CN102071251B - 一种pcr检测核酸的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于分子生物学技术领域，涉及核酸分析检测，具体涉及一种普适的利用核酸聚合酶5’-3’外切酶活性释放DNAzyme的PCR检测方法。在PCR体系中加入用DNAzyme标记或部分DNAzyme标记的寡核苷酸探针，用正反引物对待测核酸进行扩增，利用核酸聚合酶5’-3’外切酶活性将探针中的DNAzyme标记或部分DNAzyme标记释放，通过检测PCR产物中释放出的标记物来进行核酸的定性或定量分析。该方法灵敏、准确、快速且廉价，可应用于各种基因检测体系，特别是对于某些疾病早期检测和遗传分析等均有很高的实用价值。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学技术领域，涉及核酸分析检测，具体涉及一种普适的利用核酸聚合酶5’-3’外切酶活性释放DNAzyme的PCR检测方法。
背景技术
探针是能与特异靶分子反应并带有供反应后检测的合适标记物的分子。核酸探针技术就是利用核苷酸碱基互补的原理，用特异的基因探针即识别特异碱基序列的有标记的一段单链DNA(或RNA)分子，与被测定的靶序列互补，以检测被测靶序列的技术。目前核酸探针技术在临床微生物学、血液筛选、遗传病诊断和预防、法医学等领域得到越来越广泛的应用，是定性或定量检测特异RNA或DNA序列的有力工具。
K.Mullis于上世纪80年代发明了聚合酶链式反应(PCR)，首次实现体外酶促合成特异DNA片段，能迅速扩增放大目的核酸，使后续的检测更灵敏显著；PE(Perkin Elmer)公司在1995年研发的实时荧光定量PCR技术，最早利用TaqMan荧光探针，将核酸扩增与检测相结合，使核酸检测一步到位。其原理如下：TaqMan探针两端分别连接一个荧光报告基团和荧光淬灭基团，PCR扩增时加入一对引物和一个特异性的荧光探针，探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，如果探针与靶序列杂合配对，由于Taq酶具有5′-3′外切酶活性，会将探针酶切降解，使报告基团和淬灭基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。发展至今，荧光定量检测中所使用的探针除了TaqMan探针，还包括分子信标，FRET探针等。荧光定量PCR技术最突出的特点是灵敏和特异性强，但其应用仍然受到试剂成本和试验仪器等试验条件的制约。
指数富集的配基系统进化(SELEX)是一种从大容量寡核苷酸文库中经反复分离扩增步骤得到针对靶分子的高亲和力高特异性核酸配基-适配体的体外筛选技术。90年代中期Gerald F.Joyce用SELEX技术发现具有催化活性的、能特异切割RNA的单链DNA分子，即脱氧核酶(DNAzyme，Catalytic DNA，Deoxyribozyme)，由于DNA分子比RNA分子更稳定，更易于储存，化学合成也更经济方便，这使许多科学家将目光转向了DNAzyme。Dipankar Sen随后又发现能够折叠成G-四链体的富含鸟嘌呤的单链DNAzyme。2004年Itamar Willner研发出了室温下能形成发夹结构的催化信标，通过释放这种能形成G-四链体的DNAzyme来检测核酸和端粒酶的活性。2008年周翔通过将这种能形成G-四链体的DNAzyme分成一个GGG和三个GGG结构高效检测核酸。这种DNAzyme与卟啉铁(hemin)或者卟啉铁类似物结合后，具有类似于过氧化物酶的活性，能催化H202将显色底物(ABTS，DAB等)氧化成有色物质，因此可以直接在室温下通过颜色变化来检测核酸。Willner和周翔的检测方法方便、灵敏、快捷且廉价，但仅适应于检测单链核酸，在应用方面具有一定的局限性。
因此，如何设计一种有效的检测方法来检测单链和双链核酸是近年来许多学者们正在研究的问题。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术的局限性，将DNAzyme探针与酶切探针相结合，提供一种普适的利用核酸聚合酶5’-3’外切酶活性释放DNAzyme的PCR检测方法。
