CN103911379A - 核酸适配体及其衍生物、筛选方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种用于检测人鼻咽癌细胞株CNE2细胞的核酸适配体及其衍生物、筛选方法和应用，所述核酸适配体为a：5’-CGTTCGTCAGGAGTAGAGGCXCCTGCTGACTGAACCTGACG-3’，b：与a所述核酸适配体具有60%以上同源性且具有检测人鼻咽癌细胞株CNE2细胞功能；c：在严紧条件下，与a或b的序列进行杂交的序列；或d：a、b或c的核酸适配体序列转录的RNA序列，本发明的核酸适配体的筛选方法可以极大的降低筛选重复次数；本发明还提供所述核酸适配体或核酸适配体衍生物在检测人鼻咽癌细胞株CNE2细胞或制备检测人鼻咽癌细胞株CNE2细胞的试剂盒中的应用。

Description

核酸适配体及其衍生物、筛选方法和应用

技术领域

本发明涉及一种用于检测人鼻咽癌细胞株CNE2细胞的核酸适配体及其衍生物、筛选方法和应用。

背景技术

人鼻咽癌为我国最常见的恶性肿瘤之一，严重影响人类健康，由于鼻咽部位较深且位置隐蔽，以致鼻咽癌早期症状和体征不明显，容易漏诊、误诊，延误最佳治疗时机，早期诊断鼻咽癌，可有效提高治疗的效果和患者生存率。

鼻咽癌早期诊断的现状及进展，《医疗诊断》，2011,1,7-12，介绍了鼻咽癌早期诊断的技术手段，比如免疫PCR（IPCR）方法。Paramita等采用的两步EBV-IgA ELIAS法，相对于免疫印记法，灵敏性和特异性分别从85.4%和90.1%上升到96.7%和98%，阳性预测值和阴性预测值分别从78.7%和97.3%增加到93.7%和97.5%。tong等构建了一个从混合鼻咽癌组织来源的cDNA文库，并从鼻咽癌患者和健康人群血清中分离出31种肿瘤相关蛋白，表明血清中抗肿瘤相关抗原的自身抗体可用于鼻咽癌早期筛查诊断等等。但是利用蛋白抗体等的方法，亲和力和特异性不够理想，具有免疫原性，生产成本高，不利于保藏。

SELEX法筛选鼻咽癌核酸适配子的研究，山东医药2012年第52卷第23期，介绍了利用SELEX法筛选鼻咽癌核酸适配子，引物序列如下：上游引物（B1）序列：5’-FITC-ACCGACCGTGCTGGACTCT-3’，下游引物（B2）序列：5’-CGCAACGCTCGCTCATACT-3’。鼻咽癌细胞株为EB病毒阳性低分化鼻咽癌细胞株（C666），采用传统的SELEX法经过10轮循环筛选初步建立了鼻咽癌适配体库，但是此研究仅仅停留在对部分核酸适配体进行序列同源性分析上，并未对单个核酸适配体的亲和力和特异性进行研究，还需进一步研究才有可能得到性质优良的核酸适配体，不利于核酸适配体的后续应用。因此，开展鼻咽癌细胞核酸适配体筛选的相关工作，获得具体的高亲和力、高特异性地识别鼻咽癌细胞的核酸适配体是很有必要的。

Aptamers from Cell-Based Selection for Bioanalytical Applications，ChemicalReviews，2013,113,2842-2862，作者介绍了针对细胞核酸适配体的筛选，一般需要20轮左右的筛选，才能获得高亲和力的核酸适配体。由此可见，传统的cell-SELEX方法周期长，劳动量大，成本高。迫切需要发展高效快速的细胞核酸适配体的方法，以满足日益增长的科学、医疗需求。

本发明要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种亲和力强、特异性高、无免疫原性的检测人鼻咽癌细胞株CNE2细胞的核酸适配体，还提供一种效率高，可有效减少筛选循环次数的核酸适配体的筛选方法，还提供所述核酸适配体在检测人鼻咽癌细胞株CNE2细胞中的应用，还提供所述核酸适配体在制备检测人鼻咽癌细胞株CNE2细胞的试剂盒中的应用。

