CN113777141B - 电化学生物传感器及其制备方法和检测新型冠状病毒的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及电化学分析检测领域,公开了一种电化学生物传感器及其制备方法和检测新型冠状病毒的方法。本发明提供的电化学生物传感器包括丝网印刷电极和修饰在所述丝网印刷电极表面的功能层,所述功能层含有聚丙烯胺盐酸盐、二氧化铈以及二茂铁标记的非特异性单链DNA。电化学生物传感器的制备方法包括以下步骤:将含有聚丙烯胺盐酸盐、二氧化铈以及二茂铁标记的非特异性单链DNA的修饰溶液滴涂在丝网印刷电极的表面,进行干燥,以使得所述丝网印刷电极的表面形成功能层。本发明的电化学生物传感器能够实现对新型冠状病毒的快速、高灵敏度检测。
Description
技术领域
本发明涉及电化学分析检测领域,具体地,涉及一种电化学生物传感器及其制备方法和检测新型冠状病毒的方法。
背景技术
为了控制传染源,帮助患者防止病情恶化,提供一种可靠、高效、快速、准确鉴定新型冠状病毒核糖核酸的方法至关重要。病毒核酸可用于早期诊断,已广泛应用于临床,目前新型冠状病毒检测的参考方法是特异性、定量的实时聚合酶链反应(RT-qPCR)检测来自鼻或咽拭子、痰或支气管肺泡灌洗标本的样本。然而,RT-qPCR成本高、耗时长,需要大量的实验室基础设施和培训,阻碍了其目前在资源有限的领域的应用;此外,漫长的过程增加了新冠病毒进一步传播的风险,并阻碍了对所有潜在接触者的广泛检测。
CRISPR/Cas(聚集的规则间隔的短回文重复序列/CRISPR相关核酸酶) 由于其高效率和速度而成为精确核酸检测的新工具。CRISPR-Cas系统是广泛存在于古生菌和细菌中的获得性免疫系统。依据所含Cas蛋白的不同可分为两大类6个型32个亚型:一类CRISPR系统的Cas效应蛋白由多个蛋白协同作用发挥活性,包括Ⅰ型、Ⅲ型和Ⅳ型;二类CRISPR系统的Cas效应蛋白只有一个单独的蛋白构成,包括Ⅱ型、Ⅴ型和Ⅵ型。研究发现的 Cas12、Cas13、Cas14蛋白不仅具有切割特异靶标序列的顺式核酸酶活性,还有切割非特异单链DNA(ssDNA)或单链RNA(ssRNA)的反式核酸酶活性。其中,Cas12作为靶ssDNA序列位点特异性切割的可编程核酸“切刻”工具,具有组成简单、切割效率高的优点。Cas12a蛋白在crRNA与靶标dsDNA或ssDNA结合后不但可切割特异性核酸序列,还可非特异性地切割体系中存在的ssDNA,这一核酸酶活性被称为反式切割活性。在crRNA 的指导下,Cas12蛋白定位于原间隔基邻近基序(PAM),并在PAM位点附近切割DNA链。例如,在CRISPR RNA(crRNA)的介导下,Cas12a蛋白可以识别特定的DNA序列并表现出非特异性单链DNA(ssDNA)切割活性。基于这种反式切割活性,CRISPR-Cas12a体系已被转化为多种用于检测核酸靶标的生物传感器,例如单核苷酸多态性、病原菌、细菌耐药性和病毒。
针对新型冠状病毒,已有文献报道以Cas13酶结合逆转录环介导等温扩增和重组酶聚合酶扩增(RPA)等扩增方法的检测思路,但是在信号读出方面,仍有很大的改进空间,测试条仅提供定性结果,荧光检测系统依赖于昂贵的荧光检测设备和专业人员,这均会给实际应用带来不便。
发明内容
本发明的目的是为了克服现有技术存在的新型冠状病毒检测时信号读出不便的问题,提供一种电化学生物传感器及其制备方法和检测新型冠状病毒的方法,能够实现对新型冠状病毒的快速、高灵敏度检测。
为了实现上述目的,本发明第一方面提供一种电化学生物传感器,包括丝网印刷电极和修饰在所述丝网印刷电极表面的功能层,所述功能层含有聚丙烯胺盐酸盐、二氧化铈以及二茂铁标记的非特异性单链DNA。
优选地,所述聚丙烯胺盐酸盐、所述二氧化铈和所述二茂铁标记的非特异性单链DNA的摩尔比为2×104-3×104:2.5×103-3.5×103:1。
优选地,所述二茂铁标记的非特异性单链DNA的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
本发明第二方面提供一种电化学生物传感器的制备方法,包括以下步骤:将含有聚丙烯胺盐酸盐、二氧化铈以及二茂铁标记的非特异性单链 DNA的修饰溶液滴涂在丝网印刷电极的表面,进行干燥,以使得所述丝网印刷电极的表面形成含有聚丙烯胺盐酸盐、二氧化铈以及二茂铁标记的非特异性单链DNA的功能层。
优选地,所述修饰溶液中所述聚丙烯胺盐酸盐、所述二氧化铈和所述二茂铁标记的非特异性单链DNA的摩尔比为2×104-3×104: 2.5×103-3.5×103:1;
优选地,所述二茂铁标记的非特异性单链DNA的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
优选地,所述干燥的条件至少满足:温度为20-40℃、时间为8-15h。
本发明第三方面提供上述的电化学生物传感器或者上述的制备方法制得的电化学生物传感器在检测新型冠状病毒中的应用。
本发明第四方面提供一种检测新型冠状病毒的方法,包括以下步骤:
(1)将待检测的病毒RNA进行扩增得到待测DNA,将所述待测DNA 与CRISPR-Cas12a体系溶液混合后经反应I得到反应液;
(2)将步骤(1)得到的反应液滴加至电化学生物传感器进行反应II,所述反应II结束后检测所述电化学生物传感器的电化学信号;
所述电化学生物传感器为上述的电化学生物传感器或者上述的制备方法制得的电化学生物传感器。
优选地,步骤(1)中,所述扩增的的过程包括:将含有所述待检测的病毒RNA的溶液、缓冲液I、含有引物R的溶液、含有引物F的溶液和含有Mg2+的溶液混合,进行扩增反应;其中,所述引物R的核苷酸序列如 SEQ ID No.2所示,所述引物F的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示;
优选地,所述扩增反应的条件至少满足:温度为30-45℃、时间为30-50min。
优选地,步骤(1)中,所述CRISPR-Cas12a体系溶液含有crRNA、 Cas12a蛋白、核糖核酸酶抑制剂和缓冲剂II;其中,所述crRNA的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示,所述待测DNA中能够激活所述Cas12a蛋白的目标DNA片段序列如SEQ ID No.5所示;
