KR101672380B1 - 뉴클레아제를 검출하는 제제를 포함하는 미생물 오염 검출용 조성물 및 그의 이용 - Google Patents

뉴클레아제를 검출하는 제제를 포함하는 미생물 오염 검출용 조성물 및 그의 이용 Download PDF

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Abstract

본 발명은 뉴클레아제를 검출하는 제제를 포함하는 미생물 오염 검출용 조성물 및 그의 이용에 관한 것이다. 본 발명에 따른 핵산 이중가닥 뉴클레아제 측정용 프로브는 포괄적인 뉴클레아제의 핵산 분해능을 검출할 수 있으며, 이에 따라, 시료에서 살아있는 미생물을 매우 신속하고 정확하게 검출 및 정량화할 수 있으며, 검출 방법이 간편한 특징을 가진다. 더욱이, 본 발명의 프로브는 형광의 신호가 지속적으로 증가하는 특징을 나타내며, 생균의 측정이 가능하고, 이중가닥 핵산으로 구성되어 있어, 키트 또는 카트리지의 보관성이 매우 뛰어나다. 이에 따라, 본 발명의 프로브는 환경에서 미생물의 오염도를 쉽고 간편하게 측정하고 비교하는 것에 이용될 수 있을 것으로 기대된다.

Description

뉴클레아제를 검출하는 제제를 포함하는 미생물 오염 검출용 조성물 및 그의 이용{Composition for Detecting Microbial Contamination Comprising an Agent for Detecting Nuclease in Microorganism and Uses Thereof}
본 발명은 뉴클레아제를 검출하는 제제를 포함하는 미생물 오염 검출용 조성물 및 그의 이용에 관한 것이다
소득수준이 높아지면서 일반인들은 건강 및 위생에 대하여 높은 관심을 보이지만, 그들이 직접 눈에 보이지 않는 미생물을 검출하고 그를 정량적으로 평가하기는 쉽지 않은 상황이다.
사람이 사용하는 머리 빗, 휴대폰, 책상, 옷 등과 같은 일상적인 물건이나 화장실, 침실 등의 공간, 심지어 일반적인 공기 중에는 다양한 미생물이 서식하고 있으며, 이러한 미생물 중에는 기회감염균 및 병원성 세균 등이 포함되어 있을 가능성이 있다.
미생물의 양을 측정하는 전통적인 방법으로는 표준 평판법으로 미생물을 배양할 수 있는 배지에 환경으로부터 채취한 시료를 단계 희석하여 도말하고 2~3일 후에 배지로부터 생성되는 균락의 수를 계산하여 그 양을 추정하는 것이다. 이러한 전통적 방법은 전문적 실험 도구 및 숙련된 실험자가 필요할 뿐만 아니라 시간도 매우 오래 걸리는 단점을 지니고 있어 일반인이 신속하게 생존 미생물을 측정하기엔 힘든 점이 있다.
전통적 방법의 문제점을 해결하기 위하여 최근 여러 방법들이 개발되고 있다. 세포 내에 항시 존재하는 다양한 구성물질의 양을 측정함으로써 간접적으로 미생물의 양을 측정하는 것이다.
대표적인 방법으로 ATP의 양을 기반으로 측정하는 방법이 있다. ATP는 세포 내에서 주요 생체에너지원으로 사용되고 있으며, 모든 생물에 공통적으로 존재하는 구성물로 시료에서 세포 양을 측정하기에 유용한 물질이다. 이러한 장점으로 인하여 ATP 측정방법은 미생물 정량 측정에 현재 널리 사용되고 있으며, 이를 측정하기 위해서 일반적으로 루시퍼라아제(luciferase) 효소를 사용하여 발광반응을 유도하고 빛의 강도를 통하여 정량을 하게 된다. 이때, 기질로는 루시페린(luciferin)을 사용한다.
그러나, 상기 방법은 반응 시료 내 ATP가 빠르게 고갈되어 신호가 오래 지속되지 못하며, 첨가하는 효소 및 기질의 생산단가가 높은 단점이 존재한다. 또한, 측정하기 위한 구성물이 효소인 점으로 인하여 저장성에 한계점을 보유하고 있어 문제가 되고 있다. 이러한 ATP 측정을 통한 미생물 세포의 정량 방법에는 또 다른 문제점이 존재한다. 세포가 사멸하여도 ATP의 기능은 유지되어 사멸된 또는 생존력이 매우 낮은 미생물 역시 측정될 가능성이 높다는 것이다.
또 다른 방법은 리가아제(ligase)를 이용하는 방법이다. 이는 특정 DNA 단편조각들을 시료에 넣어주게 되면 세포 내에 존재하는 리가아제가 이를 인지하고 중합반응을 통하여 두 개의 단편조각을 이어주게 된다. 이렇게 이어준 조각에 특정한 프라이머를 이용하여 real-time PCR 분석을 수행하는 경우, 103 세포의 미생물 양도 평가할 수 있는 것으로 알려져 있다.
그러나, 루시퍼라아제를 통한 측정법과 마찬가지로 리가아제라는 효소를 사용하기 때문에 보관에 어려움이 있고, 리가아제와 DNA 가닥과의 반응을 통해 만들어진 새로운 핵산 분자를 확인하기 위해서는 RT-PCR 및 PCR, 겔 전기영동 과정이 요구되기 때문에 고가의 장비 및 숙련된 실험자가 필요하며 분석 시간이 매우 오래 소요된다. 또한, 루시퍼라아제 측정법처럼 ATP 분자가 죽은 세포 상에도 존재하기 때문에 생존 미생물만의 측정이 불가능하다는 단점이 있다.
따라서, 이런 문제점을 해결하기 위해서는 세포에 항시 존재하는 효소의 양 및 활성을 측정하여 미생물의 검출 및/또는 정량을 추정하는 것이 바람직할 것이다.