为解决上述技术问题，本发明提供一种用于检测人鼻咽癌细胞株CNE2细胞的核酸适配体，所述核酸适配体序列为

a：5’-CGTTCGTCAGGAGTAGAGGCXCCTGCTGACTGAACCTGACG-3’，所述X为

5’-TGCCACGTGTTGGTGGAGGGAAGGGTTTAGGATTTAGGGG-3’、

5’-TGGACCGGAGGTTGGGGGATGGGTGTTGGATTTGGGAGGA-3’或

5’-TAGCGGCACACTATGGGAGGCGGTGGGGGGTTCGGCGGTG-3’；

上述3个序列表示为，Seq ID NO:1：

5’-CGTTCGTCAGGAGTAGAGGCTGCCACGTGTTGGTGGAGGGAAGGGTTTAGGATTTAGGGGCCTGCTGACTGAACCTGACG-3’，Seq ID NO:2：

5’-CGTTCGTCAGGAGTAGAGGCTGGACCGGAGGTTGGGGGATGGGTGTTGGATTTGGGAGGACCTGCTGACTGAACCTGACG-3’，Seq ID NO:3：

5’-CGTTCGTCAGGAGTAGAGGCTAGCGGCACACTATGGGAGGCGGTGGGGGGTTCGGCGGTGCCTGCTGACTGAACCTGACG-3’。

b：与a所述核酸适配体具有60%以上同源性且具有检测人鼻咽癌细胞株CNE2细胞功能；

c：在严紧条件下，与a或b的序列进行杂交的序列；或

d：a、b或c的核酸适配体序列转录的RNA序列。

所述核酸适配体在保持整体结构不变的前提下，核酸适配体的核苷酸序列上的任一位置被磷酸化、甲基化、氨基化、巯基化或同位素化。即所述核酸适配体连接或标记了磷酸、甲基、氨基、巯基、放射性同位素。

一种核酸适配体衍生物，为所述核酸适配体的核苷酸序列的骨架衍生出的硫代磷酸酯衍生物或核酸适配体的相对应的肽核酸。

本发明还提供一种所述核酸适配体的制备方法，包括以下步骤，

1、合成以下序列所示的随机单链DNA文库（随机ssDNA文库）和引物：

随机单链DNA文

库:5’-CGTTCGTCAGGAGTAGAGGCNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNCCTGCTGACTGAACCTGACG-3’（Seq ID NO:4），N表示A或G或C或T。

5’端正向引物：5’-FAM-CGTTCGTCAGGAGTAGAGGC-3’，正向引物序列为：

5’-CGTTCGTCAGGAGTAGAGGC-3’（Seq ID NO:5），FAM为荧光素；

3’端反向引物：5’-Biotin-CGTCAGGTTCAGTCAGCAGG-3’，反向引物序列为：

5’-CGTCAGGTTCAGTCAGCAGG-3’（Seq ID NO:6），Biotin为生物素，和

链酶亲和素修饰的琼脂糖微球；

2、cell-SELEX筛选

2.1使无关序列和人鼻咽癌细胞株CNE2细胞（阳性细胞）接触，时间优选为15min，得到预处理后的人鼻咽癌细胞株CNE2细胞；无关序列是指不与人鼻咽癌细胞株CNE2细胞特异识别、结合的序列。

人鼻咽癌细胞株CNE2细胞的培养、处理方法为，培养人鼻咽癌细胞株CNE2细胞至基本铺满瓶底，去除培养基，后用缓冲液洗涤。

2.2使随机单链DNA文库和预处理后的人鼻咽癌细胞株CNE2细胞接触，孵育，孵育时间优选为30min，得到处理后的人鼻咽癌细胞株CNE2细胞；

2.3将上述步骤2.2得到的处理后的人鼻咽癌细胞株CNE2细胞和单壁碳纳米管接触，筛选，得到CNE2细胞的特异核酸适配体文库；所述人鼻咽癌细胞株CNE2细胞和单壁碳纳米管的配比为10-30nmol/mg，最优选为25.6nmol/mg。

所述接触包括孵育或/和洗涤，所述筛选包括在上述步骤2.2得到的处理后的人鼻咽癌细胞株CNE2细胞和单壁碳纳米管接触后的细胞中加入无菌水，沸水浴中加热，离心，取上清。