优选地,所述反应I的条件至少满足:温度为30-45℃、时间为 15-25min;
所述反应II的条件至少满足:温度为30-45℃、时间为50-70min。
通过上述技术方案,本发明的有益效果为:
本发明提供的电化学生物传感器以丝网印刷电极作为基体,以二茂铁标记的非特异性单链DNA(Fc-ssDNA)作为电化学探针,使得电化学生物传感器的体积小、携带方便、成本低、重复性高;当该电化学生物传感器应用于检测新型冠状病毒的CRISPR-Cas12a系统时,在crRNA的引导下,存在能够激活Cas12a蛋白的目标DNA片段时,Cas12a蛋白会被激活,切割丝网印刷电极表面固定的非特异性Fc-ssDNA,以降低来自Fc-ssDNA的电化学信号,通过将Fc-ssDNA与聚丙烯胺盐酸盐(PAH)/二氧化铈(CeO2) 偶联,以进一步放大Fc-ssDNA电化学信号的变化,从而实现建立具有成本低、特异性好和灵敏度高的新型冠状病毒检测方法,且能够在短时间内测量低浓度的SARS-CoV-2病毒基因组,检测快速、简单。
附图说明
图1是本发明提供的电化学生物传感器检测新型冠状病毒的原理图;
图2是制备电化学生物传感器时聚丙烯胺盐酸盐的浓度与△I%的关系图;
图3是制备电化学生物传感器时二氧化铈的浓度与△I%的关系图;
图4是制备电化学生物传感器时Fc-ssDNA的浓度与△I%的关系图;
图5是RNA扩增时Mg2+的浓度与△I%的关系图;
图6是CRISPR-Cas12a反应体系的孵育时间与△I%的关系图。
具体实施方式
在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值,这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说,各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间,以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围,这些数值范围应被视为在本文中具体公开。
第一方面,本发明提供了一种电化学生物传感器,包括丝网印刷电极和修饰在所述丝网印刷电极表面的功能层,所述功能层含有聚丙烯胺盐酸盐(PAH)、二氧化铈(CeO2)以及二茂铁标记的非特异性单链DNA (Fc-ssDNA)。
根据本发明,丝网印刷电极的工作电极可以采用碳电极。优选情况下,丝网印刷电极的直径为2-4mm,通常直径为3mm。
根据本发明,Fc-ssDNA中的二茂铁提供电化学检测时的电信号,该电化学生物传感器应用于检测新型冠状病毒的CRISPR-Cas12a系统时, Fc-ssDNA中的非特异性单链DNA用于被激活后Cas12a蛋白进行切割,以改变电化学信号,同时由于Fc-ssDNA与聚丙烯胺盐酸盐(PAH)/二氧化铈 (CeO2)偶联,使得电化学信号的变化进一步放大,不仅能够实现对新型冠状病毒的定量检测,而且检测灵敏度高、成本低、特异性好。
根据本发明,电化学生物传感器置于检测溶液中,利用差分脉冲伏安法(DPV)测量电流峰值随电位的变化,可以获得其电化学信号。其中,检测溶液可以采用浓度为0.05-0.15mol/L的Tris-HCl缓冲液(含0.1-0.3mol/L 的NaCl),pH约为7.4;差分脉冲伏安法的检测范围可以为-0.2V-0.7V。
根据本发明,所述聚丙烯胺盐酸盐、所述二氧化铈和所述二茂铁标记的非特异性单链DNA的摩尔比为2×104-3×104:2.5×103-3.5×103:1。发明人发现,在该优选的具体实施方式下,有利于更好地将Fc-ssDNA与聚丙烯胺盐酸盐(PAH)/二氧化铈(CeO2)进行偶联,提升对Fc-ssDNA电化学信号的放大效果。
根据本发明,所述二茂铁标记的非特异性单链DNA(Fc-ssDNA)可以采用任意一种能够被激活后的Cas12a蛋白进行切割的单链DNA序列在3’端修饰上二茂铁,以能够通过电化学生物传感器的电信号变化,表征出新型冠状病毒是否存在。优选情况下,本发明中Fc-ssDNA的核苷酸序列如 SEQ ID No.1所示;
SEQ ID No.1:
5’-TTTTTTTTAAAAAAAAAAAAAAATTTTTTT-Ferrocene-3’。
第二方面,本发明提供了一种电化学生物传感器的制备方法,包括以下步骤:将含有聚丙烯胺盐酸盐、二氧化铈以及二茂铁标记的非特异性单链DNA的修饰溶液滴涂在丝网印刷电极的表面,进行干燥,以使得所述丝网印刷电极的表面形成含有聚丙烯胺盐酸盐、二氧化铈以及二茂铁标记的非特异性单链DNA的功能层。
根据本发明,修饰溶液通过将含有聚丙烯胺盐酸盐(PAH)/二氧化铈 (CeO2)的复合溶液与含有Fc-ssDNA的溶液按一定的比例混合获得。示例性地,复合溶液中PAH的浓度为2.5-7.5mg/mL、CeO2的浓度为 0.5-1.5mg/mL,将含有Fc-ssDNA的溶液中Fc-ssDNA的浓度为1.5-2.5μM,复合溶液与含有Fc-ssDNA的溶液以体积比为1:1进行混合,得到修饰溶液。
根据本发明,修饰溶液的滴涂使得丝网印刷电极的表面部分或全部涂覆有修饰溶液。
进一步优选地,所述修饰溶液中所述聚丙烯胺盐酸盐、所述二氧化铈和所述二茂铁标记的非特异性单链DNA的摩尔比为2×104-3×104: 2.5×103-3.5×103:1。
具体地,所述二茂铁标记的非特异性单链DNA的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
根据本发明,修饰溶液滴涂在丝网印刷电极的表面后进行干燥的目的是将修饰溶液中的溶剂除去,以使得修饰溶液中的PAH、CeO2与Fc-ssDNA 附着修饰在丝网印刷电极的表面形成功能层。优选情况下,所述干燥的条件至少满足:温度为20-40℃,例如可以为20℃、25℃、30℃、35℃、 40℃,以及这些点值中的任意两个所构成的范围中的任意值;时间为8-15h,例如可以为8h、9h、10h、11h、12h、13h、14h、15h,以及这些点值中的任意两个所构成的范围中的任意值。示例性地,修饰溶液滴涂在丝网印刷电极的表面后,可以在室温下等干一夜。
