KR20170020929A - Dna 증폭 기술 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 중합효소 연쇄 반응을 실행하는데 유용한 방법 및 재료에 관한 것이다. 특히, 개선된 민감도와 함께 다중 핵산 표적의 효과적인 증폭을 가능하게 하는 핵산 증폭 디자인 전략 및 열 사이클링 프로파일이 개시된다. 본 발명은 또한 프라이머의 용융 온도(Tm)를 증가시키기 위한 방법 및 장치를 기술한다.

Description

DNA 증폭 기술{DNA AMPLIFICATION TECHNOLOGY}
본 발명은 PCR 증폭을 수행하는데 유용한 방법 및 물질에 관한 것이다. 특히, 개선된 감도와 함께 다중 핵산 표적의 효율적인 증폭을 가능하게 하는 핵산 증폭 디자인 전략 및 열 사이클링 프로파일이 개시된다.
본 발명은 또한 프라이머의 용융 온도(Tm)를 증가시키는 방법 및 장치를 기술한다. 특히, 부가된 합성 태그를 갖는 프라이머는 앰플리콘의 Tm과 프라이머의 Tm 사이의 범위를 감소시키는데 사용된다.
PCR 증폭은 전통적으로 다수의 증폭 사이클을 통해 이루어졌으며, 각 사이클은 초기 변성, 어닐링, 중합 및 최종 신장의 단계를 포함한다. 이러한 사이클은 일반적으로 표적 뉴클레오티드 서열(일반적으로 DNA 또는 RNA), DNA 폴리머라제(예를 들어, Taq 폴리머라제), 뉴클레오시드 트라이포스페이트, RT 효소, 및 표적 DNA에 혼성화되고 증폭된 DNA 생성물("앰플리콘")의 서열과 측면을 접하는 제 1 및 제 2 프라이머(프라이머 쌍을 포함)를 포함하는 생물학적 샘플을 포함하는 필수 PCR 시약이 제공된 반응 챔버에서 수행된다. PCR 장치는, 예를 들어, 통상적으로 단일 사슬 DNA를 생성하기 위해 이중 가닥 DNA의 "용융"; 단일 가닥 DNA 주형에 대한 프라이머의 어닐링; 및 폴리머라제를 통한 증폭된 DNA의 신장을 포함하는 증폭 사이클의 각 단계에 필요한 반응 챔버의 온도를 순환시키는 수단을 포함할 것이다.
특정 표적 DNA 서열을 증폭시키는데 사용된 정확한 조건은 당업자의 지식 범위 내에 있는 여러 인자에 따라 변할 수 있다. 전통적인 DNA 증폭의 일부 실시태양서, 변성은 약 90-95℃에서 약 10-30초 동안 수행되고, 어닐링은 약 45-65℃에서 약 10-30초 동안 수행되고; 신장은 약 70-75℃에서 약 10-90초 동안 수행되고; 최종 신장은 72℃에서 약 5분 동안 수행된다. 일부 실시태양에서, 반응 혼합물은 게놈 DNA, MgCl2 및 다른 생리학적 염(예를 들어, NaCl), PCR 완충액, 0.1-1.0 mM dNTPs, 0.04-1.5 μM의 각 프라이머 및 0.5-5.0 단위의 열 안정성 폴리머라제(예를 들어, Taq 폴리머라제)를 포함한다.
예를 들어, 자가-유지 서열 복제(3SR), 가닥-변위 증폭(SDA); "분지쇄" DNA 증폭(Chiron Corp.); 리가아제 연쇄 반응(LCR), QB 레플리카제 증폭(QBR), 결찰 활성화 전사(LAT), 핵산 서열-기반 증폭(NASBA), 수리 연쇄 반응(RCR) 및 사이클링 프로브 반응(CPR)을 포함하는 당 업계에 공지된 다른 증폭 방법이 또한 이용될 수 있다(예를 들어, The Genesis Report, DX; Vol. 3(4), pp. 2-7 (February 1994)에서 리뷰됨).
실시간 PCR은 통상적으로 실시간으로 PCR 생성물의 정량화 또는 탐지를 허용하는 형광 분자의 사용에 의존하는 반면, 전기화학과 같은 다른 탐지/정량화 화학이 또한 적용가능하다.
형광 분자는 SYBR® Green과 같은 DNA 결합 염료 또는 형광 표지 프라이머 또는 프로브일 수 있다. 다른 응용분야에 응용가능한 여러 형광 염료 및 프로브 디자인이 있다. 실시간 PCR을 위한 가장 일반적으로 사용된 DNA-결합 염료는 SYBR® Green I이며, 단일 가닥 DNA에 비해 이중-가닥 DNA(dsDNA)에 우선적으로 결합한다. SYBR Green 1은 dsDNA에 결합될 때 1,000-배까지 증가한다. 따라서, 형광 신호는 존재하는 dsDNA의 양에 비례한다.
DNA-결합 염료의 주요 단점은 특이성의 결여인데, 즉, DNA-결합 염료는 임의의 dsDNA와 결합한다. 그 결과, 실시간 또는 종점 PCR 반응에서 임의의 비특이적 생성물의 존재는 전체 형광에 기여하고 정량화 또는 탐지의 정확성에 영향을 미칠 것이다. 또한, DNA-결합 염료는 다중 반응에서 정량화 또는 탐지에 사용될 수 없는데 이는 다른 생성물로부터의 형광 신호는 다른 생성물의 형성을 구별하기 위해 PCR 이후 용융 곡선 분석의 포함 없이 구별될 수 없기 때문이다.
반대로, 프라이머-기반 및 프로브-기반 탐지 화학은 관심 생성물이 증폭될 때만 신호가 발생되는 것을 보장한다. 프라이머 또는 표적-특이적 올리고뉴클레오티드 프로브는 통상적으로 리포터 형광체로 표지화되나, 많은 경우, 특이적 표적이 아직 증폭되지 않거나 샘플에 존재하지 않을 때 형광은 소광된다. 주로 이것은 프라이머 또는 프로브에 소광 물질을 부착하고 프라이머 또는 프로브가 특이적 표적과 결합될 때 이에 의해 리포터 및 소광제가 분리되는 일부 메커니즘을 발명함으로써 성취된다.
현재 사용중인 주요 프라이머/프로브 탐지 화학은 다음과 같다:
가수분해( TaqMan ) 프로브
가수분해 분석법은 서열-특이적 프라이머 이외에, 서열-특이적, 형광 표지화 올리고뉴클레오티드 프로브를 포함한다. 가수분해 분석법은 Taq 또는 Tth와 같은 특정 열 안정성 폴리머라제의 5' 엑소뉴클레아제 활성을 이용한다. 이런 특정 디자인에 대한 여러 변형이 일반적으로 사용되지만, 가수분해 프로브는 한 말단에 형광 리포터 및 반대 말단에 소광제로 표지화된다. 프로브가 온전할 때, 형광은 소광제에 가까운 형광체 때문에 소광된다. 비록 이것은 사용중인 여러 염료/소광제 조합 중 단지 하나이지만, 일반적으로 사용된 형광 리포터-소광제 쌍은 녹색 형광을 발광하는 플루오레신(FAM) 및 블랙홀 소광제 1 염료이다.
증폭 반응은 조합된 어닐링/신장 단계를 포함하며 이 단계 동안 프로브는 표적에 혼성화되고 Taq 또는 Tth의 dsDNA-특이적 5' to 3' 엑소뉴클레아제 활성은 올리고뉴클레오티드를 절단하여, 소광제로부터 형광체를 분리하고, 샘플에서 증폭된 생성물의 양에 비례하는 형광 신호를 생성한다. 적절하게 디자인된 가수분해 프로브는 증폭된 표적 내에서 서열 변화, 즉, 유전자형을 측정하기 위해 유사한 디자인의 추가 프로브와 조합하여 사용될 수 있다.