本发明的技术方案如下：
对待测样品中的目标核酸序列进行PCR扩增时，在PCR体系中除了加入一对引物，还加入一段用DNAzyme标记或部分DNAzyme标记的、能与目标核酸序列互补的寡核苷酸探针，该寡核苷酸探针在常温下DNAzyme标记处于封闭状态；在复性条件下，其中一条引物和这段用DNAzyme标记或部分DNAzyme标记的寡核苷酸探针分别能与同一条目标核酸序列互补，其中，引物的3’端在用DNAzyme标记或部分DNAzyme标记的寡核苷酸探针5’端的上游；在延伸条件下，所述的与目标核酸序列结合的引物和具有5’-3’外切酶活性的核酸聚合酶结合，开始由5’端向3’端延伸，由于核酸聚合酶具有5’-3’外切酶活性，用DNAzyme标记或部分DNAzyme标记的寡核苷酸探针会被核酸聚合酶酶切，释放出含有完整DNAzyme或部分DNAzyme的片段；当释放出的是完整DNAzyme片段时，直接检测释放出的片段来进行目标核酸序列的定性或定量，当释放出的是DNAzyme中的一部分时，补加另一段寡核苷酸序列使其成为完整DNAzyme片段，再进行目标核酸序列的定性或定量。
本发明所涉及的寡核苷酸探针两端分别为长度为1-20个核苷酸的与目标核酸序列不互补的片段，DNAzyme或部分DNAzyme序列包含在此片段中；同时寡核苷酸探针还包含一段与DNAzyme或部分DNAzyme序列互补的片段，在常温下，DNAzyme或部分DNAzyme序列处于封闭状态；在引物延伸时，利用核酸聚合酶的5’-3’外切酶活性酶切该寡核苷酸探针，将DNAzyme或部分DNAzyme标记释放出来，产生能检测的信号。
本发明所涉及的寡核苷酸探针中的DNAzyme标记是一种能够产生信号的、具有催化功能的DNA序列。目前所发现的DNAzyme分为5大类：切割RNA的DNAzyme、切割DNA的DNAzyme、具有激酶活力的DNAzyme、具有连接酶功能的DNAzyme、与卟啉铁等结合具有过氧化物酶活性的DNAzyme。
本发明所涉及的寡核苷酸探针中的DNAzyme标记是与卟啉铁等结合具有过氧化物酶活性的DNAzyme时，可在DNAzyme释放后，通过加入hemin、显色底物(ABTS、DAB等)、H2O2，在室温下显色，直接用肉眼观察颜色变化或用分光光度计测得一定波长下的吸光值来检测信号，从而判断目标核酸序列是否存在。当显色底物为ABTS时，存在目标核酸序列的样品显绿色，当显色底物为DAB时，存在目标核酸序列的样品显棕红色，不存在目标核酸序列的样品都为无色。
本发明所涉及的寡核苷酸探针中的DNAzyme标记是能特异切割RNA或DNA的DNAzyme时，可在DNAzyme释放后，通过切割特异性的RNA或DNA分子来检测信号，从而判断目标核酸序列是否存在。
本发明所涉及的寡核苷酸探针中的DNAzyme标记是有连接酶功能的DNAzyme时，可在DNAzyme释放后，可通过连接特异的RNA或DNA分子来检测信号，从而判断目标核酸序列是否存在。
在本发明用与卟啉铁等结合具有过氧化物酶活性的DNAzyme标记的寡核苷酸探针对核酸进行检测时，PCR结束后加入一定浓度的钠离子，94℃加热1-5min，室温放置30min-1h，此步骤有利于加热解链后的寡核苷酸探针再重新封闭DNAzyme序列，使阴性对照的信号更低，从而使检测结果更加灵敏。
表1.与卟啉铁等结合具有过氧化物酶活性的几个代表性DNAzyme标记的名称及序列
| 名称 | DNA序列 |
| PW17 | GGGTAGGGCGGGTTGGG |
| T30695 | GGGTGGGTGGGTGGGT |
| PS2.M | GTGGGTAGGGCGGGTTGG |
| PS5.M | GTGGGTCATTGTGGGTGGGTGTGG |
表2.部分显色底物的中英文全称
