CN113151282A - 结合新型冠状病毒（SARS-CoV-2）核衣壳蛋白的核酸适配体及其用途 - Google Patents

Abstract

结合新型冠状病毒(SARS‑CoV‑2)核衣壳蛋白的核酸适配体及其用途，具体地该核酸适配体包含SEQ ID NO：1‑4中任一个所示的核苷酸序列或由其组成。本发明的核酸适配体及其衍生物具有能够快速化学合成、分子量小、稳定、易于保存和标记等优点。可以用于检测、诊断、成像以及治疗等方面。

Description

结合新型冠状病毒(SARS-CoV-2)核衣壳蛋白的核酸适配体及 其用途

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种由SEQ ID NO:1-4所示的可用于结合新型冠状病毒核衣壳蛋白(N蛋白)(the nucleocapsid protein of SARS-CoV-2)的核酸适配体及其用途。

背景技术

冠状病毒(Coronavirus)是具有外套膜的正链单股RNA病毒，是感染人和脊椎动物的病原体，可引起多种急慢性疾病。到目前为止，能够使人类致病的冠状病毒一共有7种，包括SARS冠状病毒和MERS冠状病毒等。

2020年1月12日，世界卫生组织正式将造成肺炎疫情的新型冠状病毒命名为“2019新型冠状病毒(2019-nCoV)”，其后在2020年2月11-12 日国际病毒分类委员会(International Committee on Taxonomy of Viruses, ICTV)宣布，新型冠状病毒(2019-nCoV)的正式分类名为严重急性呼吸综合征冠状病毒2(severe acute respiratorysyndrome coronavirus 2， SARS-CoV-2)，世界卫生组织(WHO)同日在日内瓦举办全球研究和创新论坛上宣布，由这一病毒导致的疾病的正式名称为“COVID-19”。几种命名均表示同一种病毒引起的肺炎，以下以SARS-CoV-2作为新型冠状病毒简称。新型冠状病毒可以人传人，对比SARS冠状病毒，SARS-CoV-2 致死率低，但传播较快，SARS-CoV-2感染者会出现急性、严重呼吸道疾病，伴有发热、咳嗽、气短及呼吸困难，严重的病例还会出现肾功能衰竭和死亡，当前并无有效的治疗药物。新型冠状病毒检测方法目前也并不完善，需依赖特定仪器、特殊实验室和专业技术人员，且检测过程复杂，不能满足及时检测需求，且存在一定的漏检率。SARS-CoV-2由于潜伏期具有传染性，为了排查很多无症状感染者，迫切需要发展现场、实时、便捷的家庭检测方法。

研究发现，新型冠状病毒(SARS-CoV-2)包含4种结构蛋白，分别是核衣壳蛋白(N蛋白)、包膜蛋白(E蛋白)、膜蛋白(M蛋白)和刺突蛋白(S蛋白)。2020年1月10日前后，新型冠状病毒基因组全序列由复旦大学上海市公共卫生临床中心提交至NCBI GenBank数据库，其中28274—29533位为“N”基因，可产生病毒核衣壳蛋白(N蛋白)。参考其它冠状病毒，已知N蛋白与病毒基因组RNA相互缠绕形成病毒核衣壳，在病毒RNA的合成过程中发挥着重要的作用。同时，N蛋白相对保守，在病毒的结构蛋白中含量非常丰富，感染早期机体就能产生抗N蛋白的高水平抗体。在抗击SARS病毒中，核衣壳蛋白已被证明是良好的诊断标记，目前新型冠状病毒结构与SARS病毒类似并且新型冠状病毒引起的肺炎，相应的疫苗、小分子药物甚至抗体药物都在开发中。目前SARS-CoV-2感染肺炎的检测方法主要是实时逆转录酶聚合酶链检测方法(rRT-PCR)。不管是小分子药物、疫苗或抗体的开发周期都较长，而筛选得到的新型冠状病毒核衣壳蛋白特异的核酸适配体既可以用于快速建立有效的检测方法，也可能用于新冠肺炎的治疗。