분자 비컨(Molecular Beacons)
분자 비컨은 헤어핀 구조를 형성하는 염료-표지화된 올리고뉴클레오티드(25-40nt)이다. 5' 및 3' 말단은 줄기를 형성하는 5-6개 뉴클레오티드의 상보적 서열을 가지는 반면, 루프는 표적 서열의 15-30개 뉴클레오티드 부분에 특이적으로 혼성화되도록 디자인된다. 형광 리포터 분자는 분자 비컨의 한 말단에 부착되고 소광제는 다른 말단에 부착된다. 프로브가 분리될 때, 헤어핀 형성이 발생하여, 리포터 및 소광제를 가깝게 하며 형광이 소광된다.
표적 서열이 증폭 반응의 어닐링 단계 동안 존재하는 경우, 분자 비컨의 루프 부분은 표적 서열에 결합하여, 줄기를 변성시킨다. 따라서 리포터 및 소광제는 분리되고, 소광은 약해지며, 리포터 형광은 탐지가능하다. 형광은 표적에 결합될 때만 프로브로부터 방출되기 때문에, 탐지된 형광의 양은 반응에서 표적의 양에 비례한다. 다시, 적절하게 디자인된 분자 비컨은 증폭된 서열 내에, 주요 서열 변화, 즉, 유전자형을 구별하는데 사용될 수 있다. 통상적으로, 이것은 PCR 이후 용융 곡선 분석에 의해 성취된다.
이중 혼성화 프로브
이런 분석법은 표적에서 인접 서열과 결합하는 2개의 서열-특이적 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용한다. 프로브는 형광 공명 에너지 전달(FRET)에 참여할 수 있는 한 쌍의 염료로 표지화된다. 도너 염료는 제 1 프로브의 3' 말단에 부착되는 반면, 억셉터 염료는 제 2 프로브의 5' 말단에 부착된다. 이 순서는, 표적에 대한 두 올리고뉴클레오티드의 결합이 형광체를 FRET 범위(포스터 반경) 내로 가져오는 한, 뒤집힐 수 있다.
실시간 PCR 동안, 도너 염료에 특이적인 파장에서 여기가 실행되며 반응은 억셉터 염료의 방출 파장에서 관찰된다. 어닐링 단계에서, 프로브는 헤드-투-테일 배열로 표적 서열에 혼성화된다. 이것이 도너 및 억셉터 염료를 가깝게 하여, FRET이 발생하게 한다. 억셉터 형광의 양은 존재하는 PCR 생성물의 양에 비례한다. 혼성화 프로브는 다양한 유전자 탐지 및 정량화 리드아웃을 가능하게 한다.
프라이머 / 프로브 조합
이런 탐지기는 서열 특이적 올리고뉴클레오티드 프라이머 및 서열 특이적 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용한다. 프라이머 및 프로브는 표적의 인접 서열에 결합하도록 디자인되며, 주로 프로브는 프라이머에 의해 형성된 가닥에 상보적이다. 프로브 및 프라이머는 (FRET)에 참여할 수 있는 한 쌍의 염료로 표지화된다. 일반적으로, 도너 염료는 프라이머의 3' 말단 근처에 부착되는 반면, 억셉터 염료는 프로브의 3' 말단에 부착되어, 프라이머 신장에 의해 합성된 상보적 가닥에 어닐링된다.
이중 혼성화 프로브에 의해, DNA 증폭 동안, 여기는 도너 염료에 특이적인 파장에서 실행되며, 반응은 억셉터 염료의 방출 파장에서 관찰된다. 어닐링 단계에서, 프로브 및 프라이머는 헤드-투-테일 배열로 표적 서열에 혼성화된다. 이것이 도너 및 억셉터 염료를 가깝게 하여, FRET이 발생하게 한다. 억셉터 형광의 증가하는 양은 존재하는 PCR 생성물의 양에 비례한다.
동적 유동 증폭
당해 기술 분야에 기재된 증폭 방법은 표적 서열의 용융 온도를 측정하는 단계 및 표적 서열의 변성을 최대화시키면서 비-표적 서열의 변성(동적 플럭스 증폭 또는 DFA)을 최소화시키도록 열 사이클링 온도의 상한을 설정하는 단계를 포함한다. 이 접근법은 반응이 표적 서열의 변성 온도에 근접하는 온도로 가열됨에 따라 기포 생성을 촉진한다. 표적 서열의 변성 온도가 인접 서열보다 작다고 가정하면, 인접 서열은 어닐링된 상태로 남아있어, 표적 서열이 변성됨에 따라 DNA 가닥에 기포가 형성될 것이다. 물론, 표적 서열과 유사한 변성 온도를 갖는 DNA 서열상의 다양한 지점에서 다수의 기포가 형성될 가능성이 있다. 그럼에도 불구하고, 변성되지 않은 서열의 총량은 상부 온도를 95℃ 이상으로 올린 경우보다 여전히 낮다.
핵산 기포를 생성하기 위해 변성 온도를 제어하는 하나의 이점은 프라이머가 표적 서열 이외의 부위에 결합하는 것을 방지하고, 이런 부위를 혼성화에 이용할 수 없게 함으로써 비특이적 생성물의 형성을 현저하게 제한한다는 것이다. 이것은 표적 게놈의 비 표적 영역에 비해 변성되기에 유리한 표적 서열로부터 초래되어 증폭 과정 동안 비특이적 결합 부위로서 작용할 수 있는 이용가능한 서열을 현저하게 감소시킨다.
상기 통상적인 프로브 화학의 한 단점은 이는 동적 유동 증폭("DFA") 기술과 양립할 수 없다. 이것은 부분적으로 DFA와 비교하여 PCR에서 사용된 프로브의 필요한 용융 온도에서의 차이 때문이다. PCR은 20 - 30 염기쌍 범위에 있고 일반적으로 관심 서열의 Tm보다 적어도 20℃ 미만의 Tm을 소유하는 프로브를 사용한다. 반대로, DFA는 관심 서열의 Tm의 20℃ 이하 내인 프로브를 필요로 한다. DFA는 일반적으로 PCR을 위한 프로브 기술에 사용된 어닐링 온도 범위의 외부에서 작동하기 때문에, 현재 사용되는 이런 프로브는 일반적으로 DFA 기술과 양립할 수 없다.
현존하는 PCR 프라이머가 DFA에서 사용되는 좁은 온도 범위 또는 적어도 종래의 PCR에서 사용된 것보다 좁은 그 열 사이클링 범위를 이용하도록 변형될 수 있고 따라서 속도 증가를 얻기 위해 프라이머를 완전히 재설계할 필요를 제거하면 바람직할 것이다. 좁은 온도 범위는 표적 핵산과 혼성화될 때 충분히 높은 Tm 값을 갖는 특이적 프라이머를 동정, 설계 및/또는 생성하기 위한 표적 온도 범위로서 사용될 수 있다.
증폭 기포를 초과하는 반응의 신장을 억제함으로써 바람직하지 않은 생성물의 형성을 현저히 제거한 증폭 방법을 갖는 것이 바람직할 것이다.
대개 필요한 Tm 범위를 갖는 프라이머는 새롭게 설계되어야 한다. 따라서, 전통적인 PCR 분석법의 사용자가 속도를 높이기를 원할지라도, 더 좁은 순환 범위를 얻기 위해 필요한 DFA를 위한 프라이머를 설계, 평가 및 최적화하는 비용은 종종 터무니없어서, 동적 플럭스 증폭에 의해 가능한 속도 증가를 이용하기보다는 사용자를 더 느린 종래의 PCR에 얽매게 한다.
따라서, DFA와 양립할 수 있는 프라이머 및 프로브, 다른 시약 및 방법을 개발하는 요구가 당업계에 존재한다. 구체적으로, DFA 프로토콜에서 사용될 수 있는 프라이머 및 프로브를 개발하는 충족되지 않는 요구가 당업계에 존재한다.
일부 양태에서, 용어 "극단 연쇄 반응" 또는 "XCR"이 본 명세서에서 사용될 것이다. 본 발명자들은 XCR을 DFA에 대한 동의어로 사용한다. 따라서, 두 용어는 교환해서 사용된다.
