CN110951830B - 一种用于铜（ii）离子检测的荧光探针及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于铜(II)离子检测的荧光探针，其由修饰FAM荧光基团的DNA构成，所述DNA序列为5'‑AAAAAAAAGCGC‑3'。该荧光探针对铜(II)离子具有高选择性识别，灵敏度高，可以实现复杂金属离子溶液体系中铜(II)离子检测，且荧光探针设计简单、成本低，有利于推广应用。

Description

一种用于铜（II）离子检测的荧光探针及其应用

技术领域

本发明涉及一种荧光探针，特别涉及一种关于铜(II)离子检测的FAM-DNA 荧光探针，还涉及一种基于铜(II)离子结合FAM-DNA荧光探针使其淬灭的特性，通过荧光信号的变化来检测铜离子的方法，属于荧光检测领域。

技术背景

金属离子不仅可以维持生物分子的结构，还可以参与各种生命过程，铜离子在生物体系中扮演着重要的角色，其浓度高低直接影响人们的健康。而在环境中，特别是水质中，铜离子已经被认定为一种环境污染物，所以准确检测二价铜离子，在环境和生物分析等领域有重要的意义。

目前检测铜离子的方法主要有电感耦合等离子体发射光谱法、原子吸收光谱法、表面增强拉曼散射、电化学检测、比色检测等。虽然这些方法灵敏度高、特异性好，但所用仪器昂贵、成本高、操作过程复杂。荧光探针法作为荧光法的一种，其选择性好、灵敏度高、成本低，适合作为铜离子检测方法的发展方向。由此，构建检测铜(II)离子的荧光探针具有十分重要的意义。

发明内容

针对现有技术的缺陷，本发明的目的是提供一种对铜(II)离子具有高选择性识别，灵敏度高的FAM-DNA荧光探针，该荧光探针设计简单、成本低，有利于推广应用。

本发明的第二个目的是在于提供一种利用FAM-DNA荧光探针检测溶液体系中铜(II)离子的方法，该方法利用铜(II)离子结合FAM-DNA荧光探针使其淬灭的特性，通过荧光信号的变化来检测铜离子，设计的FAM-DNA对铜(II) 离子具有高选择性识别，受其他金属离子干扰小，适宜溶液体系中的铜(II)离子检测，特别是复杂金属离子溶液体系中铜(II)离子的检测。

为了实现上述技术目的，本发明提供了一种用于铜(II)离子检测的荧光探针，其由修饰FAM荧光基团的DNA构成，所述DNA序列为5'-AAAAA AAAGCGC-3'。

本发明还提供了一种用于铜(II)离子检测的荧光探针的应用，其应用于荧光检测溶液体系中的铜(II)离子。

优选的方案，所述溶液体系中包含Cu²⁺，或者包含Zn²⁺、Fe²⁺、Mn²⁺、 Co²⁺、Ni²⁺、Hg²⁺、Pb²⁺、Mg²⁺、Ca²⁺中至少一种与Cu²⁺。该荧光探针可以用于单一铜(II)离子溶液中铜(II)离子的定量检测，也可以对复杂溶液体系中的铜(II)离子的定量检测。

优选的方案，将一系列不同浓度的铜(II)离子标准溶液与荧光探针溶液混合反应后，进行荧光强度检测，得到一系列荧光信号值，建立铜(II)离子溶液浓度与荧光信号值的标准曲线；将含铜(II)离子的待测溶液与荧光探针溶液混合反应后，进行荧光强度检测，得到相应荧光信号值，再根据标准曲线计算出含铜(II)离子的待测溶液中铜离子浓度。

优选的方案，荧光探针溶液与铜(II)离子标准溶液或含铜(II)离子的待测溶液，在20～30℃避光反应3～8min。

优选的方案，含铜(II)离子的待测溶液浓度在100nM～25μM范围内。

现有技术中一般的荧光探针通常由受体、具备传递作用的连接分子和荧光团三部分组成，而本发明的荧光探针是将FAM荧光团与DNA序列连结在一起。FAM本身有荧光信号，可用作信号分子。特别设计的DNA碱基上具有特殊的含N和O螯合基团，可以在复杂金属离子溶液体系中选择性络合铜(II)离子(如Zn²⁺、Fe²⁺、Mn²⁺、 Co²⁺、Ni²⁺、Hg²⁺、Pb²⁺、Mg²⁺、Ca²⁺等均不干扰DNA对铜(II)离子的络合)，形成FAM-DNA-Cu²⁺复合物，从而高效淬灭FAM的荧光，实现ON-OFF 的信号转变，并以此探针作铜离子的检测探针，通过荧光信号的变化来检测铜离子的含量，从而可以实现FAM-DNA荧光探针对铜离子的高选择性检测。

本发明的FAM-DNA是购买于生工生物工程(上海)股份有限公司。并同时设计了多种序列进行对比试验，FAM-DNA1：5'-TTTTTTTTTTTT-3'；FAM-DNA2：5'-AAAAAAAAAAAA-3'；FAM-DNA3：5'-AAAAAAAAGCGC-3'；FAM-DNA4：5'-ACACTGCCAGGC-3'。试验表明最具有高选择性，且淬灭效果好的是 FAM-DNA3，从而采用FAM-DNA3作为检测铜离子探针。

