CN112980427A - 一种氯霉素上转换荧光探针的制备方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种氯霉素上转换荧光探针的制备方法及其应用：首先取5mg上转换荧光纳米材料超声溶解于2mLMES缓冲溶液中；再称取EDC1.536mg和NHS2.4mg分别溶解于200μL MES溶液中，迅速加入到上述混合溶液中，30℃反应3h；反应完毕后，离心分离沉淀，离心产物用去离子水离心洗涤3次；用1mL HEPES缓冲液将上述产物复溶，加入氯霉素单克隆抗体，30℃反应4h；反应完毕后，取15mg BSA加入到上述混合溶液中，30℃反应1h。然后离心收集沉淀产物，并用去离子水洗涤3次，最后复溶于1mL HEPES溶液中，最终得到氯霉素上转换荧光探针。本发明优点是：本文合成了上转换荧光探针，并应用于动物源性食品中氯霉素的检测。

Description

一种氯霉素上转换荧光探针的制备方法及其应用
技术领域
本发明属于光学传感材料制备技术及免疫分析技术研究领域，具体是一种氯霉素上转换荧光探针的制备方法及应用在动物源性食品中检测氯霉素。
背景技术
氯霉素最早发现于委内瑞拉链霉菌发酵液的提取液中，是一种广谱抗生素。曾广泛应用于人类、动物和鱼类养殖业，用于治疗革兰氏阴性和革兰氏阳性细菌引起的细菌感染。氯霉素的广谱抗菌能力和价格低廉等特性，让其在早期广泛应用于人体临床治疗、动物败血病、肺部、泌尿和消化系统感染。由于氯霉素的分子结构具有的苯环上含有硝基，且半衰期消除时间比较长，一旦人体血浆中CAP的浓度超过25μg mL-1，其毒性可能会影响人体生命安全。其毒副作用主要表现为影响人体骨髓造血功能，导致再生障碍性贫血，可引起患者体内血小板和粒性白细胞量减少，少数患者会发展为粒细胞性白血病，还会引发中毒性精神病、视神经炎、神经性耳聋、视力障碍或严重失眠等多种副作用。氯霉素也可通过胎盘进入胎儿体内,从而抑制胎儿的骨骼造血功能,致使胎儿患再生障碍性贫血。对新生儿具有毒性作用，致使新生婴幼儿患灰婴综合症。
由于氯霉素对人体的遗传损害以及致癌致病性，为此世界上很多的国家将氯霉素规定为禁用兽药，并制定了相关检验标准，氯霉素也已经被包括欧盟在内的若干国家禁用。我国农业部第235号公告《动物性食品中兽药最高残留限量》中规定氯霉素(及其盐、酯)为禁止使用药物，且在动物性食品中不得检出。因动物性食品中氯霉素残留引发的安全问题一直受到社会广泛关注。一方面，含兽药氯霉素残留的动物源性食品具有直接毒性危害，长期食用此类食品会对人体造成致病、致癌、致畸等多种不良影响，危害人体健康；食用动物用药后，氯霉素经动物体内代谢后，排放于环境中，污染生态环境。另一方面，自从我国畜禽养殖类产品进入国际市场，由于氯霉素残留量超出进口国标准最高残留限量导致出现的退货、销毁、索赔甚至终止贸易往来的事件，严重影响了我国动物源性食品在国际市场上的出口贸易，使我国丧失了良好信誉，从而影响到畜牧养殖业的持续健康发展，给养殖业的生产、经营、服务等行业发展带来负面影响，造成了恶性循环，给整个产业链带来重大经济损失。食品安全问题造成的负面影响，如消费者信任缺失，影响生产行业、经济、社会乃至政治和外交。对此，这对氯霉素残留量相关的检测方法也提出了更为严格的要求，要同时满足快速筛选、高灵敏度、高特异性和测精度等条件。
目前检测动物源性食品中氯霉素残留量的方法主要有色谱法，电化学传感器，实时荧光定量PCR技术，微生物学方法，以及免疫分析方法。但是色谱法、PCR技术及传感器因其繁琐的样品处理、检测成本高以及长时间的仪器操作时间等缺点，无法在保障高灵敏准确检测的前提下，实现快速检测的需求。而荧光免疫分析方法是基于抗原抗体的高度特异性结合荧光标记的敏感性的一种方法，具有检测线性范围宽、快速、灵敏、准确等优点。
