CN111650169A - 一种基于断裂活性脱氧核酶构成的荧光型铜离子传感器 - Google Patents

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许家翠
王世瑾
王富龙
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Abstract

本发明公开一种基于断裂活性脱氧核酶构成的荧光型铜离子传感器，属于饮用水中金属离子检测领域。断裂活性脱氧核酶5’端化学修饰荧光淬灭分子，其底物5’和3’端分别化学修饰荧光淬灭分子和荧光分子。断裂活性脱氧核酶、底物以及2‑巯基乙醇组成一种荧光型铜离子传感器。当检测样品中含有铜离子时，2‑巯基乙醇与铜离子共同作用使脱氧核酶催化底物断裂进而产生荧光信号。本传感器检测铜离子下限为3nmol/L，对铜离子具有检测专一性并且表现出抗钙离子、镁离子等干扰性。使用本发明可以实现饮用水中铜离子含量检测。

Description

一种基于断裂活性脱氧核酶构成的荧光型铜离子传感器
技术领域
本发明属于分析化学领域，涉及一种铜离子传感器，具体涉及一种基于断裂活性脱氧核酶检测饮用水中铜离子含量的荧光型传感器。
背景技术
铜是人体必需的微量元素，对维持身体健康和器官的正常运行不可或缺。例如，酶催化功能也需要铜离子的参与和活化，对铁的代谢和人体的造血功能也有重要的影响。然而，铜在人体内的含量有一定的标准，过多或过少都会对人体各项机能产生危害。如果铜含量过低，会对人体发育造成影响，也会影响中枢神经和免疫系统。如果铜含量过高，也会对人体产生危害。短时间铜含量过高，会引起胃肠道紊乱，出现恶心、呕吐、胃痉挛等症状，如果长时间处于高浓度铜含量的环境中，会对心脑血管、肝以及肾脏产生危害。
饮用水是人体摄入铜离子的主要途径，水中铜离子含量与人体健康密切相关，对饮用水中铜离子含量的测定具有非常重要的意义。目前，已开发出多种检测水中铜离子的方法，例如，如光谱法、电化学法等，然而，这些方法大多需要复杂的仪器和样品制备过程，甚至有些材料会造成环境污染。相比之下，酶法检测具有专一性强，而荧光信号具有灵敏度高，是一种价格低廉、绿色环保、简单便捷的方法。因此，我们设计构建了一种基于脱氧核酶的荧光型传感器，用于检测饮用水中铜离子含量。
发明内容
本发明的目的是提供一种基于断裂活性脱氧核酶检测饮用水中铜离子含量的荧光型传感器。
为实现上述目的，本发明通过以下技术来实现：
荧光型铜离子传感器的检测原理：
荧光型铜离子传感器由两条DNA链构成。
脱氧核酶DNA链5’端化学修饰荧光淬灭分子黑洞淬灭分子2(Black HoleQuencher-2)。
底物DNA链的5’端化学修饰荧光淬灭分子黑洞淬灭分子2(Black Hole Quencher-2)，3’端化学修饰荧光分子德克萨斯红荧光分子(Texas-Red)，这种底物链分子标记方法可以有效降低背景荧光信号。
脱氧核酶通过碱基互补配对方式与底物识别结合，酶链5’端标记的荧光淬灭分子与底物链3’端标记的荧光分子靠近，荧光分子发生淬灭，无荧光信号发射。
在检测体系中，当只含有2-巯基乙醇时，脱氧核酶无催化活性。
当加入铜离子后，铜离子与2-巯基乙醇共同作用促使脱氧核酶催化断裂底物。
随着底物断裂片段离开脱氧核酶，断裂片段上修饰的荧光分子与脱氧核酶修饰的荧光淬灭分子分离，荧光分子发射荧光信号。
荧光信号强度和铜离子浓度之间可以建立数学关系，从而达到检测铜离子浓度目的。
荧光型铜离子传感器检测原理见图1。
荧光型铜离子传感器检测下线：
本传感器检测下线为3nmol/L，铜离子浓度与传感器荧光信号强度关系见图2。
荧光型铜离子传感器检测专一性：
当本传感器检测10种二价金属离子(Mg2+、Ca2+、Mn2+、Co2+、Ni2+、Cu2+、Zn2+、Cd2+、Ba2+以及Pb2+)时，只有铜离子会使本传感器荧光信号显著增强，而其他9种二价金属离子不会使荧光信号增强(见图3)。
荧光型铜离子传感器抗二价金属离子干扰性：
在饮用水中常含有多种二价金属离子，例如Ca2+、Mg2+等离子。
当9种二价金属离子(Mg2+、Ca2+、Mn2+、Co2+、Ni2+、Zn2+、Cd2+、Ba2+以及Pb2+)浓度是铜离子浓度(Cu2+为1μmol/L)10倍时，这些金属离子未能干扰本传感器检测(见图4)。
当Ca2+和Mg2+离子浓度为铜离子浓度10000倍时，也同样不干扰本传感器检测，表明本传感器具有较强的抗二价金属离子干扰性，尤其是抗Ca2+和Mg2+离子干扰。
荧光型铜离子传感器对样品检测：
检测自来水样品Cu2+含量为2.3±0.12μmol/L。
检测铜锅中水样品Cu2+含量为13.5±0.93μmol/L。
附图说明
图1为荧光型铜离子传感器检测原理图。F表示荧光分子，Q表示荧光淬灭分子。
图2为荧光型铜离子传感器检测范围和荧光信号关系图。
图3为荧光型铜离子传感器检测专一性图。
图4为荧光型铜离子传感器抗二价金属离子干扰性图。
具体实施方式
本发明实验所使用仪器为Tecan Infinite F200酶标仪。
所用脱氧核酶和底物为生工生物工程(上海)股份有限公司合成。
下面通过具体的实施方式对本发明荧光型铜离子传感器作进一步说明。
荧光型铜离子传感器对铜锅中水样品检测：
在铜锅中加入去1L离子水，室温保持30分钟后取10个10μL水样品。
检测体系组成包括10μL水样品、50nmol/L脱氧核酶、50nmol/L底物、10μmol/L 2-巯基乙醇、0.8mol/L NaCl以及50mmol/L MES(pH 6.8)，总检测体积为100μL。
23℃水浴中反应15分钟后，利用微量移液器将检测液转移到96孔荧光检测板中，使用Tecan Infinite F200多功能酶标仪检测荧光信号，然后将荧光值代入公式中计算铜离子浓度。
序列表
<110> 吉林大学
<120> 一种基于断裂活性脱氧核酶构成的荧光型铜离子传感器
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tgagtctggg cctctttctt ttagaaagaa c 31
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tctttctaag acgactca 18

