KR20190123567A - 형광염기유사체를 포함하는 분할 g-쿼드로플렉스를 이용한 표적 dna 검출방법 - Google Patents

형광염기유사체를 포함하는 분할 g-쿼드로플렉스를 이용한 표적 dna 검출방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 G-쿼드로플렉스로부터 분할된 2개의 세그먼트를 포함하는 표적 물질 검출용 키트에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 상기 키트를 시료에 처리하는 단계를 포함하는 표적 물질 존재 여부 확인하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 분할 G-쿼드로플렉스 DNA에 존재하는 형광 염기 유사체의 형광신호 차이를 이용하여 손쉽고 빠르게 표적 물질을 검출할 수 있으며, 다양한 생체 물질 및 화학 물질의 검출에 활용될 수 있다.

Description

형광염기유사체를 포함하는 분할 G-쿼드로플렉스를 이용한 표적 DNA 검출방법 {Sequence-specific DNA detection method using a fluorescent nucelobase analogue-containing split G-quadruplex}
본 발명은 분할 G-쿼드로플렉스 DNA에 존재하는 형광 염기 유사체(fluorescent nucleobase analogue)의 형광 신호 변화를 이용한 핵산 검출기술에 관한 것으로, 보다 상세하게는, 검출하고자 하는 표적 핵산이 존재하지 않는 경우, 분할 G-쿼드로플렉스는 불안정한 구조를 이루고, 형광 염기 유사체는 주변 구아닌 (guanine)염기에 의한 퀀칭(quenching)에 의해 낮은 형광 신호를 발생하게 된다. 반면, 표적 핵산이 존재하는 경우에는, 분할 G-쿼드로플렉스 양쪽 말단의 표적 핵산과 상보적인 부분이 표적 핵산과의 결합을 통하여 안정화된 G-쿼드로플렉스를 형성하게 되고, 주변 구아닌 염기에 의한 퀀칭 영향이 감소되어 형광 염기 유사체는 높은 형광 신호를 발생하게 된다. 이러한 차이를 이용하여 손쉽게 표적 핵산을 검출 할 수 있다.
핵산 검출 기술은 질병 진단, 환경 감시, 범죄 수사와 같이 다양한 분야에서 중요한 역할을 담당하고 있으며, 민감도와 특이도가 우수하고, 가격경쟁력이 우수한 새로운 검출 기술이 계속적으로 개발되고 있는 상황이다. 대표적인 핵산 검출 기술로는 형광 및 소광제(quencher) 물질이 표지된 헤어핀(hairpin) 구조의 DNA 프로브인 분자비콘(molecular beacon)에 기반을 두고 있다. 이 기술은 표적 핵산의 존재에 의한 분자비콘의 구조 변화에 따른 형광신호 생성의 유무를 확인함으로써 이루어진다(Tyagi et al., Nature biotechnology, 14:303-308, 1996; Masuko et al., Nucleic Acids Research, 26:5409-5416, 1998). 이 기술은, 추가적인 분리 과정없이 표적 핵산의 분석이 가능하기 때문에 널리 이용되고 있으며, 다양한 형태의 분자비콘 기반 핵산 분석 기술이 개발되고 있다(Song et al., Angewandte Chemie-International Edition, 48:8670-8674, 2009; Wu et al., Biosensors & Bioelectronics, 26:3870-3875, 2011; Yeh et al., Nano Letters, 10:3870-3875, 2011). 하지만, 분자비콘의 양 말단에 각각 형광체와 소광제로 수식을 진행하는 과정에서 고비용이 발생하는 문제점을 가지고 있다.
상기한 배경기술로서 설명된 사항들은 본 발명의 배경에 대한 이해 증진을 위한 것일 뿐, 이 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 이미 알려진 종래기술에 해당함을 인정하는 것으로 받아들여져서는 안 될 것이다.
본 발명자들은 기존 핵산 검출 기술들의 문제점을 해결하며, 가격경쟁력이 우수하고, 정확하게 표적 핵산의 유무를 감지하는 기술을 개발하고자 예의 노력을 하였다. 그 결과, G-쿼드로플렉스 DNA를 2개의 세그먼트로 분할하고, 이 중 하나에 형광 염기 유사체를 도입함으로써 형광 신호가 표적 핵산에 의해 조절될 수 있도록 하였으며, 분할 비율을 변화시켜 표적 핵산에 의한 최적의 신호 상승을 나타내는 비율을 찾아냄으로써 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 G-쿼드로플렉스(G-quadruplex) 구조를 형성할 수 있는 두 개의 분할된 세그먼트(segment)를 포함하는 표적 물질 검출용 키트를 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 표적 물질 검출용 키트를 포함하는 바이오 센서를 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 표적 물질 검출용 키트를 시료에 처리하는 단계를 포함하는 표적 물질 존재 여부 확인하는 방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 표적 물질 검출용 키트의 제조방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 첫 번째 서열 세그먼트(first sequence segment) 및 두 번째 서열 세그먼트(second sequence segment)를 포함하는 표적 물질 검출용 키트로서,
상기 첫 번째 서열 세그먼트는 ‘GxHyNz’서열을 포함하는 G-풍부 서열(G-rich sequence)이며;
상기 두 번째 서열 세그먼트는 ‘GxHy’서열을 포함하는 G-풍부 서열(G-rich sequence)이며;
