KR102289357B1

KR102289357B1 - 블로커 핵산분자를 이용한 g-쿼드러플렉스 구조 기반-표적 핵산의 검출 방법

Info

Publication number: KR102289357B1
Application number: KR1020200018111A
Authority: KR
Inventors: 박기수; 황성현; 김정호
Original assignee: 건국대학교 산학협력단
Priority date: 2020-02-14
Filing date: 2020-02-14
Publication date: 2021-08-12

Abstract

본 발명은 내재적 형광 모이어티를 포함하는 분할된(splitted) G-쿼드러플렉스(G-quadruplex) 핵산분자와 이들 간의 결합을 차단하는 블로커 핵산 분자를 포함하는 표적 핵산분자 검출용 조성물에 관한 것이다. 본 발명은 블로커 핵산 분자를 이용함으로써 표적 핵산의 존재에 따라 G-쿼드러플렉스의 분할된 분절을 일반적인 이중나선 구조에서 구아닌-4중 구조로 인한 평면 형태의 특징적 3차원 구조로 효과적으로 스위칭(switching)시키면서도 배경(background) 신호를 현저히 억제함으로써, 시료 내 표적 핵산의 존재 여부에 대한 신뢰도 높은 정보를 제공한다. 이에 본 발명은 병원성 미생물의 감염 여부 진단, 식품 또는 환경의 미생물 오염 여부를 비롯하여 다양한 목적의 핵산 검출 기술에 유용하게 이용될 수 있다.

Description

블로커 핵산분자를 이용한 G-쿼드러플렉스 구조 기반-표적 핵산의 검출 방법{G-Quadruplex Structure-Based Detection of Target Nucleic Acid Using Blocker Nucleic Acid molecules}

본 발명은 형광 염기 유사체를 포함하는 분할 G-쿼드러플렉스 서열 및 블로커 핵산분자를 이용하여 분석대상 시료로부터 표적 핵산을 높은 민감성과 신뢰도로 검출하는 방법에 관한 것이다.

식중독은 주로 바이러스, 박테리아 또는 기생충에 의해 유발되며 전세계적으로 공공위생의 주요 문제점이다(Le Loir, Baron, & Gautier, 2003). 특히, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, 및 Salmonella Typhimurium는 식중독의 주 원인이 된다(Kim, Batule, Mun, Shim, & Kim, 2018; Van Giau, Nguyen, Nguyen, Le, & Nguyen, 2016; Tang et al., 2017). 이러한 감염은 특히 면역력이 약한 유아, 노약자 및 임산부에서 치명적일 수 있으므로, 식품을 오염시키는 병원성 박테리아의 정확한 검출 및 정기적인 모니터링은 매우 중요하다(Wilson et al., 2019; Altintas, Akgun, Kokturk, & Uludag, 2018).

지금까지 박테리아 배양 및 이를 이용한 생화학적 검사가 식품 오염 박테리아를 검출하는 표준적인 방법이었으나, 이러한 방법은 복잡하고 시간이 소요되는 실험과정이 요구되며 육안으로 확인되지 않거나 배양 불가능한 박테리아 검출에 적용될 수 없다(Varadi et al., 2017; Lee et al., 2018). 대안으로서, 병원성 박테리아 특이적인 항원 마커를 검출하는 ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay)가 사용되었으나, 신속성과 편의성에도 불구하고 저농도 박테리아[1 mL 당0.1-10 CFU(colony forming units (CFU)) 검출을 위해서는 민감성이 부족한 단점이 있다(Park, 2018; Lazcka, Del Campo, & Munoz, 2007; Sharaha et al., 2017). 이에, 단일카피 박테리아 DNA까지도 검출이 가능한 PCR 기술을 이용한 핵산-기반 시험법의 개발에 초점이 맞추어졌다. 이러한 생물은 고유의 유전 정보를 포함하고 있으로, 종-특이적 DNA 서열은 유용한 동정 마커가 될 수 있다. 또한 미세유체 기술(microfluidic technology)의 진보로 인해 휴대 가능한 초고속 PCR 시스템의 개발과 상용화에 이루어져 환자 수준에서 핵산의 POC (point-of-care) 시험이 가능해졌다(Xiang, Xu, & Li, 2007; Houssin et al., 2016; Son et al., 2015).

특히, 식중독 박테리아의 효율적인 검출을 위해 형광 신호 검출에 기반한 단순하면서도 신뢰도 있는 방법이 연구되었다. 다양한 형광-기반 DNA 검출 전략 중, 형광 염기(fluorescent base) 유사체로서 2-아미노퓨린(2-AP)은 고유의 베이스 페어링과 형태-의존적 형광 특정이 기인한 이점을 가진다(Xu, Chan, & Kool, 2017). 예를 들어, 2-AP 단량체는 강한 형광을 나타내지만, 단일가닥 DNA(ssDNA)에서는 약한 퀀칭이 일어나고, 이중가닥 DNA(dsDNA)에서는 염기 쌓임(base stacking) 상호작용에 의해 유의한 퀀칭이 일어난다(Liu et al., 2017; Somsen, 2005). 나아가, 신호 요소로 기능하는 2-AP로 인해 종래기술과 달리 형광단 및 퀀처(예를 들어 분자 비컨 프로브)의 이중 표지를 할 필요가 없어졌다(Kim et al., 2018). 이러한 고유의 특징으로 인하여, 2-AP는 금속이온 및 효소 활성과 같은 다양한 분석 대상물의 검출에 광범위하게 사용된다(Liu et al., 2017; Lee, Kim, Park, & Park, 2019; Lee, Park, & Park, 2015; Hwang et al., 2018).

또한 고민감성 타겟 분자 검출에 2-AP를 사용하는 기술이 개발되고 있는데, 예를 들어 G-쿼드러플렉스-형성 서열에 2-AP를 삽입할 경우 형광 강도가 크게 증가됨을 발견하였다(Hwang et al., 2018; Liu et al., 2017). 그러나, 이러한 2-AP 함유 G-쿼드러플렉스 형성 서열의 이점에도 불구하고, 2-AP-함유 DNA 프로브는 타겟 DNA가 존재하지 않을 때 ssDNA에서 발견되어, 프로브가 dsDNA인 경우에 비하여 상대적으로 높은 배경 신호를 발생시킨다는 문제점이 있다. 이에, G-쿼드러플렉스-기반 핵산 검출방법의 장점을 살리면서도 배경신호를 감소시키고 민감도를 보다 향상시킬 수 있는 보다 개선된 검출 방법의 개발이 요구되고 있다.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

특허문헌 1. 미국 등록특허공보 제10,145,825호

본 발명자들은 분석대상 시료 내에서 표적 핵산의 존재 여부를 보다 높은 민감도와 향상된 신뢰도로 신속하게 검출하는 방법을 개발하기 위하여 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 특유의 3차원 구조를 가지는 핵산 복합체인 G-쿼드러플렉스(G-quadruplex) 구조 형성을 차단하는 블로커 핵산분자를 사용할 경우 표적 핵산의 존재에 따른 G-쿼드러플렉스 구조 형성의 스위칭(switching)이 효율적으로 일어날 뿐 아니라, 검출 신뢰도와 민감도 저하의 주 원인이 되었던 배경(background) 신호가 현저히 억제됨을 발견함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서 본 발명의 목적은 표적 핵산분자 검출용 조성물 및 이를 포함하는 표적 핵산분자 검출용 키트를 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 생물학적 시료 내에서 표적 핵산분자를 검출하는 방법을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 다음의 핵산 분자를 포함하는 표적 핵산분자 검출용 조성물을 제공한다:

(a) (i) 내재적 형광 모이어티(moiety)를 포함하는 구아닌-풍부(G-rich) 영역; 및 (ⅱ) 상기 표적 핵산 분자에 상보적인 제1 프로브 영역을 포함하는 제1 분절;

(b) (i) 구아닌-풍부(G-rich) 영역; 및 (ⅱ) 상기 표적 핵산 분자에 상보적인 제2 프로브 영역을 포함하는 제2 분절;

(c) 상기 제1 프로브 영역과 상보적인 서열을 포함하는 블로커(blocker) 핵산 분자.