在本发明的PCR反应体系中，寡核苷酸探针大约在0.4μM-1μM、正反向引物没有特别限制，正向引物比反向引物浓度稍大较佳，在这样的反应体系中，能保证正向引物扩增的强度较大，从而Taq酶外切探针的机会也较大，使试验结果的信噪比更大。
在本发明对核酸进行检测的过程中，寡核苷酸探针可在一开始就加入PCR体系中，也可以在PCR进行了一定循环数后再加入。较佳体系为先加入正向引物1μM、反向引物1μM进行PCR，20个循环后加入寡核苷酸探针，正向引物1μM，再PCR 20个循环。第一轮PCR的循环数可根据待检测的核酸量的多少进行加减。如果待检测的核酸量较大，可适当减少第一轮PCR的循环数；如果待检测的核酸量较小，可适当增加第一轮PCR的循环数。
在本发明中，对待测核酸样品的来源没有限制，病毒DNA或RNA、癌症样品DNA或RNA、微生物DNA或RNA等都可用本发明的方法进行检测。
本发明中所涉及的核酸聚合酶是一种具有5’-3’外切酶活性耐热性酶。
在本发明中，对待测核酸样品的长度没有限制，但对PCR反应中扩增的特异性序列长度有一定的限制，扩增片段不宜过长，通常为200个碱基以内。
如本文所用，下列词语/术语具有下列含义，除非另外说明。
“DNA”：脱氧核糖核酸。是一类带有遗传信息的生物大分子，由4种主要的脱氧核糖核苷酸通过3′，5′-磷酸二酯键连接而成，是遗传信息的载体。
“RNA”：核糖核酸。由核糖核苷酸通过3′，5′-磷酸二酯键连接而成的多聚体。
“PCR”：聚合酶链式反应。是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法，由高温变性、低温退火及适温延伸等几步反应组成一个周期，循环进行，使目的DNA得以迅速扩增，具有特异性强、灵敏度高、操作简便、省时等特点。
“目标核酸序列”：需要检测的分析物，包括DNA序列和RNA序列。
“DNAzyme”：脱氧核酶(deoxyribozyme，Catalytic DNA)是人工合成的、利用体外分子进化技术筛选的一种具有催化功能的单链DNA片段，具有高效的催化活性和结构识别能力。据催化功能的不同，可以将脱氧核酶分为5大类：切割RNA的脱氧核酶、切割DNA的脱氧核酶、具有激酶活力的脱氧核酶、具有连接酶功能的脱氧核酶、催化卟啉环金属螯合反应的脱氧核酶。
“引物”：一段短的单链RNA或DNA片段，可结合在核酸链上与之互补的区域，其功能是作为核苷酸聚合作用的起始点，核酸聚合酶可由其3′端开始合成新的核酸链。
“TaqMan”：TaqMan荧光探针是一种寡核苷酸探针，荧光基团连接在探针的5’末端，而淬灭剂则在3’末端。PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5′-3′外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。
“SELEX”：systematic evolution of ligands by exponential enrichment，指数级富集的配体系统进化技术，从大量的随机序列的寡核苷酸库中鉴定出一种数量很少的具有独特性质的核酸序列的方法。SELEX方法是由Tuerk和Ellington等在1990年建立的，它是一种通过体外反复选择和放大从巨大的核苷酸组合库中筛选特定核苷酸序列的方法。SELEX过程中，首先是用组合化学合成DNA的方法合成随机序列的核酸库然后，在一定的温度下将寡核苷酸随机序列库与靶分子共同孵育于特定的缓冲液中，组合库中的极少数分子将与靶分子结合，然后用物理的方法将结合的分子与未结合的分子分离开来。
“Hemin”：血红素，即卟啉铁。
本发明所公开的方法关键在于利用核酸聚合酶5’-3’外切酶活性将一类DNAzyme标记或部分DNAzyme标记的寡核苷酸探针中的DNAzyme序列释放出来，在PCR结束后通过直接或间接检测对目标核酸序列进行定性或定量，该方法灵敏、准确、快速且廉价，可应用于各种基因检测体系，特别是对于某些疾病早期检测和遗传分析等均有很高的实用价值。本发明具有明显优于现有技术的优点，其主要优点包括：