상기 ‘GxHyNz’서열 또는 ‘GxHy’서열에서 G는 구아닌 또는 구아닌 유도체, H는 구아닌이 아닌 핵산 염기, N은 형광 염기 유사체(fluorescent nucleobase analogue)이고, G, H, N은 순열에 의해서 무작위로 배열되며, x는 1 내지 20의 정수, y는 0 내지 10의 정수, z는 1 내지 2의 정수이고, 단, x+y+z의 합은 50을 넘지 않으며;
상기 첫 번째 서열 세그먼트 및 두 번째 서열 세그먼트의 일 말단에는 표적물질과 결합할 수 있는 물질이 결합되어 있으며;
표적 물질 존재 시, 상기 첫 번째 및 두 번째 서열 세그먼트는 G-쿼드로플렉스(G-quadruplex) 구조를 형성하며, 동시에 형광 신호를 나타내는 것을 특징으로 하는 표적 물질 검출용 키트를 제공한다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 첫 번째 서열 세그먼트(first sequence segment) 및 두 번째 서열 세그먼트(second sequence segment)를 제조하는 단계를 포함하는 표적 물질 검출용 키트의 제조방법으로서,
상기 첫 번째 서열 세그먼트는 ‘GxHyNz’서열을 포함하는 G-풍부 서열(G-rich sequence)이며;
상기 두 번째 서열 세그먼트는 ‘GxHy’서열을 포함하는 G-풍부 서열(G-rich sequence)이며;
상기 ‘GxHyNz’서열 또는 ‘GxHy’서열에서 G는 구아닌 또는 구아닌 유도체, H는 구아닌이 아닌 핵산, N은 형광 염기 유사체(fluorescent nucleobase analogue)이고, G, H, N은 순열에 의해서 무작위로 배열되며, x는 1 내지 20의 정수, y는 0 내지 10의 정수, z는 1 내지 2의 정수이고, 단, x+y+z의 합은 50을 넘지 않으며;
상기 첫 번째 서열 세그먼트 및 두 번째 서열 세그먼트의 일 말단에는 표적물질과 결합할 수 있는 물질이 결합되어 있으며;
표적 물질 존재 시, 상기 첫 번째 및 두 번째 서열 세그먼트는 G-쿼드로플렉스(G-quadruplex) 구조를 형성하며, 동시에 형광 신호를 나타내는 것을 특징으로 하는 표적 물질 검출용 키트의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 표적 물질 검출용 키트를 포함하는 바이오 센서를 제공한다.
본 발명은 분할(split) G-쿼드로플렉스 DNA에 존재하는 형광 염기 유사체의 형광신호 차이를 이용한 핵산 검출기술로, 기존의 분자비콘 기반의 핵산 검출기술과 비교하여, 가격이 저렴하고 손쉽고 빠르게 분석 결과를 제공할 수 있다. 또한, 본 발명은 표적 핵산을 포함하는 다양한 바이오 마커의 검출에 효과적으로 적용될 수 있는 센서 기술을 제공한다. 또한, 분할 G-quadruplex DNA 양끝에 표적 물질에 결합할 수 있는 aptamer를 연결시켜주면 다양한 생체 물질 및 화학 물질의 검출에도 적용할 수 있으며, G-quadruplex의 형성에 영향을 주는 금속 이온의 검출에도 이용될 수 있다.
본 명세서에서 용어, “G-쿼드로플렉스” 또는 “G-quardruplex”는 구아닌(G)으로 대표적으로 언급되어지는 구아닌(guanine), 구아노신(guanosine), 2'-데옥시구아노신(2-deoxy-guanosine), 2'-오-메틸-구아노신(2'-O-methyl-guanosine), 2'-플루오로-구아노신(2'-F-guanosine), LNA(Locked Nucleic Acid)-구아노신, D-데옥시구아노신 및 D-구아노신 중에서 선택된 1종 또는 2종 이상 등이 풍부(G-rich)하여 특정 서열의 경우 4개의 구아닌이 한 평면에 위치하여 후그스텐(hoogsten) 형태의 수소결합을 이루어서 사중 나선구조를 가지게 되는 올리고뉴클레오티드를 말하며, 여기에 형광을 나타낼 수 있는 형광 염기 유사체를 도입하도록 합성된다.
본 발명의 첫 번째 서열 세그먼트(first sequence segment) 및 두 번째 서열 세그먼트(second sequence segment)는 표적 물질 존재시 G-쿼드로플렉스를 형성한다. 상기 표적 물질은 제한되지 않으며, 바람직하게는 핵산, 단백질, 화합물, 금속 또는 금속이온을 포함한다.
상기 표적 물질이 핵산(표적 핵산)일 경우, 상기 첫 번째 서열 세그먼트에는 표적 핵산의 서열 중 일부와 상보적인 서열이 결합되어 있고; 상기 두 번째 서열 세그먼트에는 상기 표적 핵산의 서열 중 다른 일부와 상보적인 서열이 결합되어 있으며; 표적 핵산 존재 시, 상기 첫 번째 및 두 번째 서열 세그먼트는 G-쿼드로플렉스(G-quadruplex) 구조를 형성하며, 동시에 형광 신호를 나타낼 수 있다.
또한, 상기 표적 물질이 핵산(표적 핵산)일 경우, 상기 첫 번째 서열 세그먼트에 결합되어 있는 표적 핵산의 서열 중 일부와 상보적인 서열 대 상기 두 번째 서열 세그먼트에 결합되어 있는 표적 핵산의 서열 중 다른 일부와 상보적인 서열의 비율은 2:1 내지 1:2일 수 있다.
상기 표적 핵산의 서열 중 일부 및 다른 일부 서열의 합은 제한되지 않으나, 바람직하게는 10 내지 50 mer, 보다 바람직하게는 10 내지 30 mer인 것이다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 첫 번째 서열 세그먼트에 결합되어 있는 표적 핵산의 서열 중 일부와 상보적인 서열은 상기 첫 번째 서열 세그먼트의 5’부위에 결합되어 있는 것이다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 두 번째 서열 세그먼트에 결합되어 있는 표적 핵산의 서열 중 다른 일부와 상보적인 서열은 상기 두 번째 서열 세그먼트의 3’부위에 결합되어 있는 것이다.