다중 탐지
단일 반응 내에서 둘 이상의 뚜렷한 증폭 표적을 탐지하는 능력에 대한 최저의 요구는 현대 진단 테스트의 기초적인 양태이다. 비록 일부 테스트는 필수 테스트 성능 제어 수단을 함유하는 개별 반응 용기와 함께 시장에 나올 수 있다. 샘플 처리량 및 시약 사용의 면에서, 단일 반응 용기 내에 반응 제어 수단을 포함시키는 것이 비용 효과적이다. DFA의 효과적인 이용은 이상적으로 하나 이상의 증폭된 표적을 동시에 탐지하는 수단을 필요로 할 것이다.
열 사이클링 범위를 좁히는 동시에 표적 변성 및 프라이머 어닐링 온도를 맞춤 설계할 수 있는 또 다른 결과는 상이한 온도 범위에서 연속적으로 반응 용기를 열 사이클링함으로써 상이한 표적의 증폭이 단일 반응 용기 내에서 수행되게 한다.
PCR 프라이머뿐만 아니라 DFA에 일반적으로 사용된 높은 Tm 및 자주 더 긴 프라이머에 의해 사용하기 위한 프로브 기술은 (모든 목적을 위해 전문이 본 발명에 포함된) WO 2015/054516에 개시되었다.
본 발명의 목적은 상기된 선행기술의 문제점을 해결하는 것이다.
본 발명의 한 양태에서, 본 발명은 표적 핵산의 보다 특이적 증폭을 위해 증가된 용융 온도를 갖는 올리고뉴클레오티드 프라이머를 제공한다.
한 실시태양에서, 중합효소 연쇄 반응(PCR)에서 표적 핵산 서열의 증폭을 위한 올리고뉴클레오티드 프라이머는 다음을 포함한다: 제 1 영역, 여기서 제 1 영역은 표적 핵산 서열의 가닥에 상보적이고 프라이머의 3 '말단에 위치된다; 및 제 2 영역, 여기서 제 2 영역은 프라이머의 5 '말단에 위치된다; 여기서 올리고뉴클레오티드 프라이머의 Tm은 제 1 영역만을 갖는 올리고뉴클레오티드 프라이머의 Tm과 비교하여 증가된다.
다른 실시태양에서, 올리고뉴클레오티드 프라이머는 제 1 및 제 2 영역 사이의 전이를 포함한다. 또 다른 실시태양에서, 전이는 단일 뉴클레오티드, 탄소 사슬, 다기능 모이어티, 변형 뉴클레오티드, 변형 백본 또는 이의 조합을 포함한다.
한 실시태양에서, 올리고뉴클레오티드 프라이머의 용융 온도(Tm)는 표적 핵산 서열의 Tm의 적어도 15℃ 내이다. 또 다른 실시태양에서, 올리고뉴클레오티드 프라이머의 Tm은 표적 핵산 서열의 Tm의 적어도 10℃ 내이다. 또 다른 실시태양에서, 올리고뉴클레오티드 프라이머의 Tm은 표적 핵산 서열의 Tm의 적어도 5℃ 내이다. 또 다른 실시태양에서, 올리고뉴클레오티드 프라이머의 Tm은 표적 핵산 서열의 Tm의 적어도 2.5℃ 내이다. 또 다른 실시태양에서, 올리고뉴클레오티드 프라이머의 Tm은 표적 핵산 서열의 Tm과 동일하다.
한 실시태양에서, 올리고뉴클레오티드 프라이머의 제 2 영역은 올리고뉴클레오티드 프라이머의 표적 핵산 영역에 대한 어닐링을 최적화하기 위한 뉴클레오티드 또는 주쇄 변형을 포함한다.
한 실시태양에서, 제 2 영역은 표적 핵산 서열의 어느 한 가닥에 상보적이지 않은 임의의 서열이다.
한 실시태양에서, 제 2 영역은 제 1 영역이 상보적인 표적 핵산 서열의 가닥에 반대인 표적 핵산 서열의 가닥에 상보적이다. 다른 실시태양에서, 제 2 영역은 폴리머라제에 의한 절단을 억제하기 위한 절단가능한 화학제를 포함한다.
한 실시태양에서, 올리고뉴클레오티드 프라이머는 구아노신 뉴클레오티드의 제 1 서열에 인접한 시토신 뉴클레오티드의 서열을 포함한다. 다른 실시태양에서, 시토신과 구아노신 뉴클레오티드 사이의 뉴클레오티드의 수는 5 미만이다. 다른 실시태양에서, 시토신과 구아노신 뉴클레오티드 사이의 뉴클레오티드의 수는 4 미만이다. 다른 실시태양에서, 시토신과 구아노신 뉴클레오티드 사이의 뉴클레오티드의 수는 3 미만이다. 다른 실시태양에서, 시토신과 구아노신 뉴클레오티드 사이의 뉴클레오티드의 수는 2 미만이다. 다른 실시태양에서, 시토신과 구아노신 뉴클레오티드 사이의 뉴클레오티드의 수는 0이다. 다른 실시태양에서, 프라이머는 구아노신 사중체 구조를 형성할 수 있다.
한 실시태양에서, 올리고뉴클레오티드 프라이머는 구아노신 뉴클레오티드의 제 1 서열에 인접한 구아노신 뉴클레오티드의 제 2 서열을 추가로 포함한다. 다른 실시태양에서, 구아노신 뉴클레오티드의 제 2 서열은 프라이머를 이동시키고 구아노신 사중체 구조를 형성한다.
본 발명의 다른 양태에서, 본 발명은 DNA의 하나 이상의 단편으로부터의 표적 핵산 서열을 동정하는 단계; 제 1 영역 및 제 2 영역을 가진 올리고뉴클레오티드 프라이머를 설계하는 단계를 포함하는 중합효소 연쇄 반응(PCR)에서 표적 핵산 서열의 증폭을 위한 올리고뉴클레오티드 프라이머의 용융 온도(Tm)를 증가시키는 방법을 제공하며, 제 1 영역은 표적 핵산 서열의 가닥에 상보적이고 프라이머의 3' 말단에 위치하고 제 2 영역은 프라이머의 5' 말단에 위치한다; 올리고뉴클레오티드 프라이머의 Tm은 제 1 영역만을 가진 올리고뉴클레오티드 프라이머의 Tm과 비교하여 증가된다.
본 발명의 다른 양태에서, 본 발명은 표적 및 비 표적 핵산 서열을 포함하는 DNA의 하나 이상의 단편으로부터 표적 핵산 서열을 동정하는 단계; 본 발명의 제 1 올리고뉴클레오티드 프라이머 및 제 2 올리고뉴클레오티드 프라이머를 얻는 단계; 및 표적 핵산 서열 및 제 1 및 제 2 올리고뉴클레오티드 프라이머를 열 사이클링함으로써 표적 핵산 서열을 증폭시키는 단계를 포함하는 핵산 서열 증폭 방법을 제공하며, 여기서 열 사이클링은 (ⅰ) 표적 핵산을 변성하는 단계; (ii) 제 1 올리고뉴클레오티드 프라이머를 변성된 표적 핵산의 제 1 가닥에 혼성화하고 제 2 올리고뉴클레오티드 프라이머를 변성된 표적 핵산의 제 2 가닥에 혼성화하는 단계; (ⅲ) 폴리머라제로 중합함으로써 제 1 및 제 2 올리고뉴클레오티드 프라이머를 신장시켜 표적 핵산의 2개의 새로운 가닥을 생성하는 단계; (iv) 표적 핵산의 제 1 및 제 2 가닥으로부터 두 개의 새로운 가닥을 변성하는 단계; (v) 제 1 올리고뉴클레오티드 프라이머를 표적 핵산의 제 1 가닥 및 하나의 새로운 가닥에 혼성화하고 제 2 올리고뉴클레오티드 프라이머를 표적 핵산의 제 2 가닥 및 다른 새로운 가닥에 혼성화하는 단계; (vi) 폴리머라제로 중합함으로써 제 1 및 제 2 올리고뉴클레오티드 프라이머를 신장시켜 표적 핵산의 4개의 추가 새로운 가닥을 생성하는 단계; 단계 (i) 내지 (vi)을 반복하여 제 1 및 제 2 올리고뉴클레오티드 프라이머의 제 2 영역을 혼입한 표적 핵산의 다중 가닥을 생성하는 단계를 포함하며, 열 사이클링에서의 상부 열 사이클 온도는 비 표적 변성을 최소화하고 표적 변성을 최대화하도록 선택된다.