上转换纳米材料(UCNPs)是一种功能材料，可将低能光子转换为高能光子，通常由无机物和稀土掺杂离子组成。掺杂的稀土离子可以吸收低能量的长波长光子，并通过多光子跃迁发射高能量的短波长光子，从而将红外光转变为可见光。掺杂的稀土离子可以吸收低能量的长波长光子，并通过多光子跃迁发射高能量的短波长光子，从而将红外光转变为可见光。UCNPs与许多有机荧光染料和量子点(QDs)不同，UCNPs具有化学稳定性且从不光漂白。UCNPs的发射波长与晶体尺寸无关，是通过改变基质晶体和稀土掺杂剂可以轻松实现多色发射。有机荧光染料是传统的荧光指示剂，具有成本低廉、高可用性和易用性等特点，但是存在光化学稳定性差，对光漂白的敏感性和光降解现象。另一方面，有机染料通常是以紫外光或可见光作为激发光源，组织穿透性差。若将有机荧光染料用于生物标记，长时间暴露在高能光子下可能会导致生物分子被破坏，生物本身的背景荧光本身也限制了其在生物医学中的应用。UCNPs作为一种新型的功能材料的具有自发荧光低，相当窄的发射带，组织穿透力强，可调谐多色发射，卓越的光稳定性和在体外或体内的低毒性等优势。因此，UCNPs已经广泛应用于生物成像、免疫测定、DNA检测、药物递送等领域。
本发明所合成的上转换荧光探针具有荧光强度高、选择性好、灵敏度高和响应时间短等特点。本发明结合上转换荧光纳米材料的良好荧光性能和免疫分析方法的高特异性，建立一种氯霉素的荧光免疫检测方法，用于动物源性食品中氯霉素的检测
发明内容
本发明的目的是根据上述问题，弥补现有技术不足，旨在提出了一种对氯霉素具有高选择性的荧光探针，以用于动物源性食品中氯霉素检测方法的建立。
为达到上述目的，本发明创造的技术方法是这样实现的：
采用聚丙烯酸包裹的上转换荧光纳米材料作为荧光标记物，合成一种特异性识别氯霉素的荧光探针材料。
本发明的荧光探针对氯霉素可特异性识别。
本发明还公开了这种荧光探针的制备方法：
(1)称取304.29mg四水合醋酸钇，38.00mg四水合醋酸镱，3.46mg四水合醋酸铥，6mL油酸，17mL十八烯依次加入到三颈烧瓶中，剧烈搅拌并在抽真空状态下升高温度至100℃。在氩气的保护下快速将反应温度升高至160℃反应30min，然后将其自然冷却至室温。称取100mg NaOH和148mg NH4F溶于10mL的甲醇，逐滴缓慢地加入到上述反应中搅拌30min。并升高温度至100℃保持10min。最后，在氩气保护下将升温至300℃，保持1h。随后，自然冷却至室温。产物经离心处理后得到，并用乙醇洗涤三次后，置于烘箱中干燥，得到油溶性上转换材料。然后准确称取1.5g聚丙烯酸，加入30mL二甘醇，氩气保护升温至110℃反应1h。称取90mg OA-UCNPs溶解于甲苯中，快速加入，110℃反应1h后，加热到240℃并保持1h。然后自然冷却至室温，并加入适量稀盐酸溶液，离心收集沉淀物。用超纯水离心洗涤沉淀物三次后，置于烘箱中干燥，得到水溶性上转换荧光纳米材料。
(2)取5mg步骤(1)制备的水溶性上转换荧光纳米材料超声溶解于2mL2-(N-吗啉)乙磺酸(MES)缓冲溶液中；称取1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDC)1.536mg和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)2.4mg分别溶解于200μL MES溶液中，迅速加入到上述混合溶液中，30℃反应3h；反应完毕后，离心分离沉淀，离心产物用去离子水离心洗涤3次；用1mL N-(2-羟乙基)哌嗪-N'-2-乙烷磺酸(HEPES)缓冲液将上述产物复溶，加入氯霉素单克隆抗体，30℃反应4h；反应完毕后，取15mg牛血清白蛋白加入到上述混合溶液中，30℃反应1h。然后离心收集沉淀产物，并用去离子水洗涤3次，最后复溶于1mL HEPES溶液中，最终得到氯霉素上转换荧光探针，干燥条件下保存。