본 발명에서, 상기 GxHyNz’서열 또는 ‘GxHy’서열에서 H는 구아닌이 아닌 핵산으로 특별히 제한되지 않으며, 바람직하게는 아데닌(Adenine, A), 티민(Thymine, T), 시토신(Cytosine, C) 또는 이들의 유도체, 보다 바람직하게는 티민이다.
본 발명에서, 상기 GxHyNz’서열 또는 ‘GxHy’서열에서 N은 형광 염기 유사체(fluorescent nucleobase analogue)로 특별히 제한되지 않으며, 바람직하게는 2-AP(2-aminopurine), PyC(pyrrolocytosine), 8vdA(8-vinyl-deoxyadenosine), 2PyG(8-(2-pyridyl)-2′-deoxyguanosine), 3-MI(3-methyl isoxanthopterin), C8-나프탈렌 치환된 아데닌(cnA, dnA 등), 피리미딘 유사체( tC, tCO 등) 등을 포함하며, 보다 바람직하게는 2-AP이다.
본 발명의 첫 번째 서열 세그먼트 및 두 번째 서열 세그먼트가 형성하는 G-쿼드로플렉스의 서열은 당업계에 공지된 다양한 서열을 이용할 수 있다. 예를 들어, GGGGGGTGGGTGGG(T30695), GGGTGGGGGGTTGGG(PW17), GGGTGGGTGGGTGGGT, TTTGGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGTGG, GGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGTGG, ACCTGGGGGAGTATTGCGGAGGAAGGT, TGGGTAGGGCGGGTTGGGAAA, TTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGG, GGTTGGTGTGGTTGG 등의 G-쿼드로플렉스의 서열을 첫 번째 서열 세그먼트 및 두 번째 서열 세그먼트로 분할하고, 상기 첫 번째 서열 세그먼트에 형광 염기 유사체를 삽입함으로써 본 발명의 표적 물질 검출용 키트를 제조할 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 첫 번째 서열 세그먼트가 포함하는 ‘GxHyNz’서열 및 상기 두 번째 서열 세그먼트가 포함하는 ‘GxHy’서열은 x가 1 내지 10의 정수, y가 0 내지 3의 정수, z가 1의 정수이고, 단, x+y+z의 합은 20을 넘지 않는 것이다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 첫 번째 서열 세그먼트는 ‘GxHyNz’서열로 이루어지며, 상기 ‘GxHyNz’서열은 5’- GGG(2-AP) - 3’이거나 상기 5’- GGG(2-AP) - 3’의 3’말단에 G 또는 H가 순열에 의해서 무작위로 배열된 서열인 것이다.
본 발명의 일실시예에 따르면, 상기 첫 번째 서열 세그먼트가 5’- GGG(2-AP) - 3’이거나 상기 5’- GGG(2-AP) - 3’의 3’말단에 G 또는 H가 순열에 의해서 무작위로 배열된 서열의 경우(T30695 기반)가 5’- GGGT(2-AP) - 3’이거나 상기 5’- GGGT(2-AP) - 3’의 3’말단에 G 또는 H가 순열에 의해서 무작위로 배열된 서열의 경우(PW17 기반)보다 형광 신호가 2 배 이상 높았다(도 2).
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 첫 번째 서열 세그먼트에 포함된 G(구아노신 또는 구아노신 유도체)의 개수는 상기 두 번째 서열 세그먼트에 포함된 G의 개수 이상인 것이다.
본 발명의 일실시예에 따르면, 상이한 분할비를 함유하는 세그먼트 조합을 사용하여 표적 DNA를 분석한 결과, 신호 대 백그라운드 비인 (F-F0)/F0는 분할 비율에 크게 의존했으며, 첫 번째 서열 세그먼트(S1)에 더 많은 구아닌 염기를 위치시키면 더 큰 표적 DNA에 의한 형광신호 증가가 유도되었다(도 4).
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 첫 번째 서열 세그먼트에 포함된 G(구아노신 또는 구아노신 유도체) 대 상기 두 번째 서열 세그먼트에 포함된 G의 비율은 1:1 내지 3:1 인 것이다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 첫 번째 서열 세그먼트는 서열목록 제3서열, 제5서열 및 제9서열로 구성된 군으로부터 선택되는 것이다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 두 번째 서열 세그먼트는 서열목록 제4서열, 제6서열 및 제10서열로 구성된 군으로부터 선택되는 것이다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 시료 내에 표적 물질이 존재하는지 여부를 확인하기 위하여, 상기 표적 물질 검출용 키트를 상기 시료에 처리하는 단계를 포함하는 표적 물질 존재 여부 확인 방법을 제공한다.
본 명세서에서 용어, “시료”는 표적 물질 자체 또는 표적 물질을 포함하거나 포함하지 않는 물질로서 생체로부터 분리된 시료(혈액, 혈장, 뇨, 타액 등), 자연적 또는 인위적으로 혼합된 시료 등을 총칭하는 의미로 사용되며, 시료 내에 표적 물질이 존재하는지 여부를 확인하기 위하여, 상기 표적 물질 검출용 키트를 상기 시료에 처리하여 G-쿼드로플렉스를 형성하는 지 여부를 확인함으로써 상기 표적 물질의 존재 여부를 확인할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 본 발명의 표적 물질 검출용 키트를 이용하여 Chlamydia trachomatis(CT) 유래의 표적 DNA를 탐지한 결과, 대조군으로 사용된 Mycoplasma genitalium(MG), Staphylococcus aureus(SA), Neisseria gonorrheae(NG), Herpes Type 1 Virus(HSV1) 및 Klebsiella pneumonia(KP)에서 유래 한 비표적 DNA의 검출능과 비교하여 상당한 정도의 형광 강도 세기가 증가하였음을 확인하였다(도 8).
