CN114397282A - 一种用核酸适配体和g-四链体免标记荧光分析法检测氯霉素的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于靶点诱导G‑四链体结构转变的氯霉素(CAP)检测方法，将G4探针和适配体在Tris‑HCl缓冲液中合成一种特殊介导中间发卡构象的G4‑DNA‑G4检测探针，抑制了G四链体的形成，NMM染料无法被G四链体结构增强，荧光信号减弱；加入氯霉素竞争结合适配体，使得G4探针结构改变，荧光信号加强；基于上述G‑四链体荧光变化，确定待测样品中的CAP浓度；该发明检测时间不到10分钟，灵敏度高，检出限为0.518ng·mL‑1。且选择性和回收性实验也证明了该方法具有令人满意的结果。该方法具有潜在的适用性，为基于适配体和G‑四链体的无标签传感器的开发提供了一种新的策略。
Description
技术领域
本发明属于食品安全分析领域，是一种新的基于适配体的荧光传感器，用于待测样品中氯霉素的检测。
背景技术
抗生素作为抗菌药在世界范围内广泛应用，用于治疗疾病和促进动物生长。近年来，食品安全问题不断暴露，食品安全现状已成为越来越多人关注的焦点。抗生素的过度使用已经成为世界上最大的问题之一。因此，对食品中抗生素残留的检测是十分必要和重要的。
目前,许多标准测试方法，如高效液相色谱、气相色谱-质谱分析,电感耦合等离子体质谱法、液相色谱-质谱法和化学发光酶联免疫吸附等结果相对准确的，但这些方法的操作繁琐且昂贵，因此,开发简便、经济、便携的CAP测定替代品是十分必要的。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服现有技术中氯霉素检测较为繁琐的缺陷，提供一种用核酸适配体和G-四链体免标记荧光分析法检测氯霉素的方法。
G4探针和适配体在Tris-HCl缓冲液中合成，G4探针与适配体结合，形成一种特殊介导中间发卡构象的G4-DNA-G4检测探针，抑制了G-四链体的形成， NMM染料无法被G-四链体结构增强，荧光信号减弱，用于待测样品中氯霉素的检测。
本发明用核酸适配体和G-四链体免标记荧光分析法检测氯霉素的方法，包括以下步骤：
S1、G4探针和适配体在Tris-HCl缓冲液中合成，G4探针与适配体的结合，形成一种介导中间发卡构象的G4-DNA-G4检测探针，抑制了G四链体的形成， NMM染料无法被G四链体结构增强，荧光信号减弱；
S2、加入氯霉素竞争结合适配体，使得G4探针结构改变，荧光信号加强；
S3、基于上述G-四链体荧光变化，确定待测样品中的CAP浓度；
该发明检测时间不到10分钟，灵敏度高，检出限为0.518ng·mL-1。且选择性和回收性实验也证明了该方法具有令人满意的结果。
适配体CAP-AP的序列为：
5’-ACTTCAGTGAGTTGTCCCACGGTCGGCGAGTCGGTGGTAG-3’；
该适配体能够对氯霉素进行特异性识别；
从AP 5’端固定选取14个连续碱基设计的一种特殊介导中间发卡构象的 G4-DNA-G4检测探针，选用茎部5个碱基的一种特殊介导中间发卡构象的 G4-DNA-G4检测探针；选用环状区为9个碱基的一种特殊介导中间发卡构象的 G4-DNA-G4检测探针。
所述Tris-HCl缓冲液盐K+浓度为10mM。所述Tris-HCl缓冲液盐不添加 Na+。所述Tris-HCl缓冲液盐Mg2+浓度为5mM。
所述特殊介导中间发卡构象的G4-DNA-G4探针浓度与适配体浓度之比为1： 1。
基于下列回归方程，y＝59.091x+1.733，R2＝0.9939(y为不同氯霉素浓度下荧光吸收值比率，x为相应氯霉素浓度)。根据三倍相对标准偏差(3σ/K，n＝11) 计算该方法检出限，为0.518ng·mL-1。
所述氯霉素及其他抗生素(加链霉素、庆大霉素和卡那霉素)中，只有氯霉素与所述配体表现出特异性结合。