본 발명자들은 분석대상 시료 내에서 표적 핵산의 존재 여부를 보다 높은 민감도와 향상된 신뢰도로 신속하게 검출하는 방법을 개발하기 위하여 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 특유의 3차원 구조를 가지는 핵산 복합체인 G-쿼드러플렉스(G-quadruplex) 구조 형성을 차단하는 블로커 핵산분자를 사용할 경우 표적 핵산의 존재에 따른 G-쿼드러플렉스 구조 형성의 스위칭(switching)이 효율적으로 일어날 뿐 아니라, 검출 신뢰도와 민감도 저하의 주 원인이 되었던 배경(background) 신호가 현저히 억제됨을 발견하였다.

본 명세서에서, 용어 “핵산 분자”는 DNA(gDNA 및 cDNA)와 RNA 분자를 포괄적으로 포함하는 의미를 갖으며, 핵산 분자에서 기본 구성 단위인 뉴클레오타이드는 자연의 뉴클레오타이드뿐만 아니라, 당 또는 염기 부위가 변형된 유사체 (analogue)도 포함한다(Scheit, Nucleotide Analogs, John Wiley, New York(1980); Uhlman 및 Peyman, Chemical Reviews, 90:543-584(1990)). 구체적으로는, 본 발명에서 이용되는 핵산분자는 DNA(deoxyribonucleic acid)이다.

본 명세서에서 용어“내재적 형광 모이어티(intrinsic fluorescent moiety)”는 본 발명의 핵산 분자, 구체적으로는 제1 분절 내에 내재적으로 포함되어 특정 물리 화학적 자극 또는 공간적인 변화에 기반하여 형광 강도의 변화를 유발하는 제1 분절의 구성 분자를 의미한다.

본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 상기 내재적 형광 모이어티(moiety)는 형광 염기 유사체(fluorescent base analogue)이다.

본 명세서에서 용어“형광 염기 유사체”는 폴리뉴클레오타이드를 구성하는 연속적인 염기 중 하나로서 염기 자체의 기능은 유지하면서 형광 특성을 가지는 염기 유사체를 의미하며, 예를 들어 2-AP(2-아미노퓨린), PyC(피롤로사이토신), 8vdA(8-비닐-디옥시아데노신), 2PyG(8-(2-피리딜)-2′-디옥시구아노신), 3-MI(3-메틸이소잔토프테린)을 포함하나, 이제 제한되지 않고 형광을 띄는 염기 유사체로써 당업계에 알려진 모든 염기가 제한 없이 사용될 수 있다. 구체적으로는, 본 발명에서 사용되는 형광 염기 유사체는 2-AP(2-아미노퓨린)이다.

본 명세서에서 용어“구아닌-풍부(G-rich) 영역”은 구아닌(Guanine), 그 유사체 또는 유도체가 다른 영역(region)에 비해 높은 빈도로 나타나는 핵산 분자의 영역을 의미하며, 구체적으로는 구아닌이 연속으로 3번 이상 반복되는 모티프(motif)를 적어도 하나 이상 가지는 영역을 의미한다. 본 발명의 제1 분절 및 제2 분절의 각 G-rich 영역은 후술하는 바와 같이 서로 결합되어 G-쿼드러플렉스 구조를 형성할 수 있다.

본 발명의 제1 분절 및/또는 제2 분절에 포함되어 G-쿼드러플렉스를 형성할 수 있는 G-rich 서열은 당업계에 공지된 다양한 서열이 사용될 수 있다. 예를 들어, GGGGGGTGGGTGGG(T30695), GGGTGGGGGGTTGGG(PW17), GGGTGGGTGGGTGGGT, TTTGGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGTGG, GGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGTGG, ACCTGGGGGAGTATTGCGGAGGAAGGT, TGGGTAGGGCGGGTTGGGAAA, TTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGG, GGTTGGTGTGGTTGG 등의 G-쿼드로플렉스 서열이 분할(split)되어 각각 제1 분절 및 제2 분절에 포함되고, 이중 제1 분절에 상술한 형광 염기 유사체를 포함시킴으로써 본 발명의 표적 핵산분자 검출용 조성물을 제조할 수 있다.

본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 상기 제1 분절의 구아닌-풍부(G-rich) 영역과 상기 제2 분절의 구아닌-풍부 영역 내의 각 구아닌 염기의 수는 2.5:1 내지 3.5:1이다. 보다 구체적으로는, 2.7:1 내지 3.3:1이며, 가장 구체적으는 2.9:1 내지 3.1:1이다

본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 상기 제1 프로브 영역과 상보적인 상기 타겟 핵산분자 상의 영역과 상기 제2 프로브 영역과 상보적인 상기 타겟 핵산분자 상의 영역은 서로 중첩되지 않는다.

본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 상기 제1 분절의 제1 프로브 영역 및 상기 제2 분절의 제2 프로브 영역과 상기 표적 핵산분자가 혼성화되면 G-쿼드러플렉스(G-quadruplex) 구조가 형성된다.

본 명세서에서 용어, “G-쿼드러플렉스(G-quardruplex)”또는“G-사중구조”는 예를 들어 구아닌 또는 구아노신(guanosine), 2'-데옥시구아노신(2-deoxy-guanosine), 2'-오-메틸-구아노신(2'-O-methyl-guanosine), 2'-플루오로-구아노신(2'-F-guanosine), LNA(Locked Nucleic Acid)-구아노신, D-데옥시구아노신 및 D-구아노신로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 구아닌의 유사체 및/또는 유도체가 풍부(G-rich)하여 4개의 구아닌이 한 평면에 위치하여 후그스텐(hoogsten) 형태의 수소결합을 이룸으로써 특유의 사중 나선구조를 이루는 구조를 의미한다.

본 명세서에서 용어“블로커(blocker) 핵산 분자”는 제1 분절 내의 제1 프로브 영역의 전부 또는 일부와 상보적인 서열을 포함하는 핵산분자로서, 제1 프로브 영역에 대해 표적 핵산 분자와 경쟁적 결합을 함으로써 표적 핵산 분자가 존재하지 않는 경우 제1 분절과 제2 분절이 분할된(splitted) 상태로 남아있도록 하는, 즉 G-쿼드러플렉스 형성을 차단(blocking)하는 핵산 분자를 의미한다. 구체적으로는, 상기 블로커 핵산 분자는 제1 프로브 영역 뿐 아니라 제1 분절 내의 구아닌-풍부(G-rich) 영역의 전부 또는 일부와도 상보적이다. 이 경우, 블로커 DNA는 표적 핵산 분자가 존재하지 않을 때 제1 분절의 제1 프로브 영역과 구아닌-풍부 영역에 걸쳐 혼성화된다.

