CN107024583B - 硫黄素t适配体、其筛选方法及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种硫黄素T适配体、其筛选方法及用途。本发明利用SELEX方法筛选出光开关染料硫黄素T的适配体序列，并利用硫黄素T的光开关特性以及所述适配体与硫黄素T结合前后的结构变化设计了KRAS基因突变检测的非标记荧光生物传感器，并藉此实现了简单、高效、高选择性的KRAS基因突变检测，能够为肿瘤早期诊断和用药指导提供有效的帮助。

Description

硫黄素T适配体、其筛选方法及应用
技术领域
本发明涉及一种光开关染料适配体，特别是一种改良的硫黄素T适配体，其筛选技术以及应用，例如在KRAS基因突变的非标记检测中的用途，属于生物技术领域。
背景技术
适配体是利用指数富集配体的系统进化(systematic evolution of ligands byexponential enrichment,SELEX)技术从体外庞大的核酸分子文库中筛选获得的单链DNA或RNA。适配体具有高特异性、高亲和度、易合成、易修饰、分子小、无毒以及良好的稳定性等优点，因此在生物传感器中运用十分灵活，是生物传感器理想的识别元件。SELEX技术是20世纪90年代发展起来的一种新的组合化学技术，具有经济、简单、快速、适用范围广等优点。
KRAS基因12号和13号外显子突变是大肠癌的普遍特征。KRAS基因检测是目前医生了解大肠癌等癌症患者癌基因状况最直接、最有效的方法，通过检测不仅可以深入了解癌基因的情况，更重要的是筛选出针对抗表皮生长因子受体靶向药物治疗有效的癌症患者，帮助医生选择对肿瘤病人最有效的治疗方法。因此发展高效检测KRAS基因突变的方法非常必要。目前，实时定量PCR，DNA杂交或者测序等方法均被用于癌基因突变的检测，但是这些检测方法都只能小规模应用，而且价格昂贵，需要一些大型仪器的辅助。与这些方法相比，生物传感器显示出了很大的优势。
具有光开关性质的染料小分子与某些核酸链作用，会发生荧光信号的变化。基于这种性质，以核酸链为基础，将核酸链和光开关染料作为探针，设计非标记的生物传感器，可以实现不同的检测目的。这种方法不仅简单，方便，不用标记，而且不需要依赖于大型仪器和设备，因此展现出了良好的应用前景。目前利用这种方法进行检测已有一些相关报道，但用到的核酸链多为G四链体，由于G四链体可以与多种物质作用并且其效果对环境的要求非常严格，容易受到多种因素的影响。
发明内容
本发明的主要目的在于提供一种硫黄素T适配体、其筛选方法及应用，以克服现有技术中的不足。
为实现前述发明目的，本发明采用的技术方案包括：
本发明实施例提供了一种光开关染料适配体的筛选方法，其包括：将单链DNA文库与捕获链杂交形成杂交文库，之后分离出与所述光开关染料作用的DNA序列，再PCR扩增富集、迭代筛选，从而获得所述光开关染料适配体。
本发明实施例提供了一种硫黄素T适配体的筛选方法，包括以下步骤：
1)将单链DNA文库和第一连接物标记的捕获链杂交，并将形成的杂交文库与第二连接物标记的载体孵育，使所述杂交文库固定到所述载体上，所述第一连接物和第二连接物能够特异性结合；
2)将游离的核酸序列和与捕获链结合能力差的核酸序列从所述载体上洗脱，之后以硫黄素T溶液将与硫黄素T特异性作用的富集库洗脱；
3)收集所述富集库并进行PCR扩增，获得筛选文库；
4)以所述筛选文库作为单链DNA文库，重复进行步骤1)～步骤3)的操作，直至获得所述硫黄素T适配体。
较为优选的，所述单链DNA文库具有SEQ ID No.1所示的序列，该序列中的n为随机碱基。
较为优选的，所述捕获链具有SEQ ID No.2所示的序列。
本发明实施例提供了一种硫黄素T适配体，其具有SEQ ID No.3所示的序列。
本发明实施例提供了一种KRAS基因突变检测探针对，其包括：