출원번호 : KR1020100081068
이에 본 발명자들은 고가의 장비 및 숙련된 실험자 없이 매우 빠르고 효과적으로 생존 미생물을 검출하고 그 양을 측정하는 방법을 개발하기 위하여 예의노력한 결과, 세포 내에 존재하는 뉴클레아제(nuclease)의 활성을 측정할 수 있는 이중 핵산 프로브를 개발하고, 상기 프로브가 살아있는 미생물의 뉴클레아제의 핵산분해능을 정확하고 효율적으로 검출할 수 있다는 것을 확인하여 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
따라서, 본 발명의 목적은 뉴클레아제를 검출하는 제제를 포함하는, 미생물 오염 검출용 조성물을 제공하는 데 있다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 미생물 오염 검출용 키트를 제공하는 데 있다.
또한, 본 발명의 또 다른 목적은 미생물의 오염 검출 방법을 제공하는 데 있다.
또한, 본 발명의 또 다른 목적은 뉴클레아제 활성 측정을 위한 올리고뉴클레오티드를 제공하는 데 있다.
이하 본 발명에 대하여 구체적으로 설명한다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 뉴클레아제를 검출하는 제제를 포함하는, 미생물 오염 검출용 조성물을 제공한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 조성물은 살아있는 미생물을 검출하는 것에 이용될 수 있다.
즉, 본 발명의 특징은 살아있는 미생물 내 존재하는 효소인 뉴클레아제를 이용하여 미생물을 검출 및/또는 정량하는 것이다.
통상적으로 당업계에서 이용하는 미생물 정량법은 세포가 사멸하여도 ATP의 기능은 유지되기 때문에 사멸 또는 생존력이 매우 낮은 미생물 역시 측정되어 위양성 결과를 초래한다.
그러나, 본 발명의 조성물은 실질적으로 살아있는 미생물만을 신속하고 용이하게 검출 및 정량할 수 있으므로 상술한 바와 같은 위양성 발생 문제를 해결할 수 있다.
본 발명에서, 상기 미생물은 박테리아 또는 진균을 의미한다.
본 발명의 조성물이 검출할 수 있는 박테리아의 종류는 제한되지 않는다. 구체적으로 상기 박테리아는 그람-음성 박테리아 또는 그람-양성 박테리아일 수 있다.
상기 그람-음성 박테리아의 예는 Escherichia coli (E. coli), Helicobcater, Hemophilus, Neisseria , Cyano bacteria, Klebsiella , Acetobacter , Enterobacter , Chlamydia, Vibrio , Pseudomona , Salmonella, Thiobacter , Borrelia , Burkholderia, Serratia , Treponema 등 일 수 있다. 상기 그람-양성 박테리아의 예는 Bacillus, Nocardia , Clostridium, Propionibacterium , Actinomyces , Enterococcus, Cornyebacterium , Listria , Lactobacillus, Gardnerella , Mycobacterium, Mycoplasma , Staphylococcus, Streptomyces , Streptococcus등 일 수 있다.
본 발명의 조성물이 검출할 수 있는 진균은 제한되지 않는다. 예를 들어, 상기 진균은 식물병원성 진균으로 푸사리움속균(Fusarium spp.), 페니실리움속균(Penicillium spp.) 또는 라이족토니아속균(Rhizoctonia solani)일 수 있고, 동물병원성 진균으로서 칸디다(Candida spp.), 아스퍼질러스(Aspergillus spp.), 크립토코커스 네오포르만스(Cryptococcus neoformans) 및 트리코파이톤(Trichophyton spp.) 등을 포함할 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 뉴클레아제를 검출하는 제제는 올리고뉴클레오티드로 이루어진다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 올리고뉴클레오티드는 단일가닥 또는 이중가닥으로 이루어진다.
본 명세서에서 뉴클레아제를 검출하는 제제를 언급하면서 사용된 용어 "올리고뉴클레오티드"는 프로브를 의미한다.
본 발명에 있어서, 상기 프로브는 바람직하게는 이중 핵산 가닥에 있어서, 5' 또는 3' 말단에 평활 말단 (blunt end)이 존재하고, 평활말단 (blunt end)이 존재하는 말단의 반대편 말단에 접착 말단 (sticky end)이 존재하며, 평활 말단과 접착 말단 사이에 핵산 미스매치 (mismatch)가 존재하는 것을 특징으로 한다.
본 명세서에서 프로브를 언급하면서 사용된 용어 "5'-말단" 부위는, 프로브의 5'-말단으로부터 어떤 길이의 연속적인 서열을 포함하는 부위 또는 구역을 의미한다. 바람직하게는, 프로브의 5'-말단 부위는 그의 5'-말단으로부터 1-10 개의 뉴클레오티드를 포함하는 서열로 구성된다.
본 명세서에서 프로브를 언급하면서 사용된 용어 "3'-말단" 부위는 프로브의 3'-말단으로부터 어떤 길이의 연속적인 서열을 포함하는 부위 또는 구역을 의미한다. 바람직하게는, 프로브의 3'-말단 부위는 그의 3'-말단으로부터 1-10 개의 뉴클레오티드를 포함하는 서열로 구성된다.
본 발명에서 핵산 가닥은 올리고뉴클레오티드, 뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드, 및 그의 단편 또는 부분을 지칭하며, 센스 또는 안티센스 가닥을 의미할 수 있는 게놈 또는 합성 기원의 DNA 또는 RNA를 지칭한다. 본 발명에서 핵산 가닥은 바람직하게는 DNA로 이루어질 수 있다.
또한, 본 발명의 프로브는 바람직하게는 이중 핵산 가닥으로 이루어진 것을 특징으로 한다. 본 발명의 이중핵산 가닥은 상호 혼성화되어 있다. 본 명세서에서 용어 "혼성화"는 상보적인 핵산의 대합과 관련하여 사용된다. 혼성화 및 혼성화 강도(즉 핵산 사이의 연합 강도)는 핵산 사이의 상보성 정도, 관련 조건의 엄격성(stringency), 및 형성된 혼성물(hybrid)의 Tm과 같은 요인들에 의해 영향을 받는다. "혼성화" 방법은 하나의 핵산과 다른 상보적 핵산, 즉 상보적 뉴클레오티드 서열을 가진 핵산의 어닐링(annealing)을 포함한다. 상보적 서열을 포함하는 두 가지 핵산 중합체가 서로를 인식하고 염기 대합 상호작용을 통해 어닐링하는 능력은 잘 이해되어 있는 현상이다. "혼성화" 과정의 초기 관찰(Marmur and Lane, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 46:453 (1960) 및 Doty et al., Proc. Natl. Acad. Sci.USA 46:461 (1960))은 후속의 연구에 의해 진보하여 현대 생물학의 필수 도구가 되었다.
