CN116376915A - 一种基于CRISPR-Cas12a系统的重金属离子检测方法及试剂盒 - Google Patents
一种基于CRISPR-Cas12a系统的重金属离子检测方法及试剂盒 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种基于CRISPR‑Cas12a系统的重金属离子检测方法及试剂盒。本发明采用核酸酶(也称DNAzyme)与纳米金组装形成的纳米探针对重金属离子进行识别和初级的信号放大，再结合CRISPR‑Cas12a系统(规律成簇的间隔短回文重复序列及关联蛋白12a)的二次信号放大作用，提供一种重金属离子的检测方法和检测试剂盒。该方法具有操作简单、检测速度快、灵敏度高，可检测低至1pg/L的铅离子；无需任何复杂、耗时耗力的样品前处理过程；不需要专业培训即可完成整个检测过程；无需使用大型仪器，常用荧光检测仪即可检测。
Description
技术领域
本发明属于重金属离子检测领域，具体涉及一种基于CRISPR-Cas12a系统的重金属离子检测方法及检测试剂盒。
背景技术
随着我国工业化和城市化进程的快速推进，大量的重金属污染物排放进入土壤、河流、湖泊等环境中。重金属毒性大、难降解，容易动植物体内积聚，并经过食物链逐渐富集，富集含量甚至可达数千倍或百万倍以上，最终对人体健康造成影响危害。据有关研究显示：全世界每年因环境污染而死亡的人数约为300多万人，其中80％以上是因为受到重金属污染所致。重金属已被国际社会列为最重要的十种公害之一。快速灵敏检测重金属离子是控制重金属污染和危害的重要前提。
目前已经发展了多种重金属离子检测方法。传统重金属离子检测方法主要包括，原子荧光光谱法、原子吸收光谱法、电感耦合等离子体发射光谱法、激光诱导击穿光谱法和X射线荧光光谱法等。这些方法虽然具有较高的灵敏度和准确性，然而需要使用昂贵的大型仪器、检测过程十分复杂、需要熟练的操作人员和专业实验室环境才能完成检测。近年来发展了电化学检测法，这些方法依赖于复杂的电极制备和处理过程。比色检测方法虽然检测过程简单，但是灵敏较低，不能满足痕量重金属离子的检测。
发明内容
本发明第一方面的目的，在于提供一种DNAzyme酶。
本发明第二方面的目的，在于提供一种产品。
本发明第三方面的目的，在于提供上述DNAzyme酶和产品的应用。
本发明第四方面的目的，在于提供一种检测重金属离子的方法。
本发明所采取的技术方案是：
本发明的第一方面，提供一种DNAzyme酶，所述DNAzyme酶包含底物链PB1、酶链PB2和NTS三个单链组成，其中PB1包含a，b，c1区，NTS包含a*，c2区，PB2与PB1的b区部分互补，NTS的a*区与PB1的a区完全互补。
在本发明的一些实施方式中，所述PB1的序列如SEQ ID NO.1所示，所述PB2的序列如SEQ ID NO.2所示，所述NTS的序列如SEQ ID NO.2所示。
在本发明的一些实施方式中，所述DNAzyme酶的制备方法为：将PB2、NTS与PB1混合成混合液，添加缓冲液，水浴加热，室温下冷却待用。
在本发明的一些实施方式中，所述混合液与缓冲液的体积比为1：(10～15)。
在本发明的一些实施方式中，所述混合液中PB2的摩尔浓度百分比为20～30％，所述NTS的摩尔浓度百分比为20～30％，所述PB1的摩尔浓度百分比为45～55％。
在本发明的一些实施方式中，所述PB1和NTS的3’端为多聚腺苷酸，末端标记有生物素基团。
在本发明的一些实施方式中，所述水浴加热的条件为90～100℃，3～15min。
本发明的第二方面，提供一种产品，所述产品包含本发明第一方面所述的DNAzyme酶。
在本发明的一些实施方式中，所述产品中还包含DNAzyme/纳米金复合探针、链霉亲和素标记的磁珠。
在本发明的一些实施方式中，所述DNAzyme/纳米金复合探针的制备方法为：将链霉亲和素标记的纳米金与DNAzyme混合。
在本发明的一些实施方式中，所述纳米金和DNAzyme酶的体积比为(3～5)：1。