3、对步骤2的CNE2细胞的特异核酸适配体文库进行PCR扩增，得到扩增的双链DNA；

4、将步骤3的扩增的双链DNA和链酶亲和素修饰的琼脂糖微球接触，孵育，孵育时间优选为30min，分离，变性处理，分离，得到单链DNA文库；

所述变性处理，分离的方法是加入强碱性溶液，如氢氧化钠溶液，时间优选为15min，使双链DNA变性，离心，收集上清液，将上清液过除盐柱后收集滴下的溶液，得到单链DNA文库；

5、阴性筛选：使无关序列和人鼻咽癌细胞株HONE细胞接触，得到处理后的人鼻咽癌细胞株HONE细胞（阴性细胞）；将步骤5得到的单链DNA文库和处理后的人鼻咽癌细胞株HONE细胞接触，收集细胞接触后的溶液；

6、多轮筛选：将步骤5得到的细胞接触后的溶液替代步骤2的随机单链DNA文库，重复步骤2-5至少一次，重复次数优选为5-6次，分析，确认，得到所述核酸适配体。

所述分析，确认的方法为，在步骤2得到的CNE2细胞的特异核酸适配体文库中加入胎牛血清，使用流式细胞仪监测单链DNA文库对人鼻咽癌细胞株CNE2细胞的识别能力，测序，富集度高的为所述核酸适配体。

本发明还提供一种所述核酸适配体或所述核酸适配体衍生物在人鼻咽癌细胞株CNE2细胞检测中的应用。

本发明还提供一种所述核酸适配体或所述核酸适配体衍生物在制备检测人鼻咽癌药物或试剂盒中的应用。

本发明的有益效果是，核酸适配体（aptamer）是通过指数富集配基的系统进化技术（SELEX）筛选得到的，能特异结合靶物质的单链寡聚核苷酸（ssDNA或ssRNA）。核酸适配体与抗体功能类似，但是与抗体相比具有更多的优势，具有更高的亲和力与特异性；无免疫原性；能够化学合成，成本低；可进行标记；稳定性好，易于保存等优点。核酸适配体的靶分子更为广泛，包括金属离子、氨基酸、核酸、多肽、蛋白质，并从单一靶标扩展至完整的病毒颗粒及细胞等复合物靶标。因此，核酸适配体具有广泛的应用前景。

传统的细胞核酸适配体的筛选方法无需纯化，在靶标的天然状态下和不知道细胞表面分子的情况下进行筛选，并且一次性可以筛选出针对多种靶分子的核酸适配体。但是，其过程往往需要筛选20轮左右，周期长，劳动力大和成本高，因此发展快速高效的筛选方法显得尤为重要。因为单链DNA能够通过π-π电子堆积作用缠绕在单壁碳纳米管表面，所以可以很好的吸附单链DNA，从而吸附掉未与细胞结合的单链DNA，或者与细胞结合比较弱的非特异性吸附单链DNA，而那些与细胞的作用大于单壁碳纳米管的核酸适配体仍然被保留在细胞表面。本发明利用单壁碳纳米管能够很好的吸附单链DNA的特点，将单壁碳纳米管引入到筛选的过程中，降低非特异性吸附，有效地去除结合的单链DNA，并且不影响核酸适配体（aptamer）与细胞的结合。本发明的方法大大地提高了筛选的效率，节约了劳动力和降低了成本。

本发明通过SELEX筛选得到的核酸适配体具有比蛋白抗体更高的亲和力与特异性；无免疫原性；能够体外化学合成，分子量小，可以对不同部位进行修饰和取代，且序列稳定，易于保存；便于标记（不需要标记的二抗）等。

采用本发明的核酸适配体进行鼻咽癌细胞CNE2细胞的检测时，操作简单、迅速，且核酸适配体的合成成本较抗体制备成本低，且周期短，重现性好。

本发明的可识别人鼻咽癌细胞株CNE2细胞的核酸适配体均能特异性且高亲和力的识别人鼻咽癌细胞株CNE2细胞，且结合能力强，解离常数均在纳摩尔范围以内。利用本发明的核酸适配体对其结合的靶分子进行研究，可以得到其肿瘤标志物，这对于肝癌的早期检测具有重要意义，在肝癌的诊断方面有良好的应用前景。

