少非必要的患者聚集，补充现有诊断和治疗体系。

Description

SARS-CoV-2 S蛋白或RBD蛋白的核酸适配体及其应用
技术领域
本发明涉及SARS-CoV-2 S蛋白或RBD蛋白的核酸适配体及其应用。
背景技术
世界卫生组织宣布，新型冠状病毒(SARS-CoV-2或2019 nCoV)的爆发是一种全球性的流行病。冠状病毒感染的机制还不完全清楚，也没有任何治疗方法或疫苗。
在病毒诊断方面，已获批新型冠状病毒SARS-CoV-2核酸检测试剂盒(荧光PCR法)和2019新型冠状病毒核酸测序系统等多个产品。这类基于SARS-CoV-2核酸的检测方法，通常需提取病毒RNA，利用特征片段的引物进行RT-PCR或者荧光RT-PCR，通过核酸扩增结果即可判断患者是否感染。这种针对病毒核酸的诊断方法存在灵敏度高、特异性强、试剂制备相对容易等多个优势。然而仍存在操作步骤多、耗时长、对检测设备和场所要求高等局限性，无法推广到家庭、社区等场景，从而导致大量患者无法及时筛查，聚集在医院存在交叉感染风险，并加剧了医务人员工作量、人民心理负担。
在病毒治疗方面，目前世界范围内尚无SARS-CoV-2急性呼吸疾病针对性的特效药物，暂时只能依靠对症治疗及支持护理，导致具有基础疾病及体弱患者死亡率较高。
在SARS-CoV-2病毒抗原中，冠状病毒表面的刺突糖蛋白(S蛋白)是与宿主细胞受体的结合是入侵第一步，是冠状病毒主要的免疫原性抗原。目前已有研究表明2019-nCoV病毒表面的S蛋白可以和表达在上皮细胞的血管紧张素转化酶(ACE2)具有较强结合，提示2019-nCoV通过S蛋白和人体细胞ACE2结合感染细胞。因此发展SARS-CoV-2 S蛋白的识别分子，不仅能够建立基于SARS-CoV-2 S蛋白抗原的检测方法；而且若S蛋白的识别分子能有效阻断SARS-CoV-2和ACE2结合，即有望成为一种SARS-CoV-2潜在药物。但是，由于抗体这类最常用的识别分子通常需要一定的实验周期才能研制成功，导致其往往难以用到疫情防控的早期战场。因此，在研发抗体同时，研发新型识别分子，对SARS-CoV-2的诊疗有重要意义。
发明内容
本发明的主要目的，在于提供SARS-CoV-2 S蛋白或RBD蛋白的核酸适配体，所述的核酸适配体包括如SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：8所示的核苷酸序列。
本发明通过提供以上核苷酸序列，作为核酸适配体，为SARS-CoV-2 S蛋白或RBD蛋白的快速、精准检测方法，满足家庭、社区等多种应用场景的筛查需求，减少非必要的患者聚集，补充现有诊断体系。
附图说明
下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明。
图1为His-tag RBD修饰的Ni琼脂糖微球来监测富集的过程，随着筛选轮数的增加库与 RBD-Ni-beads结合的荧光强度明显增加(图1A)，然而，Ni-beads荧光强度未增加(图1B)。
图2为CoV2-RBD-1和CoV2-RBD-4与RBD-Ni琼脂糖微球的结合亲和力，CoV2-RBD-1和 CoV2-RBD-4与RBD的结合解离常数分别为3.1nM(图2A)和13.6nM(图2B)。
图3对于RBD-Ni琼脂糖微球，CoV2-RBD-1C适体的荧光强度明显强于初始库，而对于Ni 琼脂糖微球，适体强度与初始库相似(图3A)。确定CoV2-RBD-1C适体对RBD的Kd值为5.8 ±0.8nm(图3B)。图3C为CoV2-RBD-1C在缓冲液与在80％的血清培养条件下与RBD-Ni琼脂糖微球的结合信噪比。与缓冲液相比，在80％的血浆条件下，与靶RBD结合的适体数量没有明显减少(图3C)；对于RBD-Ni琼脂糖微球，CoV2-RBD-4C适体的荧光强度明显强于初始库，而对于Ni琼脂糖微球，适体强度与初始库相似(图3D)。结合亲和力的进一步分析显示CoV2-RBD-4C的Kd为19.9±2.6nm(图3E)。此外，在80％的血清培养条件下，与缓冲液相比，约75％的结合适体保持不变(图3F)
具体实施方式
化学合成一个76个碱基的DNA初始文库，DNA初始文库的两端为固定序列，其中包括中间为40个碱基的随机序列，即为5’-ATCCAGAGTGACGCAGCA-40N- TGGACACGGTGGCTTAGT-3’，库容量为1015以上。取5nmol DNA初始文库溶于结合缓冲液(12 mmol/L PBS，pH 7.4，150mmol/L NaCl，5mmol/L KCl，0.55mmol/L MgCl2)中，进行变性处理：95℃，10min，冰上5min，然后25℃下放置10min。