본 발명의 핵산 가닥은 천연 핵산에서 일반적으로 발견되지 않는 염기도 본 발명의 핵산에 포함될 수 있으며, 이는 예를 들어 이노신 및 7-데아자구아닌을 포함한다. 상보성이 완벽할 필요는 없으며; 안정한 이중체가 불일치 염기쌍 또는 쌍을 이루지 않는 염기를 포함할 수 있다. 핵산 기술 분야의 당업자는, 예를 들어 올리고뉴클레오티드의 길이, 올리고뉴클레오티드의 염기 조성 및 서열, 이온 세기 및 불일치 염기쌍의 발생률과 같은 다수의 변수를 고려하여 실험적으로 이중체의 안정성을 결정할 수 있다.
본 발명의 핵산 가닥의 길이는 한정되지 않으나 프로브의 양 말단에 존재할 수 있는 퀀쳐 및 형광물질이 서로의 영향을 주지 않는 길이인 것이 바람직하며, 따라서, 바람직하게는 31 mer 이상의 핵산으로 이루어진 것일 수 있다. 예를 들어, 31개 내지 60개, 31개 내지 50개, 또는 31개 내지 40개의 핵산으로 이루어질 수 있다.
본 발명의 핵산 가닥은 임의의 방식, 예를 들어 화학적 합성, DNA 복제, 역전사, PCR, 또는 이들의 조합에 의해 생성될 수 있다.
본 발명에서 뉴클레아제 (nuclease)는 핵산 가수분해 효소를 의미하며, 핵산, 뉴클레오티드, 뉴클레오시드등의 가수분해 반응을 촉매하는 효소를 의미한다. 상기 뉴클레아제는 그 종류의 제한이 없으며, DNA를 분해하는 DNase, RNA를 분해하는 RNase 를 포함한다. 또한, 상기 뉴클레아제는 폴리뉴클레오티다아제, 뉴클레오티다아제, 뉴클레오시다아제를 포함하는 개념이다. 또한, 이는 3' 말단 또는 5' 말단을 순차적으로 분해하는 엑소뉴클레아제(exonuclease) 및 핵산 사슬 내부를 절단하는 엔도뉴클레아제(endonuclease)를 포함한다. 특히, 본 발명은 엑소뉴클레아제 또는 엔도뉴클레아제를 동시에 측정할 수 있는 구성을 포함한다.
본 발명에서 평활 말단 (blunt end)은 단일 가닥이 존재하지 않은 이중 핵산 가닥의 말단을 의미하며, 본 발명의 올리고뉴클레오티드, 즉, 프로브에서 상기 평활 말단은 3' 말단 또는 5'말단에 존재할 수 있다.
본 발명에서 접착 말단 (sticky end)은 이중 핵산 가닥에서 말단이 한가닥 사슬 (3' 또는 5' 오버행)인 것을 의미하며, 오버행된 단일 사슬의 길이는 제한하지 않는다. 또한, 상기 접착 말단은 평활 말단이 존재하는 반대편에 위치하며, 즉, 평활 말단이 3' 말단에 존재하는 경우, 접착 말단은 5' 말단에, 평활 말단이 5' 말단에 존재하는 경우, 접착 말단은 3' 말단에 존재할 수 있다. 또한, 상기 접착 말단에는 오버행 되지 않은 말단에서 핵산 미스매치를 포함할 수 있다. 이는 DNA 중합효소(DNA polymerase)에 의한 교정작업의 일환인 3'→ 5' 핵산 분해작용이 일어날 수 있도록 구성된 것이다. 상기 핵산 미스매치는 1개 이상일 수 있으며, 바람직하게는 형광 물질과 퀀쳐의 작용이 저해되지 않는 거리를 유지하도록 미스매치가 부여될 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 "핵산 미스매치" 또는 "미스매치 뉴클레오티드"는 비-상보적인 뉴클레오티드 또는 교정(proofreading) 활성을 갖는 주형-의존적 핵산 중합효소에 의하여 미스매치로 인식되는 뉴클레오티드를 의미한다.
상기 미스매치 뉴클레오티드는 프로브의 다양한 위치(site)에 있을 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서는 이중 핵산 가닥의 프로브에 엔도뉴클레아제의 활성을 확인하기 위하여, 상기 평활 말단과 접착 말단 사이에 핵산 미스매치 (mismatch)를 부여하였다. 상기 핵산 미스매치는 핵산의 상보적 결합이 이루어지지 않은 것을 의미하며, 본 발명에서 상기 미스매치는 핵산의 수 및 길이를 제한하지 않으나, 바람직하게는 1 개 이상이며, 더욱 바람직하게는 1 내지 10 개일 수 있고, 가장 바람직하게는 3 개이다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 미스매치 뉴클레오티드는 그의 3'-말단으로부터 1-10 개의 뉴클레오티드 이격된 위치에 존재한다.
상기 올리고뉴클레오티드에 최소 2 개의 미스매치 뉴클레오티드가 있는 경우, 미스매치 뉴클레오티드는 연속적 또는 불연속적으로 위치할 수 있다.
또한, 본 발명의 상기 올리고뉴클레오티드는 3' 말단, 5' 말단, 양 말단 또는 양 말단의 사이에 형광물질 및 퀀쳐 (quencher)가 부착될 수 있다.
본 발명에 있어서, 형광물질은 퀀쳐와 물리적으로 거리가 생길 때, 형광을 발생시키는 물질로서 그 종류를 제한하지 않는다. 형광물질로는 여기상태에서 발광하는 분자, 금속 이온, 착화합물, 유기염료, 도체, 반도체, 부도체, 양자점 (quantum dot), 양자선(quantum wire) 등이 있다.
상기 형광물질의 예로서, EGFP(enhanced green fluorescent protein), ECFP (enhanced cyan fluorescent protein), EBFP (enhanced blue fluorescent protein), EYFP (enhanced yellow fluorescent protein) 및 RFP (red fluorescent protein) 등의 형광단백질이 있다.