Claims (9)

1.一种基于断裂活性脱氧核酶构成的荧光型铜离子传感器，其特征在于：该传感器由断裂活性脱氧核酶、DNA底物、2-巯基乙醇以及缓冲体系组成。
2.如权利要求1所述一种基于断裂活性脱氧核酶构成的荧光型铜离子传感器，其特征在于：断裂活性脱氧核酶的DNA序列为5’-tgagtctgggcctctttcttttagaaagaac-3’。
3.如权利要求1所述一种基于断裂活性脱氧核酶构成的荧光型铜离子传感器，其特征在于：断裂活性脱氧核酶5’端化学修饰的荧光淬灭分子为黑洞淬灭分子2(Black HoleQuencher-2)。
4.如权利要求1所述一种基于断裂活性脱氧核酶构成的荧光型铜离子传感器，其特征在于：DNA底物序列为5’-tctttctaagacgactca-3’。
5.如权利要求1所述一种基于断裂活性脱氧核酶构成的荧光型铜离子传感器，其特征在于：DNA底物5’端化学修饰的荧光淬灭分子为黑洞淬灭分子2(Black Hole Quencher-2)，3’端化学修饰的荧光分子为德克萨斯红荧光分子(Texas-Red)。
6.如权利要求1所述一种基于断裂活性脱氧核酶构成的荧光型铜离子传感器，其特征在于：断裂活性脱氧核酶与DNA底物使用浓度同为50nmol/L。
7.如权利要求1所述一种基于断裂活性脱氧核酶构成的荧光型铜离子传感器，其特征在于：断裂活性脱氧核酶催化辅因子为2-巯基乙醇(2-Mercaptoethanol)。
8.如权利要求1所述一种基于断裂活性脱氧核酶构成的荧光型铜离子传感器，其特征在于：2-巯基乙醇使用浓度为10μmol/L。
9.如权利要求1所述一种基于断裂活性脱氧核酶构成的荧光型铜离子传感器，其特征在于：缓冲体系由0.8mol/L NaCl和50mmol/L MES缓冲溶液(pH为6.8)组成。
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