구체적으로는, 상기 블로커(blocker) 핵산 분자는 8 내지 17개 염기로 이루어진다. 보다 구체적으로는 9 내지 13개 염기로 이루어지며, 보다 더 구체적으로는 9 내지 11개 염기로 이루어진다.

본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 본 발명의 조성물은 1 - 20 mM의 칼륨이온 용액을 추가적으로 포함한다. 보다 구체적으로는 2 - 15 mM, 보다 더 구체적으로는 3 - 10mM, 가장 구체적으로는 4 - 6mM 농도의 칼륨이온 용액을 추가적으로 포함한다.

본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 분석 대상 시료 내에 상기 표적 핵산분자가 존재하는 경우 상기 내재적 형광 모이어티(moiety)에 의한 형광 강도가 증가한다.

본 명세서에서 용어 “형광 강도의 증가”는 표적 핵산분자의 존재로 인하여 G-쿼드러플렉스 구조가 형성됨으로써 형광 염기 유사체의 퀀칭 효과가 소멸됨으로써, G-쿼드러플렉스 구조가 형성되지 않은 경우에 비하여 유의하게 형광 강도의 정량값이 증가되는 경우를 의미하며, 구체적으로는 G-쿼드러플렉스 구조가 형성되지 않은 경우와 비교하여 20% 이상 증가하는 경우를 의미하고, 보다 구체적으로는 30% 이상 증가하는 경우를 의미하며, 보다 더 구체적으로는 40% 이상 증가하는 경우를 의미하고, 가장 구체적으로는 50% 이상 증가하는 경우를 의미한다.

본 명세서에서 용어,“시료”는 표적 핵산분자 또는 이를 발현하는 세포, 미생물 등을 포함할 가능성이 있는 여하한 물질로서 생체로부터 분리된 시료(혈액, 혈장, 뇨, 타액 등), 환경(예를 들어, 물, 대기, 토양 등)으로부터 채취한 물질 또는 인위적으로 혼합된 시료 등을 총칭하는 의미로 사용된다.

본 발명의 다른 양태에 따르면 본 발명은 다음의 핵산 분자를 포함하는 표적 핵산분자 검출용 조성물을 제공한다:

(a) (i) 상기 표적 핵산분자에 상보적인 영역; 및 (ⅱ) 분절 결합 영역을 포함하는 프라이머 분자;

(b) (i) 내재적 형광 모이어티(moiety)를 포함하는 구아닌-풍부(G-rich) 영역; 및 (ⅱ) 상기 분절 결합 영역에 상보적인 제1 프로브 영역을 포함하는 제1 분절;

(c) (i) 구아닌-풍부(G-rich) 영역; 및 (ⅱ) 상기 분절 결합 영역에 상보적인 제2 프로브 영역을 포함하는 제2 분절;

(d) 상기 제1 프로브 영역과 상보적인 서열을 포함하는 블로커(blocker) 핵산 분자.

후술하는 실시예에서 보는 바와 같이, 본 발명의 조성물을 이용한 표적 핵산분자 검출은 PCR 기술을 접목하여 수행될 수도 있다. 이 경우 블로커 핵산분자와 제1 분절의 제1 프로브 영역에 대해 직접적으로 경쟁적 결합을 하는 것은 표적 핵산분자가 아닌 분절 결합 영역을 통해 이를 특이적으로 인식하는 프라이머가 된다.

본 명세서에서 사용되는 용어“프라이머”는 핵산쇄(주형)에 상보적인 프라이머 연장 산물의 합성이 유도되는 조건, 즉, 뉴클레오타이드와 DNA 중합효소와 같은 중합제의 존재, 적합한 온도와 pH의 조건에서 합성의 개시점으로 작용하는 올리고뉴클레오타이드를 의미한다. 구체적으로는, 프라이머는 디옥시리보뉴클레오타이드 단일쇄이다. 본 발명에서 이용되는 프라이머는 자연(naturally occurring) dNMP(즉, dAMP, dGMP, dCMP 및 dTMP), 변형 뉴클레오타이드 또는 비-자연 뉴클레오타이드를 포함할 수 있으며, 리보뉴클레오타이드도 포함할 수 있다.

본 발명에서 이용되는 연장 프라이머는 타겟 핵산의 특정 염기서열에 상보적인 혼성화 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 용어“상보적”은 소정의 어닐링 또는 혼성화 조건하에서 프라이머 또는 프로브가 타겟 핵산 서열에 선택적으로 혼성화할 정도로 충분히 상보적인 것을 의미하며, 실질적으로 상보적(substantially complementary)인 경우 및 완전히 상보적(perfectly complementary)인 경우를 모두 포괄하는 의미이며, 구체적으로는 완전히 상보적인 경우를 의미한다. 본 명세서에서 용어“실질적으로 상보적인 서열”은 완전히 일치되는 서열뿐만 아니라, 특정 서열에 어닐링하여 프라이머 역할을 할 수 있는 범위 내에서, 비교 대상의 서열과 부분적으로 불일치되는 서열도 포함되는 의미이다.

프라이머는, 중합제의 존재 하에서 연장 산물의 합성을 프라이밍시킬 수 있을 정도로 충분히 길어야 한다. 프라이머의 적합한 길이는 다수의 요소, 예컨대, 온도, pH 및 프라이머의 소스(source)에 따라 결정되지만 전형적으로 15-30 뉴클레오타이드이다. 짧은 프라이머 분자는 주형과 충분히 안정된 혼성 복합체를 형성하기 위하여 일반적으로 보다 낮은 온도를 요구한다. 이러한 프라이머의 설계는 타겟 뉴클레오티드 서열을 참조하여 당업자가 용이하게 실시할 수 있으며, 예컨대, 프라이머 디자인용 프로그램(예: PRIMER 3 프로그램)을 이용하여 할 수 있다.

본 발명의 프라이머 분자는 (i) 검출하고자 하는 표적 핵산분자에 상보적인 영역(도 4 좌측 상단의“Helper-linked primer”의 회색 부분)과, (ⅱ) 제1 및 제2 분절에 대한 결합 영역(도 4 좌측 상단의“Helper-linked primer”의 녹색 “Helper”부분)을 포함하여, 표적 핵산분자의 존재 하에서는 구성 (i)에 의해 증폭 반응에 이용되고, 표적 핵산분자의 부재 하에서는 구성 (ⅱ)에 의해 제1 및 제2 분절과 결합하여 이들이 G-쿼드러플렉스 구조 형성에 이용된다. 본 발명자들은 이러한 복합 프라이머 분자를 Helper-linked 프라이머라고 명명하였다.

본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 보다 구체적으로는, 상기 표적 핵산분자에 상보적인 영역의 5’말단에 상기 분절 결합 영역이 연결되어 있다.

보다 구체적으로는, 상기 제1 프로브 영역과 상보적인 상기 분절 결합 영역 상의 부위와 상기 제2 프로브 영역과 상보적인 상기 분절 결합 영역 상의 부위는 서로 중첩되지 않는다.