또한, 상기 형광물질의 예로서, 파이렌 (Pyrene) 또는 이의 유도체, 시아닌(Cyanine, Cy) 시리즈, 알렉사플루오르(Alexa Fluor) 시리즈, 보디피 (BODIPY) 시리즈, DY 시리즈, 로다민 (rhodamine) 또는 이의 유도체, 플루오레신(Fluorescein) 또는 이의 유도체, 쿠마린 (coumarin) 또는 이의 유도체, 아크리딘 호모다이머 (Acridine homodimer) 또는 이의 유도체, 아크리딘 오렌지(Acridine Orange) 또는 이의 유도체, 7-아미노액티노마이신 D(7-aminoactinomycin D, 7-AAD) 또는 이의 유도체, 액티노마이신 D(Actinomycin D) 또는 이의 유도체, 에이씨엠에이(ACMA, 9-amino-6-chloro-2-methoxyacridine) 또는 이의 유도체, 디에이피아이(DAPI) 또는 이의 유도체, 디하이드로에티듐(Dihydroethidium) 또는 이의 유도체, 에티듐 브로마이드(Ethidium bromide) 또는 이의 유도체, 에티듐 호모다이머-1(EthD-1) 또는 이의 유도체, 에티듐 호모다이머-2(EthD-2) 또는 이의 유도체, 에티듐 모노아자이드(Ethidium monoazide) 또는 이의 유도체, 헥시디움 아이오다이드(Hexidium iodide) 또는 이의 유도체, 비스벤지마이드(bisbenzimide, Hoechst 33258) 또는 이의 유도체, 호에크스트 33342(Hoechst 33342) 또는 이의 유도체, 호에크스트 34580(Hoechst 34580) 또는 이의 유도체, 하이드로옥시스티바미딘(hydroxystilbamidine) 또는 이의 유도체, 엘디에스 751(LDS 751) 또는 이의 유도체, 프로피디움 아이오다이드(Propidium Iodide, PI) 또는 이의 유도체, 칼세인(Calcein) 또는 이의 유도체, 오레건 그린(Oregon Green) 또는 이의 유도체, 마그네슘 그린(Magnesium Green) 또는 이의 유도체, 칼슘 그린(Calcium Green) 또는 이의 유도체, JOE 또는 이의 유도체, 테트라메틸로다민(Tetramethylrhodamine) 또는 이의 유도체, TRITC 또는 이의 유도체, TAMRA 또는 이의 유도체, 피로닌 Y(Pyronin Y) 또는 이의 유도체, 리싸민(Lissamine) 또는 이의 유도체, ROX 또는 이의 유도체, 칼슘크림선(Calcium Crimson) 또는 이의 유도체, 텍사스 레드(Texas Red) 또는 이의 유도체, 나일 레드(Nile Red) 또는 이의 유도체, 티아디카복시아닌(Thiadicarbocyanine) 또는 이의 유도체, 단실아마이드(dansylamide) 또는 이의 유도체, 캐스캐이드 블루 (cascade blue), DAPI(4',6-diamidino-2-phenylindole)일 수 있다.
상기 형광물질로서 양자점이 사용될 수 있는데, 양자점은 나노크기의 Ⅱ-Ⅳ 또는 Ⅲ-Ⅴ 반도체입자가 중심을 이루고 있는 입자로, 약 2-10nm 크기의 중심(core)과 주로 ZnS 등으로 이루어진 껍질(shell)로 구성되며, 동일한 물질이라 하더라도 입자의 크기에 따라 형광파장이 달라져 다양한 파장대의 형광을 얻을 수 있다. 상기 양자점을 이루는 Ⅱ-Ⅵ 또는 Ⅲ-Ⅴ족 화합물은 CdSe, CdSe/ZnS, CdTe/CdS, CdTe/CdTe, ZnSe/ZnS, ZnTe/ZnSe, PbSe, PbS InAs, InP, InGaP, InGaP/ZnS 및 HgTe로 구성된 군에서 선택될 수 있고, 단일 코어(core) 또는 코어(core)/쉘(shell) 형태일 수 있다.
본 발명에 있어서, 용어 "퀀쳐 (quencher)"는 소광제, 흡광물질 등으로 사용될 수 있으며, 이는 형광물질 또는 광원으로부터 에너지 또는 빛을 흡수하는 물질을 의미한다. 퀀쳐는 흡광단백질, 흡광분자, 금속나노입자, 탄소입자 등일 수 있다. 바람직하게는 BHQ(Black Hole Quencher)-1, DABCYL, 이클립스(Eclipse), TAMRA, QSY-7, BHQ(Black Hole Quencher)-2, BHQ(Black Hole Quencher)-3, 금나노입자(Gold nano-particle)로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나일 수 있으나 표지물질에 방출되는 에너지 또는 빛을 흡수할 수 있는 한, 그 종류는 제한되지 않는다. 본 발명의 일 구체예에서는 BHQ-1을 이용하였다. 상기 퀀쳐는 N-아세틸뮤라민산 (N-Acetylmuramic acid, NAA)과 결합되어 있으며, N-아세틸뮤라민산 (N-Acetylmuramic acid, NAA)을 통하여 펩티도글리칸에 연결(link)되어 있을 수 있고, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는, 미생물 오염 검출 키트를 제공한다.
본 발명의 키트는 미생물을 검출하는 것에 이용될 수 있다.
본 발명의 상기 키트는 미생물 검출을 실시하기 위해 필요한 반응 구성성분의 보관 또는 전달을 위한 키트를 제공한다. 키트는 검출에 필요하거나 바람직한 임의의 모든 구성성분을 포함할 수 있으며, 여기에는 시약 자체, 완충액, 제어 시약(예를 들어 조직 시료, 양성 및 음성 대조군 표적 올리고뉴클레오티드 등), 고체 지지체, 표지, 서면 및/또는 도면 사용 설명서 및 제품 정보, 저해제, 표지화 및/또는 검출 시약, 포장 환경 제어(예를 들어 얼음, 제습제 등) 등이 포함되나 이에 한정되지는 않는다.
본 발명의 키트는 상술한 조성물을 구성으로 포함하므로, 중복된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여 그 기재를 생략한다.
또한, 본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 다음 단계를 포함하는 미생물의 오염을 검출하는 방법을 제공한다:
(a) 상기 조성물을 시료에 처리하는 단계; 및
(b) 상기 시료에서 형광발색을 확인하는 단계.