附图说明

图1为本发明的碳纳米管辅助的细胞核酸适配体制备、筛选的原理和主要步骤示意图。

图2为本发明利用mfold软件模拟的T10核酸适配体的二级结构示意图。

图3为本发明利用mfold软件模拟的T11核酸适配体的二级结构示意图。

图4为本发明利用mfold软件模拟的T12核酸适配体的二级结构示意图。

图5为本发明利用流式细胞仪检测核酸适配体对人鼻咽癌细胞株CNE2细胞的结合能力的检测结果。

图6为本发明利用流式细胞仪检测核酸适配体对人鼻咽癌细胞株HONE的结合能力的检测结果。

图7为本发明利用激光共聚焦检测核酸适配体对阳性细胞人鼻咽癌细胞株CNE2细胞的结合能力及人鼻咽癌细胞株HONE细胞的检测结果，左图为荧光成像，右图为明场成像。

图8为本发明利用流式细胞仪测定FAM-T10核酸适配体结合CNE2细胞的解离常数绘制曲线。

图9为本发明利用流式细胞仪测定FAM-T11核酸适配体结合CNE2细胞的解离常数绘制曲线。

图10为本发明利用流式细胞仪测定FAM-T12核酸适配体结合CNE2细胞的解离常数绘制曲线。

具体实施方式

实施例1

本发明的用于检测人鼻咽癌细胞株CNE2细胞的核酸适配体，所述核酸适配体序列为

a：5’-CGTTCGTCAGGAGTAGAGGCXCCTGCTGACTGAACCTGACG-3’，所述X为

5’-TGCCACGTGTTGGTGGAGGGAAGGGTTTAGGATTTAGGGG-3’、

5’-TGGACCGGAGGTTGGGGGATGGGTGTTGGATTTGGGAGGA-3’或

5’-TAGCGGCACACTATGGGAGGCGGTGGGGGGTTCGGCGGTG-3’；

上述3个序列表示为，Seq ID NO:1，即T10：

5’-CGTTCGTCAGGAGTAGAGGCTGCCACGTGTTGGTGGAGGGAAGGGTTTAGGATTTAGGGGCCTGCTGACTGAACCTGACG-3’，Seq ID NO:2，即T11：

5’-CGTTCGTCAGGAGTAGAGGCTGGACCGGAGGTTGGGGGATGGGTGTTGGATTTGGGAGGACCTGCTGACTGAACCTGACG-3’，Seq ID NO:3，即T12：

5’-CGTTCGTCAGGAGTAGAGGCTAGCGGCACACTATGGGAGGCGGTGGGGGGTTCGGCGGTGCCTGCTGACTGAACCTGACG-3’。

b：与a所述核酸适配体具有60%以上同源性且具有检测人鼻咽癌细胞株CNE2细胞功能；

c：在严紧条件下，与a或b的序列进行杂交的序列；或

d：a、b或c的核酸适配体序列转录的RNA序列。

所述核酸适配体在保持整体结构不变的前提下，核酸适配体的核苷酸序列上的任一位置被磷酸化、甲基化、氨基化、巯基化或同位素化。即所述核酸适配体连接或标记了磷酸、甲基、氨基、巯基、放射性同位素。

本发明还提供一种核酸适配体衍生物，为所述核酸适配体的核苷酸序列的骨架衍生出的硫代磷酸酯衍生物或核酸适配体的相对应的肽核酸。

实施例2

本发明的一种可用于检测人鼻咽癌细胞株CNE2细胞的核酸适配体，所述核酸适配体的核苷酸序列包括以下序列1-序列3中的任意一条序列所示的DNA片段，且所述核酸适配体的5’端标记有FAM，即：序列1为FAM-T10，序列2为FAM-T11，序列3为FAM-T12，