本发明的三羟甲基氨基甲烷(Tris)可购买于Sigma-Aldrich(St Louis，MO)。

优选的方案，荧光探针溶液与铜(II)离子标准溶液或含铜(II)离子溶液在Tris-HCl缓冲液(10mM，pH 6.0)中反应。

优选的方案，荧光探针溶液的浓度为50nM。

相对现有技术，本发明的技术方案带来的有益技术效果：

本发明技术方案设计的FAM-DNA荧光探针，实现了对铜(II)离子的荧光检测，具有选择性高、灵敏度高、检测浓度范围广、生物安全性好、成本低、操作简单等优点。

本发明技术方案设计的FAM-DNA荧光探针可以实现复杂金属离子体系中铜(II)离子的选择性识别，如Zn²⁺、Fe²⁺、Mn²⁺、Co²⁺、Ni²⁺、Hg²⁺、 Pb²⁺、Mg²⁺、Ca²⁺等干扰小。

本发明技术方案设计的FAM-DNA荧光探针，其稳定性好、成本低、不需要复杂的合成过程以及昂贵的仪器，有效的改善了现有技术成本高、稳定性低以及材料合成过程复杂的问题。

本发明的技术方案通过荧光信号变化的方法检测铜离子，性质更稳定，操作更为简便，有利于推广应用。

附图说明

【图1】为通过荧光信号变化的方法检测铜离子的实验方法的示意图；

【图2】为铜离子对FAM-DNA1、FAM-DNA2、FAM-DNA3三种不同荧光探针的淬灭效果；

【图3】A图和B图分别为FAM-DNA4和FAM-DNA3荧光探针对目标离子和其他离子的选择性图；

【图4】为在一定浓度范围内检测铜离子含量的荧光图；

【图5】为一定浓度范围内检测铜离子含量的线性关系图。

具体实施方式

以下实施例旨在进一步说明本发明内容，而不是限制本发明权利要求的保护范围。

实施例1

1、FAM-DNA荧光探针溶液的制备方法，步骤如下：

用去离子水配制pH为6.0、浓度为10mM的Tris-HCl缓冲溶液；将FAM-DNA 荧光探针用离心机离心，加入Tris-HCl缓冲液(10mM，pH 6.0)，在振荡器上混匀5分钟，配制成10μMFAM-DNA，稀释成100nM，放4℃冰箱待用。

2、铜离子溶液的制备方法，步骤如下：

用分析天平称取0.0034g的CuCl₂·2H₂O，加入配置好的Tris-HCl缓冲溶液(10 mM，pH 6.0)溶解，稀释成200nM、1.6μM、4μM、8μM、16μM、30μM、40μM、 50μM、60μM、100μM一系列浓度，放4℃冰箱待用。

3、铜离子溶液的检测步骤如下：

取等体积的FAM-DNA荧光探针溶液，分别加入最终浓度为100nM、800nM、 2μM、4μM、8μM、15μM、20μM、25μM、30μM、50μM的铜离子溶液，放入 25℃水浴中反应5min后检测其荧光信号。

4、对不同序列的FAM-DNA荧光探针淬灭步骤如下：

取等体积的FAM-DNA1、FAM-DNA2、FAM-DNA3荧光探针溶液于离心管中，分别加入等体积铜离子(50μM)，对照组加入等体积缓冲液，放入25℃水浴中反应5min后检测其荧光信号。

5、选择性检测步骤如下：

将所述的FAM-DNA3和FAM-DNA4荧光探针，分别加入20μM Zn²⁺、 Fe²⁺、Mn²⁺、Co²⁺、Ni^{2 +}、Hg²⁺、Pb²⁺、Mg²⁺、Ca²⁺、Cu²⁺等离子，放入25℃水浴中反应5min后检测荧光信号。

6、建立坐标曲线步骤如下：

用Tris-HCl缓冲液(10mM，pH 6.0)配置不同浓度的铜离子溶液，每个溶液取相同体积加入到FAM-DNA3荧光探针溶液中，放入25℃水浴中反应5min后检测荧光信号，重复3组实验，用origin软件做出线性拟合曲线图。

从图2可以看出铜离子淬灭FAM-DNA荧光探针程度为FAM-DNA3＞ FAM-DNA2＞FAM-DNA1，表明铜离子对FAM-DNA3淬灭效果最好；

从图3可以看出所设计的FAM-DNA3荧光探针(B图)对铜离子有高选择性，FAM-DNA3荧光探针对其他离子产生的干扰明显优于FAM-DNA4荧光探针 (A图)；

从图4可以看出荧光信号随着铜离子浓度增大而减小；

从图5可以看出在一定的浓度范围内铜离子与其所对应的响应信号有一定的线性关系。

Claims (1)

1.一种用于铜(II)离子检测的荧光探针，其特征在于：由FAM荧光基团修饰的DNA构成，所述DNA序列为5'-AAAAAAAAGCGC-3'。

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