핵산 서열 증폭 방법의 한 실시태양에서, 열 사이클링은 변성된 표적 핵산 서열 및 인접한 어닐링된 비 표적 핵산 서열로 이루어진 기포를 생성한다. 다른 실시태양에서, 올리고뉴클레오티드 프라이머는 기포를 넘어서는 표적 핵산 서열의 증폭을 방지한다.
본 발명의 또 다른 양태에서, 본 발명은 DNA의 하나 이상의 단편으로부터 2개 이상의 표적 핵산 서열을 동정하는 단계; 각각의 표적 핵산 서열에 특이적인 한 쌍의 올리고뉴클레오티드 프라이머를 얻는 단계로서, 각 쌍의 올리고뉴클레오티드 프라이머는 이의 표적 핵산 서열의 변성 곡선(TD)과 중첩하는 어닐링 곡선(TA)을 가져서, 이런 방식으로 올리고뉴클레오티드 프라이머의 쌍의 더 높은 용융 온도와 이의 표적 핵산 서열의 용융 온도 사이의 온도 범위를 최소화한다; 각 쌍의 올리고뉴클레오티드 프라이머 및 이의 표적 핵산 서열을 특정 온도 범위 내에서 열 사이클링함으로써 각각의 표적 핵산 서열을 증폭시키는 단계로서, 상이한 온도 범위에서 연속적인 열 사이클링이 2개 이상의 표적 핵산 서열의 증폭을 유도한다; 및 2개 이상의 증폭된 표적 핵산 서열을 탐지하는 단계를 포함하는 샘플에서 2개 이상의 표적 핵산 서열을 증폭하고 탐지하는 방법을 제공한다.
샘플에서 2개 이상의 표적 핵산 서열을 증폭 및 탐지하는 방법의 한 실시태양에서, 각각의 증폭된 표적 핵산 서열은 약 400 bp 이상이다. 다른 실시태양에서, 하나 이상의 온도 적합한 폴리머라제가 각각의 온도 범위에 대해 선택된다.
한 실시태양에서, 하나 이상의 표적 핵산 서열은 내부 대조군이다. 다른 실시태양에서, 내부 대조군에 특이적인 한 쌍의 올리고뉴클레오티드 프라이머는 표적 핵산 서열과 상이한 온도 범위에서 내부 대조군의 증폭을 허용하는 미스매치를 제외하고 표적 핵산 서열에 특이적인 한 쌍의 올리고뉴클레오티드 프라이머와 동일하다.
한 실시태양에서, 각 쌍의 올리고뉴클레오티드 프라이머는 자체 열 사이클링 온도 범위에서만 사용된다. 다른 실시태양에서, 각 온도 범위에서 열 사이클링은 각 표적 핵산 서열의 증폭에 필요한 여러 사이클을 포함한다.
한 실시태양에서, 열 사이클링은 최저 온도 범위에서 시작하여 최고 온도 범위로 이동하는 온도 범위에서 연속적으로 사이클링하는 단계를 포함한다. 다른 실시태양에서, 열 사이클링은 가장 높은 온도 범위에서 시작하여 최저 온도 범위로 이동하는 온도 범위에서 연속적으로 사이클링하는 단계를 포함한다.
한 실시태양에서, 하나 이상의 온도 범위들 사이에 중첩이 존재한다. 다른 실시태양에서, 열 사이클링은 약 50℃ 내지 약 65℃, 약 60℃ 내지 약 95℃ 및 약 90℃ 내지 약 105℃의 온도 범위를 포함한다. 다른 실시태양에서, 열 사이클링은 약 45℃ 내지 약 72℃ 및 약 72℃ 내지 약 99℃의 온도 범위를 포함한다. 다른 실시태양에서, 열 사이클링은 약 54℃ 내지 약 63℃, 약 63℃ 내지 약 81℃ 및 약 81℃ 내지 약 99℃의 온도 범위를 포함한다.
샘플에서 2개 이상의 표적 핵산 서열을 증폭 및 탐지하는 방법의 한 실시태양에서, 탐지하는 단계는 형광 염료, 전기 화학적 지시자, 표적 고정화 전략 또는 이의 임의의 조합을 사용하는 것을 포함한다.
한 실시태양에서, 증폭 단계는 각 쌍의 올리고뉴클레오티드 프라이머, 이의 표적 핵산 서열 및 표적 핵산 서열에 상보적이고 절단 가능한 서열을 가진 올리고뉴클레오티드 프로브를 열 사이클링하는 단계를 추가로 포함한다. 또 다른 실시태양에서, 각각의 올리고뉴클레오티드 프로브는 각 프로브의 5' 또는 3' 말단에 상호교환 가능하게 위치된 형광 염료 및 소광제를 포함한다. 다른 실시태양에서, 각 올리고뉴클레오티드 프로브는 각 프로브의 5' 또는 3' 말단에 상호교환 가능하게 위치된 동일한 형광 염료를 포함한다. 다른 실시태양에서, 각 올리고뉴클레오티드 프로브의 절단 가능한 서열은 중합 독립적 절단에 의해 또는 폴리머라제에 의한 중합 의존성 절단에 의해 절단된다. 다른 실시태양에서, 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 프로브는 하이브리드 헤어핀/절단 프로브이다.
샘플에서 2개 이상의 표적 핵산 서열을 증폭 및 탐지하는 방법의 한 실시태양에서, 탐지 단계는 상기 프로브의 절단으로부터 생성된 신호를 탐지하는 단계를 포함한다.
샘플에서 2개 이상의 표적 핵산 서열을 증폭 및 탐지하는 방법의 한 실시태양에서, 증폭 단계는 각 쌍의 올리고뉴클레오티드 프라이머, 이의 표적 핵산 서열 및 표적 핵산 서열에 상보적이고 절단 가능한 서열을 가진 올리고뉴클레오티드 프로브를 열 순환하는 단계를 더 포함하며, 2개 이상의 표적 핵산 서열은 세모편모충(Trichomonas) 서열 및 곤충병원세균(Xenorhabdus nematophila) 서열을 포함한다. 다른 실시태양에서, 곤충병원세균 서열은 대조 서열이다. 다른 실시태양에서, 세포편모충 서열에 특이적인 올리고뉴클레오티드 프라이머의 쌍은 SEQ ID NO: 56 및 SEQ ID NO: 57을 포함한다. 다른 실시태양에서, 세포편모충 서열에 상보적인 올리고뉴클레오티드 프로브는 SEQ ID NO: 59를 포함한다. 다른 실시태양에서, 곤충병원세균 서열에 특이적인 올리고뉴클레오티드 프라이머의 쌍은 SEQ ID NO: 51 및 SEQ ID NO: 52를 포함한다. 다른 실시태양에서, 곤충병원세균 서열에 상보적인 올리고뉴클레오티드 프로브는 SEQ ID NO: 53을 포함한다. 다른 실시태양에서, 열 사이클링은 약 89℃ 내지 약 74℃ 및 약 63℃ 내지 약 78℃의 온도 범위를 포함한다. 다른 실시태양에서, 약 89℃ 내지 약 74℃의 열 사이클링은 세모편모충 서열을 증폭시킨다. 다른 실시태양에서, 약 63℃ 내지 약 78℃의 열 사이클링은 곤충병원세균 서열을 증폭시킨다.