包含KRAS突变基因互补序列的第一探针，其一端连接有第一核酸序列；
以及，包含KRAS突变基因互补序列的第二探针，其一端连接有第二核酸序列；
并且，当所述第一探针和第二探针与KRAS突变基因杂交结合后，所述第一核酸序列和第二核酸序列邻接而组成SEQ ID No.3所示的核酸序列。
较为优选的，所述第一探针和第二探针分别具有SEQ ID No.4、SEQ ID No.5所示的序列。
本发明实施例还提供了所述硫黄素T适配体或所述KRAS基因突变检测探针对在制备KRAS基因突变检测传感器、试剂盒或检测系统中的用途。
本发明实施例还提供了一种KRAS基因突变检测传感器，包括：将所述硫黄素T适配体的序列一分为二并形成两个裂解序列后，在该两个裂解序列的末端分别连接KRAS突变基因互补序列而形成的第一探针和第二探针。
本发明实施例还提供了一种试剂盒，其包括：所述的KRAS基因突变检测探针对；以及，硫黄素T。
本发明实施例还提供了一种KRAS基因突变检测系统，其包括：
所述的KRAS基因突变检测探针对，用以与待检测的KRAS基因共同孵育而形成待检测体系；
硫黄素T，用于与所述待检测体系共同孵育；以及，
荧光光谱仪，用于检测所述待检测体系在与硫黄素T共同孵育前后的荧光强度变化。
与现有技术相比，本发明的优点包括：
1)提供了一种高效率的光开关染料适配体筛选方法，并藉此方法筛选出了具有良好的特异性和亲和力的硫黄素T适配体；
2)基于所述硫黄素T适配体与硫黄素T特异性作用的荧光变化，可以实现非标记检测的目的。
3)基于所述硫黄素T适配体设计了一种可用于检测KRAS基因突变的试剂盒、传感器、检测系统及检测方法，其操作简单、方便，选择性好，准确度高，可以大规模应用，成本低廉。
附图说明
图1是本发明一典型实施案例中一种利用SELEX方法筛选硫黄素T适配体的示意图；
图2a是实施例1筛选得到的一系列硫黄素T适配体及优化硫黄素T适配体与硫黄素T作用的荧光增强效果曲线图；
图2b是图2a中优化硫黄素T适配体的构型图；
图3是实施例1所获优化硫黄素T适配体和随机链与硫黄素T作用的荧光强度比较图；
图4a是实施例1所获优化硫黄素T适配体与硫黄素T作用的亲和力情况的表征图；
图4b是实施例1所获优化硫黄素T适配体与硫黄素T的作用比例测试图；
图5是实施例3中用以检测KRAS突变基因的非标记生物传感器的设计原理图；
图6a是实施例3中以非标记生物传感器检测KRAS基因突变链与野生链的效果比较图；
图6b是实施例3中以非标记生物传感器检测KRAS基因突变的线性关系图。
具体实施方式
如前所述，鉴于现有技术存在的诸多缺陷，本案发明人经长期研究和大量实践，得以提出了本发明的技术方案，如下将予以更为具体的说明。
本发明实施例首先提供了一种光开关染料适配体的筛选方法，其包括：将单链DNA文库与捕获链杂交形成杂交文库，之后分离出与所述光开关染料作用的DNA序列，再PCR扩增富集、迭代筛选，从而获得所述光开关染料适配体。
进一步的，本发明实施例的一个方面提供了一种改良硫黄素T适配体(SELEX)的筛选方法，其可以包括以下步骤：
1)将单链DNA文库和捕获序列杂交，杂交文库与特定载体孵育。
2)靶分子洗脱特异性结合的序列并进行扩增，纯化，再筛选。
3)研究最终富集获得的每个序列的适配潜力，并进行改造优化，得到靶分子的最优适配体。
进一步的，所述筛选方法包括以下步骤：
1)将单链DNA文库和第一连接物标记的捕获链杂交，并将形成的杂交文库与第二连接物标记的载体孵育，使所述杂交文库固定到所述载体上，所述第一连接物和第二连接物能够特异性结合；
2)将游离的核酸序列和与捕获链结合能力差的核酸序列从所述载体上洗脱，之后以硫黄素T溶液将与硫黄素T特异性作用的富集库洗脱；
3)收集所述富集库并进行PCR扩增，获得筛选文库；