본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 상기 제1 분절의 제1 프로브 영역 및 상기 제2 분절의 제2 프로브 영역과 상기 분절 결합 영역이 혼성화되면 G-쿼드러플렉스(G-quadruplex) 구조가 형성된다.

본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 이 경우 분석 대상 시료 내에 상기 표적 핵산분자가 존재하는 경우 상기 내재적 형광 모이어티(moiety)에 의한 형광 강도가 감소한다.

블로커 핵산분자와 표적 핵산분자가 제1 분절의 제1 프로브 영역에 대해 직접적으로 경쟁적 결합을 하는 경우와 달리, 표적 핵산분자 특이적 프라이머 분자를 추가적인 구성으로 이용하는 경우 표적 핵산분자의 존재로 인하여 프라이머가 이의 증폭 반응에 소모됨으로써 블로커 핵산분자가 이탈하지 않고, G-쿼드러플렉스 구조가 형성되지 않아 내재적 형광 모이어티(moiety)의 형광 퀀칭 효과가 제거되지 않으므로, 형광 강도는 오히려 약해진다.

본 명세서에서 용어 “형광 강도의 감소”표적 핵산분자 특이적 프라이머를 사용 시 표적 핵산분자의 존재로 인하여 G-쿼드러플렉스 구조가 형성되지 않으므로써 G-쿼드러플렉스 구조가 형성되는 경우에 비하여 유의하게 형광 강도의 정량값이 감소되는 경우를 의미하며, 구체적으로는 G-쿼드러플렉스 구조가 형성되는 경우와 비교하여 20% 이상 감소하는 경우를 의미하고, 보다 구체적으로는 30% 이상 감소하는 경우를 의미하며, 보다 더 구체적으로는 40% 이상 감소하는 경우를 의미하고, 가장 구체적으로는 50% 이상 감소하는 경우를 의미한다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 본 발명의 조성물을 포함하는 생물학적 시료로부터 표적 핵산분자의 검출용 키트를 제공한다.

본 발명에서 이용되는 G-쿼드러플렉스 기반 조성물에 대해서는 이미 상술하였으므로, 과도한 중복을 피하기 위해 그 기재를 생략한다.

본 명세서에서 용어 “생물학적 시료(biological sample)”는 살아있는 생명체로부터 채취, 분리하거나, 또는 이로부터 유래한 관심 성분의 유효량을 함유하고 있는 가공되지 않거나 또는 전처리된 시료를 의미한다. 생물학적 시료는 동물, 식물의 조직 절편(section) 및 약리학적, 진단학적 또는 식품학적 목적을 위해 동물, 식물로부터 채취한 동결 또는 파라핀 포매 절편, 세포, 세포 배양액, 초대배양물(primary culture), 절편체(explant)를 포함할 수 있으나, 그에 한정되는 것은 아니다. 또한, "생물학적 시료"는 특정 생명체가 존재하는 것으로 의심되는 환경(예를 들어, 물, 대기, 토양 등)으로부터 채취한 물질일 수 있다.

본 발명의 표적 핵산분자의 검출용 키트는 환자 유래의 생물학적 시료로부터 병원성 세균의 지표 유전자를 검출함으로써 해당 세균의 감염 여부의 진단 목적으로 사용되거나, 감염모델 동물을 이용한 약물 후보물질의 스크리닝 방법 등에 적용될 수도 있고, 식품 시료를 대상으로 식중독 관련 미생물의 지표 유전자를 검출함으로써 식품 독성을 판단하는 목적으로 사용될 수도 있다.

본 명세서에서 용어 “진단”은 특정 질환에 대한 개체의 감수성(susceptibility)의 판정, 특정 질환을 현재 개체가 가지고 있는 지 여부의 판정, 및 특정 질환에 걸린 한 객체의 예후(prognosis)의 판정을 포함한다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 생물학적 시료 내에서 표적 핵산분자를 검출하는 방법을 제공한다:

(a) 제 1 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항의 조성물을 상기 생물학적 시료와 접촉시키는 단계; 및

(b) 상기 생물학적 시료 내의 형광 강도 변화를 측정하는 단계.

본 발명에서 이용되는 G-쿼드러플렉스 기반 조성물 및 적용 가능한 생물학적 시료에 대해서는 이미 상술하였으므로, 과도한 중복을 피하기 위해 그 기재를 생략한다

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:

(a) 본 발명은 내재적 형광 모이어티를 포함하는 분할된(splitted) G-쿼드러플렉스(G-quadruplex) 핵산분자와 이들 간의 결합을 차단하는 블로커 핵산 분자를 포함하는 표적 핵산분자 검출용 조성물을 제공한다.

(b) 본 발명은 특유의 3차원 구조를 가지는 핵산 복합체인 G-쿼드러플렉스구조의 형성 여부를 표적 핵산의 존재에 따라 효과적으로 스위칭(switching)하고 배경(background) 신호를 현저히 억제함으로써, 시료 내 표적 핵산의 존재 여부에 대한 신뢰도 높은 정보를 제공한다.

(c) 본 발명은 병원성 미생물의 감염 여부 진단, 식품 또는 환경의 미생물 오염 여부를 비롯하여 다양한 목적의 핵산 검출 기술에 유용하게 이용될 수 있다.