本发明所达到的有益效果是：本发明公开了一种基于靶点诱导G-四链体结构转变的氯霉素(CAP)检测方法，将G4探针和适配体在Tris-HCl缓冲液中合成一种特殊介导中间发卡构象的G4-DNA-G4检测探针，抑制了G四链体的形成， NMM染料无法被G四链体结构增强，荧光信号减弱；加入氯霉素竞争结合适配体，使得G4探针结构改变，荧光信号加强；基于上述G-四链体荧光变化，确定待测样品中的CAP浓度；该发明检测时间不到10分钟，灵敏度高，检出限为 0.518ng·mL-1。且选择性和回收性实验也证明了该方法具有令人满意的结果。该方法具有潜在的适用性，为基于适配体和G-四链体的无标签传感器的开发提供了一种新的策略。
附图说明
附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：
图1是基于适配体和G-四链体的荧光分析法检测氯霉素的原理示意图；
图2是与AP结合位置不同的G4探针检测效果图；
图3是探针结合部位、长度固定情况下G4颈环结构颈部碱基数优化检测效果图；
图4是探针茎杆区固定情况下G4颈环结构环部碱基数优化检测效果图；
图5是 Tris-HCl缓冲液中钾离子浓度对检测效果的影响图；
图6 是Tris-HCl缓冲液中钠离子浓度对检测效果的影响图；
图7 是Tris-HCl缓冲液中镁离子浓度对检测效果的影响图；
图8 是G4探针与AP浓度之比对检测效果图；
图9 是CAP浓度与F-F0的线性关系图；
图10是链霉素、庆大霉素、卡那霉素对检测氯霉素的影响图。
具体实施方式
以下结合附图对本发明的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例
试剂准备
CAP–AP(5’-ACTTCAGTGAGTTGTCCCACGGTCGGCGAGTCGGTGGTAG-3’)购自上海生工，所有G4探针(P1-P9)(见附表1)均购自上海生工，Tris–HCl(20mM Tris-HCl，10mM KCl,，5mMMgCl2，pH 7.4)缓冲液及其他化学药品均购自国药集团化学试剂有限公司。所用试剂除特别说明外均为分析纯，实验用水均为过滤除菌的超纯水。
反应
将CAP-AP溶液与P1-9溶液恢复至室温，分别用移液枪移取相应体积的适配体溶液和G4探针溶液于96孔酶标板(黑底)中，加入上述配制的Tris-HCl 缓冲液充分混合，使得加上氯霉素和NMM溶液后的终体积为200μL。在室温下震荡30分钟得到双链DNA,用于氯霉素检测。向孔中加入氯霉素标准溶液和NMM 染料溶液，NMM染料浓度为G4探针的两倍。在37℃下反应1小时后检测该溶液在激发波长399nm、发射波长610nm处的荧光强度F。F0即表示溶液中不存在氯霉素时的荧光强度。酶标仪使用光学元件类型为单色器，光学元件位置为顶部，检测高度为7mm，检测类型为终点检测。
实验条件优化
选取氯霉素适配体序列14个连续碱基作为互补模板，分别位于适配体序列的5’端、中间位置和3’端，与G4探针互补配对，分别形成基于5’端、中间位置和3’端互补的AP-G4复合物，根据图2中荧光增强的效果，确定从AP 5’端固定选取14个连续碱基设计G4探针(特殊介导中间发卡构象的G4-DNA-G4 探针)的效果更好。
从5’端固定选取14个连续碱基用于茎环结构的组成，这样G4探针(特殊介导中间发卡构象的G4-DNA-G4探针)能和适配体相结合的碱基也随之确定，然后分别以8个、5个、3个和0个碱基作为茎杆区的碱基序列，比较不同茎环结构(用茎部碱基个数+环部碱基个数表示)的G4探针(特殊介导中间发卡构象的G4-DNA-G4探针)对检测氯霉素效果的影响。如图3所示，我们可以发现选用茎部5个碱基，效果更好，在此基础上继续优化序列。
固定探针茎杆区的碱基序列，比较环部碱基个数不同的探针检测氯霉素的效果，其结果如图4所示。我们可以发现以5个碱基为茎杆区序列、9个碱基为环状区序列构成G4探针(特殊介导中间发卡构象的G4-DNA-G4探针)时，荧光增强效果最好，对氯霉素的检测效果最佳。
缓冲液中盐离子的种类与浓度与G-四链体结构的形成密切相关，这是因为 G-四链体序列需要经过金属阳离子配位才能提高形成G-四链体结构的稳定性，本实验选择钾离子、钠离子和镁离子，探究阳离子种类及浓度大小对实验效果的影响。由图5-7可以发现，当K+浓度较低时，荧光增强效果很差，这是因为此时形成的G-四链体结构很不稳定，不利于G-四链体与NMM的结合。随着体系中K+浓度的增加，当K+浓度为10mM时，荧光增强效果最佳。