4)以所述筛选文库作为单链DNA文库，重复进行步骤1)～步骤3)的操作，直至获得所述硫黄素T适配体。
其中，所述单链DNA文库两端引物序列固定，中间有多个(例如30～33个)随机碱基。例如，较为优选的，所述单链DNA文库具有SEQ ID No.1所示的序列，即：5’-GGAGGCTCTCGGGACGAC-n30-GTCGTCCCGATG-3’，该序列中的n为随机碱基。
其中，所述3’端生物素标记的捕获序列与单链DNA文库有多个(例如，15～18个)碱基互补。例如，较为优选的，所述捕获链具有SEQ ID No.2所示的序列，即：5’-GTCGTCCCGAGAGCCATA-3’。因而，DNA杂交文库在琼脂糖树脂上的固定可以是依赖链霉亲合素与生物素的特异性作用。
其中，对筛选得到的适配体进行缩短，可得到更优的序列长度(例如33个)，特别是例如SEQ ID No.3所示的序列，即：
5’-GACGACGACACAGGATTAATCTTATTAGTCGTC-3’。
在一些实施方案中，所述第一连接物和第二连接物选自生物素及链霉亲和素。所述载体包括琼脂糖树脂。例如，所述捕获序列的3’端可以标记有生物素。
在一些较为具体的实施案例中，所述的筛选方法可以包括以下步骤，
(1)单链DNA文库与捕获链杂交；
(2)将杂交的DNA文库固定；
(3)分离与硫黄素T作用的DNA序列；
(4)PCR扩增富集步骤3)所获的DNA序列，迭代筛选；
(5)克隆和测序步骤4)所获的DNA序列，分析、优化序列，获得所述硫黄素T适配体。
在前述实施案例中，步骤(2)中固定前杂交DNA文库浓度的大于200nmol。
在前述实施案例中，步骤(3)中硫黄素T洗脱时孵育时间优选为约5分钟左右。
在前述实施案例中，步骤(4)中PCR解链温度优选为约92℃左右，退火温度为约58℃左右，延伸温度为约72℃左右。
显然的，在前述的筛选方法中，诸如单链DNA文库与捕获链的杂交、杂交文库的固定、PCR扩增等均是在本领域技术人员悉知的、合适的液相体系，特别是缓冲体系中进行，其相关工艺条件等亦均是本领域技术人员参考本领域的工具书、教科书等而很容易的选择的，故而此处不再予以详细描述。
本发明实施例提供了一种优化的硫黄素T适配体，其具有SEQ ID No.3所示的序列。该硫黄素T适配体可以高效特异的结合靶分子硫黄素T，亲和力约为4μM，不易受环境影响，而且与随机链相比，该硫黄素T适配体与硫黄素T作用后的荧光增强效果有很明显的优势，为生物传感器的设计提供了一种新的研究平台。
本发明实施例提供了一种KRAS基因突变检测探针对，其包括：
包含KRAS突变基因互补序列的第一探针，其一端连接有第一核酸序列；
以及，包含KRAS突变基因互补序列的第二探针，其一端连接有第二核酸序列；
并且，当所述第一探针和第二探针与KRAS突变基因杂交结合后，所述第一核酸序列和第二核酸序列邻接而组成SEQ ID No.3所示的核酸序列。
更为具体的，利用所述探针对进行KRAS基因突变检测的原理在于：通过将所述硫黄素T适配体的序列一分为二形成两个裂解序列，可以保存该适配体染料作用保守区域的完整性。而通过在该两个裂解序列的末端非保守区域连接KRAS基因的突变基因的互补序列而形成第一、第二探针，预测当KRAS基因突变型存在时，该两条第一、第二探针的距离被拉近，染料作用保守区域重新形成并与染料(即硫黄素T)作用，使荧光增强。
较为优选的，所述第一探针和第二探针分别具有SEQ ID No.4、SEQ ID No.5所示的序列。
本发明实施例还提供了所述硫黄素T适配体或所述KRAS基因突变检测探针对在制备KRAS基因突变检测传感器、试剂盒或检测系统中的用途。
例如，本发明实施例提供了一种KRAS基因突变检测传感器，包括：
将所述硫黄素T适配体序列一分为二后，分别在形成的两个裂解序列的末端连接KRAS突变基因互补序列而形成的第一探针和第二探针。