核酸适配体(aptamer)是指通过指数富集的配基系统进化技术(SELEX) 筛选分离得到的DNA或者RNA分子，它可以与其它靶标如蛋白质、金属离子、小分子、多肽甚至整个细胞进行高亲和力和特异性的结合，因此在生化分析、环境监测、基础医学、新药合成等方面展示广阔的前景。核酸适配体与抗体相比分子量小，稳定性更好，易改造修饰，无免疫原性，制作周期短，可以通过人工合成等优势，免去了动物免疫、饲养、蛋白提取和纯化等一系列流程。基于核酸适配体的性质，新型冠状病毒核衣壳蛋白的核酸适配体具有结构相对稳定，简单，易于修饰以及短期内可以人工合成的优势。因此，本领域对具有针对新型冠状病毒核衣壳蛋白的结合亲和力高的核酸适配体存在需求。

发明内容

为了克服现有技术的不足，本发明要解决的问题是提供一种具有高度特异性、分子量小、化学性质稳定、易于保存和标记的能够结合新型冠状病毒核衣壳蛋白的核酸适配体及其衍生物，还相应提供所述核酸适配体的用途。

为了解决上述技术问题，使用体外指数富集的配基系统进化(SELEX) 技术，筛选得到了特异性结合新型冠状病毒核衣壳蛋白的核酸适配体。具体的，本发明人设计并合成了一个随机单链DNA文库和相应的引物，用来筛选具有高度特异性、分子量小、化学性质稳定、易于保存和标记的能够结合新型冠状病毒核衣壳蛋白的核酸适配体，由此筛选得到一些特异性结合新型冠状病毒核衣壳蛋白的核酸适配体，并检测了它们与新型冠状病毒核衣壳蛋白的结合能力。在此基础上，本发明人完成了本发明。

在一个方面，本发明提供结合新型冠状病毒SARS-CoV-2核衣壳蛋白的核酸适配体，所述核酸适配体包含以下序列或由以下序列组成：

如下所示的SEQ ID NO:1-4中任一个所示的核苷酸序列：

或

(2)与SEQ ID NO:1-4中任一个所示的核苷酸序列具有至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少94％、至少 96％、至少98％或至少99％的同源性且特异性结合SARS-CoV-2核衣壳蛋白的核苷酸序列，例如可将SEQ ID NO:1-4所示的核苷酸序列删除或增加部分互补的核苷酸；或

(3)由(1)或(2)的核苷酸序列转录且特异性结合SARS-CoV-2核衣壳蛋白的RNA序列。

另外，本领域技术人员应该理解，作为对上述技术方案的改进，可对上述核酸适配体的核苷酸序列进行修饰，例如，磷酸化、甲基化、氨基化、巯基化、用硫取代氧、用硒取代氧或连接同位素化等，条件是这样修饰后得到的核酸适配体序列具有合乎需要的性质，例如，可以具有与修饰前的母体核酸适配体序列相等或更高的结合SARS-CoV-2核衣壳蛋白的亲和力，或虽然亲和力没有明显提升但是具有更高的稳定性。

所以，在一些实施方案中，所述核酸适配体的核苷酸序列被修饰且修饰后的核酸适配体特异性结合SARS-CoV-2核衣壳蛋白，所述修饰选自磷酸化、甲基化、氨基化、巯基化、用硫取代氧、用硒取代氧和同位素化中的至少一种。

在另一方面，本发明还提供核酸适配体的缀合物。本领域技术人员应该理解，作为对上述技术方案的改进，可在上述核酸适配体的核苷酸序列上连接荧光物质，放射性物质、治疗性物质、生物素、地高辛、纳米发光材料、小肽、siRNA或酶标记等，条件是这样修饰后得到的核酸适配体序列具有合乎需要的性质，例如，可以具有与修饰前的母体核酸适配体序列相等或更高的结合SARS-CoV-2核衣壳蛋白的亲和力，或虽然亲和力没有明显提升但是具有更高的稳定性。

换言之，以上不论是经部分取代或经过修饰后的核酸适配体序列，都具有原核酸适配体基本相同或类似的分子结构、理化性质和功能，都可应用于与新型冠状病毒核衣壳蛋白的结合。

此外，作为一个总的技术构思，本发明还提供核酸适配体衍生物，所述衍生物是由前述所有技术方案中所述核酸适配体的核苷酸序列的骨架衍生出的硫代磷酸酯骨架，或者是前述所有技术方案中所述核酸适配体改造成的相应肽核酸。条件是所述衍生物都具有与原核酸适配体基本相同或类似的分子结构、理化性质和功能，且都与新型冠状病毒核衣壳蛋白结合。