第三方面,本发明提供了上述的电化学生物传感器或者上述的制备方法制得的电化学生物传感器在检测新型冠状病毒中的应用。
根据本发明,新型冠状病毒具体可以为SARS-CoV-2病毒基因组。本发明提供的电化学生物传感器可以与新型冠状病毒的电化学检测反应体系相结合,以放大电信号的变化,使得新型冠状病毒检测方法的成本低、特异性好和灵敏度高。
第四方面,本发明提供了一种检测新型冠状病毒的方法,包括以下步骤:
(1)将待检测的病毒RNA进行扩增得到待测DNA,将所述待测DNA 与CRISPR-Cas12a体系溶液混合后经反应I得到反应液;
(2)将步骤(1)得到的反应液滴加至电化学生物传感器进行反应II,所述反应II结束后检测所述电化学生物传感器的电化学信号;
所述电化学生物传感器为上述的电化学生物传感器或者上述的制备方法制得的电化学生物传感器。
根据本发明提供的方法,当CRISPR-Cas12a系统中存在能够激活 Cas12a蛋白的目标DNA片段时,在crRNA的引导下,Cas12a会被激活,不加区分地切割丝网印刷电极表面固定的非特异性Fc-ssDNA,将 Fc-ssDNA从丝网印刷电极表面切割下来,从而降低了Fc-ssDNA上二茂铁的电化学信号,在检测时可以获得一个比电化学生物传感器的初始电化学信号降低的信号值;在CRISPR-Cas12a体系中不存在能够激活Cas12a蛋白的目标DNA片段时,Cas12a蛋白的反式切割活性未被激活,Fc-ssDNA的电化学信号则不会发生改变。通过记录不同浓度待测DNA下的电化学信号变化,可实现对新型冠状病毒的定量检测。
本发明中,检测新型冠状病毒的方法将CRISPR-Cas12a与逆转录重组酶介导核酸扩增技术(RT-RAA)相结合,并利用上述的电化学生物传感器形成电化学信号的改变,能够建立新型冠状病毒检测的便携式生物传感器平台,用于快速、灵敏、特异和定量检测该病毒核酸。
发明人在研究过程中,成功构建了一种基于CRISPR-Cas12a的快速检测新型冠状病毒(SARS-CoV-2)的电化学丝网印刷电极,通过将Fc-ssDNA 与PAH、CeO2偶联来放大电化学信号;当CRISPR-Cas12a系统内待测DNA 中存在目标DNA片段时,在crRNA的引导下能够激活Cas12a蛋白,切割丝网印刷电极表面固定的非特异性Fc-ssDNA,并降低来自Fc-ssDNA的电化学信号。发明人将CRISPR-Cas12a的反式切割活性引入电化学生物传感器(E-CRISPR)中,结合逆转录重组酶介导核酸扩增技术(RT-RAA),建立具有成本低、特异性好和灵敏度高的检测方法;在优化的条件下,使用本发明提供的便携式电化学生物传感器,可实现60min内测量低浓度的SARS-CoV-2病毒基因组,进一步表明该电化学生物传感器可以实现快速、简单的高灵敏度检测。
根据本发明,所述扩增的的过程具体可以采用RT-RAA核酸扩增试剂盒进行。示例性地,步骤(1)中,所述扩增的的过程包括:将含有所述待检测的病毒RNA的溶液、缓冲液I、含有引物R的溶液、含有引物F的溶液和含有Mg2+的溶液(例如乙酸镁溶液)混合,进行扩增反应;其中,所述引物R的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示,所述引物F的核苷酸序列如 SEQ IDNo.3所示;
SEQ ID No.2:5’-AGACCAGAAGA TCAGGAACTCTAGAAGAAT-3’;
SEQ ID No.3:5’-CGGAAGAGACAGGTACGTTAA TAGTTAA TAGC-3’。
例如,扩增的反应总体系可以为50μL,具体含有:25μL缓冲液v(即为缓冲液I),nμL含有待检测的病毒RNA的溶液,2μL浓度为2μM的引物R溶液,2μL浓度为2μM的引物F溶液,2.5μL含有Mg2+的溶液, (18.5-n)μL纯化水。其中,n为含有待检测的病毒RNA的溶液的加样量,若其病毒RNA的浓度高,则加样量n可以为1μL;含有Mg2+的溶液中Mg2+的浓度优选为10-25mmol/L。
根据本发明,所述扩增反应的条件可以参照相应的试剂盒,示例性地,所述扩增反应的条件至少满足:温度为30-45℃,例如可以为30℃、 35℃、40℃、45℃,以及这些点值中的任意两个所构成的范围中的任意值;时间为30-50min,例如可以为30min、35min、40min、45min、 50min,以及这些点值中的任意两个所构成的范围中的任意值。
根据本发明,步骤(1)中,所述CRISPR-Cas12a体系溶液可以采用已经公开的体系溶液,示例性地,所述CRISPR-Cas12a体系溶液含有 crRNA、Cas12a蛋白、核糖核酸酶抑制剂和缓冲剂II;其中,所述crRNA 的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示,所述待测DNA中能够激活所述Cas12a 蛋白的目标DNA片段序列如SEQ ID No.5所示;Cas12a蛋白和核糖核酸酶抑制剂均可以商购得到,也可以通过现有技术中公开的方法自行合成;
SEQ ID No.4:5’-TTTTCTTGCTTTCGTGGTATTCTTGCT-3’;
SEQ ID No.5:
5’-ATGTACTCATTCGTTTCGGAAGAGACAGGTACGTTAATAGTTAATAG CGTACTTCTTTTTCTTGCTTTCGTGGTATTCTTGCTAGTTACACTAGCCATCCTTACTGCGCTTCGATTGTGTGCGTACTGCTGCAATATTGTTAACGTG AGTCTTGTAAAACCTTCTTTTTACGTTTACTCTCGTGTTAAAAATCTGAATTCTTCTAGAGTTCCTGATCTTCTGGTCTAA-3’。
根据本发明,crRNA、Cas12a蛋白、核糖核酸酶抑制剂和缓冲剂II的体积比可以为0.5-1.5:0.5-1.5:0.5-1.5:2,待测DNA的添加量可根据其浓度进行添加。示例性地,待测DNA与CRISPR-Cas12a体系溶液混合后的总体积可以为20μL,其配制的方法包括:将2μL10*Buffer(缓冲剂II)、1μL 核糖核酸酶抑制剂(Rnase Inhibitors)、1μL的crRNA、1μL的Cas12a蛋白与1μL的待测DNA混合,最后用超纯水补充至20μL。