본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:
(ⅰ) 본 발명은 G-쿼드로플렉스로부터 분할된 2개의 세그먼트를 포함하는 표적 물질 검출용 키트를 제공한다.
(ⅱ) 또한, 본 발명은 상기 키트를 시료에 처리하는 단계를 포함하는 표적 물질 존재 여부 확인하는 방법을 제공한다.
(ⅲ) 본 발명의 표적 물질 검출용 키트를 활용하면, 분할 G-쿼드로플렉스 DNA에 존재하는 형광 염기 유사체의 형광신호 차이를 이용하여 손쉽고 빠르게 표적물질 검출 결과를 제공할 수 있으며, 다양한 생체 물질 및 화학 물질의 검출에 활용될 수 있다.
도 1은 2-AP를 포함하는 G-quadruplex(AG)를 핵심 검출 주체로 사용하는 새로운 DNA 감지 시스템의 기본 작동 원리이다. S1 및 S2는 두 개의 분리된 G- 풍부 세그먼트로서 표적 특이적 돌출 서열에 연결되어 있으며, S1만이 2-AP를 포함하고 있다.
도 2는 표적 DNA-유도 형광 증가에 대한 G-quadruplex 서열의 효과를 나타낸다. 잘 알려진 G-quadruplex 서열(PW17 및 T30695)을 이용하여 시험하였다. S1, S2 및 표적 DNA의 최종 농도는 각각 2 μM, 2 μM 및 200 nM이었다.
도 3은 G-quadruplex 분할 비율이 표적 DNA-유도 형광 증가에 미치는 영향을 나타낸 것이다. (a)는 표적 DNA의 존재 하에서 상이한 분할비(1:1, 3:1, 1:3, 2:1, 및 1:2)를 갖는 2-AP 함유하는 분할 G-quadruplex 구조의 모식도를 나타낸다. (b)는 신호-배경비, (F-F0)/F0에 대한 것으로, 여기서 F와 F0는 각각 표적 DNA의 부재 및 존재 하에서의 형광 신호이다. S1, S2 및 표적 DNA의 최종 농도는 2 μM이었다.
도 4는 표적 DNA-유도 형광 증가에 대한 G-quadruplex 분할비의 효과를 나타낸다. (a-e)는 (1:1), (3:1), (1:3), (2:1), (1:2)의 분할비를 갖는 분할 G-quadruplex에 포함된 2-AP의 형광 강도를 나타낸다. S1, S2 및 표적 DNA의 최종 농도는 2 μM이었다.
도 5는 본 발명에서 개발한 새로운 센서의 검출 효율을 나타낸다. (a)는 형광 강도이고 (b)는 상이한 조건 하에서 샘플에 대한 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 이미지를 나타낸다(1: 표적 DNA, 2: S1, 3: S2, 4: S1+S2, 5: 표적 DNA+S1+S2). S1, S2 및 표적 DNA의 최종 농도는 2 μM이었다.
도 6은 다른 길이(26, 36 및 46-mer)의 표적 DNA 검출결과를 나타낸다. Inset은 신호 대 배경 비율 (F-F0)/F0을 나타낸다. S1, S2 및 표적 DNA(26, 36 및 46-mer)의 최종 농도는 2 μM이었다.
도 7은 본 발명에서 개발한 새로운 센서의 감지 감도를 나타낸다. (a)는 신호 - 배경 비율 및 (b) (F-F0)/F0 대 표적 DNA 농도 (0-1000 nM)의 플롯의 선형 범위(Linear range)를 나타낸다. S1과 S2의 최종 농도는 2 μM이었다.
도 8은 본 발명에서 개발한 새로운 센서의 감지 선택도를 나타낸다. 표적 DNA는 Chlamydia trachomatis(CT)이며 비-표적 DNA는 Mycoplasma genitalium(MG), Staphylococcus aureus(SA), Neisseria gonorrheae(NG), Herpes 1 형 바이러스(HSV1), Klebsiella pneumoniae(KP)였다. S1, S2, 표적 DNA 및 비-표적 DNA의 최종 농도는 2 μM이었다.
이하, 실시 예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시 예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시 예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실험재료 및 방법
1. 실험재료
본 연구에 사용된 모든 DNA 샘플은 Bioneer(대전, 한국)에 의해 합성되었고 Bio-RP 카트리지 정제를 통해 정제되었다. 모든 DNA 샘플의 서열은 표 1에 열거되어있다. Tris(hydroxymethyl)aminomethane (Tris), 초산(CH3COOH), 초산 칼륨 (CH3CO2K) 및 질산 마그네슘(Mg(NO3)2)는 Sigma-Aldrich(St. Louis, Mo, USA)에서 구입하였다. 다른 모든 화학 물질은 분석 수준을 만족하여 더 이상의 정제없이 사용하였다. DNase/RNase-free 증류수(DW)는 Bioneer에서 구입하여 사용하였다.