而藉由该传感器进行检测的方法可以包括：
1)将KRAS的突变基因序列和野生基因序列分别与第一探针及第二探针孵育。
2)在步骤1)的孵育体系中加入硫黄素T继续孵育，并用荧光光谱仪检测该体系的荧光强度变化。
前述的KRAS突变型和野生型基因的序列可分别如SEQ ID No.6、SEQ ID No.7所示，即，分别为：
5’-GCTGGTGATGTAGGCAAGAGTGCC-3’
5’-GCTGGTGGCGTAGGCAAGAGTGCC-3’。
同理，该传感器也可用于其它KRAS突变型的检测。
本发明实施例还提供了一种检测试剂盒，其包括：所述的KRAS基因突变检测探针对；以及，硫黄素T。
本发明实施例还提供了一种KRAS基因突变检测系统，其包括：
所述的KRAS基因突变检测探针对，用以与待检测的KRAS基因共同孵育而形成待检测体系；
硫黄素T，用于与所述待检测体系共同孵育；以及，
荧光光谱仪，用于检测所述待检测体系在与硫黄素T共同孵育前后的荧光强度变化。
在基于前述试剂盒、传感器或检测系统的KRAS基因突变检测方法中，所述第一探针、第二探针和待检测KRAS基因可以有一定的摩尔浓度比，例如可以为约1:1:1。
又及，在基于前述试剂盒、传感器或检测系统的KRAS基因突变检测方法中，荧光检测的激发波长可以在425nm附近，发射波长可以在490nm附近。
本发明利用SELEX方法筛选出光开关染料硫黄素T的适配体序列，利用硫黄素T的光开关特性以及所述硫黄素T适配体与硫黄素T结合前后的结构变化设计KRAS基因突变检测的非标记荧光生物传感器、试剂盒、检测系统及方法，可以实现简单、高效、高选择性的KRAS基因突变检测，能够为肿瘤早期诊断和用药指导提供有效的帮助。
以下结合具体实施例对上述方案做进一步说明。应理解，这些实施例是用于说明本发明而不限于限制本发明的范围。实施例中采用的实施条件可以根据具体厂家的条件做进一步调整，未注明的实施条件通常为常规实验中的条件。
实施例1参阅图1，本实施例涉及的一种光开关染料硫黄素T适配体的筛选方法可以包括如下具体步骤：
(1)链霉亲和素标记的琼脂糖树脂加入到空柱中，静置沉降，然后用400μl SELEXbuffer洗5次；
(2)将1nmol ssDNA库和生物素标记的捕获序列按1:2摩尔比杂交，在95℃水浴中加热5min，然后自然冷却至室温。将上述杂交后的ssDNA库与亲和柱孵育(重复过柱约3次)，固定到亲和柱上；
(3)先用SELEX buffer洗脱游离的以及结合能力差的序列，再用100μM硫黄素T溶液洗脱3次，每次孵育约5分钟，得到与硫黄素T特异性作用的富集库；
(4)将富集到的DNA序列进行PCR扩增得到第二轮的筛选文库200pmol，反复进行直到得到非常富集的ssDNA文库；
(5)对最终得到的DNA序列进行克隆，测序，并分析序列的二级结构，优化序列，获得优化的硫黄素T适配体，其构型如图2b所示。
实施例2采用如下方法对实施例1所获硫黄素T适配体(如下简称“适配体”)的亲和力、荧光增强效果、特异性进行测试。具体步骤如下：
(1)分别配置终浓度约1μM适配体(ThT.2-2)及适配体的改造链(ThT.2、ThT.2-1)与2μM硫黄素T(ThT)的混合溶液，以425nm波长为激发光，检测荧光的变化，背景为未加DNA链的2μM硫黄素T溶液，结果如图2a所示。
(2)分别配置不同摩尔比例的硫黄素T与所述适配体的混合溶液，总摩尔浓度为5μM,以425nm波长为激发光，检测一下荧光的变化，证明所述适配体和硫黄素T的作用比例为1:1。
(3)分别配置浓度约1μM的所述适配体(ThT.2-2)和4条随机链ThT.2-4、random1～3)与2μM硫黄素T的混合溶液，以425nm波长为激发光，检测荧光的变化，背景为未加DNA链的2μM硫黄素T溶液，结果如图3所示。