도 1은 2-AP-함유 split G-쿼드러플렉스와 블로커 DNA의 조합을 사용한 형광-기반 타겟 DNA 검출 전략을 개략적으로 도식화한 그림이다. S1 및 S2 프로브는 2개의 분할(split) G-rich 분절(각각 하늘색 및 오렌지색)를 가지며, 이들은 구아닌 염기의 수 및 타겟-특이적 돌출(overhang) 서열(검은색)에 따라 3:1의 비율로 분할된다. S1 프로브는 2-AP 만을 포함한다.
도 2는 블로커 DNA를 사용함으로써 신호 대 배경잡음(background noise) 비율(S/N ratio)이 개선됨을 보여주는 그림이다. 도 2a는 상이한 길이의 블로커 DNA를 이용하여 퀀칭 효율(%)을 측정한 결과로서(a: 14mer, b: 15mer, c: 16mer, d: 17mer, e: 18mer, f: 19mer, g: 20mer, h: 21mer, i: 22mer, j: 23mer), 퀀칭 효율은 (F - F₀)/F₀×100 (F₀및 F는 각각 타겟 DNA의 존재 및 부재 하의 형광 신호)로 정의된다. S1, S2, 블로커 DNA 및 타겟 DNA의 최종 농도는 2μM이다. 블로커 DNA를 사용하지 않는 종래 기술 및 블로커 DNA를 채용한 본 발명 기술의 S/N 비율(도 2c) 및 형광 스펙트럼(도 2d)를 각각 나타내었다. S1, S2 및 타겟 DNA의 최종 농도는 2μM이고, 블로커 DNA의 최종 농도는 3μM이다. 에러바는 3회 반복실험 간의 표준편차를 보여준다.
도 3은 합성 타겟 DNA를 이용한 본 발명의 신규한 검출 방법의 검출 민감성(도 3a) 및 선택성(도 3b)를 보여주는 그림이다. 도 3a 내에 삽입된 그래프는 S/N 비율인 (F - F₀)/F₀과 타겟 DNA 농도(0-1000nM) 간의 선형 범위를 보여준다. 도 2b에서 타겟 DNA는 Chlamydia trachomatis(CT) 유래이며, 비-타겟 DNA는 Staphylococcus aureus(SA), Klebsiella pneumonia(KP), Neisseria gonorrhoeae(NG) 및 Mycoplasma genitalium(MG) 유래이다. “Mix” 는 indicates the mixture of 타겟(CT) 및 비-타겟 DNA(SA, KP, NG 및 MG)의 혼합물을 의미한다. S1, S2, 타겟 DNA 및 비-타겟 DNA의 최종 농도는 2μM이고 블로커 DNA는 3μM였다. 에러바는 3회 반복실험 간의 표준편차를 보여준다.
도 4는 2-AP-함유 분할 G-쿼드러플렉스 및 블로커 DNA의 조합을 이용한 병원성 박테리아에 대한 형광 검출 전략의 모식도를 보여준다. 도 1과 PCR 증폭의 조합을 위하여, 도 1에서 나타난 5′-말단의 CT 타겟 서열(녹색)뿐 아니라 3′-말단에 E. coli-특이적 서열(회색)도 포함되도록 helper-linked DNA 프라이머를 설계하였다.
도 5는 박테리아 gDNA 검출 결과를 보여주는 그림이다. 상이한 조건 하에서 시료의 형광 스펙트럼(도 5a) 및 폴리아크릴아미이드 젤 전기영동 이미지(도 5b)를 각각 나타낸다(1: S1+S2; 2: S1+S2+블로커 DNA; 3: Helper-linked 프라이머; 4: S1+S2+블로커 DNA+Helper-linked 프라이머; 5: E. coli gDNA가 있는 경우의 S1+S2+블로커 DNA+PCR 산물; 6: E. coli gDNA가 없는 경우의 S1+S2+블로커 DNA+PCR 산물). E. coli gDNA의 복제수는 10⁴로 맞추었다. 도 5c는 다양한 E. coli gDNA 복제수에 대해 375nm에서의 형광 강도(F₃₇₅)를 보여주는 표준화 곡선(Calibration curve)이다. 삽입된 그림은 E. coli 복제수의 로그값에 대한 F₃₇₅의 곡선을 보여준다. 도 5d는 본 발명에 따른 다양한 병원성 박테리아의 검출 전략에 의해 수득한 F₃₇₅값을 나타낸다. 타겟 및 비-타겟 박테리아에서의 gDNA 복제수는 10⁴으로 간주하였다. “Mix”는 E. coli의 타겟 gDNA 및 박테리아(E. aerogenes, S. aureus, S. Typhi, and P. aeruginosa)의 비-타겟 gDNA의 혼합물을 의미한다. 에러바는 3회 반복실험 간의 표준편차를 보여준다.
도 6는 본 발명에서 개발된 검출 시스템의 효율적인 작동을 위한 실험조건 최적화 결과를 보여주는 그림이다. 도 6a는 칼륨 이온 농도를, 도 6b는 블로커 DNA 농도를 각각 나타낸다. S/N 비율을 (F-F₀)/F₀로 계산하였다(F₀는 타겟 DNA 부재 하의 형광신호/F는 타겟 DNA 존재 하의 형광신호). S1, S2 및 타겟 DNA의 최종 농도는 2μM이다. 에러바는 3회 반복실험 간의 표준편차를 보여준다.
도 7은 농도의 최적화를 보여주는 그림이다. F₀및 F는 각각 E. coli gDNA의 부재 및 존재 하에서의 형광이다 신호s in the absence and presence of E. coli gDNA, respectively. The 복제수 of E. coli gDNA is 10⁴ _.에러바는 3회 반복실험 간의 표준편차를 보여준다.
도 8은 375 nm에서의 형광 강도(F₃₇₅) 및 상추 시료에 첨가된 E. coli 농도(CFU) 간의 선형의 상관관계를 보여주는 그림이다. S1 및 S2의 최종 농도는 2μM였으며, 블로커 DNA의 농도는 3μM였다. 에러바는 3회 반복실험 간의 표준편차를 보여준다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예

실험방법

합성 타겟 DNA의 검출 과정

본 발명에서 이용된 모든 DNA 올리고뉴클레오타이드는 Integrated DNA Technology(Skokie, IL, USA)에서 합성하였으며 서열은 표 S1에 기재하였다. 5 mM 아세트산칼륨(CH₃CO₂K) 및 10 mM 질산마그네슘 [Mg(NO₃)₂] 을 포함하는 Tris(하이드록시메틸)아미노메탄(Tris)-아세테이트 완충액(pH 7.0; Sigma)(이상 Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)에 용해된 2μM 의 S1, 2 μM의 S2, 3 μM의 블로커 DNA를 포함하는 용액(100 μL) 및 상이한 농도의 타겟 DNA가 포함된 용액(100 μL)을 90℃로 5분간 가열하고, 25 ℃로 서서히(0.1℃/s) 냉각한 다음 25℃에서 30분 간 배양하였다. 마지막으로, 각각 305 nm 및 375 nm의 여기 및 방사 파장으로 마이크로 플레이트 리더(Spectramax iD5 multi-mode microplate reader, Molecular Devices, USA) 상에서 형광 강도를 측정하였다. 모든 실험은 세 번 반복되었고 데이커터는 평균 ± 표준편차로 표시하였다. 초순도 무-DNase/RNase 증류수는 Bioneer에서 구입하였다.

박테리아 gDNA 검출 과정

다음의 박테리아 균주는 ATCC(American Type Culture Collection) 및 KCTC(Korean Collectionfor Type Cultures)에서 수득하였다: Escherichia coli (ATCC 2571), Enterobacter aerogenes (ATCC 13048), Staphylococcus aureus (KCTC 3881), Salmonella typhi (ATCC 19430), and Pseudomonas aeruginosa (KCTC 2513). 박테리아는 먼저 37℃ LB(Luria-Bertani) 브로스에서 1일간 배양하고, Total DNA Extraction S&V Kit(Bionics, Korea)를 이용하여 제조자의 프로토콜에 따라 gDNA를 분리하였다. 추출된 gDNA의 양 및 순도를 NanoDrop 분광광도계(Spectramax iD5 multi-mode microplate reader, Molecular Devices, USA)로 230 nm, 260 nm 및 280 nm에서의 흡광도를 측정함으로써 평가하였다.

다양한 농도의 E. coli gDNA(반응 당 0-10⁶ 카피), 1x PCR 완충액, 1 μM 정방향 및 역방향 프라이머, 0.2 mM dNTPs 및 1U Taq DNA 중합효소(Enzynomics, Daejeon, Korea)가 함유된 20μL의 총 부피로 다음의 조건 하에서 PCR 증폭을 수행하였다: 95℃에서 2분간 변성;94℃에서 15초간 변성, 60℃에서 30초간 어닐링 및 72℃에서 15초간 연장의 35사이클 수행; 및 72℃에서 2분간 최종 연장. 증폭된 PCR 산물은 2μM의 S1, 2μM의 S2 및 3μM의 블로커 DNA를 함유하는 용액(20μL)과 혼합하였다. 시료는 앞선 실시예와 동일한 방법으로 분석하였다.