在另一个方面，本发明还提供前述任一项所述的核酸适配体或上述核酸适配体的缀合物或上述的核酸适配体的衍生物在开发夹心法检测中的用途。

本文所使用的，“夹心法”是指通过两个适配体结合同一蛋白的不同位置来进行检测，例如但不限于夹心ELISA法。本发明筛选结合新型冠状病毒SARS-CoV-2核衣壳蛋白的核酸适配体的方法其是在SELEX筛选方法的基础上，在磁珠法筛选的步骤进一步在结合缓冲液使用了较高的氯化钠浓度梯度的DPBS，并在结合缓冲液中使用了高血清浓度梯度。

因N蛋白的等电点较高，容易吸附核酸，因此SELEX筛选过程中除了常规的反筛步骤，还需要去除非特异性吸附在蛋白表面的序列，才能使特异性结合N蛋白的高亲和力的序列不断富集从而最终获得。在结合缓冲液中逐步增加盐浓度，可以去除那些非特异性结合的序列，从而增加筛选过程的严格性，使保留的序列亲和力更高。

核酸适配体筛选常规条件是在离子缓冲液中进行，本实施例在筛选条件下逐步添加一定浓度的血清，一方面因为血清中含有丰富的蛋白，可以与磁珠表面的蛋白竞争性的与文库结合，从而去除那些与靶标N蛋白结合能力很弱或者只是吸附上的序列。另一方面，适配体在血清环境中结合靶标，可以更好的满足后期基于核酸适配体开发的应用的实际检测环境。

本发明所使用的术语“硫代磷酸酯骨架”具有本领域普通技术人员一般理解的含义，其是指RNA和DNA核酸适配体的磷酸二酯骨架的非桥键氧原子可以被一个或两个硫原子取代，分别产生具有硫代磷酸酯或二硫代磷酸酯键的硫代磷酸酯骨架。已知这样的硫代磷酸酯骨架具有增加的对其靶标的结合亲和力，以及对核酸酶降解的增强的抗性。

本发明所使用的术语“肽核酸”具有本领域普通技术人员一般理解的含义，其是指一种人工合成DNA分子类似物，于1991年由Nielsen等首次报道。用N-2-(氨乙基)-甘氨酸(N-(2-a分钟oethyl)-glycine)单位代替糖-磷酸酯骨架作为重复结构单元，合成了以肽键连接的寡核苷酸模拟物，称为肽核酸。由于肽核酸(PNA)没有如DNA或RNA上的磷酸基团，因此PNA与DNA之间缺乏电性相斥的现象，使两者之间的结合强度大于 DNA与DNA之间的结合强度。

在另一方面，本发明提供前述核酸适配体、其缀合物或其衍生物在由以下各项组成的组中的任意一项中的用途：

(1)检测新型冠状病毒(SARS-CoV-2)核衣壳蛋白的浓度；

(2)纯化新型冠状病毒(SARS-CoV-2)核衣壳蛋白；

(3)新型冠状病毒(SARS-CoV-2)核衣壳蛋白的成像；

(4)结合新型冠状病毒(SARS-CoV-2)并将其富集；

(5)检测新型冠状病毒(SARS-CoV-2)的存在；或

(6)制备新型冠状病毒(SARS-CoV-2)感染的肺炎诊断和治疗的药物。

在另一方面，本发明提供试剂盒，所述试剂盒包含前述核酸适配体、其缀合物或其衍生物。

在另一方面，上述任一项的核酸适配体或上述核酸适配体的缀合物或上述核酸适配体的衍生物在制备试剂盒中的用途，其中所述试剂盒用于例如纯化新型冠状病毒核衣壳蛋白或检测新型冠状病毒核衣壳蛋白，或用于新型冠状病毒(SARS-CoV-2)核衣壳蛋白的成像，结合新型冠状病毒 (SARS-CoV-2)并将其富集，检测新型冠状病毒(SARS-CoV-2)，新型冠状病毒(SARS-CoV-2)感染的肺炎诊断和治疗中的应用。

由于

SARS-CoV-2—N48(SEQ ID NO:2)与SARS-CoV-2—N58(SEQ ID NO: 3)，SARS-CoV-2—N48(SEQ ID NO:2)与SARS-CoV-2—N61(SEQ ID NO: 4)；SARS-CoV-2—N15(SEQ ID NO:1)与SARS-CoV-2—N58(SEQ ID NO: 3)，SARS-CoV-2—N15(SEQ ID NO:1)与SARS-CoV-2—N61(SEQ ID NO: 4)，结合在蛋白的不同位置，因此可以配对使用，用于开发夹心法检测SARS-CoV-2的核衣壳蛋白。所以，在又一个方面，本发明提供上述任一项的核酸适配体或上述核酸适配体的缀合物或上述核酸适配体的衍生物在开发夹心法检测中的用途。