2)以表达在小鼠C端IgG的Fc区域的重组SARS-CoV-2RBD蛋白(刺突糖蛋白受体结合域，即S蛋白结构域，购买自Sino Biological)作为适配体的筛选靶标。SARS-CoV-2 S 蛋白或RBD蛋白修饰于Protein A乳胶微球，通过IgG-tag的表位与Protein A相互作用形成RBD-Protein A乳胶微球。
3)得到的预处理初始文库液体与RBD乳胶微球一起于25℃下孵育30min；去除上清液回收微球，用结合缓冲液清洗两次，回收的RBD-Protein A乳胶微球加入到包含前向引物(5’-ATCCAGAGTGACGCAGCA-3')、生物素化的反向引物(5’-ACTAAGCCACCGTGTCCA-3')，dNTPs，Taq DNA聚合酶及PCR缓冲液的PCR混合物中，扩增目标的序列。为获得单链的文库，PCR产物与链霉亲和素包被的琼脂糖凝胶珠子孵育，用0.1M NaOH处理1分钟变性。使用3 K超滤管脱盐后，产物可用于下一轮筛选。
4)开始的8轮筛选通过经典的SELEX方法以保证SARS-CoV-2 S蛋白或RBD蛋白与DNA 链的多个拷贝结合。从第三轮开始protein A微球和IgG修饰的protein A乳胶微球用作负筛的靶标。以排除与IgG或者protein A结合的序列。
5)8轮筛选结束后，在接下来的4轮筛选中引入ACE2竞争。将DNA文库与RBD-Beads孵育后，上清中未结合或者弱结合的序列被去除，然后加入ACE2被加入并与RBD-beads孵育，以收集与ACE2竞争的序列。随后4轮引入5μg ACE2以用来模拟感染过程，有利于与ACE2有同样结合位点的适配体与RBD的结合。
6)His-tag RBD修饰的Ni琼脂糖微球来监测富集的过程。流式的结果表明，随着筛选轮数的增加库与RBD-Ni-beads结合的荧光强度明显增加(图1A)，然而，Ni-beads荧光强度未增加(图1B)，表明12轮筛选之后，DNA库成功地富集了SARS-CoV-2 S蛋白或RBD蛋白的识别序列。
7)通过序列优化获得一些序列SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：8(见表1)。SEQ ID NO：1和EQ ID NO：4的结合解离常数分别为3.1nM(图2A)和13.6nM(图2B)。通过移除不参与形成茎环结构的两个末端的碱基，保留了CoV2-RBD-1适体的整体结构，产生51 nt 3- 发夹结构的CoV2-RBD-1C适体(5’-CAGCACCGACCTTGTGCTTTGGGAGTGCT GGTCCAAGGGCGTTAATGGACA-3’)。评估截短的适体CoV2-RBD-1C对SARS-CoV2-RBD的结合能力和特异性。对于RBD-his琼脂糖微珠，CoV2-RBD-1C适体的荧光强度明显强于初始库，而对于Ni珠，适体强度与初始库相似(图3A)。确定CoV2-RBD-1C适体对RBD的Kd值为5.8±0.8nm (图3B)，与全长CoV2-RBD-1适体相似。对所选适体在80％人血浆中与SARS-CoV-2 RBD的结合性能进行了评价，以探讨所选适体的实际应用价值。与缓冲液相比，在80％的血浆条件下，与靶RBD结合的适体数量没有明显减少(图3C)。类似地，CoV2-RBD-4序列被操作优化，产生一个67nt发夹序列CoV2-RBD-4C(5’-ATCCAGAGTGACGCAGCATTTCATCGGGTCCAAA AGGGGCTGCTCGGGATTGCGGATATGGACACGT-3’)。结合亲和力的进一步分析显示CoV2-RBD-4C的 Kd为19.9±2.6nm(图3E)。此外，在80％的血浆培养条件下，与缓冲液相比，约75％的结合适体保持不变(图3F)。这些结果表明，这两种抗体不仅能在缓冲溶液中与高亲和力的 SARS-CoV-2rbd结合，而且能在复杂环境中识别RBD，具有很好的应用前景。
表1
Figure RE-GDA0002598593610000051
以上所述，仅为本发明较佳实施例而已，故不能依此限定本发明实施的范围，即依本发明专利范围及说明书内容所作的等效变化与修饰，皆应仍属本发明涵盖的范围内。

Claims (3)

1.SARS-CoV-2 S蛋白或RBD蛋白的核酸适配体，其特征在于：所述的核酸适配体为如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：8所示的核苷酸序列。
2.权利要求1所述的SARS-CoV-2 S蛋白或RBD蛋白的核酸适配体在制备SARS-CoV-2 S蛋白或RBD蛋白检测试剂中的应用。
3.权利要求1所述的SARS-CoV-2 S蛋白或RBD蛋白的核酸适配体在制备SARS-CoV-2 S蛋白或RBD蛋白识别试剂方面的应用。
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