본 발명에 있어서 용어 "시료"는 가장 광범위한 의미로 사용된다. 한편으로 이는 검체 또는 배양물 (예를 들어 미생물 배양물)을 포함하는 의미이다. 다른 한편으로는 생물학적 및 환경적 시료 양자 모두를 포함 하는 의미이다. 시료는 합성 기원의 검체를 포함할 수 있다.
생물학적 시료는 멸균된 액체 및 고체 식품 및 사료 제품(feed product) 및 유제품 품목, 야채, 식육 및 식육 부산물과 같은 성분, 및 폐기물일 수도 있다. 생물학적 시료는 야생화(feral) 또는 야생 동물을 비롯하여 다양한 계열의 모든 가축으로부터 수득할 수 있으며, 이들 동물은 유제류, 곰, 물고기, 토끼목의 포유류, 설치류 등을 포함하나 이에 한정되지는 않는다.
환경적 시료는, 식품 및 유제품 가공 기기, 기구, 장비, 용구, 일회용 및 비-일회용 품목과 함께, 표면 소재 (surface matter), 토양, 물 및 산업적 시료와 같은 환경적 재료를 포함한다. 이들 예가 본 발명에 적용할 수 있는 시료 유형을 한정하는 것으로 해석되어서는 안 된다.
본 발명의 상기 방법은 상기 시료에서 형광발색을 확인하는 단계를 포함할 수 있다. 상기 형광발색은 프로브의 퀀쳐가 형광물질의 발광을 제한하며, 뉴클레아제에 의하여 프로브가 절단하는 시점에서 퀀쳐의 작용이 사라져, 형광이 발색하는 것을 확인할 수 있다.
본 발명의 방법은 상술한 조성물을 이용하여 검출하므로, 중복된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여 그 기재를 생략한다.
또한, 본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 바와 같이, 뉴클레아제 활성 측정을 위한, 이중 핵산 가닥의 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 프로브를 제공한다.
상기 프로브는 이중 핵산 가닥에서, 5' 또는 3' 말단에 평활 말단 (blunt end)이 존재하며; 평활 말단 (blunt end)이 존재하는 말단의 반대편 말단에 접착 말단 (sticky end)이 존재하고; 상기 평활 말단과 접착 말단 사이에 1개 이상의 핵산 미스매치 (mismatch)가 존재하는, 뉴클레아제 활성 측정을 위한 올리고뉴클레오티드이다.
본 발명에 따른 핵산 이중가닥 뉴클레아제 활성 측정을 위한 프로브는 포괄적인 뉴클레아제의 핵산 분해능을 검출할 수 있으며, 이에 따라, 시료에서 미생물을 매우 신속하고 정확하게 검출 및 정량화 할 수 있으며, 검출 방법이 간편한 특징을 가진다. 이에 따라서, 환경에서 미생물의 오염도를 쉽고 간편하게 측정하고 비교하는 것에 이용될 수 있을 것으로 기대된다.
본 발명에 따른 살아있는 미생물 내 뉴클레아제를 검출하는 제제를 포함하는, 미생물 오염 검출용 조성물은 포괄적인 뉴클레아제의 핵산 분해능을 검출할 수 있으며, 이에 따라, 시료에서 살아있는 미생물을 매우 신속하고 정확하게 검출 및 정량화 할 수 있으며, 검출 방법이 간편한 특징을 가진다. 더욱이, 본 발명의 프로브는 형광의 신호가 지속적으로 증가하는 특징을 나타내며, 생균의 측정이 가능하고, 이중가닥 핵산으로 구성되어 있어, 키트 또는 카트리지의 보관성이 매우 뛰어나다. 이에 따라, 본 발명의 조성물은 환경에서 미생물의 오염도를 쉽고 간편하게 측정하고 비교하는 것에 이용될 수 있을 것으로 기대된다.
도 1은 본 발명에 따른 뉴클레아제 측정을 위한 핵산 이중가닥 프로브의 개념도이다.
도 2는 조추출물에 존재하는 뉴클레아제에 의한 이중가닥 프로브의 형광발색 반응을 측정한 결과이다.
도 3은 이중가닥 프로브의 시간에 따른 형광 세기 변화를 측정한 결과이다.
도 4는 생존 대장균과 사멸 처리된 대장균 각각의 조추출물에 대한 이중가닥 프로브의 반응을 나타낸 결과이다.
도 5는 생존 대장균과 사멸 처리된 대장균 각각의 luciferase 기반 발광을 측정 비교한 결과이다.
도 6은 E. coli에서의 본 프로브의 구조 별 형광 세기를 측정한 결과이다.
도 7은 E. coli에서의 본 프로브의 미스매치 수 별 형광 세기를 측정한 결과이다.
도 8은 E. coli 생균 및 사균에서의 본 프로브의 형광 시그널을 측정한 결과이다.
도 9는 E. coli 세포 수에 따른 본 프로브의 형광 강도(intensity)를 측정한 결과이다.
도 10은 S. aureus 세포 수에 따른 본 프로브의 형광 강도(intensity)를 측정한 결과이다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
< 실시예 1> 프로브의 설계 및 합성
포괄적 핵산분해능을 측정하기 위하여 이중가닥 프로브의 양 말단에 형광발색단(fluorophore)와 퀀쳐(quencher) 쌍을 위치시켰다. 양 말단에 존재하는 퀀쳐(quencher)는 반대 방향에 존재하는 형광발색단에 영향을 미치지 않게 하기 위하여 (100 Å이 넘는 거리를 유지하기 위하여) 총 염기서열 31 내지 40 mer의 길이로 프로브를 구성하였다. 이중가닥 양 말단에서 한 쪽은 이중가닥 핵산 분해효소(double strand DNA exonuclease)가 작용할 수 있도록 평활 말단 (blunt-end) 구조로 구성하였으며, 반대 말단은 단일가닥 핵산 분해효소(single strand DNA exonuclease)에 의해 분해될 수 있도록 5' 말단이 노출되도록 접착 말단 (sticky-end)로 구성하였다.