在本发明的一些实施方式中，所述链霉亲和素标记的纳米金的制备方法为：将纳米金与链霉亲和素溶液混合后于25-45℃反应10-50min，加入BSA与PEG反应1-10min，离心。
在本发明的一些实施方式中，所述纳米金、链霉亲和素、BSA与PEG的体积比为：(50～150)：(2～15)：(2～15)：1。
在本发明的一些优选实施方式中，所述纳米金、链霉亲和素、BSA与PEG的体积比为：(80～120)：(8～12)：(8～12)：1。
在本发明的一些实施方式中，所述链霉亲和素的浓度为0.05～0.15mg/L。
在本发明的一些实施方式中，所述BSA的浓度为0.1～0.3％BSA。
在本发明的一些实施方式中，所述PEG为PEG20000，所述PEG的浓度为1～3％。
在本发明的一些实施方式中，所述离心的条件为：5000-10000rpm，10-30min。
在本发明的一些实施方式中，所述纳米金的制备方法为：将浓度为的氯化金溶液加热至沸腾，再加入柠檬酸钠混合均匀煮沸15-45min，冷却至室温。
在本发明的一些实施方式中，所述氯化钾与柠檬酸钠的体积比为(20～30)：1。
在本发明的一些实施方式中，所述氯化金的浓度为0.005～0.015％。
在本发明的一些实施方式中，所述柠檬酸钠的浓度为0.5～1.5％。
在本发明的一些实施方式中，所述纳米金的粒径为12～18nm。
在本发明的一些实施方式中，所述产品中还包含：CRISPR-Cas检测试剂。
在本发明的一些实施方式中，所述CRISPR-Cas检测试剂包含：crRNA、LbCas12a、报告探针ssDNA-FQ。
在本发明的一些实施方式中，所述crRNA的序列如SEQ ID NO.3所示。
在本发明的一些实施方式中，所述报告探针的序列为：TTATT。
在本发明的一些实施方式中，所述报告探针的5’端标记的荧光基团，3’端标记的猝灭基团。
在本发明的一些实施方式中，所述荧光基团为FAM，猝灭基团为BHQ1。
在本发明的一些实施方式中，所述产品为试剂盒。
本发明的第三方面，提供本发明第一方面所述的DNAzyme酶或本发明第二方面所述产品在检测重金属离子或制备检测重金属离子中的应用。
在本发明的一些实施方式中，所述重金属离子为铅离子。
本发明的第四方面，提供一种检测重金属离子的方法，通过本发明第二方面所述的产品检测重金属离子。
在本发明的一些实施方式中，所述方法包含以下步骤：
S1：将链霉亲和素修饰的磁珠、DNAzyme酶与DNAzyme/纳米金复合探针组装成MB-DNAzyme/AuNP复合物后，加入待测样本进行反应，取上清液；
S2：在上清液中添加crRNA、LbCas12a、ssDNA-FQ，混合均匀进行反应，检测荧光信号。
在本发明的一些实施方式中，所述S2中的反应条件为35～45℃、40～60min。
在本发明的一些实施方式中，所述步骤S1的具体步骤包含：将链霉亲和素磁珠加缓冲液振荡2-8min后静置，取沉淀后加入DNAzyme酶振荡5-25min，取沉淀后加缓冲液振荡2-8min，取沉淀后加缓冲液振荡均匀，然后加入链霉亲和素标记的纳米金，于25-45℃振荡10-30min，加入待测液进行反应，25-45℃反应15-45min。
步骤S2的具体步骤为：在上清液中加入含有ssDNA-FQ、crRNA和LbCas12a的混合液，振荡混匀，置于25-45℃反应20-60min。
在本发明的一些实施方式中，所述上清液与混合物的体积比为(15～20):3。
在本发明的一些优选实施方式中，所述ssDNA-FQ、crRNA、LbCas12a的摩尔比为(18～22)：(1～1.5)：1。
在本发明的一些优选实施方式中，所述ssDNA-FQ、crRNA、LbCas12的摩尔比为：20：1.25：1。
本发明的有益效果是：
针对现有技术中所存在的不足，本发明采用核酸酶(也称DNAzyme)与纳米金组装形成的纳米探针对重金属离子进行识别和初级的信号放大，再结合CRISPR-Cas12a系统(规律成簇的间隔短回文重复序列及关联蛋白12a)的二次信号放大作用，提供一种重金属离子的检测方法和检测试剂盒。该方法具有操作简单、检测速度快、灵敏度高，可检测低至1pg/L的铅离子；无需任何复杂、耗时耗力的样品前处理过程；不需要专业培训即可完成整个检测过程；无需使用大型仪器，常用荧光检测仪即可检测。