进一步，步骤(1)中四水合醋酸钇、四水合醋酸镱和四水合醋酸铥的摩尔质量比为90:9:1；1.5g聚丙烯酸需溶解于30mL二甘醇中，加入OA-UCNPs的量为90mg，甲苯体积为6mL。
进一步，步骤(2)中牛血清白蛋白的量为15mg，用于封闭上转换荧光探针上未与氯霉素抗体结合的位点。
相对现有技术，本发明创造所述的氯霉素上转换荧光探针的制备方法及应用在氯霉素检测中具有以下优势：
本发明首次合成了上转换荧光探针，具有自发荧光低，组织穿透力强，光稳定性、低毒性和良好的生物相容性等优点。通过活化酯法合成了具有高选择性、高稳定性的上转换荧光探针，从而实现了对氯霉素的高灵敏、高特异性检测。与目前氯霉素检测方法(液相色谱法和气相色谱法)相比，本方法具有材料制备简单、抗基质干扰能力强、选择性高、易于操作、快速等优点。
附图说明
构成本发明创造的一部分的附图用来提供对本发明创造的进一步理解，本发明创造的示意性实施例及其说明用于解释本发明创造，并不构成对本发明创造的不当限定。在附图中：
图1是本发明创造实施例所述的油溶性和水溶性上转换荧光纳米材料荧光光谱图；
图2、图3分别为本发明创造实施例所述的油溶性和水溶性上转换荧光纳米材料透射电镜图；
图4为本发明创造实施例所述的油溶性和水溶性上转换荧光纳米材料的粒径分布图；
图5为本发明创造实施例所述的油溶性和水溶性上转换荧光纳米材料的傅里叶红外光谱图。
图6为本发明创造实施例所述的上转换荧光探针对不同浓度的氯霉素相应曲线；
具体实施方式
为了理解本发明，下面通过具体的实施例对本发明作进一步说明，需要说明的是下述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
实施例1(制备实施例)
具体实施步骤如下：
(1)上转化荧光纳米材料(NaYF4:Yb,Tm)的制备
热分解法制备油溶性上转换材料(OA-UCNPs)：准确称取304.29mg四水合醋酸钇，38.00mg四水合醋酸镱，3.46mg四水合醋酸铥，6mL油酸，17mL十八烯依次加入到三颈烧瓶中，剧烈搅拌并在抽真空状态下升高温度至100℃。稳定温度在100℃，在氩气的保护下快速将反应温度升高至160℃反应30min，然后将其自然冷却至室温。称取100mg NaOH和148mgNH4F溶于10mL的甲醇，逐滴缓慢地加入到上述反应中搅拌30min。升温到80℃去除甲醇，然后抽真空，并升高温度至100℃保持10min。最后，在氩气保护下将升温至300℃，保持1h。随后，自然冷却至室温。产物经离心处理后得到，并用乙醇洗涤三次后，置于烘箱中干燥，得到油溶性上转换材料。
配体交换法将油溶性上转换材料转变为水溶性(PAA-UCNPs)：准确称取1.5g PAA，加入到含30mL DEG的中，在氩气的保护下升温至110℃反应1h。称取90mg OA-UCNPs溶解于6mL甲苯中，并快速加入到上述反应体系中，110℃保持1h后，继续升温至240℃并保持1h。反应完毕后自然冷却至室温，并加入适量稀盐酸溶液，离心收集沉淀物。用超纯水离心洗涤沉淀物三次后，置于烘箱中干燥，得到水溶性上转换材料。
(2)氯霉素抗体偶联上转换荧光纳米材料制备信号探针