한 실시태양에서, 소에서 세모편모충을 탐지하는 방법은 세모편모충 표적 핵산 서열에 특이적인 한 쌍의 올리고뉴클레오티드 프라이머를 얻는 단계; 곤충병원세균 대조 핵산 서열에 특이적인 한 쌍의 올리고뉴클레오티드 프라이머를 얻는 단계로서, 각 쌍의 올리고뉴클레오티드 프라이머는 이의 표적 핵산 서열의 변성 곡선(TD)과 중첩하는 어닐링 곡선(TA)을 가져서, 이런 방식으로 올리고뉴클레오티드 프라이머의 쌍의 더 높은 용융 온도와 이의 표적 핵산 서열의 용융 온도 사이의 온도 범위를 최소화한다; 각 쌍의 올리고뉴클레오티드 프라이머 및 이의 표적 핵산 서열을 특정 온도 범위 내에서 열 사이클링함으로써 각각의 표적 핵산 서열을 증폭시키는 단계로서, 상이한 온도 범위에서 연속적인 열 사이클링이 세모편모충 및 곤충병원세균 서열의 증폭을 유도한다; 및 증폭된 표적 핵산 서열을 탐지하는 단계를 포함한다.
샘플에서 2개 이상의 표적 핵산 서열을 증폭 및 탐지하는 방법의 한 실시태양에서, 각 쌍의 올리고뉴클레오티드 프라이머의 하나 또는 모두는 삼중체 형성 영역(TFR)을 포함한다. 다른 실시태양에서, TFR 프라이머는 표적 핵산 서열이 TFR 프라이머의 서열과 상보성을 갖는 서열을 포함할 때 삼중체 형성 DNA의 가닥을 생성한다. 다른 실시태양에서, 표적 핵산 서열은 천연 삼중체 형성 영역을 포함한다.
샘플에서 2개 이상의 표적 핵산 서열을 증폭 및 탐지하는 방법의 한 실시태양에서, 각 쌍의 올리고뉴클레오티드 프라이머의 하나 또는 모두는 표지를 추가로 포함한다.
한 실시태양에서, 상기 방법은 하나 이상의 TFR에 혼성화하여, 하나 이상의 TFR 프라이머에 의한 표적 핵산 서열의 증폭 과정 동안 생성된 이중 가닥 DNA 서열에서 삼중체를 형성하는 하나 이상의 삼중체 형성 올리고뉴클레오티드(TFO) 프로브를 추가로 포함한다. 다른 실시태양에서, TFO 프로브는 TFR 프라이머의 Tm과 거의 동일하거나 더 낮은 온도에서 어닐링하도록 설계된다. 다른 실시태양에서, 상기 방법은 혼성화된 삼중체 DNA와 결합하는 하나 이상의 비특이적 DNA 결합 염료를 추가로 포함한다. 다른 실시태양에서, 상기 방법은 하나 이상의 사중체 결합 염료를 추가로 포함한다.
한 실시태양에서, 각각의 TFO 프로브는 형광 모이어티, 방사성 모이어티, 컬러 모이어티, 형광 리포터 모이어티, 형광 소광 모이어티, 한 쌍의 형광 공명 에너지 전달 모이어티의 하나 및 이의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 표지 모이어티를 포함한다. 다른 실시태양에서, 하나 이상의 TFO 프로브는 삼중체 형성 형광 프로브(TFFP)이다. 다른 실시태양에서, 하나 이상의 TFO 프로브는 삼중체 형성 형광 프로브(TFFP)이고 이중 가닥 DNA는 리셉터 염료를 갖는다. 다른 실시태양에서, 표지 모이어티는 각각의 TFO 프로브에 대해 동일하다. 또 다른 실시태양에서, TFO 프로브의 3 '말단의 캡은 프로브의 3' 말단으로부터의 신장을 억제한다.
한 실시태양에서, 이중 가닥 DNA는 제 1 표지를 갖고 TFO 프로브는 제 2 표지를 가지며, 제 1 표지 및 제 2 표지는 가까운 결합시 탐지 가능한 방출을 제공한다.
한 실시태양에서, TFO 프로브는 형광 염료 및 소광제를 포함한다. 다른 실시태양에서, TFO 프로브는 헤어핀 형태의 형광 염료 및 소광제를 포함한다.
또한 상기 올리고뉴클레오티드, 프라이머, 프로브 및 반응 시약 중 임의의 것을 포함하는 키트가 제공된다.
본 발명의 실시태양들의 이런 및 다른 특징, 양태 및 이점은 아래 설명된 이하 상세한 설명, 청구항 및 첨부 도면과 관련하여 더욱 잘 이해될 것이다.
본 발명의 내용 중에 포함되어 있다.
도 1a 및 1b는 겹쳐진 프라이머 어닐링 온도 및 주형 변성 온도에 대한 디자인의 그래프 도면(도 1a) 및 겹쳐지지 않은 프라이머 어닐링 온도 및 주형 변성 온도에 대한 디자인의 그래프 도면(도 1b)을 도시한다.
도 2는 실시간 PCR에 의한 통상적인 증폭 생성물의 예시이다.
도 3은 도 2에 사용된 동일한 주형의 고온 PCR 증폭을 도시하는 그래프이다.
도 4는 다른 출발 재료 농도를 사용하여 동일한 주형 재료의 HTPCR 증폭을 도시하는 그래프이다.
도 5는 반응이 표적 서열의 변성 온도에 근접한 온도로 가열됨에 따라 "기포"(16)의 생성을 도시한다.
도 6은 기포의 한 말단에서 DNA 가닥(24)에 어닐링된 제 1 프라이머(32)를 갖는 기포(16)를 도시한다. 프라이머(32)는 상보적 DNA 가닥(28)에 어닐링하는 제 1 차단 태그(42)를 갖는다. 제 2 프라이머(38)는 기포의 다른 말단에서 DNA 가닥(28)에 어닐링된다. 프라이머(38)는 상보적 DNA 가닥(24)에 어닐링하는 제 2 차단 태그(46)를 갖는다.
도 7은 차단 태그를 갖는 프라이머를 사용하는 증폭의 신장 단계를 도시한다. 제 1 프라이머(32)는 제 2 차단 태그(46)의 방향으로 산장되어, 제 2 차단 태그(46)를 넘어 쉽게 신장할 수 없는 신장부(50)를 생성한다. 유사하게, 제 2 프라이머(38)는 제 1 차단 태그(42)의 방향으로 신장되어, 제 1 차단 태그(42)를 넘어 쉽게 신장할 수 없는 신장부(54)를 생성한다.
도 8a-8c는 차단 태그를 갖는 프라이머를 사용하는 증폭의 제 2 사이클을 도시한다. 도 8a는 증폭의 제 1 사이클로부터의 두 개의 신장 생성물을 도시한다. 태그(태그(42) 또는 태그(46))가 프라이머(프라이머(32) 또는 프라이머 (38))로 전환되는 지점은 전이를 나타내기 위해 T로 표시된다. 도 8b는 태그(66)를 포함하는 새로운 프라이머(58)의 신장부(50)의 3' 말단에 대한 어닐링에 의한 신장부(70)의 증폭을 도시한다. 도 8c는 태그(42)를 포함하는 프라이머(32)의 신장부(54)의 3' 말단에 대한 어닐링에 의한 신장부(79)의 증폭을 도시한다.
도 9는 차단 태그를 갖는 프라이머를 사용하는 증폭의 제 3 사이클을 도시한다. 주형으로서의 신장부(70) 생성물에 의해, 태그(74)를 포함하는 프라이머(78)은 신장부(70)의 3 '말단에 어닐링되고 증폭은 표적 서열의 다른 완전한 복제물과 표적 서열의 양 말단 상의 태그(74 및 66)를 생성한다.