根据本发明,所述反应I的条件至少满足:温度为30-45℃,例如可以为30℃、35℃、40℃、45℃,以及这些点值中的任意两个所构成的范围中的任意值;时间为15-25min,例如可以为15min、17min、19min、21min、 23min、25min,以及这些点值中的任意两个所构成的范围中的任意值。
根据本发明,所述反应II的条件至少满足:温度为30-45℃,例如可以为30℃、35℃、40℃、45℃,以及这些点值中的任意两个所构成的范围中的任意值;时间为50-70min,例如可以为50min、55min、60min、65min、 70min,以及这些点值中的任意两个所构成的范围中的任意值。
作为本发明中检测新型冠状病毒的方法的一种优选的具体实施方式,检测原理如图1所示,包括以下步骤:
(1)将含有聚丙烯胺盐酸盐(PAH)和二氧化铈(CeO2)的复合溶液与Fc-ssDNA浓度为2μM的溶液按体积比1:1混合得到修饰溶液,其中,复合溶液中PAH的浓度为5mg/mL,CeO2的浓度为1mg/mL,Fc-ssDNA的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示;
(2)将步骤(1)得到的修饰溶液滴涂于丝网印刷电极的表面,室温下等干一夜,即制成电化学生物传感器;
(3)将1μL含有待检测的病毒RNA的样品与25μL缓冲液v、2μL浓度为2μM的引物R溶液、2μL浓度为2μM的引物F溶液、2.5μL的Mg2+浓度为的溶液和17.5μL纯化水混合,在温度为37℃的条件下进行扩增反应 40min,得到待测DNA,其中,引物R的核苷酸序列如SEQ IDNo.2所示,引物F的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示;
(4)将1μL步骤(3)得到的待测DNA与2μL10*Buffer、1μL核糖核酸酶抑制剂、1μL的crRNA、1μL的Cas12a蛋白和14μL超纯水混合,得到 CRISPR-Cas12a反应体系,将CRISPR-Cas12a反应体系在温度为37℃的条件下反应20min,得到反应液,其中,crRNA的核苷酸序列如SEQ ID No.4 所示;
(5)将步骤(4)得到的反应液滴加至步骤(2)得到的电化学生物传感器表面,在温度为37℃的条件下分别反应60min,反应结束后检测电化学生物传感器的电化学信号。
以下将通过实施例对本发明进行详细描述。以下实施例中,三(羟甲基)氨基甲烷(Tris)购自Aladdin Industrial Corporation(中国上海);RT-RAA 核酸扩增试剂盒采购于江苏奇天基因生物科技有限公司;供试病毒 (2019-nCoV-E)购买自南京科佰生物科技有限公司,供试病毒中含有如 SEQ ID No.5所示的激活Cas12a蛋白的目标DNA片段;咽拭子样本是从志愿者身上采集的;冷冻食品购自永辉超市;丝网印刷电极、电化学工作站来自上海辰华仪器有限公司;其它原料和试剂为常规的市售品。
以下实施例中,无特殊说明的情况下,室温指的是25±5℃,一夜指的是8-12h;
电化学生物传感器的检测溶液采用浓度为0.1mol/L的Tris-HCl缓冲液 (含0.2mol/L的NaCl)、pH为7.4;差分脉冲检测范围为-0.2V-0.7V;
△I%通过以下公式计算得到:△I%=[(I0-I)/I0]×100%,
其中,I0为电化学生物传感器的初始电化学信号;I为电化学生物传感器经反应液处理后的电化学信号。
实施例1
(1)将含有聚丙烯胺盐酸盐(PAH)和二氧化铈(CeO2)的复合溶液与Fc-ssDNA浓度为2μM的溶液按体积比1:1混合得到修饰溶液,其中,复合溶液中CeO2的浓度为1mg/mL、PAH的浓度分别为1mg/mL、3mg/mL、 5mg/mL、7mg/mL、8mg/mL,Fc-ssDNA的核苷酸序列如SEQ IDNo.1所示;
(2)将修饰溶液滴涂于丝网印刷电极的表面,室温下等干一夜,制得电化学生物传感器;
(3)将1μL含有供试病毒(2019-nCoV-E)的待测样品(供试病毒添加浓度为10copies/μL)与25μL缓冲液v、2μL浓度为2μM的引物R溶液、2μL 浓度为2μM的引物F溶液、2.5μL的Mg2+浓度为15mmol/L的乙酸镁溶液和 17.5μL纯化水混合,在温度为37℃的条件下进行扩增反应40min,得到待测DNA,其中,引物R的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示,引物F的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示;
(4)将1μL步骤(3)得到的待测DNA与2μL10*Buffer、1μL核糖核酸酶抑制剂、1μL的crRNA、1μL的Cas12a蛋白和14μL超纯水混合,得到 CRISPR-Cas12a反应体系,将CRISPR-Cas12a反应体系在温度为37℃的条件下反应20min,得到反应液,其中,crRNA的核苷酸序列如SEQ ID No.4 所示;
(5)将步骤(4)得到的反应液滴加至步骤(2)得到的电化学生物传感器表面,在温度为37℃的条件下分别反应60min,反应结束后检测电化学生物传感器的电化学信号。
将步骤(2)得到的电化学生物传感器置于检测溶液中,进行差分脉冲检测获得初始电化学信号I0,计算步骤(5)测得的电化学信号I与相应的初始电化学信号之间的变化比值△I%,结果见图2,随着PAH浓度的升高,电化学信号的变化比值△I%先升高后下降,进而选择最佳PAH浓度为 5mg/mL。
实施例2
(1)将含有聚丙烯胺盐酸盐(PAH)和二氧化铈(CeO2)的复合溶液与Fc-ssDNA浓度为2μM的溶液按体积比1:1混合得到修饰溶液,其中,复合溶液中PAH的浓度为5mg/mL,CeO2的浓度分别为0.5mg/mL、1mg/mL、 2mg/mL、3mg/mL、4mg/mL,Fc-ssDNA的核苷酸序列如SEQID No.1所示;
(2)将修饰溶液滴涂于丝网印刷电极的表面,室温下等干一夜,制得电化学生物传感器;