取水溶性上转换材料5mg溶解于2mL MES缓冲液中。称取1.54mg EDC和2.4mg NHS分别溶解到200μL MES中，迅速加入到上述混合溶液中，30℃水浴3h；然后，离心分离沉淀(4000rpm，10min，4℃)，用去离子水离心洗涤白色沉淀物，重复操作3次；用1mL HEPES缓冲液复溶沉淀，加入氯霉素单克隆抗体，30℃水浴4h；反应完毕后，取15mg牛血清白蛋白加入到上述混合溶液中，30℃水浴反应1h。离心处理弃掉上清液，收集沉淀，并用去离子水洗涤3次，最后复溶于1mL的HEPES缓冲液中，最终得到上转换荧光探针，4℃储存。
为了更好地理解本发明提供的上转换荧光纳米材料的性能，对合成所用的材料油溶性上转换荧光纳米材料和水溶性上转换荧光纳米材料进行了荧光光谱、透射电镜、粒径分布表征和傅里叶红外光谱表征。
图1是本发明创造实施例所述的OA-UCNPs和PAA-UCNPs荧光光谱图。从图中可以看出二者均在482nm处有显著的特征发射峰，无其他明显杂峰干扰，荧光强度无显著差别。
图2、图3分别为本发明创造实施例所述的OA-UCNPs和PAA-UCNPs透射电镜图。从图中可以看出合成的OA-UCNPs和水溶性上转换荧光纳米材料形态均接近圆球状，表面光滑，颗粒大小均一。
图4为本发明创造实施例所述的OA-UCNPs和PAA-UCNPs的粒径分布图。从图中可以看出OA-UCNPs粒径主要分布在24-34nm之间，PAA-UCNPs的粒径主要分布在25-37nm范围之内。
图5为本发明创造实施例所述的OA-UCNPs和PAA-UCNPs的傅里叶红外光谱图。通过对比观察，OA-UCNPs在2928cm-1和2856cm-1处有两个特征峰，它们对应的是其表面上油酸分子的亚甲基基团的不对称和对称伸缩振动峰。然而，这两个峰对应的波数在水溶性上转换荧光纳米材料中却显著减弱，表明油酸分子已大部分被取代。此外，在3436cm-1处二者都出现了代表羟基官能团(-OH)的伸缩振动峰。PAA-UCNPs图谱出现一个新的特征峰在1731cm-1处，它代表了羰基(C＝O)的伸缩振动，进一步证明了羧基基团(-COOH)成功引入到OA-UCNPs表面，OA-UCNPs经配体交换法成功改性成PAA-UCNPs。
实施例2
本发明创造实施例所述的上转换荧光探针对不同浓度的氯霉素相应曲线如图6。取7份体积为50μL不同浓度氯霉素标品(0、0.05、0.1、0.5、1、5和100pg mL-1)与50μL捕获元件同时加入到50μL的信号探针中，室温孵育反应后，借助磁力架将沉淀分离，复溶到PBS中使用F-2500荧光分光光度计(外配980nm激发器作为激发光源)进行检测。记录上转换荧光材料特征峰处(482nm)的荧光强度变化，建立该方法的标准曲线，检测限为0.01pg mL-1(3σ)，检测线性范围0.05-100pg mL-1，线性相关系数R2＝0.9911。
实施例3(应用实施例)
应用氯霉素上转换荧光探针建立免疫检测方法测定动物肌肉组织样品，具体操作如下：
动物肌肉组织样品前处理方法：称取经绞碎均质处理后的5g动物肌肉组织样品，加入到含有15mL乙酸乙酯的离心管中，高速涡旋提取15min后，经离心处理后，弃去下层沉淀，氮吹后，再加入5mL PBS复溶，再加入5mL正己烷除脂，弃去上层有机层，用PBS稀释后用本方法检测。
50μL肌肉组织样品提取液与50μL捕获元件同时加入到50μL的上转换荧光探针中，孵育反应后，借助磁力架将沉淀分离，复溶到PBS中，使用F-2500荧光分光光度计(外配980nm激发器作为激发光源)进行检测，记录在482nm处的荧光强度值。根据标准曲线方程计算样品溶液中氯霉素的含量。
以上所述仅为本发明创造的较佳实施例而已，并不用以限制本发明创造，凡在本发明创造的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明创造的保护范围之内。