序列4为FAM-Lib，Lib的序列为：

5’-NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN-3’（Seq ID NO:7）。

注:N代表A、T、G、C中任一碱基（序列4作为对照序列，即阴性探针，也即图5-图7中的Lib）。

本实施例的上述序列1-序列3的可用于检测人鼻咽癌细胞株CNE2细胞的核酸适配体采用以下筛选方法筛选得到，如图1所示，具体包括以下步骤：

1.合成以下序列所示的随机单链DNA文库和引物：

随机单链DNA文

库:5’-CGTTCGTCAGGAGTAGAGGCNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNCCTGCTGACTGAACCTGACG-3’，

5’端引物：5’-FAM-CGTTCGTCAGGAGTAGAGGC-3’，

3’端引物：5’-Biotin-CGTCAGGTTCAGTCAGCAGG-3’，和

链酶亲和素修饰的琼脂糖微球；

2.cell-SELEX筛选获得CNE2细胞特异核酸适体文库：

2.1细胞预处理：1640培养基（购买自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司）加质量浓度为15%的小牛血清培养人鼻咽癌细胞株CNE2细胞至铺满瓶底95%，去除培养基后用10mLwashing buffer洗涤，与l mL含1nM无关序列的binding buffer在冰上孵育15min，弃溶液；得到预处理后的人鼻咽癌细胞株CNE2细胞。所述无关序列为：5’-AGCTAGTAATCGAGATTAAGAGACCAATCCAAGACATATCAGCAGTAGCA-3’（Seq ID NO:8）。

2.2孵育：用300μL binding buffer溶解10nmol随机单链DNA文库，95℃恒温振荡5min，迅速放入冰中；在随机单链DNA文库中补充binding buffer至终体积为l mL，与步骤2.1中得到的预处理后的人鼻咽癌细胞株CNE2细胞在冰上孵育30min，得到处理后的人鼻咽癌细胞株CNE2细胞。

2.3解离：孵育完成后倒出孵育培养瓶内的液体，用2mL含有单壁碳纳米管的washingbuffer洗涤孵育培养瓶中的细胞；用l mL无菌水刮取孵育培养瓶内细胞，置于EP管中沸水浴加热10min，12000rpm离心取上清，即为筛选所得CNE2细胞的特异核酸适配体文库。

3.进行PCR扩增文库：

取100μL筛选所得的CNE2细胞的特异核酸适配体文库进行常规PCR扩增，扩增条件为95℃3min，95℃30sec，60℃30sec，72℃30sec，经合适循环轮数，72℃3min。第一轮筛选后需将全部所得的CNE2细胞的特异核酸适体文库预扩增10个循环，再进行本步骤的扩增，得到扩增的双链DNA。

4.制备单链DNA文库：

将100μL链霉亲和素修饰的琼脂糖微球5000rpm离心去上清，再用500μL PBS洗涤，离心去上清；重复洗涤一次。将步骤3中PCR扩增所得的双链DNA与链霉亲和素修饰的琼脂糖微球在常温下孵育半小时，通过双链DNA上的生物素与琼脂糖微球上的链霉亲和素的亲和作用将双链DNA充分捕获到琼脂糖微球表面；5000rpm离心去上清，用PBS离心洗涤两次；然后加入200mM NaOH溶液500μL至琼脂糖微球中用于双链DNA的变性处理，常温反应15min，5000rpm离心5min，收集上清；除盐柱用10mL无菌水洗涤后，加入碱变性后收集得到的上清液，自然滴完。加入1mL无菌水，收集滴下的溶液，干燥后即为单链DNA文库。

5.阴性筛选：

将步骤4后筛选得到的单链DNA文库进行阴性筛选，阴性筛选的具体操作为：培养人鼻咽癌细胞HONE至铺满瓶底95%，去除培基后用缓冲液洗涤，然后与无关序列在冰上孵育后，弃溶液，得到处理后的人鼻咽癌细胞株HONE细胞；再将步骤4筛选得到的单链DNA文库溶解，恒温振荡后与经前述处理后的人鼻咽癌细胞HONE细胞在冰上孵育，孵育完成后收集细胞接触后的溶液。