在本发明中，夹心法检测是指已知二个结合同一蛋白不同位点的核酸适配体之一包被在载体上，然后将含有抗原(如本专利中的新型冠状病毒 SARS-CoV2的N蛋白)的待检测标本加入，共同孵育后，抗原结合于包被在载体上的核酸适配体上，然后再加入做了酶或者荧光标记的另一条核酸适配体，该条适配体会连接到抗原上的另外表位上，最后根据酶的反应或者荧光标记判定待测物中的抗原含量。

本发明的有益效果在于：本公开所提供的核酸适配体、其缀合物及其衍生物高度特异性结合SARS-CoV-2核衣壳蛋白，且分子量小、化学性质稳定、易于保存和标记。

附图说明

图1显示利用表面等离子共振(SPR)检测本发明实施例1筛选得到的富集文库与靶标蛋白和对照蛋白结合情况。

图2显示利用表面等离子共振(SPR)检测本发明实施例1筛选得到的4个核酸适配体SARS-CoV-2-N15、SARS-CoV-2-N48、SARS-CoV-2-N58、 SARS-CoV-2-N61与新型冠状病毒(SARS-CoV-2)核衣壳蛋白的亲和力。

图3显示利用表面等离子共振(SPR)检测本发明实施例1筛选得到的4个核酸适配体SARS-CoV-2-N15、SARS-CoV-2-N48、SARS-CoV-2-N58、 SARS-CoV-2-N61与其他几种对照蛋白的结合能力。

图4显示利用表面等离子共振(SPR)检测本发明实施例1筛选得到的核酸适配体SARS-CoV-2-N48与SARS-CoV-2-N58结合在N蛋白的不同位点，SARS-CoV-2-N48与SARS-CoV-2-N61结合在N蛋白的不同位点， SARS-CoV-2-N15与SARS-CoV-2-N58结合在N蛋白的不同位点， SARS-CoV-2-N15与SARS-CoV-2-N61结合在N蛋白的不同位点。

具体实施方式

下面参照具体的实施例进一步描述本发明，但是本领域技术人员应该理解，以下的实施例便于更好的理解本发明，本发明并不限于这些具体的实施例。

以下实施例中的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的实验材料如无特殊说明，均为常规生化试剂，可通过商业途径购买得到。

实施例1：特异性结合新型冠状病毒(SARS-CoV-2)核衣壳蛋白的 ssDNA核酸适配体的筛选

1、合成以下序列所示的随机单链DNA文库和引物：

随机单链DNA文库：

SEQ ID NO:5：5’-GTTCGTGGTGTGCTGGATGTNNNNNNNNNNN NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNTGACACATCCAGCAGCACGA -3’

其中，36个“N”表示36个任意的核苷酸碱基连接而成的序列。该文库由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

引物信息如表1，由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。

表1引物及其序列

其中，引物名称中的S代表正向引物，引物名称中A代表反向引物，序列中的19个A表示由19个腺苷酸(A)组成的polyA尾，“Spacer 18”表示18原子的六乙二醇间臂。在上述3’端引物中所用的“Spacer 18”结构式如下式所示。

引物分别用DPBS缓冲液(氯化钙0.1g/L，氯化钾0.2g/L，磷酸二氢钾0.2g/L，六水氯化镁0.1g/L，氯化钠8g/L，十二水磷酸氢二钠2.8915g/L； PH7.4，25℃)配制成100μM的贮存液，于-20℃保存备用。

2、磁珠法筛选

采用磁珠法筛选，共计筛选5轮，每一轮的筛选条件见表2。

表2新型冠状病毒核衣壳蛋白核酸适配体筛选流程

具体筛选方法如下：

1)羧基磁珠固定新型冠状病毒核衣壳蛋白

取50μl羧基磁珠(Invitrogen,Dynabeads^TMMyOne^TM Carboxylic Acid，#65012)，用200μl超纯水清洗4遍，磁铁垂钓磁珠，去上清。取配置好的NHS(N-羟基琥珀酰亚胺；0.1M水溶液)和EDC(1-(3-二甲氨基丙基)-3- 乙基碳二亚胺盐酸盐；0.4M水溶液)，等体积混合，加入到磁珠中，25℃孵育20分钟活化磁珠表面的羧基，磁珠用PBS缓冲液清洗1遍后备用。