附图说明
图1为DNAzyme/纳米金复合探针设计原理示意图；
图2为DNAzyme/纳米金复合探针检测重金属离子原理示意图；
图3为DNAzyme/纳米金复合探针检测铅离子和空白对照结果；
图4为Cas12a酶切反应温度的优化；
图5为Cas12a酶切反应时间的优化；
图6为荧光信号值与重金属离子浓度关系的回归曲线；
图7为DNAzyme/纳米金复合探针检测不同重金属离子结果。
具体实施方式
以下将结合实施例对本发明的构思及产生的技术效果进行清楚、完整地描述，以充分地理解本发明的目的、特征和效果。显然，所描述的实施例只是本发明的一部分实施例，而不是全部实施例，基于本发明的实施例，本领域的技术人员在不付出创造性劳动的前提下所获得的其他实施例，均属于本发明保护的范围。
链霉亲和素购买自北京索莱宝科技有限公司；氯金酸购买于北京颖诺凯胜科技有限公司；链霉亲和素修饰的磁性微球购买于苏州海狸生物医学工程有限公司；LbCas12a购买自New England Biolab公司；核酸探针由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。本发明中“室温”是指20-30℃的温度。
实施例1：DNAzyme/纳米金复合探针的设计和制备
(1)DNAzyme/纳米金复合探针设计。
DNAzyme/纳米金复合探针制备原理如图1所示。该探针由重金属离子特异性的DNAzyme和链霉亲和素标记的纳米金(SA-AuNP)构成。DNAzyme由酶链PB2、底物链PB1(分为a，b，c1区)和NTS(分为a*，c2区)三个单链组成，其中PB2与Pb1的b区域互补；NTS的a*区与PB1的a区互补；NTS和Pb1的c1和c2区域为多聚腺苷酸，作为间隔区用于减少空间位阻，末端标记有生物素基团(Biotin)。PB2、NTS和PB1通过碱基配对形成DNAzyme(NTS-Pb2-PB1)，能够与SA-AuNP通过Biotin-SA亲和作用，组装形成了DNAzyme/纳米金复合探针。表1是用于铅离子检测的DNA核酸序列，其中rA为腺嘌呤核糖核苷酸，是铅离子的切割位点。
表1核酸探针序列
15nm纳米金合成：配制100毫升浓度为0.01％的氯化金溶液，加热至沸腾，再将4ml1％的柠檬酸钠投入此水溶液中，混匀并煮沸30min成酒红色胶体，冷却至室温后，置于4℃保存。
纳米金的链霉亲和素标记：取200μL制备好的纳米金，加入到1.5mL的离心管中，加入20μL浓度为0.1mg/L的链霉亲和素溶液。在37℃下静置反应30min，加入20μL 0.2％BSA与2μL 2％PEG20000，37℃下放置5min。随后在7000rpm的条件下离心20min。用含2％ BSA的HEPES缓冲液(4.338g NaHEPES，0.158g无水氯化镁，0974g氯化钠，300ml超纯水，15μLTween-20，PH7.3)复溶至50μL，待用。
DNAzyme杂交：取20μL摩尔浓度为10μM的PB2，20μL摩尔浓度为10μM的NTS，36μL摩尔浓度为10μM的PB1与924μL HEPES缓冲液一同加入1.5mL离心管中，95℃水浴加热5min，室温下冷却待用。
DNAzyme/纳米金复合探针的制备：取200μL纳米金于1.5mL离心管中，加入20μL链霉亲和素(浓度为0.1mg/L)。37℃下放置30min后，加入20μL 0.2％BSA与2μL 2％PEG20000，37℃下放置5min。随后在7000rpm的条件下离心20min。用含2％ BSA的HEPES缓冲液复溶至50μL，加入50μL制备好的DNAzyme，振荡15min，待用。
实施例2：DNAzyme/纳米金复合探针检测重金属离子步骤