6.多轮筛选：

将步骤5所收集的细胞接触后的溶液替代步骤2中的随机单链DNA文库，继续重复进行上述步骤2-5的操作过程，在第一轮筛选以后，用于细胞孵育筛选的文库量约为200pmol，从第三轮筛选开始，步骤2.2中随机单链DNA文库和预处理后的人鼻咽癌细胞株CNE2细胞在冰上孵育时加入胎牛血清，随着筛选轮数的增加，添加量从5%增加至20%；重复筛选过程中用流式细胞仪监测所得单链DNA文库对人鼻咽癌细胞株CNE2细胞识别能力的增强情况，直至6轮筛选后单链DNA文库对人鼻咽癌细胞株CNE2细胞的识别能力满足要求，将所得产物（产物中含有15条序列）经克隆测序分析，对测序结果整理分析后，最终可得到富集度高的三条序列，这三条序列即为上述本实施例的可用于检测人鼻咽癌细胞株CNE2细胞的核酸适配体。

用mfold软件对该本发明的三条序列进行二级结构模拟。用mfold软件对本发明的三条序列进行二级结构模拟后的结构示意图如图2-图4所示。

实施例3

流式细胞仪检测本发明的三条核酸适配体与人鼻咽癌细胞株CNE2细胞的结合效果及其特异性。将处于对数期生长的人鼻咽癌细胞株CNE2细胞用无酶消化液消化后打散，2000rpm离心去上清，用5mL PBS离心洗涤两次。人鼻咽癌细胞株CNE2细胞与含250nM DNA序列（包括序列1：FAM-T10、序列2：FAM-T11、序列3：FAM-T12和序列4：FAM-Lib阴性探针）的binding buffer冰上孵育半小时，2000rpm去上清，用400μL binding buffer洗涤两次，最后加入200μL binding buffer，用于流式细胞仪检测，以人鼻咽癌细胞株HONE作为对照，检测结果如图5、图6所示。由图5、图6的检测结果证明，本发明的T10、T11、T12三条核酸适体均对靶细胞人鼻咽癌细胞CNE2细胞具有较强的特异性识别能力，而对对照细胞人鼻咽癌细胞株HONE细胞无识别，与阴性探针（即上述的序列4：FAM-Lib）也无识别。

实施例4

激光共聚焦检测本发明的三条核酸适配体与人鼻咽癌细胞株CNE2细胞的结合效果及其特异性。在激光共聚焦小皿中分别培养人鼻咽癌细胞株CNE2细胞和人鼻咽癌细胞株HONE细胞，倒出培养基，用PBS将人鼻咽癌细胞株CNE2细胞和人鼻咽癌细胞株HONE细胞洗涤三次，然后与含250nM上述本发明的三条核酸适体的binding buffer冰上孵育半小时，倒出反应液，用binding buffer洗涤三次，最后加入200μL binding buffer用于检测，检测结果如图7所示，CNE2细胞表示人鼻咽癌细胞株CNE2细胞，HONE表示人鼻咽癌细胞株HONE细胞。检测结果表明：本发明的三条核酸适体均能识别原位生长状态下的靶细胞，即人鼻咽癌细胞株CNE2细胞，而不能识别对照细胞，即人鼻咽癌细胞株HONE细胞。

实施例5

流式细胞仪测定本发明的三条核酸适配体对人鼻咽癌细胞株CNE2细胞的解离常数

特异性检测的操作与实施例3的操作基本一致，平行配制不同浓度的含本发明的核酸适配体的反应液与人鼻咽癌细胞株CNE2细胞孵育，以流式细胞仪的荧光几何平均值为纵坐标，以核酸适配体的浓度为横坐标，由Y=Bmax*X/（Kd+X）方程模拟曲线，得到本发明的三条核酸适配体的解离常数绘制曲线，如图8-10所示，由此可得到解离常数Kd，如下表1所示。图8-图10及表1的检测结果表明：T10、T11及T12与靶细胞，即人鼻咽癌细胞株CNE2细胞的结合能力很强，解离常数均在纳摩尔级别。

表1：解离常数结果

序列名	解离常数（纳摩尔）
		T10	120.3±1.2
T11	131.8±2.3
		T12	81.4±2.6

Claims (8)