Name Sequence
PW17
S1 (1:1)a 5’-AAGCTGCAATCC GGGT(2-AP)GGG-3’(서열목록 제1서열)
S2 (1:1)a 5’-GGGTTGGG CTTTTAAGATAACC-3’(서열목록 제2서열)
T30695
S1 (1:1)a 5’-AAGCTGCAATCC GGG(2-AP)GGG-3’(서열목록 제3서열)
S2 (1:1)a 5’-TGGGTGGG CTTTTAAGATAACC-3’(서열목록 제4서열)
S1 (3:1)a 5’-AAGCTGCAATCC GGG(2-AP)GGGTGGG-3’(서열목록 제5서열)
S2 (3:1)a 5’-TGGG CTTTTAAGATAACC-3’(서열목록 제6서열)
S1 (1:3)a 5’-AAGCTGCAATCC GGG(2-AP)-3’(서열목록 제7서열)
S2 (1:3)a 5’-GGGTGGGTGGG CTTTTAAGATAACC-3’(서열목록 제8서열)
S1 (2:1)a 5’-AAGCTGCAATCC GGG(2-AP)GGGTGG-3’(서열목록 제9서열)
S2 (2:1)a 5’-GTGGG CTTTTAAGATAACC-3’(서열목록 제10서열)
S1 (1:2)a 5’-AAGCTGCAATCC GGG(2-AP)G-3’(서열목록 제11서열)
S2 (1:2)a 5’-GGTGGGTGGG CTTTTAAGATAACC-3’(서열목록 제12서열)
CT (26 mer)b 5’-GGTTATCTTAAAAGGGATTGCAGCTT-3’(서열목록 제13서열)
CT (36 mer)b 5’-TGCGGGGTTATCTTAAAAGGGATTGCAGCTTGTAGT-3’(서열목록 제14서열)
CT (46 mer)b 5’-GCACGTGCGGGGTTATCTTAAAAGGGATTGCAGCTTGTAGTCCTGC-3’(서열목록 제15서열)
MG (26 mer) 5’-CTCAAGTATCTCAATGCTGTTGAGAA -3’(서열목록 제16서열)
SA (26 mer) 5’-TCAGACTATTATTGGTTGATACACCT -3’(서열목록 제17서열)
NG (26 mer) 5’-CTGCCGCCGATATACCTAGCAAGCTC -3’(서열목록 제18서열)
HSV-1 (26 mer) 5’-ATGCCTTCTTGGAGTACGTGGGTCAT -3’(서열목록 제19서열)
KP (26 mer) 5’-GCCGCCATTACCATGAGCGATAACAG -3’(서열목록 제20서열)
서열 a: 표적핵산의 전부 또는 일부와 결합가능한 상보서열을 각각 포함하는 S1과 S2는 표적핵산이 존재할 경우 결합하여 G-quadruplex 이룰 수 있다. 상기 서열에서 (#:#)는 G-quadruplex를 구성하는 뉴클레오타이드의 분할 비율을 나타내고, 2-AP는 삽입된 2-aminopurine을 나타내며, 이탤릭체의 뉴클레오타이드는 표적핵산의 상보서열을 나타내고, 볼드체는 G-quadruplex의 분할된 단편을 나타낸다.
서열 b: 서열 a와 결합가능한 표적핵산으로 상기 서열에서 밑줄(underlined) 뉴클레오타이드는 서열 a와 결합가능한 표적핵산의 부위를 나타낸다.
2. 서열 특이적인 DNA 검출
5 mM CH3CO2K와 10 mM Mg(NO3)2를 함유한 10 mM Tris- 아세테이트 완충액 (pH 7.0)에 2 μM의 S1, 2 μM의 S2(표 1) 및 다양한 농도의 DNA가 포함 된 용액(100 μL)을 90℃에서 5분간 가열시키고, 25℃(0.1℃/s)로 서서히 냉각시킨 다음, 25℃에서 30 분간 항온처리하였다. 마지막으로 각 용액을 검정색 96- 웰 플레이트에 넣은 후 마이크로 플레이트 리더(Spectramax iD5 multi-mode microplate reader, Molecular Devices, USA)를 사용하여 305 nm 및 375 nm의 여기 파장과 방출 파장으로 형광 강도를 측정했다.
3. 폴리아크릴아미드 겔 전기영동
반응 생성물은 1X TBE를 이동 완충제로 사용하여 130 V의 정전압에서 130분 동안 15% 폴리아크릴아미드 겔에서 분석하였다. GelRed(Biotium) 염색 후, UV trans-illuminator를 사용하여 겔을 스캔하였다.
4. 인간 혈청 내 서열특이적 DNA 검출
개발된 센서의 실제적인 적용 가능성을 확인하기 위해, 다양한 농도의 표적 DNA를 희석한 인간 혈청(1%)에 첨가하고, 상기 기술한 서열 특이적 DNA 검출을 위해 동일한 절차를 수행했다.
실험결과
2-AP를 포함하는 G-quadruplex(AG)를 핵심 검출 주체로 사용하는 새로운 DNA 감지 시스템의 기본 작동 원리는 도 1에 표현되어 있다. 센서에서 AG는 합리적으로 분할되어 표적 DNA에 반응하여 형광 증가가 최대 수준으로 나타나게 된다. AG의 각 G-풍부 세그먼트는 하나(S1)가 2-AP를 함유하고 다른 하나(S2)는 2-AP를 함유하지 않는 표적 특이적 돌출 서열(target specific overhang sequence, Li et al., 2018)을 함유하도록 고안되었다(표 1). 도 1에서 볼 수 있듯이, AG의 2개의 분할된 G-풍부 세그먼트는 표적 DNA의 존재 하에서만 활성 G-quadruplex 구조를 형성하며, 2-AP와 근처의 G 염기 간 스태킹 상호 작용을 차단하여 결과적으로 형광 강도의 드라마틱한 상승을 촉진한다.