DNAzyme/纳米金复合探针检测重金属离子原理如图2所示。取100μL HEPES加入到1.5mL的离心管中，然后加入2μL浓度为10mg/mL的链霉亲和素磁珠，于室温下用旋涡振荡仪振荡5min；静置磁分离后，吸除上清液，重复上述步骤2-3次。取40μL杂交好的DNAzyme与已经洗涤好的链霉亲和素磁珠混合，室温振荡15min；磁选，去除上清液，沉淀加100μL HEPES缓冲液溶解，室温振荡5min；磁选，沉淀再加入100μLHEPES缓冲液，室温振荡5min。随后与上述制备的DNAzme/纳米金复合探针混合后37℃下振荡15min，磁选，去除上清液，获得沉淀为磁珠/DNAzyme/纳米金(MB-DNAzyme/AuNP复合物探针)，加100μL HEPES缓冲液分散，振荡5min，待用。
将铅离子加入到磁珠/DNAzyme/纳米金探针中，在37℃下振荡反应30min。置于外磁场静置5min后，吸取上清液17μL，加入到白色八联管中，先后加入1μL 10000nM的ssDNA-FQ、1μL 62.5nM的crRNA、1μL 50nM的LbCas12a，振荡混匀，置于37℃反应40min。使用QTOWER3型荧光定量PCR仪检测产生的荧光信号。
实施例3：DNAzyme/纳米金复合探针用于重金属离子检测可行性评估
为证明本检测方法的可行性，将制备的DNAzyme/纳米金复合探针用于检测含Pb2+样品和空白样品。结果如图3所示，含Pb2+样品具有强的荧光信号，荧光强度为7024.70；而不含Pb2+空白可以只有微弱的背景信号。将铅离子和空白检测的结果进行差异性分析，结果见图2，铅离子和空白检测的结果的差异性为极显著(P<0.001)，这些结果证明本方法用于检测铅离子是可行的。
实施例4：DNAzyme/纳米金复合探针检测重金属离子的工作条件优化
为了获得最佳的检测效果，本实施例对影响检测性能的Cas12a酶切反应温度和时间作进一步的优化。
由于温度会对酶切反应产生影响，因此需要对CRISPR-Cas12a系统的反应温度进行优化。选择温度为20℃、25℃、30℃、37℃、45℃分别进行反应。铅离子浓度均为10ng/L。结果如图4所示，当酶切温度从20℃增加到37℃时，荧光强度逐渐增大，在37℃时达到最大值，随后开始降低，因此37℃为最佳反应温度。
Cas12a酶反应时间是影响检测灵敏度的重要因素，因此对CRISPR-Cas12a系统反应时间进行了优化。选择浓度为10ng/L的铅离子进行实验，如图5所示，在反应时间为0min～40min时，荧光强度随时间快速增大，但是在40min之后，荧光强度几乎不再增长。为尽量缩短检测时间，将CRISPR-Cas12a系统反应时间定为40min。
实施例5:检测重金属离子的最优方案
取100μL HEPES加入到1.5mL的离心管中，然后加入2μL浓度为10mg/mL的链霉亲和素磁珠，置于旋涡振荡仪振荡5min；静置磁分离后，吸除上清液，重复上述步骤2-3次。取40μL杂交好的DNAzyme与已经洗涤好的链霉亲和素磁珠混合，振荡15min；磁选，去除上清液，沉淀加100μL HEPES缓冲液溶解，振荡5min；磁选，沉淀再加入100μL HEPES缓冲液，振荡5min。随后与上述制备的DNAzyme/纳米金复合探针混合后37℃下振荡15min，磁选，去除上清液，获得沉淀为MB-DNAzyme/AuNP复合物探针，加100μL HEPES缓冲液分散，振荡5min，待用。
将铅离子加入到MB-DNAzyme/AuNP复合物探针中，在37℃下振荡反应30min。置于外磁场静置5min后，吸取上清液17μL，加入到白色八联管中，先后加入1μL 10000nM的ssDNA-FQ、1μL 62.5nM的crRNA、1μL 50nM的LbCas12a，振荡混匀，置于37℃反应40min。使用QTOWER 3型荧光定量PCR仪检测产生的荧光信号。
实施例6：DNAzyme/纳米金复合探针检测重金属离子的线性范围分析
在以上优化的最佳检测条件下，应用构建的检测方法对浓度为1pg/L、10pg/L、100pg/L、1ng/L、10ng/L、100ng/L、1μg/L、10μg/L的Pb2+进行检测。如图6所示，荧光响应信号强度随Pb2+浓度的增加而增强。对荧光信号强度与Pb2+浓度作相关分析，结果表明荧光信号强度与Pb2+浓度在1pg/L～10μg/L之间具有良好的线性关系，其线性方程为y＝0.7554x+2.6201,相关系数R2＝0.9959，检测限为1pg/L。