1.一种核酸适配体，其特征是，所述核酸适配体为

a：5’-CGTTCGTCAGGAGTAGAGGCXCCTGCTGACTGAACCTGACG-3’，

所述X为5’-TGCCACGTGTTGGTGGAGGGAAGGGTTTAGGATTTAGGGG-3’、

5’-TGGACCGGAGGTTGGGGGATGGGTGTTGGATTTGGGAGGA-3’或

5’-TAGCGGCACACTATGGGAGGCGGTGGGGGGTTCGGCGGTG-3’；

b：与a所述核酸适配体具有60%以上同源性且具有检测人鼻咽癌细胞株CNE2细胞功能；

c：在严紧条件下，与a或b的序列进行杂交的序列；或

d：a、b或c的核酸适配体序列转录的RNA序列。

2.如权利要求1所述的核酸适配体，其特征是，所述核酸适配体在保持整体结构不变的前提下，所述核酸适配体的核苷酸序列上的任一位置被磷酸化、甲基化、氨基化、巯基化或同位素化。

3.一种核酸适配体衍生物，其特征是，所述核酸适配体衍生物为如权利要求1或2的所述核酸适配体的核苷酸序列的骨架衍生出的硫代磷酸酯衍生物或核酸适配体的相对应的肽核酸。

4.一种如权利要求1或2的核酸适配体的筛选方法，其特征是，包括以下步骤，

1、合成以下序列所示的随机单链DNA文库和引物：

随机单链DNA文

库:5’-CGTTCGTCAGGAGTAGAGGCNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNCCTGCTGACTGAACCTGACG-3’，

5’端引物：5’-FAM-CGTTCGTCAGGAGTAGAGGC-3’，

3’端引物：5’-Biotin-CGTCAGGTTCAGTCAGCAGG-3’，和

链酶亲和素修饰的琼脂糖微球；

2、cell-SELEX筛选

2.1使无关序列和人鼻咽癌细胞株CNE2细胞接触，得到预处理后的人鼻咽癌细胞株CNE2细胞；

2.2使随机单链DNA文库和预处理后的人鼻咽癌细胞株CNE2细胞接触，孵育，得到处理后的人鼻咽癌细胞株CNE2细胞；

2.3将上述步骤2.2得到的处理后的人鼻咽癌细胞株CNE2细胞和单壁碳纳米管接触，筛选，得到CNE2细胞的特异核酸适配体文库；

3、对步骤2的CNE2细胞的特异核酸适配体文库进行PCR扩增，得到扩增的双链DNA；

4、将步骤3的扩增的双链DNA和链酶亲和素修饰的琼脂糖微球接触，孵育，分离，变性处理，分离，得到单链DNA文库；

5、阴性筛选：使无关序列和人鼻咽癌细胞株HONE细胞接触，得到处理后的人鼻咽癌细胞株HONE细胞；将步骤4得到的单链DNA文库和处理后的人鼻咽癌细胞株HONE细胞接触，收集细胞接触后的溶液；

6、多轮筛选：将步骤5得到的细胞接触后的溶液替代步骤2的随机单链DNA文库，重复步骤2-5至少一次，分析，确认，得到所述核酸适配体。

5.如权利要求4所述的筛选方法，其特征是，所述步骤4的所述变性处理，分离的方法是，加入强碱性溶液，离心，收集上清液，将上清液过除盐柱后收集滴下的溶液，得到单链DNA文库。

6.如权利要求4所述的筛选方法，其特征是，所述步骤6中，分析，确认的方法为，在步骤2得到的CNE2细胞的特异核酸适配体文库中加入胎牛血清，使用流式细胞仪监测单链DNA文库对人鼻咽癌细胞株CNE2细胞的识别能力，测序，富集度高的为所述核酸适配体。

7.如权利要求1或2所述的核酸适配体、权利要求3所述的核酸适配体衍生物或权利要求4-6所述的筛选方法得到的核酸适配体在检测人鼻咽癌细胞株CNE2细胞中的应用。

8.如权利要求1或2所述的核酸适配体、权利要求3所述的核酸适配体衍生物或权利要求4-6任一项所述的筛选方法得到的核酸适配体在制备检测人鼻咽癌细胞株CNE2细胞的试剂盒中的应用。