取20μl的新型冠状病毒核衣壳蛋白(购自义翘神州，40588-V08B，浓度为0.75mg/ml)，加入pH4.5的10mM NaAC80μl混匀，加入到上述的活化磁珠中。25℃置于垂直混合仪上孵育60分钟，新型冠状病毒核衣壳蛋白通过蛋白表面的氨基偶联到磁珠表面。

偶联结束，将偶联管置于磁力架上，吸弃上清，取100μl 1M乙醇胺 pH8.5加入到磁珠中，25℃垂直混合仪上孵育10分钟，封闭磁珠表面未反应的活化位点。置于磁力架上，吸弃封闭液。磁珠用200μl PBS清洗4 遍，标记为MB-NP。

2)反筛与筛选

反筛磁珠制备：将his小肽与磁珠偶联，his小肽由杭州丹港生物科技有限公司合成，为9个连续的组氨酸，偶联his蛋白的步骤与偶联新型冠状病毒核衣壳蛋白相同。His小肽的浓度为10mM，用pH3.6的10mM NaAC 溶液稀释，具体的，取20μl his小肽，加入80μlpH3.6的10mM NaAC溶液混匀。其余步骤一样。

文库溶解与变复性处理：取1OD随机单链核苷酸文库，14000rpm离心10分钟，将文库离心到管底，用PBS缓冲液溶解至10μM，混匀后分装到PCR管进行变复性处理。处理过程如下：PCR仪设定程序95℃保持 10分钟，此步骤目的是使折叠的链解开，然后4℃保持5分钟，然后平衡至室温。将处理后的文库加入到50μl的MB-his磁珠，混匀后在垂直混合仪上室温孵育一段时间。置于磁力架上，收集上清，标记为pool-，上清作为单链核酸文库与MB-NP磁珠进行正筛。每一轮磁珠筛选，在进行以新型冠状病毒核衣壳蛋白为靶标的正筛之前都先用MB-his进行反筛，反筛上清作为单链核苷酸文库与MB-NP磁珠进行正筛。具体的为：将反筛后的文库pool-加入到50μl MB-NP磁珠中，在垂直混合仪上25℃孵育40 分钟。置于磁力架上，吸弃上清，保留磁珠，用200μl PBS清洗磁珠4次。最后将清洗后的磁珠加入200μlPBS，沸水浴10分钟，收集上清，标记为 elution-NP。

以elution-NP中的核酸分子为模板，用乳浊液PCR(ePCR)进行扩增。方法如下：将全部模板elution-NP加入2ml PCR mix中混匀，加入4倍体积的ePCR微液滴生成油，涡旋制备乳浊液。将乳浊液分成100μl/管加入到PCR管中，扩增条件如下：95℃预变性2分钟，95℃变性60秒，60℃退火60秒，72℃延伸60秒，共25个循环，4℃保存。ePCR微液滴生成油以及PCRmix购自安徽省昂普拓迈(Aptamy)生物科技有限公司，货号分别为EPO100和ESE2018。

扩增产物用正丁醇纯化：收集所有的ePCR产物于15ml尖底离心管中，加入2倍体积的正丁醇，在旋涡混合器上震荡以充分混匀；台式离心机，9000rpm(转/分钟)于25℃离心10分钟；移弃上相(正丁醇)，得到浓缩的PCR扩增产物，按体积比1：1加入TBE/尿素变性缓冲液，煮沸变性10分钟使DNA变性，随后冰浴1分钟，将所有的样品进行尿素变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，400V电压下电泳至溴酚蓝到达胶底部，使带荧光的FAM标记的正义链与反向的加长的链分开，7M尿素变性聚丙烯酰胺凝胶配方如表3。

表3变性聚丙烯酰胺凝胶配方

成分	用量
		尿素	3.78g
40％聚丙烯酰胺	1.8ml
		5*TBE	1.8ml
ddH2O	2.25ml
		10％APS	60μl
TEMED	15μl