다음으로, G-quadruplex의 서열이 2-AP가 포함된 분할 G-quadruplex(ASG)의 표적 DNA 유도 형광 증가에 어떠한 영향을 미치는지를 조사했다. PW17 및 T30695(서열 정보는 표 1 참조)와 같은 잘 알려진 G- 풍부 서열 각각을 1:1의 분할 비(split ratio)로 2 개의 세그먼트로 분할한 다음 표적 특이 돌출 서열에 연결하였다. 도 2에서 볼 수 있듯이, 표적 DNA 존재 하에서 T30695에서 유래한 split G-quadruplex는 PW17(Chen et al., 2015)의 경우보다 더 높은 신호 향상을 나타냈다. 다음으로, 분할비의 효과를 결정하기 위해, T30695는 구아닌 염기의 수에 기초하여 1:1, 3:1, 1:3, 2:1 및 1:2를 포함하는 5가지의 상이한 비율로 나누었다(도 3a). 이들 상이한 분할비를 함유하는 ASG를 사용하여 표적 DNA를 분석 한 결과, 신호 대 백그라운드 비인 (F-F0)/F0(여기서 F 및 F0는 각각 표적 DNA의 부재 및 존재 하에서의 형광 신호를 나타낸다)는 분할 비율에 크게 의존했다(도 3b). 구체적으로, ASG의 S1에 더 많은 구아닌 염기를 위치시키면 더 큰 표적 DNA에 의한 형광신호 증가가 유도된다. 놀랍게도, 표적 DNA 존재시 3:1의 분할비가 가장 큰 형광 강도 증가를 가져 오는데, 이 값은 자주 사용되는 1:1 분리 비의 값보다 훨씬 더 큰 값이었다(도 4).
다음으로, T30695에서 유도된 G-quadruplex 및 3:1 분할비로 최적화된 ASG 프로브를 포함하는 새로운 센서가 실제로 잘 작동하는지를 확인하기 위하여, 375 nm에서의 형광 강도(F375)인 2-AP의 최대 방출 파장을 측정하였다(도 5a). 예상한 바와 같이, 표적 DNA의 부재 하(도 5a)에서 센서로부터 발생하는 약한 형광 신호는 표적 DNA의 존재 하(도 5a)에서 현저하게 증가하였다. 또한 길이가 다른 표적 DNA(26, 36 및 46-mer) 모두 프로브에서 발생하는 형광 강도의 증가를 효과적으로 촉진하였다(도 6). 형광 강도의 이러한 변화는 탐침과 표적 DNA 상호 작용의 결과인 것으로, 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 분석의 결과에 의해 증명되었다. 도 5b)에서 볼 수 있듯이, 표적 DNA가 존재할 때 분할된 G-풍부 세그먼트는 새로운 전기영동 밴드를 생성하는데, 표적 DNA와 ASG의 분할된 세그먼트(S1과 S2)의 혼성화 결과물의 것과 위치가 일치하였다. 전반적으로, 형광 및 전기영동 결과는 표적 DNA가 효과적으로 ASGs에 결합하고 형광 세기의 수반되는 증가와 함께 활성 G-quadruplexes의 형성을 유도한다는 것을 확인하였다.
새로운 센서의 감도는 표적 DNA 농도의 함수로서 375 nm에서의 형광 세기를 측정함으로써 결정하였다(Lee 등, 2017). 도 7의 플롯에 표시된 결과는 신호 대 백그라운드 비율이 2 μM까지 표적 DNA 농도가 증가함에 따라 증가하고 2 μM을 초과하는 농도에서 약간 감소함을 나타내었다(도 7). 또한, 형광 증가 수준과 표적 DNA 농도(0-1000 nM 범위)간 우수한 선형 관계(R2 = 0.9987)가 나타났다. 본 센서 시스템은 분리 및/또는 세척 단계 없이 "혼합 및 판독" 형식을 사용하는 균질 분석이기 때문에 작동 방식이 간단하다는 장점을 갖는다.
다음으로, 상기 센서를 이용하여 Chlamydia trachomatis(CT) 유래의 표적 DNA 검출능을 Mycoplasma genitalium(MG), Staphylococcus aureus(SA), Neisseria gonorrheae(NG), Herpes Type 1 Virus(HSV1) 및 Klebsiella pneumonia(KP)에서 유래 한 비표적 DNA의 검출능과 비교 하였다. 도 8의 그래프에서 알 수 있듯이 표적 CT DNA가 있는 경우 형광 강도 상당히 증가하였지만, 다른 비표적 DNA가 있는 경우에는 무시할만한 수준이었다. 이 결과는 센서가 표적 DNA에 대해 매우 선택적임을 보여 주며, 서열 특이적인 DNA 혼성화가 활성화된 G-quadruplex 구조의 형성에 매우 중요하다는 것을 나타낸다.
마지막으로, 상기 센서의 실제 적용 가능성은 인간 혈청에서 표적 DNA를 결정하는데 사용하여 증명하였다. 인간 혈청 내에서 순환하는 cell-free DNA는 비침습성 질환 진단을 위한 새로운 표적 표지자로서 주목을 받고 있다. 모의 임상 샘플은 다른 농도의 표적 CT DNA를 인간 혈청에 넣고 준비한 다음, 위의 ASG 기반 분석 절차를 수행하였다. 도 8의 결과에서 알 수 있듯이, 0-1000 nM 범위의 표적 DNA 농도가 증가함에 따라 인간 혈청 샘플의 형광 강도는 선형적으로 증가하였다(R2 = 0.9937). 또한, 표적 DNA 농도는 관찰된 변동 계수(coefficient of variation , CV)가 10.3% 미만이고 회수율이 101% 내지 111%인 것으로 우수한 정밀도를 갖는 것으로 입증되었다(표 2). 상기 결과는 본 검출방법이 우수한 재현성 및 정확성을 갖고 있으며, 실제 임상 샘플에서 표적 DNA를 검출할 수 있는 잠재적인 가능성을 보여준다.