또한, 접착 말단(sticky-end)의 3' 말단에서 DNA 중합효소(DNA polymerase)에 의한 교정작업의 일환인 3' → 5' 핵산 분해작용이 일어날 수 있도록 미스매치가 발생하게 하였다. 다만, 상보적 염기서열이 5' 말단으로부터 3개 이상 떨어지게 되면 퀀쳐(quencher)에 의한 효과가 감소되어 1개의 미스매치만을 부여하였다. 핵산말단분해효소(exonuclease) 이외에 핵산내부가수분해효소(endonuclease)에 의한 분해효과도 함께 작용시키기 위하여 프로브 내에 3 개의 불일치 염기서열(mismatched bases)을 구성하였다.
본 발명에 따른 이중 핵산 가닥 프로브의 구성을 도 1에 나타내었다.
본 실시예에서 제작된 프로브들의 서열은 다음과 같다:
- 이중가닥 프로브 센스 서열 (SEQ ID NO:1) 5'- ACA TTA AGT GTA CCA GCT GCA TGA AAG TAC TTA ATA -3'; 및
- 이중가닥 프로브 안티센스 서열 (SEQ ID NO:2) 5'- TAT TAA GTA CTT TCA TGC AAA CGG TAC ACT TAA TA -3'.
(밑줄은 미스매치 뉴클레오티드들을 가리킨다)
상기 제작된 본 발명의 프로브는 "평활 말단과 접착 말단 사이에 핵산 미스매치 (mismatch)가 존재"하는 것을 특징으로 한다. 실제 이중핵산가닥에서 한쪽 가닥에 미스매치 서열을 넣으면 상보가닥과 서로 맞지 않기 때문에 두 가닥 모두 서로 미스매치가 생긴다. 즉, 본 발명에서 미스매치는 두 상보가닥이 서로 결합되지 않고 벌어져 있는 것을 의미한다.
또한, 이중핵산 가닥 프로브의 경우 센스의 표기된 길이는 36 mer(또는 44 mer; 하기 실험예에서 이용)이고, 안티센스의 길이는 접착 말단 부분에 뉴클레아제가 잘 작용하도록 작게 설계하였으므로 이들 간의 길이는 상이하다.
또한, 양 말단에 형광발색단(fluorophore)과 퀀쳐(quencher)가 표지된 단일가닥 DNA 각각을 합성하여 아래의 조건에서 어닐링(annealing)하여 이중가닥을 제조하였다:
1. 각 oligomer 20 pmol을 annealing buffer (10 mM Tris (pH 8.0), 50 mM NaCl, 1 mM EDTA, 2.5 mM의 MgCl2) 첨가;
2. 95℃에서 5분간 변성 (denaturation);
3. 25℃까지 2~4시간에 걸쳐 서서히 냉각함.
< 실시예 2> 시료의 준비
LB에서 37℃ 진탕 배양한 미생물 배양액(대장균 배양액: 흡광도 1.3~1.7)으로부터 원심분리 방법을 통하여 미생물 세포를 회수하였다.
리소자임(lysozyme; 10 mg/ml)과 일반 상업용 세포용해 완충용액을 이용한 화학적 방법 및 초음파처리(sonication)를 통하여 미생물 배양액으로부터 조추출물(crude extracts)을 회수하였다.
화학적 방법은 다음과 같이 진행하였다. 원심 분리 후, 상층액은 제거하고 세포 펠릿(pellet)만을 회수하였으며 Bacterial lysis buffer 998 ㎕와 2 ㎕ lysozyme (10 mg/ml)을 혼합한 용액 100 ㎕를 세포 펠릿에 첨가하여 10분간 세포 용해를 수행하였다. 이후, 12000 rpm에서 15분간 원심분리를 수행함으로 수용성 단백질만을 분리 진행하였다. 또한, 초음파처리 방법은 다음과 같이 진행하였다. 원심 분리 후, 상층액은 제거하고 세포 펠릿(pellet)만을 회수하였으며 이를 1.0 X PBS (Phosphate buffered saline) 완충용액에 재부유(resuspension)하고 이를 초음파처리 장비를 이용하여 세포 용해를 수행하고 12,000 rpm에서 15분간 원심분리를 수행함으로 수용성 단백질만을 분리 진행하였다.
< 실시예 3> 프로브에 의한 미생물 검출 방법
상기 실시예 1에서 제조된 이중가닥 프로브를 세균 배양액에서 추출한 조추출물 100 ㎕와 함께 반응시킨 후, 형광발색단에 의한 방출 파장 스펙트럼을 측정하였다.
또한, 상기 제조된 이중가닥 프로브를 세균 배양액에서 추출한 조추출물 100 ㎕와 함께 37℃에서 반응시키면서 방출 파장 520 nm에서 일정시간 간격으로(30 sec.) 형광 세기를 측정하여 반응이 진행되는 동안 형광 값의 변화를 측정하였다.
< 실시예 4> 미생물 검출 확인
104 CFU/100 ㎕, 105 CFU/100 ㎕, 106 CFU/100 ㎕의 농도에 따른 세균 조추출물에 이중가닥 프로브 (20 pmole)를 30분 동안 처리하였다. 그 결과를 도 2에 나타내었다. 도 2에 나타난 바와 같이, 형광발색단의 방출파장 영역에서 세균 배양액에서 추출한 조추출물 농도가 높을수록 형광 세기가 높아지는 것을 확인할 수 있었다. 반복 실험 결과 마찬가지로 조추출물의 농도에 따라 형광 세기가 높아지는 것을 확인하였다.
첨가된 이중가닥 프로브는 핵산분해에 따라 퀀쳐와 분리된 형광발색단에 측정장비에서 에너지를 부여함으로써 ATP 측정 방법과 달리 어떠한 첨가물을 넣어주지 않아도 광 신호를 지속적으로 측정할 수 있는 장점이 있다. 이를 증명하기 위해, 조추출물과 이중가닥 프로브를 혼합한 후, 시간에 따른 형광 세기의 변화를 측정하였다. 그 결과를 도 3에 나타내었다.