첨가된 상추 시료에서의 박테리아 검출

복잡한 실제 음식 시료에서 박테리아 검출용으로 개발된 센서의 실용성을 평가하기 위해, 본 발명의 시스템을 이용하여 지역 수퍼마켓에서 구입 후 박테리아를 첨가한 실제 상추(lettuce) 시료에서 E. coli를 검출하였다. 상추 시료는 먼저 멸균수로 세척하고, 20% 에탄올 및 1% 젖산 용액을 포함하는 플라스택 백에 10분간 담궜다(Kim, Batule, Mun, Shim & Kim, 2018). 다음으로, 멸균된 상추 시료를 대략 동일한 크기로 자르고, E. coli 부유액(10¹-10⁸ CFU/mL)으로 접종 후 밤새 4℃ 페트리 디쉬에 넣어두었다. Total DNA Extraction S&V Kit(Bionics, Korea)을 이용하여 제조자의 프로토콜에 따라 첨가된 상추 시료로부터 gDNA를 분리하였다. 마지막으로, 추출된 gDNA를 이용하여 앞선 실시예와 동일한 방법으로 PCR 어세이를 수행하였다.

폴리아크릴아마이드 젤 전기영동

1x TBE를 런닝 완충액으로 이용하여 100V의 정전압으로 150분간 반응 산물을 15% 폴리아크릴아미이드 젤에 용해시켰다. GreenStar(Bioneer, Daejeon, Korea)로 염색 후, FAS-Nano(Nippon Genetics, Binsfelder, Germany) 상에서 젤 이미지를 수득하였다.

실험결과

전반적인 검출 과정

도 1은 배경(background) 신호를 억제함으로써 형광 반응을 향상시키기 위해 2-AP-함유 분할(split) G-쿼드러플렉스 뿐 아니라 블로커 DNA를 이용하는 본 발명의 신규한 시스템의 기본적인 작동 원리를 보여준다. 본 발명자들의 최근 연구 결과(Hwang et al., 2018)에 따르면, G-rich 서열은 G 염기의 수에 따라 3:1의 비율을 가지는 두 개의 분절로 나누어지고, 이후 타겟-특이적 돌출(overhang) 서열에 결합된다(Yang, Li, Li, & Wang, 2010; Chen et al., 2014). 특히, 2-AP를 포함하는 S1 프로브는 S2 프로브보다 3배 많은 구아닌 염기를 가진다. 또한, 블로커 DNA는 S1 프로브에 상보적으로 설계되어 이중가닥 dsDNA를 형성함으로써 배경 신호를 효과적으로 억제하도록 하였다. 타겟 DNA가 존재할 경우, 블로커 DNA는 S1으로부터 효과적으로 분리되어 활성형의 G-쿼드러플렉스 구조를 형성한다. 그 결과, 2-AP와 부근의 G 염기와의 상호작용 감소로 인해 2-AP의 형광이 극적으로 증가한다.

블로커 DNA-유도된 신호 강화

dsDNA에 포함된 2-AP의 형광이 ssDNA에 포함된 2-AP보다 효과적으로 퀀칭되기 때문에, S1 프로브에 상보적인 블로커 DNA를 이용하였다. 우선, S1의 G-rich 영역에 상보적인 서열을 감소시킴으로써 2-AP의 형광을 효과적으로 퀀칭하는 최적의 길이를 탐색하기 위해 다양한 길이(14-23 mer; 표 1)의 블로커 DNA 서열을 시험하였다(Liu et al., 2017; Somsen, 2005). 예상대로, 블로커 DNA가 존재할 때 배경 신호가 유의하게 억제되었으며(도 2a), 18-mer 블로커 DNA(e)가 추가 실험을 위한 서열로 선정되었는데, 이보다 길이가 길면 블로커 DNA가 타겟 DNA로 대체되기 어려울 것이기 때문이다.

Added (CFU/mL)	Mean (CFU/mL)^a	SD (CFU/mL)^b	Recovery (%)^c
1 × 10³	0.87 × 10³	0.23 × 10³	87 %
1 × 10⁶	1.04 × 10⁶	0.38 × 10⁶	104 %

^a3회 측정의 평균값

^b3회 측정의 표준 편차

^c평균/첨가 × 100

다음으로, S1에서의 타겟-특이적 영역에 대한 18-mer 블로커 DNA의 서열 상보성을 감소시키면서(18-8 mer; 표 1) 타겟 DNA의 존재 하에 상응하는 S/N 비율을 측정하였다. 도 2b는 타겟 DNA가 10 mer(e-4)의 블로커 DNA를 가장 효율적으로 대체함을 가장 높은 S/N 비율을 통해 보여준다. 마지막으로, 최적의 블로커 DNA를 이용하여, 블로커 DNA를 사용하지 않는 종래 기술과 본 발명의 시스템의 신호 강화를 비교하였다. 도 2c 및 2d에서 보는 바와 같이, 본 발명의 방법에 의할 때 블로커 DNA가 없는 경우에 비하여 타겟 DNA 존재 하의 S/N 비율은 300%가지 증가하였으며, 이를 통해 본 발명은 타겟 DNA를 현저히 향상된 민감도로 검출할 수 있음을 확인할 수 있다.

실험 조건의 최적화

타겟 DNA의 형광 검출에서의 효율을 극대화하기 위한 최적의 실험조건 탐색을 위해 칼륨 이온 및 블로커 DNA 농도가 G-쿼드러플렉스 구조의 형성에 미치는 영향 및 이에 따른 형광 반응을 조사하였다(Wu, Guo, Shen, & Yu, 2007; Li et al., 2018). 도 6a에서 보는 바와 같이, S/N 비율은 5 mM 칼륨 이온을 함유한 용액에서 가장 높았다. 칼륨 이온이 너무 적으면 G-쿼드러플렉스 형성을 효율적으로 촉진할 수 없는 반면, 과량의 칼륨 이온은 배경 노이즈를 증가시킴을 확인하였다. 도 6b에서 보는 바와 같이, S/N 비율은 블로커 DNA 농도가 증가함에 따라 함께 증가하였다(1내지 3μM); 이에 3μM 블로커 DNA를 이용하여 추가 실험을 진행하였다.

합성 타겟 DNA의 검출

최적의 조건 하에서, 본 발명의 시스템의 민감성을 평가하고자 동적 범위(dynamic range) 및 검출 한계를 조사하였다. S/N 비율은 타겟 DNA 농도가 2μM까지 증가함에 따라 증가하고, >2μM에서는 조금 감소하였다(도 3a). 이러한 감소는 과량의 타겟 DNA가 2개의 분할(split) 분절(S1 및 S2 프로브; 2μM) 중 하나에만 결합하여 활성의 G-쿼드러플렉스 구조를 형성할 기회가 감소하기 때문이다(Hwang et al., 2018). 특히, 1-1000 nM 범위 내에서 약 169 pM의 검출한계(3δ/slope)를 가지는 우수한 선형 관계(R² = 0.9981)가 관찰되는데, 이는 신호 증폭 없이DNA를 검출하는 다른 보고된 형광-기반 방법에 필적하거나 더 우수한 효과이다(도 3a 및 표 S2)(Wu et al., 2016; Zhang, Li, Cheng, & Lv, 2009; Jung, Lee, Park, Park & Park, 2018).