4)分别配置终浓度约0.1、0.25、0.5、1、2、4、8、16、32μM的适配体与1μM硫黄素T的混合溶液，以425nm波长为激发光，检测荧光的变化，背景为未加DNA链的1μM硫黄素T溶液，得到所述适配体与硫黄素T作用的亲和力，结果如图4a、图4b所示。
实施例3参阅图5，基于实施例1所获适配体设计检测KRAS基因突变的非标记生物传感器。而藉由该传感器实施的KRAS基因突变检测方法如下：
(1)配置两条DNA探针(ThT.2-2-S1及ThT.2-2-S2，序列分别如SEQ ID No.4、SEQID No.5所示)，并将其与KRAS基因的突变型(KRAS-mut)和KRAS的野生型(KRAS-wt)的溶液混合，孵育10min，之后加入硫黄素T并再孵育10分钟，检测荧光，激发波长为425nm，背景为未加入KRAS基因的硫黄素T和探针的混合物，前述DNA探针以及硫黄素T浓度均为1μM，测试结果如图6a所示。
(2)配置浓度分别为0.2、0.4、0.6、0.8、1.0μM的KRAS突变基因与1μM的所述DNA探针的混合物，按照步骤(1)的方法测定荧光变化，获得KRAS突变基因与荧光增强效果的线性关系，如图6b所示。
上述实例只为说明本发明的技术构思及特点，旨在让熟悉此项技术的人是能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所做的等效变换或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种硫黄素T适配体的筛选方法，其特征在于包括以下步骤：
1）将单链DNA文库和第一连接物标记的捕获链杂交，并将形成的杂交文库与第二连接物标记的载体孵育，使所述杂交文库固定到所述载体上，所述第一连接物和第二连接物能够特异性结合；
2）将游离的核酸序列和与捕获链结合能力差的核酸序列从所述载体上洗脱，之后以硫黄素T溶液将与硫黄素T特异性作用的富集库洗脱；
3）收集所述富集库并进行PCR扩增，获得筛选文库；
4）以所述筛选文库作为单链DNA文库，重复进行步骤1）～步骤3）的操作，直至获得序列如SEQ ID No.3所示的硫黄素T适配体。
2.根据权利要求1所述的筛选方法，其特征在于：所述单链DNA文库的序列如SEQ IDNo.1所示，该序列中的n为随机碱基。
3.根据权利要求1所述的筛选方法，其特征在于：所述捕获链的序列如SEQ ID No.2所示。
4.根据权利要求1所述的筛选方法，其特征在于：所述第一连接物和第二连接物选自生物素及链霉亲和素，所述载体包括琼脂糖树脂。
5.一种硫黄素T适配体，其特征在于它的序列如SEQ ID No.3所示。
6.一种KRAS基因突变检测探针对，其特征在于包括第一探针和第二探针，将SEQ IDNo.3所示核酸序列一分为二形成两个裂解序列后，在该两个裂解序列的末端分别连接KRAS突变基因互补序列而形成所述第一探针、第二探针。
7.权利要求5所述硫黄素T适配体或权利要求6所述KRAS基因突变检测探针对在制备KRAS基因突变检测传感器、试剂盒或检测系统中的用途。
8.一种KRAS基因突变检测传感器，其特征在于包括：将权利要求5所述硫黄素T适配体的序列一分为二并形成两个裂解序列后，在该两个裂解序列的末端分别连接KRAS突变基因互补序列而形成的第一探针、第二探针。
9.一种试剂盒，其特征在于包括：权利要求6所述的KRAS基因突变检测探针对；以及，硫黄素T。
10.一种KRAS基因突变检测系统，其特征在于包括：
权利要求6所述KRAS基因突变检测探针对，用以与待检测的KRAS基因共同孵育而形成待检测体系；
硫黄素T，用于与所述待检测体系共同孵育；以及，
荧光光谱仪，用于检测所述待检测体系在与硫黄素T共同孵育前后的荧光强度变化。
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