Added a (nM) Measured b (nM) SD c CV d (%) Recovery e (%)
50 50.5 0.367 0.726 101
100 111 11.5 10.3 111
250 269 16.4 6.12 107
a To measure the concentration of target DNA, a calibration curve was first created by using standards containing known concentrations of target DNA spiked in diluted human serum (1%). Based on the calibration curve, the F375 from the unknown samples was used to determine the concentration of target DNA present in human serum.
b Mean of three measurements.
c Standard deviation of three measurements.
d Coefficient of variation = SD/mean × 100.
e Measured value/added value × 100.
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
<110> KONKUK UNIVERSITY INDUSTRIAL COOPERATION CORP <120> Sequence-specific DNA detection method using a fluorescent nucelobase analogue-containing split G-quadruplex <130> HP7971 <160> 20 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 8 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PW17 S1 <220> <221> misc_feature <222> (5) <223> 2-AP <400> 1 gggtnggg 8 <210> 2 <211> 8 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PW17 S2 <400> 2 gggttggg 8 <210> 3 <211> 7 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> T30695 S1 (1:1) <220> <221> misc_feature <222> (4) <223> 2-AP <400> 3 gggnggg 7 <210> 4 <211> 8 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> T30695 S2 (1:1) <400> 4 tgggtggg 8 <210> 5 <211> 11 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> T30695 S1 (3:1) <220> <221> misc_feature <222> (4) <223> 2-AP <400> 5 gggngggtgg g 11 <210> 6 <211> 4 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> T30695 S2 (3:1) <400> 6 tggg 4 <210> 7 <211> 4 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> T30695 S1 (1:3) <220> <221> misc_feature <222> (4) <223> 2-AP <400> 7 gggn 4 <210> 8 <211> 11 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> T30695 S2 (1:3) <400> 8 gggtgggtgg g 11 <210> 9 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> T30695 S1 (2:1) <220> <221> misc_feature <222> (4) <223> 2-AP <400> 9 gggngggtgg 10 <210> 10 <211> 5 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> T30695 S2 (2:1) <400> 10 gtggg 5 <210> 11 <211> 5 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> T30695 S1 (1:2) <220> <221> misc_feature <222> (4) <223> 2-AP <400> 11 gggng 5 <210> 12 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> T30695 S2 (1:2) <400> 12 ggtgggtggg 10 <210> 13 <211> 26 <212> DNA <213> Chlamydia trachomatis <400> 13 ggttatctta aaagggattg cagctt 26 <210> 14 <211> 36 <212> DNA <213> Chlamydia trachomatis <400> 14 tgcggggtta tcttaaaagg gattgcagct tgtagt 36 <210> 15 <211> 46 <212> DNA <213> Chlamydia trachomatis <400> 15 gcacgtgcgg ggttatctta aaagggattg cagcttgtag tcctgc 46 <210> 16 <211> 26 <212> DNA <213> Mycoplasma genitalium <400> 16 ctcaagtatc tcaatgctgt tgagaa 26 <210> 17 <211> 26 <212> DNA <213> Staphylococcus aureus <400> 17 tcagactatt attggttgat acacct 26 <210> 18 <211> 26 <212> DNA <213> Neisseria gonorrhoeae <400> 18 ctgccgccga tatacctagc aagctc 26 <210> 19 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HSV-1 <400> 19 atgccttctt ggagtacgtg ggtcat 26 <210> 20 <211> 26 <212> DNA <213> Klebsiella pneumoniae <400> 20 gccgccatta ccatgagcga taacag 26

Claims (18)

  1. 첫 번째 서열 세그먼트(first sequence segment) 및 두 번째 서열 세그먼트(second sequence segment)를 포함하는 표적 물질 검출용 키트로서,
    상기 첫 번째 서열 세그먼트는 ‘GxHyNz’서열을 포함하는 G-풍부 서열(G-rich sequence)이며;
    상기 두 번째 서열 세그먼트는 ‘GxHy’서열을 포함하는 G-풍부 서열(G-rich sequence)이며;
    상기 ‘GxHyNz’서열 또는 ‘GxHy’서열에서 G는 구아닌 또는 구아닌 유도체, H는 구아닌이 아닌 핵산, N은 형광 염기 유사체(fluorescent nucleobase analogue)이고, G, H, N은 순열에 의해서 무작위로 배열되며, x는 1 내지 20의 정수, y는 0 내지 10의 정수, z는 1 내지 2의 정수이고, 단, x+y+z의 합은 50을 넘지 않으며;
    상기 첫 번째 서열 세그먼트 및 두 번째 서열 세그먼트의 일 말단에는 표적물질과 결합할 수 있는 물질이 결합되어 있으며;
    표적 물질 존재 시, 상기 첫 번째 및 두 번째 서열 세그먼트는 G-쿼드로플렉스(G-quadruplex) 구조를 형성하며, 동시에 형광 신호를 나타내는 것을 특징으로 하는 표적 물질 검출용 키트.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 표적 물질은 핵산이며; 첫 번째 서열 세그먼트에는 표적 핵산의 서열 중 일부와 상보적인 서열이 결합되어 있고; 상기 두 번째 서열 세그먼트에는 상기 표적 핵산의 서열 중 다른 일부와 상보적인 서열이 결합되어 있으며; 표적 핵산 존재 시, 상기 첫 번째 및 두 번째 서열 세그먼트는 G-쿼드로플렉스(G-quadruplex) 구조를 형성하며, 동시에 형광 신호를 나타내는 것을 특징으로 하는 표적 물질 검출용 키트.