종래 기술과의 비교

핵심 검출 수단 및 원리	동적 범위	검출 한계	어세이 시간	참조
Graphene oxide 및 SYBR Green I dye	0-50 nM	0.5 nM	70분	Qiu et al., (2015)
DNA oligonucleotide-stabilized silver nanoclusters	25-1000 nM	14 nM	50분	Lan, Chen, & Chang (2011)
ssDNA-adsorbed graphene oxide	0-50 nM	1 nM	35분	Zhang, Yin, Tan, & Ye (2011)
Bioluminescence resonance energy transfer	20-130 nM	20 nM	30분	Cissell, Campbell, & Deo, (2008)
2-AP-함유 분할 G-쿼드러플렉스	10-2000 nM	7.24 nM	45분	Hwang et al., (2018)
2-AP-함유 분할 G-쿼드러플렉스 및 블로커 DNA	1-2000 nM	0.17 nM	45분	본 발명

본 발명의 타겟 DNA 검출 시스템의 선택성을 평가하기 위해, 비-타겟 DNA가 형광 증가를 유도하는 능력을 조사하여 Chlamydia trachomatis(CT) 유래 타겟 DNA에 의해 촉진되는 형광 강도 증가와 비교하였다. 비-타겟 DNA 시료에는 Neisseria gonorrhea(NG), Klebsiella pneumoniae(KP) 및 Mycoplasma genitalium(MG)의 전장 지놈으로부터 선정된 인공 합성 올리고뉴클레오타이드가 포함되었다. 도 3b에서 보는 바와 같이, 타겟 DNA(CT)가 존재할 때 형광 강도의 유의한 증가가 검출된 반면, 비-타겟 DNA는 별다른 반응을 보이지 않았다. 이러한 결과는 본 발명의 센서가 타겟 DNA에 대해 매우 선택적임을 보여주어, 활성의 G-쿼드러플렉스 구조 형성에 있어 서열-특이적 DNA 혼성화가 중요함을 뒷받침한다.

박테리아 gDNA의 검출

본 발명자들은 실제 식중독을 야기하는 박테리아 유래 gDNA를 검출하는 데에 본 발명의 시스템이 유용한지를 시험하였다. 도 4에서 보는 바와 같이, CT 타겟 서열과 결합된 타겟-특이적 프라이머 및 2-AP-함유 분할(split) G-쿼드러플렉스를 이용하여 표준적인 핵산 증폭 기술인 PCR을 적용하였다. E. coli가 그람-음성 박테리아에 속하는 가장 흔한 감염성 유기체임을 고려하여(Kudinha, 2017; Olsvik, Wasteson, Lund, & Hornes, 1991) 이를 식품 오염 박테리아의 모델로 선정하였고, Uid A 유전자의 서열에 기반하여 타겟-특이적 프라이머를 설계하였다.

E. coli gDNA가 없으면 PCR 증폭은 일어나지 않으며, CT 타겟 서열에 결합한 E. coli-특이적 프라이머(“helper-linked 프라이머”로 명명)는 S1에서 블로커 DNA를 대체함으로써 활성의 G-쿼드러플렉스 구조 형성을 유도하고, 이를 통해 형광의 유의한 증가가 나타난다. 반면, E. coli gDNA가 존재할 경우 helper-linked ssDNA 프라이머는 PCR을 통해 E. coli gDNA를 증폭하고, 이후 PCR 산물 내에서 dsDNA로 전환된다. 이 단계에서, helper-linked 프라이머는 더 이상 S1 및 S2와 반응할 수 없으며, 블로커 DNA에 혼성화된 S1의 2-AP은 유의하게 퀀칭된 신호를 나타낸다. 그 결과, PCR 완료 후 S1, S2 및 블로커 DNA의 첨가 만으로도 추가적인 세척 작업 없이 측정 결과를 얻을 수 있다. 블로커 DNA의 3’말단에 인산을 첨가함으로써 원치않는 연장(extension) 반응을 막을 수 있다(표 3)

^(a)파란색 및 오렌지색은 G-쿼드러플렉스의 분할 분절인 S1 및 S2를 각각 나타낸다.

^(b)붉은색과 녹색은 Chlamydia trachomatis(CT) 타겟 서열 및 E. coli-특이적 서열을 각각 나타낸다.

우선, 본 발명자들은 본 발명의 시스템의 효율적인 적용을위한 핵심인자로서, helper-linked 프라이머의 농도를 최적화하였다. 도 7은 E. coli gDNA 존재 하에 1μM의 helper-linked 프라이머가 가장 큰 신호 감소(F-F₀)를 유발함으로 보여주는 그림이다. 다음으로, 본 발명의 방법의 검출 유용성을 평가하였다. 도 5a의 형광 스펙트럼에서 보는 바와 같이, 2-AP의 형광 강도는 E. coli gDNA가 존재할 경우에만 유의하게 감소하였으나(검은색 곡선), E. coli gDNA가 존재하지 않는 경우는 그렇지 않았다(붉은색 곡선). 이들 형광 결과는 폴리아크릴아미이드 젤 전기영동 분석을 통해서도 뒷받침되어, S1 프로브로부터 블로커 DNA가 분리됨에 따라 helper-linked 프라이머가 S1 및 S2와 혼성화됨을 보여준다(도 5b의 1~4번 레인). 나아가, helper-linked 프라이머는 E. coli gDNA가 존재하지 않는 경우와 달리 E. coli gDNA가 존재할때는 PCR 증폭 후에 S1 및 S2 프로브에 결합할 수 없음이 확인되었다(도 5b의 5번 및 6번 레인).

본 발명의 방법을 이용하여 E. coli gDNA를 정량하고 검출 한계를 확인하였다. 초기 E. coli gDNA 복제수는 0에서 10⁶사이로 다양했으며, PCR 증폭 완료 후 helper-linked 프라이머를 이용하여 각각 S1, S2 및 블로커 DNA와 함께 배양하였다. 도 5c에 나타난 바와 같이, 형광 신호의 변화는 초기 E. coli gDNA의 양과 반비례하였고, E. coli gDNA의 log 10-10⁶ 카피수 범위에서 음의 선형 관계(R²= 0.9878)가 관찰되었다. 검출 한계(3δ/slope)는 약 5.2 카피로서, 종래의 형광-기반 박테리아 검출법에 필적하거나 보다 우수하였다(Deprez et al., 2016; Albayrak et al., 2016).

나아가, 다른 병원성 박테리아 유래의 gDNA를 이용하여 본 발명의 검출 선택성을 임증하고자 하였다. 도 5d에서 보는 바와 같이, 타겟 E. coli gDNA가 존재하는 경우에만 유의한 형광 감소가 관찰되고 다른 박테리아(E. aerogenes, S.aureus, S. Typhi 및 P. aeruginosa) 유래의 비-타겟 gDNA는 형광 감소를 거의 유발하지 못했다. 이를 통해 본 발명의 방법이 타겟 박테리아에 매우 특이적이며 높은 민감성을 가짐을 알 수 있다.