(3)将1μL含有供试病毒(2019-nCoV-E)的待测样品(供试病毒添加浓度为10copies/μL)与25μL缓冲液v、2μL浓度为2μM的引物R溶液、2μL 浓度为2μM的引物F溶液、2.5μL的Mg2+浓度为15mmol/L的乙酸镁溶液和 17.5μL纯化水混合,在温度为37℃的条件下进行扩增反应40min,得到待测DNA,其中,引物R的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示,引物F的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示;
(4)将1μL步骤(3)得到的待测DNA与2μL10*Buffer、1μL核糖核酸酶抑制剂、1μL的crRNA、1μL的Cas12a蛋白和14μL超纯水混合,得到 CRISPR-Cas12a反应体系,将CRISPR-Cas12a反应体系在温度为37℃的条件下反应20min,得到反应液,其中,crRNA的核苷酸序列如SEQ ID No.4 所示;
(5)将步骤(4)得到的反应液滴加至步骤(2)得到的电化学生物传感器表面,在温度为37℃的条件下分别反应60min,反应结束后检测电化学生物传感器的电化学信号。
将步骤(2)得到的电化学生物传感器置于检测溶液中,进行差分脉冲检测获得初始电化学信号I0,计算步骤(5)测得的电化学信号I与相应的初始电化学信号之间的变化比值△I%,结果见图3,随着CeO2浓度的升高,电化学信号的变化比值△I%先升高后下降,进而选择最佳CeO2浓度为 1mg/mL。
实施例3
(1)将含有聚丙烯胺盐酸盐(PAH)和二氧化铈(CeO2)的复合溶液与含有Fc-ssDNA的溶液按体积比1:1混合得到修饰溶液,其中,复合溶液中PAH的浓度为5mg/mL,CeO2的浓度为1mg/mL,含有Fc-ssDNA的溶液中Fc-ssDNA的浓度分别为0μM、1μM、2μM、3μM、4μM,Fc-ssDNA的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示;
(2)将修饰溶液滴涂于丝网印刷电极的表面,室温下等干一夜,制得电化学生物传感器;
(3)将1μL含有供试病毒(2019-nCoV-E)的待测样品(供试病毒添加浓度为10copies/μL)与25μL缓冲液v、2μL浓度为2μM的引物R溶液、2μL 浓度为2μM的引物F溶液、2.5μL的Mg2+浓度为15mmol/L的乙酸镁溶液和 17.5μL纯化水混合,在温度为37℃的条件下进行扩增反应40min,得到待测DNA,其中,引物R的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示,引物F的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示;
(4)将1μL步骤(3)得到的待测DNA与2μL10*Buffer、1μL核糖核酸酶抑制剂、1μL的crRNA、1μL的Cas12a蛋白和14μL超纯水混合,得到 CRISPR-Cas12a反应体系,将CRISPR-Cas12a反应体系在温度为37℃的条件下反应20min,得到反应液,其中,crRNA的核苷酸序列如SEQ ID No.4 所示;
(5)将步骤(4)得到的反应液滴加至步骤(2)得到的电化学生物传感器表面,在温度为37℃的条件下分别反应60min,反应结束后检测电化学生物传感器的电化学信号。
将步骤(2)得到的电化学生物传感器置于检测溶液中,进行差分脉冲检测获得初始电化学信号I0,计算步骤(5)测得的电化学信号I与相应的初始电化学信号之间的变化比值△I%,结果见图4,观察到电流响应的变化比值△I%随着Fc-ssDNA浓度的增加而先增加,然后再趋于平稳,这表明当丝网印刷电极上滴涂的Fc-ssDNA浓度达到一定值后,其电流响应将不会再增加,在浓度为2μM时丝网印刷电极的负载量达到了饱和,因此选择 Fc-ssDNA的浓度为2μM。
实施例4
(1)将含有聚丙烯胺盐酸盐(PAH)和二氧化铈(CeO2)的复合溶液与Fc-ssDNA浓度为2μM的溶液按体积比1:1混合得到修饰溶液,其中,复合溶液中PAH的浓度为5mg/mL,CeO2的浓度为1mg/mL,Fc-ssDNA的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示;
(2)将步骤(1)得到的修饰溶液滴涂于丝网印刷电极的表面,室温下等干一夜,即制成电化学生物传感器;
(3)将1μL含有供试病毒(2019-nCoV-E)的溶液(供试病毒添加浓度为10copies/μL)与25μL缓冲液v、2μL浓度为2μM的引物R溶液、2μL浓度为2μM的引物F溶液、2.5μL乙酸镁溶液和17.5μL纯化水混合,在温度为37℃的条件下进行扩增反应40min,得到待测DNA,其中,引物R的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示,引物F的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示,乙酸镁溶液中Mg2+的浓度分别为0mmol/L、5mmol/L、10mmol/L、 15mmol/L、20mmol/L、25mmol/L;
(4)将1μL步骤(3)得到的待测DNA与2μL10*Buffer、1μL核糖核酸酶抑制剂、1μL的crRNA、1μL的Cas12a蛋白和14μL超纯水混合,得到 CRISPR-Cas12a反应体系,将CRISPR-Cas12a反应体系在温度为37℃的条件下反应20min,得到反应液,其中,crRNA的核苷酸序列如SEQ ID No.4 所示;
(5)将步骤(4)得到的反应液滴加至步骤(2)得到的电化学生物传感器表面,在温度为37℃的条件下反应60min,反应结束后检测电化学生物传感器的电化学信号。
将步骤(2)得到的电化学生物传感器置于检测溶液中,进行差分脉冲检测获得初始电化学信号I0,计算步骤(5)测得的电化学信号I与相应的初始电化学信号之间的变化比值△I%,结果见图5。