도 10은 임의의 서열을 갖는 태그를 포함하는 프라이머를 사용하는 증폭에서의 제 1 사이클을 도시한다. 태그(80)는 프라이머(84)에 첨부된다. 태그(80)는 표적 서열(88)에 인접한 임의의 DNA 가닥에 해당하지 않고 오히려 약간의 임의의 올리고뉴클레오티드 서열을 나타낸다. 제 1 사이클에서, 프라이머(84)는 표적 서열 (88)에 결합하고 표적 서열(88)을 완전히 가로질러 신장되어, 프라이머(84), 신장 물(90) 및 태그(80)를 포함하는 올리고뉴클레오티드(94)를 생성한다. 제 1 사이클에서, 태그(80)는 표적 서열(88)에 결합한다.
도 11은 임의의 서열을 갖는 태그를 포함하는 프라이머를 사용하는 증폭에서의 제 2 사이클을 도시한다. 제 2 사이클에서, 올리고 뉴클레오티드(94)는 새로운 프라이머(96) 및 태그(98)에 결합한다. 새로운 태그(98)는 올리고뉴클레오티드(94) 상에 결합하는 상보적인 서열을 갖지 않는다. 프라이머(96)는 올리고뉴클레오티드 (94)의 말단까지 신장되어, 올리고뉴클레오티드(94)의 태그(80), 프라이머(84) 및 신장부(90)의 재생물을 포함하는 복제 올리고뉴클레오티드(99)를 생성한다. 이 복제 올리고뉴클레오티드는 한 말단 상에 태그(80)의 복제물 및 반대 말단 상에 태그(98)를 포함한다.
도 12는 임의의 서열을 갖는 태그를 포함하는 프라이머를 사용하는 증폭에서 제 3 사이클을 도시한다. 제 3 사이클에서, 새로운 태그(100) 및 프라이머(104)는 복제된 올리고뉴클레오티드(99)에 결합한다(새로운 프라이머(104) 및 태그(100)는 프라이머(84) 및 태그(80)와 서열이 동일하다는 것에 유의한다). 프라이머 신장부 (106)는 태그(98)의 말단까지 신장되어 완전한 복제물을 생성한다.
도 13은 G-사중체의 형성을 위한 하나의 메커니즘의 초기 단계를 도시한다. 이 메커니즘에서, 프라이머(130)는 표적 기포(134)의 한 말단과 접촉하도록 설계되며, 기포는 주로 GC 서열을 포함한다. 프라이머(130)는 표적의 GC 서열을 보완하기 위한 GC 서열로 설계된다.
도 14는 높은 GC 함량을 포함하는 영역에서 호그스틴 쌍을 형성하여 G 사중체가 가닥을 접는 과정을 통해 형성되어 G를 G와 정렬시키는 G와 G의 비 통상적인 혼성화를 도시한다.
도 15는 G 사중체 형성을 도시한다. 변위된 C 서열(138)은 표적에서 임의의 상보적인 서열에 결합되지 않으며, 기포를 지나치는 프라이머의 임의의 신장에 대한 고체 차단제로서 작용하는 접힌 형태로 비틀린다.
도 16은 3' 말단에 인접하고 프라이머(130)의 사중체 형성 영역에 인접한 프라이머 내부에 부가된 G의 서열(140)을 도시한다. G의 이 서열(140)은 표적(148)의 제 1 가닥 상에서 이에 인접한 C의 서열(144)에 끌어 당겨진다. 이런 인력은 프라이머에 추가된 운동력을 제공하여 G 사중체를 형성한다.
도 17은 G 사중체 형성을 도시한다. G의 서열(140)은 표적(148)의 제 1 가닥상의 C의 서열(144)과 쌍을 이루도록 이동한다. 변위된 C 서열(138)은 표적에서 임의의 상보적인 서열에 결합되지 않으며, 기포를 지나치는 프라이머의 임의의 신장에 대한 고체 차단제로서 작용하는 접힌 형태로 비틀린다.
도 18은 기포를 넘어서는 신장을 차단하는 G-사중체 구조를 형성하기 위한 마이코박테리움 아비움 subsp. 파라투베르쿨로시스 str(Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis str.) k10 서열(SEQ ID NO: 21)에 대한 프라이머(SEQ ID NO: 22 및 23)의 혼성화를 나타낸다.
도 19는 첫 번째로 높은 AT 핵산 영역의 증폭, 두 번째로 정상적인 핵산 영역(전통적인 PCR 온도 범위에 의해 증폭된 영역), 세 번째로 높은 GC 핵산 영역의 증폭에 대한 열 프로파일을 도시한다.
도 20은 첫 번째로 높은 GC 핵산 영역의 증폭, 두 번째로 정상적인 핵산 영역(전통적인 PCR 온도 범위에 의해 증폭된 영역), 세 번째로 높은 AT 핵산 영역의 증폭에 대한 열 프로파일을 도시한다.
도 21은 약 45℃ 내지 약 72℃에서 핵산 영역의 증폭 및 약 72℃ 내지 약 99℃에서 핵산 영역의 증폭에 대한 열 프로파일을 도시한다.
도 22는 약 54℃ 내지 약 63℃에서 핵산 영역의 증폭; 약 63℃ 내지 약 81℃에서 핵산 영역의 증폭; 및 약 81℃ 내지 약 99℃에서 핵산 영역의 증폭에 대한 열 프로파일을 도시한다.
도 23은 5개의 상이한 유기체로부터의 5개의 상이한 핵산 표적의 증폭에 대한 열 프로파일을 도시한다. 낮은 온도에서 높은 온도까지 5개 표적의 각각에 대한 하나의 온도 범위로서 5개의 구별된 온도 범위가 존재한다.
도 24는 5개의 상이한 유기체로부터의 5개의 상이한 핵산 표적의 증폭에 대한 열 프로파일을 도시한다. 낮은 온도에서 높은 온도까지 5개 표적의 각각에 대한 하나의 온도 범위로서 5개의 구별된 온도 범위가 존재한다.
도 25는 실시예 4에 기술된 증폭의 형광 이력 및 온도 이력을 도시한다.
도 26은 실시예 4에 기술된 증폭의 형광 이력 및 온도 이력을 도시한다.
도 27은 세모편모충(Trichomonas foetus) 표적 및 반응 대조군 주형 곤충병원세균(Xenorhabdus nematophila)의 증폭에 대한 예시적인 열 프로파일을 도시한다.
도 28은 세모편모충(Trichomonas foetus) 표적 및 반응 대조군 주형 곤충병원세균(Xenorhabdus nematophila)의 증폭에 대한 예시적인 열 프로파일을 도시한다.
도 29는 세모편모충(Trichomonas foetus) 표적 및 반응 대조군 주형 곤충병원세균(Xenorhabdus nematophila)의 증폭에 대한 예시적인 열 프로파일을 도시한다.
도 30은 세모편모충(Trichomonas foetus) 표적 및 반응 대조군 주형 곤충병원세균(Xenorhabdus nematophila)의 증폭에 대한 예시적인 열 프로파일을 도시한다.
도 31a 및 31b는 세모편모충(Trichomonas foetus) 표적 및 반응 대조군 주형 곤충병원세균(Xenorhabdus nematophila)의 증폭에 대한 예시적인 열 프로파일을 도시한다.
도 32는 본 발명에 따른 절단 프로브 기술의 일반적인 실시태양이다.
도 33은 바토페난트롤린-RU II 복합체가 표지 분자로서 사용되는 실시태양에서 절단 프로브 기술을 도시한다.
도 34는 이중 혼성화 프로브 및 프라이머 조합을 도시한다.
도 35는 FRET에 참여할 수 있는 프라이머/프로브 조합을 도시한다.
도 36은 염료(직사각형)가 프라이머의 길이를 따라 대략 6-9개 뉴클레오티드 떨어져 분리되나, 3' 말단 상에 염료 없이 충분한 뉴클레오티드가 남겨진, 포워드(상부) 및 리버스(하부)를 예시한다. 프라이머가 보체와 결합할 때, 형광 소광이 방출되어서 탐지가능한 신호가 형성된다.