1.新颖性。本发明成功将DNAzyme探针与酶切探针相结合，提供一种普适的利用核酸聚合酶5’-3’外切酶活性释放DNAzyme的PCR检测方法来进行核酸检测，在国内尚为首创。
2.通用性。本发明所涉及的PCR检测方法，针对不同样品中的待测核酸，只需改变寡核苷酸探针中的与目标核酸序列互补的特异性序列，创造性的建立了一种PCR通用型核酸检测体系。
3.实用性。现有的实时荧光PCR技术通常对检测设备具有较高的要求，从而使检测具有一定的局限性，而本发明检测方法仅需要普通PCR仪，因此，核酸检测变得更加广泛、实用、方便。
4.经济性。现有的实时荧光PCR技术，试剂和探针的合成费用都较高，而本发明中所涉及的探针序列和标记物都由普通的核苷酸组成，不用修饰和改性，合成方便，试剂较为廉价，因此，大大降低了检测成本。
附图说明
图1是具体实施例1检测核酸的流程示意图。
图2是具体实施例2检测核酸的流程示意图。
图3是具体实施例1的检测结果图A，a：DNA T-1的浓度为0.1pM，b：不加DNA T-1。
图4是具体实施例1的检测结果图B，DNA T-1的浓度为0.1aM-0.1fM。
具体实施方式
下面结合附图，通过实例进一步说明本发明。本领域的技术人员应理解，这些实例仅用于说明本发明，而不用于限制本发明的范围。
实施例1、用寡核苷酸探针1检测DNA T-1
检测核酸的反应步骤参见图1。寡核苷酸探针1的一端标记了一种与卟啉铁等结合具有过氧化物酶活性的DNAzyme序列，另一端为能与该DNAzyme序列形成部分互补的序列，在常温条件下两端能够部分互补，使寡核苷酸探针1形成一端带有一小段单链的茎环发夹结构，寡核苷酸探针1发夹结构的环部能与目标核酸序列DNA T-1互补。
将寡核苷酸探针1加入PCR体系后，变性条件下，待测DNA T-1的双链以及探针1的发夹结构都打开；在复性的条件下，正向引物和探针都与DNAT-1其中一条链杂交；在Taq酶的作用下，正向引物延伸；延伸至探针处时，由于Taq酶具有5’端到3’端的外切酶活性，将探针与DNAT-1杂交的部分酶切降解，使探针酶切只剩两个茎部，这时DNAzyme序列释放出来能形成G-四链体，加入hemin，具有过氧化物酶活性，能催化H202将ABTS氧化成绿色自由基。从理论上说，每扩增一条DNA链，就有一个G-四链体分子形成，可以实现信号的累积与PCR产物形成完全同步。
此反应过程中，PCR结束后加入一定浓度的钠离子，94℃加热1-5min，室温放置30min-1h，此步骤是因为：寡核苷酸探针1加热解链后其中一个茎部形成的G-四链体具有较高的稳定性，导致降温后发夹结构不能还原，从而干扰试验结果。而加入一定浓度的钠离子，有利于寡核苷酸探针1在降温后再重新返回发夹结构，封闭DNAzyme序列，使阴性对照的信号更低，从而使检测结果更加灵敏。
(1)正反引物1、寡核苷酸探针1、DNAT-1序列
正向引物2：5’-GAA TTC TAA TAC GAC TCA CTA TA-3’
反向引物2：5’-TTT TTA GAG TTA CGC AGC-3’
寡核苷酸探针1：5’-CCC TAC CCA ACA ATT ACA ATG GAC TAC AAG GAC GAT GACGAT GGG TAG GGC GGG TTG GG-3’
DNA T-1：5’-GAA TTC TAA TAC GAC TCA CTA TA GGG ACA ATT ACT ATT TAC AATTAC AAT GGA CTA CAA GGA CGA TGA CGA TAA GCA GCT GCG TAA CTC TAAAAA-3’
(2)反应体系及PCR条件
正向引物 1μM
反向引物 1μM
Taq酶 5U
dNTPs 0.4mM
DNA T-1 0.1aM-0.1pM
10倍Taq缓冲液 5μl
超纯水将体系补足到50μl。
PCR条件是：95℃预热1min；95℃变性30s，45℃复性45s，72℃延伸45s，20个循环。加0.5μM寡核苷酸探针1和1μM正向引物，95℃变性30s，45℃复性45s，72℃延伸45s，20个循环。
1个阴性对照分别为：不含DNA T-1的体系；
(3)检测方法