Claims (5)

1.一种氯霉素上转换荧光探针的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)上转化荧光纳米材料的制备：
称取304.29mg四水合醋酸钇，38.00mg四水合醋酸镱，3.46mg四水合醋酸铥，6mL油酸，17mL十八烯依次加入到三颈烧瓶中，剧烈搅拌并在抽真空状态下升高温度至100℃，在氩气的保护下快速将反应温度升高至160℃反应30min，然后将其自然冷却至室温，称取100mgNaOH和148mg NH4F溶于10mL的甲醇，逐滴缓慢地加入到上述反应中搅拌30min。并升高温度至100℃保持10min，最后，在氩气保护下将升温至300℃，保持1h，随后，自然冷却至室温；产物经离心处理后得到，并用乙醇洗涤三次后，置于烘箱中干燥，得到油溶性上转换材料，然后准确称取1.5g聚丙烯酸，加入30mL二甘醇，氩气保护升温至110℃反应1h，称取90mg OA-UCNPs溶解于甲苯中，快速加入，110℃反应1h后，加热到240℃并保持1h；然后自然冷却至室温，并加入适量稀盐酸溶液，离心收集沉淀物，用超纯水离心洗涤沉淀物三次后，置于烘箱中干燥，得到水溶性上转换荧光纳米材料；
(2)氯霉素上转换荧光探针的制备：
取5mg水溶性上转换荧光纳米材料超声溶解于2mL 2-(N-吗啉)乙磺酸缓冲溶液中；称取1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺1.536mg和N-羟基琥珀酰亚胺2.4mg分别溶解于200μL MES溶液中，迅速加入到上述混合溶液中，30℃反应3h；反应完毕后，离心分离沉淀，离心产物用去离子水离心洗涤3次；用1mL N-(2-羟乙基)哌嗪-N'-2-乙烷磺酸缓冲液将上述产物复溶，加入一定量的氯霉素单克隆抗体，30℃反应4h；反应完毕后，取15mg牛血清白蛋白加入到上述混合溶液中，30℃反应1h。然后离心收集沉淀产物，并用去离子水洗涤3次，最后复溶于1mL HEPES溶液中，最终得到氯霉素上转换荧光探针，干燥条件下保存。
2.根据权利要求1所述的一种氯霉素上转换荧光探针的制备方法，其特征在于，步骤(1)中四水合醋酸钇、四水合醋酸镱和四水合醋酸铥的摩尔质量比为90:9:1；1.5g聚丙烯酸需溶解于30mL二甘醇中，加入OA-UCNPs的量为90mg，甲苯体积为6mL。
3.根据权利要求1所述的一种氯霉素上转换荧光探针的制备方法，其特征在于，步骤(2)中牛血清白蛋白的量为15mg，用于封闭上转换荧光探针上未与氯霉素抗体结合的位点。
4.权利要求1-3任一权利要求所述制备方法，其特征在于，得到的上转换荧光纳米材料的直径在28-32nm之间，蓝色荧光强度高，荧光光谱特征峰在482nm处，980nm红外激发器激发。
5.权利要求1-3任一权利要求所述制备方法得到的上转换荧光探针用于氯霉素的检测。
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CN114397282A (zh) * 2021-12-24 2022-04-26 江苏鑫蓝鑫生物科技有限公司 一种用核酸适配体和g-四链体免标记荧光分析法检测氯霉素的方法
WO2023168822A1 (zh) * 2022-03-11 2023-09-14 杭州傲敏生物科技有限公司 一种基于人工核酶的食品中污染物多色荧光分析方法

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