缓冲液中盐离子的种类与浓度与G-四链体结构的形成密切相关，这是因为 G-四链体序列需要经过金属阳离子配位才能提高形成G-四链体结构的稳定性，本实验选择钾离子、钠离子和镁离子，探究阳离子种类及浓度大小对实验效果的影响。可以发现，当缓冲液中不添加Na+时，F-F0值最大，因此本实验Tris-HCl 缓冲液中不添加Na+。
缓冲液中盐离子的种类与浓度与G-四链体结构的形成密切相关，这是因为 G-四链体序列需要经过金属阳离子配位才能提高形成G-四链体结构的稳定性，本实验选择钾离子、钠离子和镁离子，探究阳离子种类及浓度大小对实验效果的影响。可以发现，当Mg2+为5mM时，荧光增强效果最佳。
G4探针浓度对G-四链体结构的形成有重要的影响，本实验通过G4探针和适配体溶液浓度的比值反应两者之间的关系。由图8可见，实验中采用G4探针和氯霉素适配体(CAP-AP)浓度比例为1:1时，终浓度控制为1μM，荧光增强效果最佳。
测定方法的敏感性及标准曲线建立
在上述最优条件下考察该方法对氯霉素的检测灵敏度。向体系中添加不同浓度的氯霉素标准品稀释液进行检测，计算F-F0。以CAP浓度(单位为ng·mL-1) 为横坐标，F-F0为纵坐标，得到目标物浓度与荧光增强的关系曲线，结果如图 3-9所示。如图9所示，在氯霉素浓度在1～10ng·mL-1时体系的荧光强度增长值与氯霉素浓度呈线性关系，线性方程为y＝59.091x+1.733(R2＝0.9939)。根据三倍相对标准偏差(3σ/K，n＝11)计算该方法检出限，为0.518ng·mL-1。
实施例5：氯霉素特异性测定
为了考察本方法的特异性，实验选取了另外三种常见的抗生素在在相同条件下用本方法进行检测，分别是链霉素、庆大霉素和卡那霉素。如图10所示，实验结果表明当加入庆大霉素和卡那霉素时，荧光强度几乎没有变化。当加入链霉素时，荧光强度不仅没有增强反而降低，只有氯霉素产生荧光增强效果，这三种抗生素对CAP的检测都没有产生明显的干扰，表明本方法对CAP的检测具有良好的选择性。
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 江苏鑫蓝鑫生物科技有限公司
江南大学
<120> 一种用核酸适配体和G-四链体免标记荧光分析法检测氯霉素的方法
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gggttttggg taccgtggga caactcccac ggttgggttt tggg 44
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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Claims (4)
1.一种用核酸适配体和G-四链体免标记荧光分析法检测氯霉素的方法；其特征在于，核酸适配体的核苷酸序列为：
ACTTCAGTGAGTTGTCCCACGGTCGGCGAGTCGGTGGTAG；
G4探针的核苷酸序列为：
GGGTTTTGGGT ACTTCCAACTCACTGAAGT TGGGTTTTGGG；
将G4探针和核酸适配体在Tris-HCl缓冲液中结合，形成介导中间发卡构象的G4-DNA-G4检测探针；
加入氯霉素竞争结合适配体，使得G4探针结构改变，荧光信号加强；
基于G-四链体荧光变化，确定待测样品中的CAP浓度。
2.如权利要求1所述的用核酸适配体和G-四链体免标记荧光分析法检测氯霉素的方法，其特征在于，Tris-HCl缓冲液盐中K+浓度为10mM，Na+含量为0，Mg2+浓度为5mM。
3.如权利要求1所述的用核酸适配体和G-四链体免标记荧光分析法检测氯霉素的方法，其特征在于，G4探针浓度与核酸适配体浓度之比为1：1。
4.如权利要求1所述的用核酸适配体和G-四链体免标记荧光分析法检测氯霉素的方法，其特征在于，检测限为0.518ng·mL-1。
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