실용적인 적용

식품 유해 박테리아에 의한 피해가 증가함을 고려하여(예를 들어, 매년 미국인 6명중 1명이 식중독을 겪는다)(Mead et al., 1999; Hedberg, 2011), 본 발명자들은 박테리아가 첨가된 상추 시료에서 E. coli를 검출함으로써 본 발명의 실용적인 적용 가능성을 평가하고자 하였다. 특히, 상추 시료는 단백질, 펙틴, 폴리페놀 및 다당류와 같은 다양한 생물학적 구성요소를 포함하여 본 발명의 효용성 검증에 적합한 모델이다(Andreou, Mirsafavi, Moskovits, & Meinhart, 2015). 도 8에서 보는 바와 같이, 2-AP의 형광 강도는가 상추 시료 내 E. coli 농도가 증가함에 따라 감소하였으며, log 10¹-10⁸ CFU/mL 범위에서 선형의 관계가 관찰되었다(R²= 0.9865). 검출 한계는 3σ/S의 정의에 기반하여 약 10 CFU/mL이다. 특히, 본 발명의 방법은 상추 시료에서 87-104%에 달하는 E. coli의 우수한 정확도를 보여주었다(표 1). 이러한 결과를 통해 본 발명의 방법이 정밀하고도 반복재현이 가능함을 알 수 있으며, 실제 음식 시료에서의 타겟 박테리아 검출에 유용하게 사용될 수 있음을 시사한다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

<110> KONKUK UNIVERSITY INDUSTRIAL COOPERATION CORP <120> G-Quadruplex Structure-Based Detection of Target Nucleic Acid Using Blocker Nucleic Acid molecules <130> HPC-9155 <160> 24 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> S1 <400> 1 aagctgcaat ccgggagggt ggg 23 <210> 2 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> S2 <400> 2 tgggctttta agataacc 18 <210> 3 <211> 14 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> a (14mer) <400> 3 ccggattgca gctt 14 <210> 4 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> b (15mer) <400> 4 cccggattgc agctt 15 <210> 5 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> c (16mer) <400> 5 tcccggattg cagctt 16 <210> 6 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> d (17mer) <400> 6 ctcccggatt gcagctt 17 <210> 7 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> e (18mer) <400> 7 cctcccggat tgcagctt 18 <210> 8 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> f (19mer) <400> 8 ccctcccgga ttgcagctt 19 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> g (20mer) <400> 9 accctcccgg attgcagctt 20 <210> 10 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> h (21mer) <400> 10 caccctcccg gattgcagct t 21 <210> 11 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> i (22mer) <400> 11 ccaccctccc ggattgcagc tt 22 <210> 12 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> j (23mer) <400> 12 cccaccctcc cggattgcag ctt 23 <210> 13 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> e-1 (16mer) <400> 13 cctcccggat tgcagc 16 <210> 14 <211> 14 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> e-2 (14mer) <400> 14 cctcccggat tgca 14 <210> 15 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> e-3 (12mer) <400> 15 cctcccggat tg 12 <210> 16 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> e-4 (10mer) <400> 16 cctcccggat 10 <210> 17 <211> 8 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> e-5 (8mer) <400> 17 cctcccgg 8 <210> 18 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CT (26mer) <400> 18 ggttatctta aaagggattg cagctt 26 <210> 19 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SA (26mer) <400> 19 tcagactatt attggttgat acacct 26 <210> 20 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NG (26mer) <400> 20 ctgccgccga tatacctagc aagctc 26 <210> 21 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KP (26mer) <400> 21 gccgccatta ccatgagcga taacag 26 <210> 22 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MG (26mer) <400> 22 ctcaagtatc tcaatgctgt tgagaa 26 <210> 23 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Helper-linked F- primer <400> 23 ggttatctta aaagggattg cagcttgcga ggtacggtag gagttg 46 <210> 24 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Helper-linked R- primer <400> 24 ggttatctta aaagggattg cagcttgaag ggcgaacagy ycctga 46

Claims

다음의 핵산 분자를 포함하는 표적 핵산분자 검출용 조성물:
(a) (i) 형광 염기 유사체(fluorescent base analogue)를 포함하는 구아닌-풍부(G-rich) 영역; 및 (ⅱ) 상기 표적 핵산 분자에 상보적인 제1 프로브 영역을 포함하는 제1 분절;
(b) (i) 구아닌-풍부(G-rich) 영역; 및 (ⅱ) 상기 표적 핵산 분자에 상보적인 제2 프로브 영역을 포함하는 제2 분절;
(c) 상기 제1 프로브 영역과 상보적인 서열을 포함하는 블로커(blocker) 핵산 분자.
삭제
제 1 항에 있어서, 상기 형광 염기 유사체는 2-AP(2-아미노퓨린)인 것을 특징으로 하는 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 제1 분절의 구아닌-풍부(G-rich) 영역과 상기 제2 분절의 구아닌-풍부 영역 내의 각 구아닌 염기의 수는 2.5:1 내지 3.5:1인 것을 특징으로 하는 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 제1 프로브 영역과 상보적인 상기 표적 핵산분자 상의 영역과 상기 제2 프로브 영역과 상보적인 상기 표적 핵산분자 상의 영역은 서로 중첩되지 않는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 제1 분절의 제1 프로브 영역 및 상기 제2 분절의 제2 프로브 영역과 상기 표적 핵산분자가 혼성화되면 G-쿼드러플렉스(G-quadruplex) 구조가 형성되는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 블로커(blocker) 핵산 분자는 8 내지 17개 염기로 이루어진 것을 특징으로 하는 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 핵산분자는 DNA(deoxyribonucleic acid)인 것을 특징으로 하는 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 조성물은 1 - 20 mM의 칼륨이온 용액을 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 1 항에 있어서, 분석 대상 시료 내에 상기 표적 핵산분자가 존재하는 경우 상기 형광 염기 유사체에 의한 형광 강도가 증가하는 것을 특징으로 하는 조성물.
다음의 핵산 분자를 포함하는 표적 핵산분자 검출용 조성물:
(a) (i) 상기 표적 핵산분자에 상보적인 영역; 및 (ⅱ) 분절 결합 영역을 포함하는 프라이머 분자;
(b) (i) 형광 염기 유사체(fluorescent base analogue)를 포함하는 구아닌-풍부(G-rich) 영역; 및 (ⅱ) 상기 분절 결합 영역에 상보적인 제1 프로브 영역을 포함하는 제1 분절;
(c) (i) 구아닌-풍부(G-rich) 영역; 및 (ⅱ) 상기 분절 결합 영역에 상보적인 제2 프로브 영역을 포함하는 제2 분절;
(d) 상기 제1 프로브 영역과 상보적인 서열을 포함하는 블로커(blocker) 핵산 분자.
제 11 항에 있어서, 상기 프라이머 분자는 상기 표적 핵산분자에 상보적인 영역의 5’말단에 상기 분절 결합 영역이 연결되어 있는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 11 항에 있어서, 상기 제1 프로브 영역과 상보적인 상기 분절 결합 영역 상의 부위와 상기 제2 프로브 영역과 상보적인 상기 분절 결합 영역 상의 부위는 서로 중첩되지 않는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 11 항에 있어서, 분석 대상 시료 내에 상기 표적 핵산분자가 존재하는 경우 상기 형광 염기 유사체에 의한 형광 강도가 감소하는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 1 항 및 제 3 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항의 조성물을 포함하는 생물학적 시료로부터 표적 핵산분자의 검출용 키트.
다음의 단계를 포함하는 생물학적 시료 내에서 표적 핵산분자를 검출하는 방법:
(a) 제 1 항 및 제 3 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항의 조성물을 상기 생물학적 시료와 접촉시키는 단계; 및
(b) 상기 생물학적 시료 내의 형광 강도 변화를 측정하는 단계.