切胶回收FAM标记的链：将凝胶取出放在塑料膜上，Ex(nm)：495，Em(nm)：517检测我们需要的带有FAM标记的ssDNA；用干净的刀片将目的条带直接切下，将胶条转移至1.5mlEP管中并捣碎，加入1ml ddH2O 后沸水浴10分钟将胶中的ssDNA转移至溶液中，离心去除胶的碎片，留上清。上清用正丁醇纯化，得到DNA单链用3KD的透析袋透析过夜，即可作为下一轮筛选的文库；

磁珠法重复筛选5轮，每次操作均以前一次操作中得到的次级文库为起始核酸文库，文库进行变复性处理之后，按照表2的数据，添加相应浓度的血清，调整相应的氯化钠的浓度，然后与偶联好蛋白的磁珠进行孵育。筛选过程中用SPR检测DNA单链文库对SARS-CoV-2核衣壳蛋白识别能力的变化，当DNA单链文库对SARS-CoV-2核衣壳蛋白的识别能力满足要求，即筛选后的DNA单链文库与靶标蛋白的结合能力高于筛选起始投入的文库(图1)，图中pool2，pool4，pool5分别表示第二轮、第四轮和第五轮筛选得到的文库，可以看出第四轮和第五轮得到的文库比第二轮与靶标的亲和力高很多，满足测序要求，将所得文库经高通量测序分析。

3、分析和鉴定多次筛选后得到的核酸适配体：将得到的富集文库产物经高通量测序分析后，挑选若干条序列由通用生物合成，检测亲和力。

在后续检测中，确定了4条序列具有很强的结合能力，将4条序列进行截短之后分别得到了SEQ ID NO:1-4所示的核酸适配体，且验证后具有理想的结合SARS-CoV-2核衣壳蛋白的亲和力，将它们分别命名为 SARS-CoV-2-N15、SARS-CoV-2-N48、SARS-CoV-2-N58、SARS-CoV-2-N61。

实施例2：表面等离子共振(SPR)检测SARS-CoV-2核衣壳蛋白核酸适配体与SARS-CoV-2核衣壳蛋白的亲和力和特异性检测

1.将通用生物合成的核酸适配体SARS-CoV-2-N15、SARS-CoV-2-N48、 SARS-CoV-2-N58、SARS-CoV-2-N61，分别用DPBS缓冲液稀释成500nM。

2.将SARS-CoV-2核衣壳蛋白偶联到CM5芯片表面的第2通道：先用50mM NaOH清洗芯片，进样20μl，流速10μl/分钟，然后用将等体积的EDC(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐；0.4M水溶液)和 NHS(N-羟基琥珀酰亚胺；0.1M水溶液)两个试剂混合后进样50μl活化芯片，流速5μl/分钟。将SARS-CoV-2核衣壳蛋白用pH5.5的10mM醋酸钠稀释至终浓度为50μg/mL后进样，进样体积50μL，流速5μL/分钟， SARS-CoV-2核衣壳蛋白偶联量为2000Ru。进样完成后，进乙醇胺封闭芯片，流速5μL/分钟，进样50μL。第1通道按照上述处理，只是不进行偶联蛋白的步骤，活化和封闭的步骤完全一样，作为对照通道。

3.将溶菌酶(上海生工，#A610308-0005)和新冠病毒SARS-CoV-2 的S1-RBD蛋白(义翘神州，40592-V05H)分别偶联到芯片表面的第3通道和第4通道。

4.检测：使用表面等离子共振仪(GE Healthcare，型号：Biacore T200) 设定动力学检测参数，步骤1中稀释好的4种适配体样品依次流过1、2、 3、4通道，每一个适配体的程序如下：进样30μL/分钟*2分钟，解离30μL/ 分钟*3分钟，再生1M NaCl 30μL/分钟*0.5分钟，将稀释好的核酸适配体依次进样。

亲和力检测数据见图2，每一条曲线是通道2差减通道1之后的曲线，说明了对应的核酸适配体与靶标蛋白N蛋白的结合能力。这些数据说明核酸适配体核衣壳SARS-CoV-2-N15、SARS-CoV-2-N48、SARS-CoV-2-N58、 SARS-CoV-2-N61用SPR仪均检测到与SARS-CoV-2核衣壳蛋白有很强的结合，KD值分别如下表4所示。

表4

名称	亲和力KD(nM)
		SEQ ID NO:1(SARS-CoV-2—N15):	3.28
SEQ ID NO:2(SARS-CoV-2—N48):	1.91
		SEQ ID NO:3(SARS-CoV-2—N58):	7.71
SEQ ID NO:4(SARS-CoV-2—N61):	5.86