实施例7：选择性检测
对重金属离子的选择性是检测方法的另外一个重要指标。利用铅离子的检测系统分别对金属阳离子(Fe3+、Mn2+、Ni2+、Cd2+、Cu2+、Ca2+、Zn2+、K+、Na+),阴离子(SO4 2-、Cl-、NO3 -、HCO3 -)和有机物(牛血清白蛋白)进行检测，其中Pb2+的浓度是100ng/L，其它对照样品的浓度是100μg/L。结果如图7所示，这些对照样品只有弱的背景信号，而Pb2+有强的响应信号。尽管对照样品的的质量浓度为Pb2+的1000倍，但它们检测的荧光信号强度远低于Pb2+，说明本方法对铅离子具有优异的选择性。
实施例8：加标样品的分析
下面对本发明的微生物检测方法及检测试剂盒作进一步的效果评估。
为了验证本方法在实际样品检测的可行性，分别采集湖水和自来水水样，用于制备铅离子溶液。铅离子的掺杂浓度分别为0.01ng/L、0.1ng/L、1ng/L，利用构建的方法对上述铅离子掺杂的水样进行检测，回水收率计算结果如表2所示，自来水样品回收率在98％-99％之间，湖水为97％-98％，所有的样品相对标准偏差均小于5％。这些结果说明，本发明构建的检测方法对样品基质有良好的抗干扰能力，可用于环境样品的检测。
表2检测掺杂铅离子真实水样的回收率
Claims (10)
1.一种DNAzyme酶，其特征在于，所述DNAzyme酶由底物链PB1、酶链PB2和NTS三个单链组成，其中PB1包含a，b，c1区，NTS包含a*，c2区，PB2与PB1的b区部分互补，NTS的a*区与PB1的a区完全互补。
2.根据权利要求1所述的DNAzyme酶，其特征在于，所述PB1的序列如SEQ ID NO.1所示，所述PB2的序列如SEQ ID NO.2所示，所述NTS的序列如SEQ ID NO.2所示。
3.根据权利要求2所述的DNAzyme酶，其特征在于，所述PB1和NTS的3’端为多聚腺苷酸，末端标记有生物素基团。
4.一种产品，其特征在于，所述产品包含权利要求1～3任一项所述的DNAzyme酶。
5.根据权利要求4所述的产品，其特征在于，所述产品中还包含链霉亲和素标记的纳米金SA-AuNP；优选地，所述产品中还包含：CRISPR-Cas检测试剂、链霉亲和素标记的磁珠。
6.根据权利要求5所述的产品，其特征在于，所述CRISPR-Cas检测试剂包含：crRNA、Cas12a、报告探针ssDNA-FQ；优选地，所述crRNA的序列如SEQ ID NO.3所示；
优选地，所述报告探针ssDNA-FQ的序列为：TTATT。
7.权利要求1～3任一项所述的DNAzyme酶或权利要求4～6任一项所述的产品在检测重金属离子或制备检测重金属离子的产品中的应用。
8.一种检测重金属离子的方法，其特征在于，通过权利要求4～6任一项所述的产品检测重金属离子；优选地，所述重金属离子为铅离子。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述方法包含以下步骤：
S1：将DNAzyme酶与链霉亲和素标记的纳米金混合组装成DNAzyme/纳米金复合探针，然后将链霉亲和素修饰的磁珠、DNAzyme酶与DNAzyme/纳米金复合探针组装成MB-DNAzyme/AuNP复合物，加入待测样本进行反应，取上清液；
S2：在上清液中添加crRNA、Cas12a、ssDNA-FQ，混合均匀进行反应，检测荧光信号。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述S2中的反应条件为25～45℃、20～60min。
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|---|---|---|---|---|
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2023
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