도 3에 나타난 바와 같이, 103 CFU/100 ㎕ 농도의 시료에서도 형광 세기 값이 줄어들지 않고 시료에 남아있는 조출물에 의하여 지속적으로 프로브의 형광발색단이 퀀쳐와 분리됨으로 인하여 오히려 형광 세기가 지속적으로 증가하는 것을 관찰하였다. 형광 세기의 증가 비율은 시간이 경과되어도 지속적으로 유지되고 있으며, 반복실험 결과, 증가 기울기 값은 조추출물 농도에 따라 일정하게 유지됨을 확인하였다 (R2 값≒0.85).
그에 반하여 대조군인 이중가닥 프로브만 존재하는 시료에서는 기울기 값이 0.1이하에서 유지되는 것을 확인할 수 있어, 시간이 경과되어도 형광 세기가 세포 존재 시 보다 증가하지 않고 있음을 확인하였다.
생존 세포와 사멸된 세포 각각의 반응을 확인하기 위하여 대장균을 LB 배지에 배양한 후, 배양액 일부를 95℃에서 5분간 열처리하였다. 열처리한 배양액과 처리하지 않은 배양액으로부터 각각 106 CFU/100 ㎕에 해당하는 조추출물을 회수하여 이중가닥 프로브 처리 및 루시퍼라아제(luciferase) 및 ATP를 이용한 미생물 양을 측정하였다. 그 결과를 도 4 및 도 5에 나타내었다.
도 4에 나타난 바와 같이, 이중가닥 프로브 처리에서는 열 처리된 세포의 조추출물 시료에서 확연하게 형광값이 줄어드는 것을 확인하였다. 그에 반하여, 도 5에 나타난 바와 같이, ATP 측정에서는 사멸된 미생물 균주의 발광 세기 값이 줄어들지 않음을 확인할 수 있었다.
< 실시예 5> 본 프로브의 구성적 특징 확인
본 발명자들은 본 발명의 이중가닥 프로브의 구성적 우수성을 확인하기 위하여 추가적으로 단일가닥 프로브 및 미스매치 뉴클레오티드 수를 변화시킨 프로브를 제작하여 각 미생물 검출 정도를 비교하였다.
본 실시예에서 제작된 프로브들의 서열은 다음과 같다:
- 18 mer 길이의 단일가닥 프로브 서열 (SEQ ID NO:3) 5'- CCA CAG TCA CAT ACT CCA -3';
- 30 mer 길이의 단일가닥 프로브 서열 (SEQ ID NO:4) 5'- AGT GTA CCA GCT GCA TGA CCT CTA AGT AGT -3';
- 36 mer 길이의 이중가닥 프로브 서열 (상술한 SEQ ID NOs:1 및 2);
- 44 mer 길이의 이중가닥 프로브 센스 서열 (SEQ ID NO:5) 5'- ATC ATC TTC CCT CCC CGC ACC TAA AGG GTG CGG GGA GGG AAG AT -3'; 및
- 44 mer 길이의 이중가닥 프로브 안티센스 서열 (SEQ ID NO:6) 5'- ATC TTC CCT CCC CGC ACC CTA TTG GTG CGG GGA GGG AAG A -3'.
(밑줄은 미스매치 뉴클레오티드들을 가리킨다).
36 mer 및 44 mer 이중가닥 프로브에 있어서, 안티센스의 경우 접착 말단을 형성시키기 위해 36 mer 및 44 mer 길이의 센스에 비해 짧게 설계하였으므로, 실제로는 해당 숫자의 길이가 아니나, 이중핵산 가닥 프로브를 만들기 위한 안티센스이므로 명칭 표기에 있어서 혼동을 피하기 위하여 동일하게 명명하였다.
5-1. E. coli 에서의 프로브 종류 별 검출 비교 확인
5-1-1. 프로브의 구조 별 형광 세기 측정
본 이중가닥 프로브(double strand probe)의 이중 구조에 대한 우수성을 확인하기 위하여, 단일가닥 프로브를 제작하여 다음과 같이 E. coli 검출을 측정하였다.
용해 완충액(lysis buffer)으로 용해한 E. coli (105CFU)를 각각 18 mer와 30 mer의 단일가닥(single strand) 36 mer와 44 mer의 이중가닥 프로브(double strand probe)에 처리한 후 37℃에서 30분 동안 반응시킨 후에 형광 세기를 측정하였다.
그 결과, 도 6에 나타낸 바와 같이, 단일가닥 프로브(single strand probe)에서는 형광 세기가 거의 증가하지 않은 반면, 36 mer의 이중가닥 프로브(double strand probe)에서 형광 시그널이 가장 크게 증가함을 확인하였다.
5-1-2. 프로브의 미스매치 뉴클레오티드 수 별 형광 세기 측정
본 이중가닥 프로브(double strand probe)의 미스매치 수에 대한 우수성을 확인하기 위하여, 미스매치 뉴클레오티드 수를 변화시킨 프로브를 제작하여 다음과 같이 E. coli 검출을 측정하였다.
이중가닥 프로브(double strand probe)의 중간에 미스매치(mismatch) 서열을 넣어, 단일가닥 엔도뉴클레아제(single strand endonuclease)가 반응하도록 프로브를 디자인하였다. 이 때 미스매치된 염기 서열의 양에 따른 효과를 확인하기 위해, 용해 완충액로 용해한 E. coli (105CFU)를 각각의 probe에 처리하여 37℃에서 30분 동안 반응시킨 후, 형광 세기를 측정하였다.
그 결과, 도 7에 나타낸 바와 같이, 미스매치가 없는(0 mer) 프로브보다 미스매치가 존재하는 프로브에서 형광 세기가 크게 증가했으며, 그 중 3 mer의 미스매치가 있는 프로브에서 형광 세기가 가장 크게 증가하였다.
5-1-3. 생균 및 사균에서의 형광 시그널 측정
본 이중가닥 프로브(double strand probe)의 위양성(false positive)에 대한 우수성을 확인하기 위하여, 다음과 조건 하에서 생균 및 사균 E. coli의 검출을 측정하였다.
E. coli (105CFU)를 각각 100℃에서 30분 동안 가열하거나, 70% EtOH와 락스를 밤새 처리하여 살균시켰다. 각각의 살균 샘플과 생균 샘플을 프로브에 처리하여 증가된 형광 세기를 측정하였다.
그 결과, 도 8에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 프로브의 경우 살아있는 세포에서만 형광 시그널이 크게 증가하였으며 살균샘플에서는 시그널이 크게 떨어짐을 확인하였다.