已知Cas12a RuvC结构域通过双金属离子机制切割ssDNA,其中Mg2+离子通过改变RuvC活性切割中心周围ssDNA的空间分布诱导RuvC结构域和ssDNA的构象协调。因此,可通过CRISPR体系溶液中Mg2+离子的添加对Cas12a蛋白的切割功能活性进行优化,只有当测试溶液中存在Mg2+离子时,切割活性才被激活。如图5所示,当Mg2+的浓度增加到15mmol/L时,Cas12a蛋白的切割活性增强,继续增加Mg2+的浓度Cas12a蛋白的切割活性并无太大变化,因此,选择扩增反应体系中Mg2+的最佳浓度为15mmol/L。
实施例5
(1)将含有聚丙烯胺盐酸盐(PAH)和二氧化铈(CeO2)的复合溶液与Fc-ssDNA浓度为2μM的溶液按体积比1:1混合得到修饰溶液,其中,复合溶液中PAH的浓度为5mg/mL,CeO2的浓度为1mg/mL,Fc-ssDNA的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示;
(2)将步骤(1)得到的修饰溶液滴涂于丝网印刷电极的表面,室温下等干一夜,即制成电化学生物传感器;
(3)将1μL含有供试病毒(2019-nCoV-E)的溶液(供试病毒添加浓度为10copies/μL)与25μL缓冲液v、2μL浓度为2μM的引物R溶液、2μL浓度为2μM的引物F溶液、2.5μL的Mg2+浓度为15mmol/L的乙酸镁溶液和 17.5μL纯化水混合,在温度为37℃的条件下进行扩增反应40min,得到待测DNA,其中,引物R的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示,引物F的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示;
(4)将1μL步骤(3)得到的待测DNA与2μL10*Buffer、1μL核糖核酸酶抑制剂、1μL的crRNA、1μL的Cas12a蛋白和14μL超纯水混合,得到 CRISPR-Cas12a反应体系,将CRISPR-Cas12a反应体系在温度为37℃的条件下反应20min,得到反应液,其中,crRNA的核苷酸序列如SEQ ID No.4 所示;
(5)将步骤(4)得到的反应液滴加至步骤(2)得到的电化学生物传感器表面,在温度为37℃的条件下分别反应20min、40min、60min、 80min、100min,反应结束后检测电化学生物传感器的电化学信号。
将步骤(2)得到的电化学生物传感器置于检测溶液中,进行差分脉冲检测获得初始电化学信号I0,计算步骤(5)测得的电化学信号I与相应的初始电化学信号之间的变化比值△I%,结果见图6,待测DNA与 CRISPR-Cas12a体系溶液混合后孵育60min,可以获得最佳的检测效果。
实施例6
(1)将含有聚丙烯胺盐酸盐(PAH)和二氧化铈(CeO2)的复合溶液与Fc-ssDNA浓度为2μM的溶液按体积比1:1混合得到修饰溶液,其中,复合溶液中PAH的浓度为5mg/mL,CeO2的浓度为1mg/mL,Fc-ssDNA的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示;
(2)将步骤(1)得到的修饰溶液滴涂于丝网印刷电极的表面,室温下等干一夜,即制成电化学生物传感器;
(3)将1μL含有供试病毒(2019-nCoV-E)的待测样品(供试病毒添加浓度为10copies/μL)与25μL缓冲液v、2μL浓度为2μM的引物R溶液、2μL 浓度为2μM的引物F溶液、2.5μL的Mg2+浓度为15mmol/L的乙酸镁溶液和 17.5μL纯化水混合,在温度为37℃的条件下进行扩增反应40min,得到待测DNA,其中,引物R的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示,引物F的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示;
(4)将1μL步骤(3)得到的待测DNA与2μL10*Buffer、1μL核糖核酸酶抑制剂、1μL的crRNA、1μL的Cas12a蛋白和14μL超纯水混合,得到 CRISPR-Cas12a反应体系,将CRISPR-Cas12a反应体系在温度为37℃的条件下反应20min,得到反应液,其中,crRNA的核苷酸序列如SEQ ID No.4 所示;
(5)将步骤(4)得到的反应液滴加至步骤(2)得到的电化学生物传感器表面,在温度为37℃的条件下分别反应60min,反应结束后检测电化学生物传感器的电化学信号;
步骤(3)中含有供试病毒(2019-nCoV-E)的待测样品分别为:供试病毒添加浓度为0copies/μL的冷冻虾、供试病毒添加浓度为5copies/μL的冷冻鱼、供试病毒添加浓度为10copies/μL的冷冻猪肉、供试病毒添加浓度为 100copies/μL的冷冻青豆;供试病毒添加浓度为0copies/μL的咽拭子1、供试病毒添加浓度为5copies/μL的咽拭子2、供试病毒添加浓度为10copies/μL 的咽拭子3、供试病毒添加浓度为100copies/μL的咽拭子4。
将步骤(2)得到的电化学生物传感器置于检测溶液中,进行差分脉冲检测获得初始电化学信号I0,计算步骤(5)测得的电化学信号I与相应的初始电化学信号之间的变化比值△I%,结果见表1和表2。
表1
样品名称 | 假病毒种类 | 添加浓度(copies/μL) | 显示结果 |
冷冻虾 | 2019-nCoV-E | 0 | - |
冷冻鱼 | 2019-nCoV-E | 5 | + |
冷冻猪肉 | 2019-nCoV-E | 101 | + |
冷冻青豆 | 2019-nCoV-E | 102 | + |
本发明的实施例6中,用采样拭子对冷冻食品(冷冻虾、冷冻鱼、冷冻猪肉、冷冻青豆)的表面进行涂抹采样以收集样品,在收集的样品中加入不同浓度的供试病毒(2019-nCoV-E),以模拟真实阳性样品,对加入供试病毒后的样品进行病毒RNA提取,再利用RT-RAA试剂盒扩增得到待测DNA,最后利用步骤(2)制得的电化学生物传感器进行检测,表1的结果表明本发明提供的电化学生物传感器的实用性。
表2
样品名称 | 假病毒种类 | 添加浓度(copies/μL) | 显示结果 |
咽拭子1 | 2019-nCoV-E | 0 | - |