  3. 제 2 항에 있어서, 상기 첫 번째 서열 세그먼트에 결합되어 있는 표적 핵산의 서열 중 일부와 상보적인 서열은 상기 첫 번째 서열 세그먼트의 5’부위에 결합되어 있는 것을 특징으로 하는 표적 물질 검출용 키트.
  4. 제 2 항에 있어서, 상기 두 번째 서열 세그먼트에 결합되어 있는 표적 핵산의 서열 중 다른 일부와 상보적인 서열은 상기 두 번째 서열 세그먼트의 3’부위에 결합되어 있는 것을 특징으로 하는 표적 물질 검출용 키트.
  5. 제 1 항에 있어서, 상기 H는 티민(thymine, T)인 것을 특징으로 하는 표적 물질 검출용 키트.
  6. 제 1 항에 있어서, 상기 형광 염기 유사체는 2-AP(2-aminopurine)인 것을 특징으로 하는 표적 물질 검출용 키트.
  7. 제 1 항에 있어서, 상기 첫 번째 서열 세그먼트가 포함하는 ‘GxHyNz’서열 및 상기 두 번째 서열 세그먼트가 포함하는 ‘GxHy’서열은 x가 1 내지 10의 정수, y가 0 내지 3의 정수, z가 1의 정수이고, 단, x+y+z의 합은 20을 넘지 않는 것을 특징으로 하는 표적 물질 검출용 키트.
  8. 제 7 항에 있어서, 상기 첫 번째 서열 세그먼트는 ‘GxHyNz’서열로 이루어지며, 상기 ‘GxHyNz’서열은 5’- GGG(2-AP) - 3’이거나 상기 5’- GGG(2-AP) - 3’의 3’말단에 G 또는 H가 순열에 의해서 무작위로 배열된 서열인 것을 특징으로 하는 표적 물질 검출용 키트.
  9. 제 7 항에 있어서, 상기 첫 번째 서열 세그먼트에 포함된 G(구아닌 또는 구아닌 유도체)의 개수는 상기 두 번째 서열 세그먼트에 포함된 G의 개수 이상인 것을 특징으로 하는 것을 특징으로 하는 표적 물질 검출용 키트.
  10. 제 9 항에 있어서, 상기 첫 번째 서열 세그먼트에 포함된 G(구아닌 또는 구아닌 유도체) 대 상기 두 번째 서열 세그먼트에 포함된 G의 비율은 1:1 내지 3:1 인 것을 특징으로 하는 표적 물질 검출용 키트.
  11. 제 10 항에 있어서, 상기 첫 번째 서열 세그먼트는 서열목록 제3서열, 제5서열 및 제9서열로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 표적 물질 검출용 키트.
  12. 제 10 항에 있어서, 상기 두 번째 서열 세그먼트는 서열목록 제4서열, 제6서열 및 제10서열로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 표적 물질 검출용 키트.
  13. 제 2 항에 있어서, 상기 첫 번째 서열 세그먼트에 결합되어 있는 표적 핵산의 서열 중 일부와 상보적인 서열 대 상기 두 번째 서열 세그먼트에 결합되어 있는 표적 핵산의 서열 중 다른 일부와 상보적인 서열의 비율은 2:1 내지 1:2인 것을 특징으로 하는 표적 물질 검출용 키트.
  14. 제 2 항에 있어서, 상기 표적 핵산의 서열 중 일부 및 다른 일부 서열의 합은 10 내지 50 mer인 것을 특징으로 하는 표적 물질 검출용 키트.
  15. 제 14 항에 있어서, 상기 표적 핵산의 서열 중 일부 및 다른 일부 서열의 합은 10 내지 30 mer인 것을 특징으로 하는 표적 핵산 검출용 키트.
  16. 제 1 항의 표적 물질 검출용 키트를 포함하는 바이오 센서.
  17. 시료 내에 표적 물질이 존재하는지 여부를 확인하기 위하여, 제 1 항의 표적 물질 검출용 키트를 상기 시료에 처리하는 단계를 포함하는 표적 물질 존재 여부 확인 방법.
  18. 첫 번째 서열 세그먼트(first sequence segment) 및 두 번째 서열 세그먼트(second sequence segment)를 제조하는 단계를 포함하는 표적 물질 검출용 키트의 제조방법으로서,
    상기 첫 번째 서열 세그먼트는 ‘GxHyNz’서열을 포함하는 G-풍부 서열(G-rich sequence)이며;
    상기 두 번째 서열 세그먼트는 ‘GxHy’서열을 포함하는 G-풍부 서열(G-rich sequence)이며;
    상기 ‘GxHyNz’서열 또는 ‘GxHy’서열에서 G는 구아닌 또는 구아닌 유도체, H는 구아닌이 아닌 핵산, N은 형광 염기 유사체(fluorescent nucleobase analogue)이고, G, H, N은 순열에 의해서 무작위로 배열되며, x는 1 내지 20의 정수, y는 0 내지 10의 정수, z는 1 내지 2의 정수이고, 단, x+y+z의 합은 50을 넘지 않으며;
    상기 첫 번째 서열 세그먼트 및 두 번째 서열 세그먼트의 일 말단에는 표적물질과 결합할 수 있는 물질이 결합되어 있으며;
    표적 물질 존재 시, 상기 첫 번째 및 두 번째 서열 세그먼트는 G-쿼드로플렉스(G-quadruplex) 구조를 형성하며, 동시에 형광 신호를 나타내는 것을 특징으로 하는 표적 물질 검출용 키트의 제조방법.
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