将PCR产物加200mM NaCl，94℃加热1-5min，室温放置1h，加1.8μM hemin，2.1μMABTS，2.1μM H2O2，用肉眼观察颜色变化或用分光光度计在414nm下检测。
(4)检测结果
如附图3所示，DNAT-1浓度为0.1pM时，用分光光度计在414nm下检测到的吸光值为对照(不加DNA T-1)的8倍左右；附图4为DNA T-1浓度在0.1aM-0.1pM范围内的显色结果，在一定范围内显色结果随DNA T-1的浓度呈线性变化。
实施例2、用寡核苷酸探针2检测DNA T-1
检测核酸的反应步骤参见图2。寡核苷酸探针2包含两个片段A和B，都分别包含部分DNAzyme序列和一段互补序列。将寡核苷酸探针2片段A加入PCR体系后，变性条件下，待测DNA T-1的双链以及探针2的发夹结构都打开；在复性的条件下，正向引物和探针2都与DNAT-1其中一条链杂交；在核酸聚合酶的作用下，正向引物延伸；延伸至探针2处时，由于核酸聚合酶具有5’端到3’端的外切酶活性，将探针2与DNAT-1杂交的部分酶切降解，含有部分DNAzyme的片段C就被释放出来，此时加入寡核苷酸探针2的片段B，片段C与片段B通过一段序列互补能形成完整的DNAzyme，加入hemin，具有过氧化物酶活性，能催化H202将ABTS氧化成绿色自由基。从理论上说，每扩增一条DNA链，就有一个G-四链体分子形成，可以实现信号的累积与PCR产物形成完全同步。
检测的过程中，PCR结束后加入过量浓度的片段B，是因为：片段A被Taq酶酶解生成片段C外，还生成一个片段。此片段会与片段B一起竞争片段C。加入适当过量的片段B，能使片段B更容易与片段C互补。
(1)正反引物1、寡核苷酸探针1、DNAT-1序列
正向引物2：5’-GAA TTC TAA TAC GAC TCA CTA TA-3’
反向引物2：5’-TTT TTA GAG TTA CGC AGC-3’
寡核苷酸探针2片段A：5’-CCC TAC CCA ACA ATT ACA ATG GAC TAC AAG GACGAT GA CGA ACT ATA ACA ATC AAT GGG TAG GGC GGG-3’
寡核苷酸探针2片段B：5’-GGGT TT GAT TGT TAT A-3’
DNA T-1：5’-GAA TTC TAA TAC GAC TCA CTA TA GGG ACA ATT ACT ATT TAC AATTAC AAT GGA CTA CAA GGA CGA TGA CGA TAA GCA GCT GCG TAA CTC TAAAAA-3’
(2)反应体系及PCR条件
正向引物 1μM
反向引物 1μM
Taq酶 5U
dNTPs 0.4mM
DNAT-1 0.1pM
10倍Taq缓冲液 5μl
超纯水将体系补足到50μl。
PCR条件是：95℃预热1min；95℃变性30s，45℃复性45s，72℃延伸45s，20个循环。加0.6μM片段A和1μM正向引物，95℃变性30s，45℃复性45s，72℃延伸45s，20个循环。
1个阴性对照为：不含DNA T-1的体系；
(3)检测方法
将PCR产物加1.5μM寡核苷酸探针2B，室温放置1h，加1.8μM hemin，2.1μM ABTS，2.1μM H2O2，用肉眼观察颜色变化或用分光光度计在414nm下检测。
(4)检测结果
用肉眼可观察到：加0.1pM DNA T-1的显绿色，阴性对照(不含DNA T-1)不显色，颜色差别较明显。
实施例3、用寡核苷酸探针3检测嗜水气单胞菌(编号：EU678635.1)
(1)正反引物2、寡核苷酸探针3、嗜水气单胞菌的部分序列
正向引物2：5’-GCC ATG CCG CGT GTG TGA AG-3’
反向引物2：5’-AGC CGG TGC TTC TTC TGC GA-3’
寡核苷酸探针3：5’-CCC TAC CCA GGG TTG TAA AGC ACT TTC AGC GAG GAG GAAAGG TTG ATG TGG GTA GGG CGG GTT GGG-3’