咽拭子2 | 2019-nCoV-E | 5 | + |
咽拭子3 | 2019-nCoV-E | 101 | + |
咽拭子4 | 2019-nCoV-E | 102 | + |
本发明的实施例6中,在收集的人咽拭子样品中加入不同浓度的供试病毒(hCoV-229E-E)以模拟真实阳性样品,对加入供试病毒后的样品进行病毒RNA提取,再利用RT-RAA试剂盒扩增得到待测DNA,最后利用步骤(2) 制得的电化学生物传感器进行检测,表2的结果表明本发明提供的电化学生物传感器的实用性。
对比测试例1
(1)将含有聚丙烯胺盐酸盐(PAH)和二氧化铈(CeO2)的复合溶液与Fc-ssDNA浓度为2μM的溶液按体积比1:1混合得到修饰溶液,其中,复合溶液中PAH的浓度为5mg/mL,CeO2的浓度为1mg/mL,Fc-ssDNA的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示;
(2)将修饰溶液滴涂于丝网印刷电极的表面,室温下等干一夜,制得电化学生物传感器;
(3)将1μL含有供试病毒(2019-nCoV-E)的溶液(供试病毒添加浓度为10copies/μL)与25μL缓冲液v、2μL浓度为2μM的引物R溶液、2μL浓度为2μM的引物F溶液、2.5μL的Mg2+浓度为15mmol/L的溶液和17.5μL 纯化水混合,在温度为37℃的条件下进行扩增反应40min,得到待测 DNA,其中,引物R的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示,引物F的核苷酸序列如SEQID No.3所示;
(4)将1μL步骤(3)得到的待测DNA与2μL10*Buffer、1μL核糖核酸酶抑制剂、1μL的crRNA、1μL的Cas12a蛋白和14μL超纯水混合,得到 CRISPR-Cas12a反应体系,将CRISPR-Cas12a反应体系在温度为37℃的条件下反应20min,得到反应液,其中,crRNA的核苷酸序列如SEQ ID No.4 所示;
(5)将步骤(4)得到的反应液分别滴加至步骤(2)得到的电化学生物传感器表面以及未修饰的丝网印刷电极表面,在温度为37℃的条件下反应60min,反应结束后检测电化学生物传感器的电化学信号。
将步骤(2)得到的电化学生物传感器与未滴加步骤(4)得到的反应液前的丝网印刷电极置于检测溶液中,分别进行差分脉冲检测获得初始电化学信号I0,再计算步骤(5)测得的电化学信号I与相应的初始电化学信号 I0之间的变化比值△I%,结果见表3。从表3可以看出,修饰了PAH和二氧化铈CeO2的电极△I%远远高于未修饰电极,证明了修饰PAH和二氧化铈 CeO2可以提升丝网印刷电极的灵敏度。
表3
丝网印刷电极 | I0(μA) | I(μA) | △I% |
修饰 | 5.486 | 1.049 | 80.88 |
未修饰 | 2.791 | 2.375 | 14.91 |
对比测试例2
(1)配制含有PAH+MnO2、PAH+CeO2、PAH、CeO2的四种材料溶液,再分别与Fc-ssDNA浓度为2μM的溶液按体积比1:1混合得到修饰溶液,其中,材料溶液中PAH的浓度为5mg/mL,CeO2的浓度为1mg/mL, MnO2的浓度为1mg/mL,Fc-ssDNA的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示;将修饰溶液涂覆于丝网印刷电极进行干燥,制成四种不同材料修饰的电化学生物传感器;
(2)将1μL含有供试病毒(2019-nCoV-E)的溶液(供试病毒添加浓度为10copies/μL)与25μL缓冲液v、2μL浓度为2μM的引物R溶液、2μL浓度为2μM的引物F溶液、2.5μL的Mg2+浓度为15mmol/L的溶液和17.5μL 纯化水混合,在温度为37℃的条件下进行扩增反应40min,得到待测 DNA,其中,引物R的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示,引物F的核苷酸序列如SEQID No.3所示;
(3)将1μL步骤(2)得到的待测DNA与2μL10*Buffer、1μL核糖核酸酶抑制剂、1μL的crRNA、1μL的Cas12a蛋白和14μL超纯水混合,得到 CRISPR-Cas12a反应体系,将CRISPR-Cas12a反应体系在温度为37℃的条件下反应20min,得到反应液,其中,crRNA的核苷酸序列如SEQ ID No.4 所示;
(4)将步骤(3)得到的反应液滴加至步骤(1)得到的四种不同材料修饰的电化学生物传感器表面,在温度为37℃的条件下反应60min,反应结束后检测电化学生物传感器的电化学信号。
将步骤(1)制得的四种不同电化学生物传感器置于检测溶液中,进行差分脉冲检测获得初始电化学信号I0,再计算步骤(4)测得的电化学信号I 与相应的初始电化学信号I0之间的变化比值△I%,结果见表4。从表4可以看出PAH+CeO2修饰电极的△I%最高,证明其具有最好的灵敏度。
表4
修饰材料 | I0(μA) | I(μA) | △I% |
PAH+MnO2 | 4.819 | 2.496 | 48.21 |
PAH+CeO2 | 4.613 | 1.043 | 77.39 |
CeO2 | 0.5423 | 0.4876 | 10.09 |
PAH | 0.5602 | 0.455 | 18.78 |
对比测试例3
以Hajime Shinoda等开发的新型冠状病毒(SARS-CoV-2)方法作为对照方法,该方法的具体过程是:将纯化的LwaCas13a蛋白与等体积互补鱼 tgRNA1的crRNA(crRNA1)混合,在37℃孵育10min;然后将 LwaCas13a-crRNA1复合物加入含有tgRNA1和荧光团淬灭剂(FQ)标记的RNA报告子的样品溶液中;再将分析混合物加到微室装置中,然后使用荧光显微镜观察源自LwaCas13a介导的反式切割FQ标记的RNA报告子的荧光。该方法基于CRISPR的无扩增数字RNA检测(SATORI)平台,通过结合CRISPR-Cas13的RNA检测和微室阵列技术来检测新型冠状病毒 (SARS-CoV-2)的N基因RNA和全基因组RNA,检测限为 3.4×103copies/μL。