特异性数据见图3，说明SARS-CoV-2-N15、SARS-CoV-2-N48、SARS-CoV-2-N58、SARS-CoV-2-N61与对照蛋白溶菌酶(左图)、新冠病毒SARS-CoV-2的S1-RBD蛋白(右图)没有结合或者结合很弱。

实施例3.显示利用表面等离子共振(SPR)检测本发明实施例1筛选得到的四种核酸适配体与N蛋白的结合位点的结合情况

利用表面等离子共振(SPR)，使用实施例2的芯片，将通用生物合成的四条核酸适配体分别稀释到500nM，将SARS-CoV-2-N48进样2分钟，然后接着将SARS-CoV-2-N58进样2分钟，解离2分钟。如图4所示，可见两次进核酸适配体样品的信号均有明显的提升，可以说明SARS-CoV-2-N48与SARS-CoV-2-N58结合在N蛋白的不同的位点。同样的实验方法，验证了SARS-CoV-2-N48与SARS-CoV-2-N61结合在N蛋白的不同位点，SARS-CoV-2-N15与SARS-CoV-2-N58结合在N蛋白的不同位点，SARS-CoV-2-N15与SARS-CoV-2-N61结合在N蛋白的不同位点。 SARS-CoV-2-N48与SARS-CoV-2-N15可能结合的是相同位点或者是结合的位点靠近导致二者无法同时大量的结合靶标蛋白N蛋白。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.特异性结合SARS-CoV-2核衣壳蛋白的核酸适配体，所述核酸适配体包含以下序列或由以下序列组成：

(1)SEQ ID NO：1-4中任一个所示的核苷酸序列，

或

(2)与SEQ ID NO：1-4中任一个所示的核苷酸序列具有至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少94％、至少96％、至少98％或至少99％的同源性且特异性结合SARS-CoV-2核衣壳蛋白的核苷酸序列；或

(3)由(1)的核苷酸序列转录且特异性结合SARS-CoV-2核衣壳蛋白的RNA序列。

2.根据权利要求1所述的核酸适配体，其特征在于所述核酸适配体的核苷酸序列被修饰且修饰后的核酸适配体特异性结合SARS-CoV-2核衣壳蛋白，所述修饰选自磷酸化、甲基化、氨基化、巯基化、用硫取代氧、用硒取代氧和同位素化中的至少一种。

3.核酸适配体的缀合物，其特征在于其为在根据权利要求1或2所述核酸适配体的核苷酸序列上连接其它用于标记、检测、诊断或治疗的物质，且连接所述物质后的所述核酸适配体的缀合物特异性结合新型冠状病毒核衣壳蛋白，所述物质是荧光标记物例如FAM、放射性物质、治疗性物质、生物素、地高辛、纳米发光材料、小肽、siRNA和酶标记中的至少一种。

4.核酸适配体的衍生物，其特征在于所述衍生物是将权利要求1或2所述的核酸适配体或权利要求3所述的核酸适配体的缀合物的核苷酸序列的骨架改造成特异性结合SARS-CoV-2核衣壳蛋白的硫代磷酸酯骨架而得，或者是由权利要求1或2所述的核酸适配体或权利要求3所述的核酸适配体的缀合物改造成的特异性结合SARS-CoV-2核衣壳蛋白的肽核酸。

5.权利要求1或2所述的核酸适配体或权利要求3所述的核酸适配体的缀合物或权利要求4所述的核酸适配体的衍生物在由以下各项组成的组中的任意一项中的用途：

1)检测SARS-CoV-2核衣壳蛋白的浓度；

2)纯化SARS-CoV-2核衣壳蛋白；

3)SARS-CoV-2核衣壳蛋白的成像；

4)结合SARS-CoV-2并将其富集；

5)检测SARS-CoV-2的存在；或

6)制备SARS-CoV-2感染的肺炎诊断和治疗的药物。

6.试剂盒，其包括权利要求1或2所述的核酸适配体或权利要求3所述的核酸适配体的缀合物或权利要求4所述的核酸适配体的衍生物。

7.权利要求1或2所述的核酸适配体或权利要求3所述的核酸适配体的缀合物或权利要求4所述的核酸适配体的衍生物在开发夹心法(优选夹心ELISA法)检测SARS-CoV-2的核衣壳蛋白中的用途。

Images