반면, 대표적인 기존 ATP-기반 미생물 오염도 측정 장비인 Kikkoman 기기로 측정했을 땐, 살균 샘플에서도 살아있는 세포의 시그널이 비슷하거나 오히려 더 증가하였다.
따라서, 본 발명의 프로브를 포함하는 미생물 오염도 검출 기술을 통해 살아있는 미생물만을 선택적으로 검출할 수 있음을 확인하였다.
5-1-4. 세포 수에 따른 형광 강도(intensity) 측정 결과
본 이중가닥 프로브(double strand probe)의 민감도에 대한 우수성을 확인하기 위하여, 다음과 조건 하에서 E. coli의 검출을 측정하였다.
살아있는 E. coli 세포들을 농도 별로 프로브에 처리하여 37℃에서 30분 동안 반응시킨 후, 형광 세기를 측정하였다.
그 결과, 도 9에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 프로브를 포함하는 미생물 오염도 검출 기술을 통해서 약 104CFU의 오염 정도부터 검출할 수 있음을 확인하였다.
일반적인 미생물에 대한 오염기준은 105CFU 이상의 미생물이 검출됐을 때 오염으로 판단하며, 통상적으로 이용되는 기존 검출 장비인 Kikkoman의 경우도 103CFU부터 분석 가능하다고 하지만, 실제 측정 시 104CFU부터 유의성 있는 측정값을 보인다는 점을 고려하면, 본 발명의 프로브를 이용한 미생물 오염도 검출기술은 기존 검출 방법과 유사한 민감도 수준으로 신속하고 용이하게 미생물을 검출할 수 있다는 것을 의미한다.
5-2. S. aureus 에서의 세포 수에 따른 형광 강도(intensity) 측정 결과
본 이중가닥 프로브(double strand probe)의 민감도에 대한 우수성을 재확인하기 위하여, E. coli의와 동일한 조건하에서 S. aureus의 검출을 측정하였다.
5-1-4와 같이 살아있는 S. aureus 세포들을 농도 별로 프로브에 처리하여 37℃에서 30분 동안 반응시킨 후, 형광 세기를 측정하였다.
그 결과, 도 10에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 프로브를 활용한 미생물 오염도 검출 기술을 통해서 S. aureus 역시 약 104CFU의 오염 정도부터 검출할 수 있음을 확인하였다.
따라서, 본 발명의 프로브를 활용한 미생물 오염도 검출 기술을 이용하면 그람-음성 박테리아 또는 그람-양성 박테리아 모두를 위양성 시그널 없이 신속하며 용이하게 검출할 수 있다.
<110> BioNano Health Guard Research Center <120> Composition for Detecting Microbial Contamination Comprising an Agent for Detecting Nuclease in Microorganism and Uses Thereof <130> NHG1-4p-1 <150> KR 1020150049614 <151> 2015-04-08 <160> 6 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Double nucleic acid probe sense <400> 1 acattaagtg taccagctgc atgaaagtac ttaata 36 <210> 2 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Double nucleic acid probe antisense <400> 2 tattaagtac tttcatgcaa acggtacact taata 35 <210> 3 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> single nucleic acid probe <400> 3 ccacagtcac atactcca 18 <210> 4 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> single nucleic acid probe <400> 4 agtgtaccag ctgcatgacc tctaagtagt 30 <210> 5 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> double nucleic acid probe sense <400> 5 atcatcttcc ctccccgcac ctaaagggtg cggggaggga agat 44 <210> 6 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> double nucleic acid probe antisense <400> 6 atcttccctc cccgcaccct attggtgcgg ggagggaaga 40

Claims (15)

  1. 뉴클레아제를 검출하는 제제를 포함하는 살아있는 미생물 오염 검출용 조성물로서,
    상기 뉴클레아제를 검출하는 제제는 31 mer 내지 40 mer 길이의 이중가닥 올리고뉴클레오티드로 이루어진 프로브이며;
    상기 이중가닥 올리고뉴클레오티드는, 5' 또는 3' 말단에 평활 말단 (blunt end)이 존재하며; 상기 평활 말단 (blunt end)이 존재하는 말단의 반대편 말단에 접착 말단 (sticky end)이 존재하고; 상기 평활 말단과 접착 말단 사이에 1 내지 10 개의 핵산 미스매치 (mismatch)가 존재하며; 상기 양 말단의 사이에 형광물질 및 퀀쳐 (quencher)가 부착된 것을 특징으로 하는, 조성물.
  2. 청구항 1에 있어서,
    상기 이중가닥 올리고뉴클레오티드는 서열번호 1 및 2에 기재된 염기 서열로 구성된 이중가닥 또는 서열번호 5 및 6에 기재된 염기서열로 구성된 이중가닥인 것을 특징으로 하는, 조성물.
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 삭제
  7. 삭제
  8. 삭제
  9. 삭제
  10. 삭제
  11. 청구항 1에 있어서,
    상기 형광물질은 발광 분자, 금속 이온, 착화합물, 유기염료, 도체, 반도체, 부도체, 양자점 (quantum dot), 또는 양자선(quantum wire)인 것을 특징으로 하는, 조성물.
  12. 청구항 1에 있어서,
    상기 퀀쳐는 BHQ(Black Hole Quencher)-1, DABCYL, 이클립스(Eclipse), TAMRA, QSY-7, BHQ(Black Hole Quencher)-2, BHQ(Black Hole Quencher)-3, 및 금나노입자 (Gold nano-particle)로 이루어진 군에서 선택되는 1 종 이상인 것을 특징으로 하는, 조성물.
  13. 청구항 1, 2, 11 및 12 중 어느 한 항의 조성물을 포함하는, 살아있는 미생물 오염 검출용 키트.
  14. 청구항 1, 2, 11 및 12 중 어느 한 항의 조성물을 시료에 처리하는 단계; 및상기 시료에서 형광발색을 확인하는 단계를 포함하는, 살아있는 미생물의 오염 검출 방법.
  15. 삭제
KR1020160042967A 2015-04-08 2016-04-07 뉴클레아제를 검출하는 제제를 포함하는 미생물 오염 검출용 조성물 및 그의 이용 KR101672380B1 (ko)

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