嗜水气单胞菌的部分序列：5′-GCC ATG CCG CGT GTG TGA AGA AGG CCT TCG GGTTGT AAA GCA CTT TCA GCG AGG AGG AAA GGT TGA TGC CTA ATA CGT GTC AAC TGTGAC GTT ACT CGC AGA AGA AGC ACC GGC T-3′
(2)反应体系及PCR条件
正向引物 1μM
反向引物 1μM
Taq酶 5U
dNTPs 0.4mM
浓度为100个/μl嗜水气单胞菌菌液 2μl
10倍Taq缓冲液 5μl
超纯水将体系补足到50μl。
PCR方案是：95℃预热5min； 95℃变性30s，55℃复性45s，72℃延伸45s，40个循环。加0.5μM寡核苷酸探针和1μM正向引物，95℃变性30s，55℃复性45s，72℃延伸45s，20个循环。
3个阴性对照分别为：含大肠杆菌菌液、不含嗜水气单胞菌菌液的体系；
含金黄色葡萄球菌、不含嗜水气单胞菌菌液的体系；
不含嗜水气单胞菌菌液的体系。
(3)检测方法
将PCR产物加200mM NaCl，94℃加热1-5min，室温放置1h，加1.8μM hemin，2.1μMABTS，2.1μM H2O2，用肉眼观察颜色变化或用分光光度计在414nm下检测。
(4)检测结果
用肉眼可观察到，嗜水气单胞菌菌液显绿色，大肠杆菌菌液，金黄色葡萄球菌液，空白对照(不含嗜水气单胞菌菌液)不显色，颜色差别明显。
Claims (7)
1.一种PCR检测核酸的方法，其特征是：在PCR体系中加入用DNAzyme标记的寡核苷酸探针，用正反引物对待测核酸进行扩增，利用核酸聚合酶5’-3’外切酶活性将探针中的DNAzyme标记释放，通过检测PCR产物中释放出的标记物来进行核酸的定性或定量分析；寡核苷酸探针中含有一段15个碱基以上的序列能与目标核酸序列互补，当引物与寡核苷酸探针分别跟同一条目标核酸序列互补时，引物的3’端在寡核苷酸探针5’端的上游；同时寡核苷酸探针包含一段与DNAzyme序列互补的片段，在常温下，通过寡核苷酸探针分子内的DNA碱基互补作用，DNAzyme序列处于封闭状态。
2.一种PCR检测核酸的方法，其特征是：在PCR体系中加入用部分DNAzyme标记的寡核苷酸探针，用正反引物对待测核酸进行扩增，利用核酸聚合酶5’-3’外切酶活性将探针中的部分DNAzyme标记释放，PCR结束后补加另一段寡核苷酸序列使其成为完整DNAzyme片段，再通过检测DNAzyme来对核酸进行定性或定量；寡核苷酸探针中含有一段15个碱基以上的序列能与目标核酸序列互补，当引物与寡核苷酸探针分别跟同一条目标核酸序列互补时，引物的3’端在寡核苷酸探针5’端的上游；同时寡核苷酸探针包含一段与部分DNAzyme序列互补的片段，在常温下，通过寡核苷酸探针分子内的DNA碱基互补作用，部分DNAzyme序列处于封闭状态。
3.根据权利要求1或2中所述的PCR检测核酸的方法，其特征是：所述寡核苷酸探针中的DNAzyme标记是一种能够产生信号的、具有类似于过氧化物酶催化功能的DNA序列。
4.根据权利要求1或2所述的PCR检测核酸的方法，其特征是：所述核酸聚合酶是一种具有5’-3’外切酶活性的耐热性核酸聚合酶。
5.根据权利要求1或2所述的PCR检测核酸的方法，其特征是：所述正反引物的3’端与用DNAzyme标记或部分DNAzyme标记的寡核苷酸探针的5’端相隔的核苷酸在20个以下。
6.根据权利要求1或2所述的PCR检测核酸的方法，其特征是：所述寡核苷酸探针两端分别为长度为1-20个核苷酸的与目标核酸序列不互补的片段，DNAzyme或部分DNAzyme序列包含在此片段中。
7.根据权利要求1或2所述的PCR检测核酸的方法，其特征是：所述寡核苷酸探针在94℃变性时打开分子内的DNA碱基互补，引物延伸时核酸聚合酶利用其的5’-3’外切酶活性剪切寡核苷酸探针，将DNAzyme标记或部分DNAzyme标记释放，从而产生能检测的信号。
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