采用实施例6的方法对含有不同浓度的供试病毒(2019-nCoV-E)的溶液进行检测,结果显示对试病毒(2019-nCoV-E)的检测限为5copies/μL,远低于对照方法的检测限,表明了本发明提供的电化学生物传感器和检测方法具有较高的灵敏度。
以上详细描述了本发明的优选实施方式,但是,本发明并不限于此。在本发明的技术构思范围内,可以对本发明的技术方案进行多种简单变型,包括各个技术特征以任何其它的合适方式进行组合,这些简单变型和组合同样应当视为本发明所公开的内容,均属于本发明的保护范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 南京师范大学
<120> 电化学生物传感器及其制备方法和检测新型冠状病毒的方法
<130> 2021.8.3
<160> 5
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 1
ttttttttaa aaaaaaaaaa aaattttttt 30
<210> 2
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 2
agaccagaag atcaggaact ctagaagaat 30
<210> 3
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 3
cggaagagac aggtacgtta atagttaata gc 32
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<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 4
ttttcttgct ttcgtggtat tcttgct 27
<210> 5
<211> 228
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 5
atgtactcat tcgtttcgga agagacaggt acgttaatag ttaatagcgt acttcttttt 60
cttgctttcg tggtattctt gctagttaca ctagccatcc ttactgcgct tcgattgtgt 120
gcgtactgct gcaatattgt taacgtgagt cttgtaaaac cttcttttta cgtttactct 180
cgtgttaaaa atctgaattc ttctagagtt cctgatcttc tggtctaa 228
Claims (9)
1.一种电化学生物传感器,其特征在于,包括丝网印刷电极和修饰在所述丝网印刷电极表面的功能层,所述功能层含有聚丙烯胺盐酸盐、二氧化铈以及二茂铁标记的非特异性单链DNA,所述二茂铁标记的非特异性单链DNA的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
2.根据权利要求1所述的电化学生物传感器,其特征在于,所述聚丙烯胺盐酸盐、所述二氧化铈以及所述二茂铁标记的非特异性单链DNA的摩尔比为2×104-3×104:2.5×103-3.5×103:1。
3.一种电化学生物传感器的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:将含有聚丙烯胺盐酸盐、二氧化铈以及二茂铁标记的非特异性单链DNA的修饰溶液滴涂在丝网印刷电极的表面,进行干燥,以使得所述丝网印刷电极的表面形成含有聚丙烯胺盐酸盐、二氧化铈以及二茂铁标记的非特异性单链DNA的功能层;所述二茂铁标记的非特异性单链DNA的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
4.根据权利要求3所述的制备方法,其特征在于,所述修饰溶液中所述聚丙烯胺盐酸盐、所述二氧化铈以及所述二茂铁标记的非特异性单链DNA的摩尔比为2×104-3×104:2.5×103-3.5×103:1。
5.根据权利要求3所述的制备方法,其特征在于,所述干燥的条件至少满足:温度为20-40℃、时间为8-15h。
6.权利要求1或2所述的电化学生物传感器或者根据权利要求3至5中任意一项所述的制备方法制得的电化学生物传感器在检测新型冠状病毒中的应用。
7.一种检测新型冠状病毒的方法,其特征在于,包括以下步骤:
(1)将待检测的病毒RNA进行扩增得到待测DNA,将所述待测DNA与CRISPR-Cas12a体系溶液混合后经反应I得到反应液;
(2)将步骤(1)得到的反应液滴加至电化学生物传感器进行反应II,所述反应II结束后检测所述电化学生物传感器的电化学信号;
所述电化学生物传感器为权利要求1或2所述的电化学生物传感器,或者根据权利要求3至5中任意一项所述的制备方法制得的电化学生物传感器。
8.根据权利要求7所述的检测新型冠状病毒的方法,其特征在于,步骤(1)中,所述扩增的的过程包括:将含有所述待检测的病毒RNA的溶液、缓冲液I、含有引物R的溶液、含有引物F的溶液和含有Mg2+的溶液混合,进行扩增反应;其中,所述引物R的核苷酸序列如SEQ IDNo.2所示,所述引物F的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示;
所述扩增反应的条件至少满足:温度为30-45℃、时间为30-50min。
9.根据权利要求7所述的检测新型冠状病毒的方法,其特征在于,步骤(1)中,所述CRISPR-Cas12a体系溶液含有crRNA、Cas12a蛋白、核糖核酸酶抑制剂和缓冲剂II;其中,所述crRNA的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示,所述待测DNA中能够激活所述Cas12a蛋白的目标DNA片段序列如SEQ ID No.5所示;
所述反应I的条件至少满足:温度为30-45℃、时间为15-25min;
所述反应II的条件至少满足:温度为30-45℃、时间为50-70min。
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