도 37은 소광된 포워드 프라이머-다이머 복합체(상부), 소광된 리버스 프라이머-다이머 복합체(중간) 및 포워드 및 리버스 프라이머의 일괄 결합에 의해 형성된 프라이머-다이머 복합체(하부)를 예시하며, 이는 FRET 신호를 통해 탐지가능하다. 직사각형은 염료를 나타낸다.
도 38은 포워드 프라이머 주형 형성 신호(상부), 리버스 프라이머 주형 형성 신호(중간) 및 포워드 및 리버스 프라이머가 표적화된 주형을 생산할 때 발생된 신호(하부)를 예시한다. 직사각형은 염료를 나타낸다.
도 39는 두 염료 표지화 프라이머를 가진 정확한 생성물은, 증폭 생성물의 형성에서 서로 직접 연결될 것이며 2개의 형광 채널에서 동시에 관찰될 것이기 때문에, 동일한 반응 형성 효율을 가진 뚜렷한 염료로부터의 형광 신호의 형성을 나타낼 것이다.
도 40은 증폭된 생성물이 형성되고 두 형광 신호가 증폭 생성물에 의해 발생되는 본 발명의 디자인 전략의 데이터 평가 이점을 예시한다. 유사 프라이머가 소광될 것과 같이, FRET를 초래하는 임의의 프라이머-다이머 신호는 형성된 신호로부터 제거되어 증폭 신호의 기준 정규화를 가능하게 할 수 있다. 포워드 및 리버스 프라이머 신호는 S자형 곡선을 형성한다. 제거될 프라이머-다이머 신호는 그래프의 하부에 직선으로 예시된다.
도 41은 삼중체 형성 영역(TFR) 프라이머가 표적 서열의 증폭에 참여하여, 길이를 따르며 표적 서열에 부착된 삼중체 형성 DNA의 가닥을 형성하는 것을 예시한다.
도 42는 삼중체 형성 올리고뉴클레오티드(TFO) 프로브의 3' 말단이 덮이는 삼중체 형성 올리고뉴클레오티드 프로브를 예시한다.
도 43은 삼중체 형성 영역을 포함하는 이중 가닥 DNA 서열을 도시한다. 이중 가닥 DNA 서열은 억셉터 염료를 소유한다. TFFP의 TFR은 이중 가닥 DNA의 삼중체 형성 영역에 부착된다.
도 44는 TFO 프로브, 본 예에서, TFO 프로브의 말단 상의 특정 위치에 대한 공유 결합에 의해 제약된 결합 염료는 TFO 프로브가 결합되어, 관심 증폭 서열에 부착된 염료에 가깝게 TFO 프로브에 놓일 때 혼성화된 DNA 구조에 결합될 수 있다는 것을 예시한다. 따라서, 형광 신호는 증폭이 발생하였다는 것을 나타낸다.
도 45는 본 실시태양에서 TFO 프로브는 헤어핀 염료 및 소광제 구성을 사용하는 것을 도시한다.
도 46은 동일한 TFR 서열을 가진 둘 이상의 프라이머는 TFR 서열에 상보적인 서열을 포함하는 TFR 프라이머와 함께 사용될 수 있다는 것을 예시한다.
도 47은 6개 프라이머가 각각 2개의 3개 세트로 나뉜 실시태양을 도시한다.
도 48은 도너 염료는 제 1 프라이머의 3' 말단 근처에 부착되는 반면, 억셉터 염료는 제 2 프라이머의 3' 말단 근처에 부착되는 것을 도시한다. 어닐링 단계에서, 프라이머는 거의 꼬리-대-꼬리 배열로 이들의 표적 서열에 혼성화되며, 이것이 FRET가 일어나기에 충분히 가깝게 염료를 가져온다.
이하의 설명과 표에서, 여러 용어는, 이런 용어에 의해 제공된 범위를 포함하는 상세한 설명과 청구항의 분명하고 일치하는 이해를 제공하기 위해서, 사용되며, 다음 정의가 제공된다.
정의
실질적으로 임의의 복수 및/또는 단수 형태의 사용과 관련하여, 당업자는 내용 및/또는 출원에 대해 적절한 것과 같이 복수로부터 단수 및/또는 단수로부터 복수로 해석할 수 있다. 다양한 단수/복수 치환은 명쾌함을 위해 본 발명에서 명백하게 설명될 수 있다.
용어 하나("a" 또는 "an")는 하나 이상의 존재를 의미한다; 예를 들어, "한 프라이머"는 하나 이상의 프라이머 또는 적어도 하나의 프라이머를 의미한다. 이와 같이, 하나("a" 또는 "an"), "하나 이상" 및 "적어도 하나"는 본 발명에서 서로 교환하여 사용된다. 또한, 부정관사에 의한 "한 요소"에 대한 언급은, 내용이 분명하게는 요소의 하나 및 단지 하나가 존재하는 것을 요구하지 않는 한, 하나 이상의 요소가 존재하는 가능성을 배제하지 않는다.
본 발명에 사용된 대로 용어 "인접한"은 뉴클레오티드가 직접 서로 인접할 수 있는 주형 핵산의 상보적 가닥 상의 프로브에 대한 프라이머의 위치선정을 의미한다. 선택적으로, 중합-의존성 방법에서 사용하기 위해, 본 발명에 교시된 대로, 본 방법이 PCR과 DFA 및 탐지 방법에서 사용될 때와 같이, "인접"은 증폭될 서열 내의 임의의 위치, 프라이머의 하류 임의의 곳일 수 있어서, 프라이머 신장은 프로브의 절단이 일어나도록 폴리머라제를 위치시킬 것이다.
본 발명에 사용된 용어 "대립 유전자"는 한 형질 또는 특징과 관련된 유전자의 하나 이상의 대안 형태의 임의의 것이다. 이중 세포 또는 유기체에서, 소정의 유전자의 2개의 이중 세포는 상동 염색체의 쌍 위의 상응하는 좌위를 차지한다.
본 발명에 사용된 용어 "아미노산 서열"은 식물에 고유한 또는 자연적으로 발생하는 것으로부터 분리되거나 합성적으로 만들어지나 내인성 대응물의 핵산 서열을 포함하는 올리고펩티드, 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질 및 이의 단편을 포함한다.
본 발명에 기술된 "생물학적 샘플"은 가래(예를 들어, 객담), 혈액, 혈액 세포(예를 들어, 림프구), 조직, 생검, 배양 세포, 흉수, 복수 또는 뇌척수, 땀, 대변 및 소변을 포함하나 이에 제한되지 않는 피험자로부터 채취한 임의의 생물학적 재료를 포함할 수 있다. 일부 실시태양에서, 피험자로부터의 생물학적 샘플은, 본 발명에 제공된 방법에 따라 분석되기 전에, 예를 들어, 감염성 미생물을 배양 및/또는 이의 유전 재료를 증폭하도록 처리된다.
용어 "생체발광"은 발광 화합물이 살아있는 유기체에서 발견되는 것인 한 형태의 화학발광을 의미한다. 생체발광 화합물의 예는 박테리아 루시페라제 및 반딧불이 루시페라제를 포함한다.
본 발명에 사용된, 용어 "약물"은 임의의 화합물, 물질, 처리 방법 또는 이의 조합을 의미할 수 있다. 일부 바람직한 양태에서, 약물은 항생 화합물이다.
본 발명에 사용된 용어 "효율"은 실시간 PCR 분석의 품질 증명을 의미한다. 이상적인 qPCR(정량적 PCR) 반응은 -3.32의 기울기를 가진 100%의 효율을 가지며, 이는 각 사이클 동안 PCR 생성물의 완벽한 두 배와 상관이 있다. 그러나, 90 내지 110% 사이의 효율을 가진 -3.1 내지 -3.6의 기울기는 일반적으로 허용가능한 것으로 생각된다(Commission, C. A. (2009). Definition of Minimum Performance Requirements for Analytical Methods of GMO Testing European Network of GMO Laboratories(ENGL), (October 2008), 1-8). 효율은 복제된 표준 곡선에 의해 만들어진다. 증폭 효율은 표준 곡선의 로그-선형 부분의 기울기로부터 측정되며 E= (10(-1/slope) -1)*100로 계산된다. (Bustin, S. A., et al. (2009). MIGE 가이드라인: Minimum I nformation for Publication of Quantitative Real-Time PCR Experiments. Clinical Chemistry, 55(4), 1-12. doi:10.1373/clinchem. 2008.112797).
용어 "형광체"는 형광할 수 있는, 즉 한 주파수에서 빛을 흡수하고 다른, 일반적으로 더 낮은 주파수에서 빛을 방출할 수 있는 화합물을 의미한다.
다단계 공정에 사용된 본 발명에 사용된 용어 "균질한"은 공정의 단계를 실행하기 위한 방법을 의미하며, 단계들 사이의 샘플 처리 및 조작에 대한 필요가 최소화 또는 제거된다. 예를 들어, "균질" 증폭/탐지 분석법은 결합된 증폭 및 탐지 분석법을 의미하며 증폭과 탐지 사이의 샘플 처리 및 조작에 대한 필요는 최소화되거나 제거된다.
용어 "삽입 물질"은 핵산 이중 나선에서 적층된 염기쌍 사이에 비-공유 삽입이 가능한 물질 또는 모이어티를 의미한다.
본 발명에 사용된 용어 "표지"는 탐지가능한(바람직하게는 정량가능한) 신호를 제공하는데 사용될 수 있고, 핵산 또는 단백질에 부착될 수 있는 임의의 원자 또는 분자를 의미한다. 표지는 형광, 인광, 화학발광, 전기화학, 방사성, 측색법, 중량측정, X-레이 회절 또는 흡수, 자성, 효소 활성 등에 의해 탐지가능한 신호를 제공할 수 있다.
본 발명에 사용된 용어 "선형성"은 최적화된 실시간 PCR 분석의 품질 증명을 의미하며 선형 회귀 분석에 의해 얻은 R2 값에 의해 측정되며, ≥0.98이어야 한다(Bustin et al., 2009).
본 발명에 사용된 용어 "미생물"은 박테리아, 고세균, 곰팡이, 단세포 동물, 기생충 및/또는 바이러스를 의미할 수 있다.
용어 "핵산" 및 "올리고뉴클레오티드"는 탐지될 프라이머, 프로브 및 올리고머 단편을 의미하며, 폴리데옥시리보뉴클레오티드(2-데옥시-D-리보오스 함유), 폴리뉴클레오티드(D-리보오스 함유) 및 퓨린 또는 피리미딘 염기 또는 변형 퓨린 또는 피리딘 염기의 N 글리코시드를 함유하는 임의의 다른 형태의 폴리뉴클레오티드에 대해 특유해야 한다. 용어 "핵산"과 "올리고뉴클레오티드" 사이에서 길이의 의도한 차이는 없고 이런 용어는 서로 교환하여 사용될 것이다. 이런 용어는 분자의 주요 구조만을 언급한다. 따라서, 이런 용어는 이중 및 단일 가닥 DNA뿐만 아니라 이중 및 단일 가닥 RNA를 포함한다.
올리고뉴클레오티드는 임의의 존재하는 또는 자연적 서열로부터 반드시 물리적으로 유래되지 않으나 화학적 합성, DNA 복제, 역전사 또는 이의 조합을 포함하는 임의의 방식으로 생성될 수 있다. 용어 "올리고뉴클레오티드"는 이의 기원 또는 조작에 의해: (1) 자연적으로 결합하는 폴리뉴클레오티드의 전부 또는 일부와 결합하지 않고; 및/또는 (2) 자연적으로 연결되는 것 이외의 폴리뉴클레오티드에 연결되며, (3) 자연적으로 발견되지 않는 게놈 DNA 또는 RNA, cDNA, 반합성 또는 합성 기원의 폴리뉴클레오티드를 의미한다.
본 발명에 사용된 핵산 서열의 보체는 핵산 서열과 정렬되어 한 서열의 5' 말단이 다른 것의 3' 말단과 쌍을 이룰 때, "역평행 결합" 상태인 올리고뉴클레오티드를 의미한다. 자연 핵산에서 일반적으로 발견되지 않는 특정 염기는 본 발명의 핵산에 포함될 수 있고, 예를 들어, 이노신 및 7-데사구아닌을 포함할 수 있다. 상보성은 완벽할 필요가 없으며; 안정한 이중체는 미스매치 염기쌍 또는 언매치 염기를 함유할 수 있다. 핵산 기술의 당업자는, 예를 들어, 올리고뉴클레오티드의 길이, 올리고뉴클레오티드의 염기 조성물 및 서열, 미스매치 염기쌍의 이온 강도 및 발생을 포함하는 여러 변수를 고려하여 실험적으로 이중체 안정성을 결정할 수 있다.
본 발명에 사용된 용어 "표적 핵산(들)"은 감염성 미생물, 인간, 포유류 또는 식물로부터 유래된 핵산을 의미한다. 일부 양태에서, 표적 핵산은 본 발명에 제공된 방법에 따라 분석된 유기체 또는 미생물의 핵산이다.
용어 "표적 영역", "표적 서열" 및 "표적 핵산 서열"은 탐지되거나, 정량되거나, 유전자형이 결정될 핵산의 영역을 의미한다.
본 발명에 사용된 용어 "참조 핵산"은 하나 이상의 서열 변이에 의해 표적 핵산과 다른 표적 핵산에 해당하는(예를 들어, 게놈 DNA의 동일 부분을 나타내는) 핵산을 의미한다. 예를 들어, 일부 양태에서, 참조 핵산은 (예를 들어, 관심 약물에 대한 반응성에 대해) 야생형 미생물의 서열을 가진다. 추가 양태에서, 참조 핵산 서열은, 예를 들어, 인간 암세포를 포함하는 병든 세포와 같은 야생형 인간 세포의 서열을 가진다.
용어 "프라이머"는 하나 초과의 프라이머를 의미할 수 있고, 정제된 제약 분해에서와 같이 자연적으로 발생되거나 합성적으로 생산된 올리뉴클레오티드를 의미할 수 있으며, 핵산 가닥에 상보적인 프라이머 신장 생성물의 합성이 촉매화되는 조건하에서 놓일 때 상보적 가닥을 따라 합성의 개시점으로서 작용할 수 있다. 이런 조건은, 적절한 온도에서, DNA 폴리머라제 또는 역전사효소와 같은 5개의 다른 데옥시리보뉴클레오시드 삼인산염 및 중합-유도제의 존재를 포함한다. 프라이머는 바람직하게는 증폭에서 최대 효율을 위한 단일 가닥이다.
용어 "프로브"는 상보적 염기쌍에 의해 표적 핵산의 서열을 가진 이중 구조를 형성하는 통상적으로 표지화된 올리고뉴클레오티드를 의미한다. 프로브는 표적 서열의 영역에 해당하는, 바람직하게는 30개 이상의 뉴클레오티드 및 일부 경우에, 50개 이상 뉴클레오티드로 이루어진 "혼성화 영역"을 포함할 것이다. 이상적으로, 프로브의 Tm은 관심 서열의 Tm의 30도 이하 내일 것이다. "상응하는"은 지정된 핵산과 동일하거나 상보적인 것을 의미한다. 프로브는, 바람직하게는, PCR을 준비하는데 사용된 서열(들)에 상보적인 서열을 함유하지 않는다. 일반적으로, 프로브의 3' 말단은 프라이머 신장 생성물 속으로 프로브의 일체화를 억제하도록 "차단될" 것이다. "차단"은 비-상보적 염기를 사용하거나 비오틴, 인산염기 또는 형광체와 같은 화학적 모이어티를 선택된 모이어티에 따라, 표지에 부착된 핵산의 후속 탐지 또는 포획을 위한 표지로서 작용함으로써 이중 목적을 만족시킬 수 있는 염기 뉴클레오티드의 3' 하이드록실에 첨가함으로써 얻을 수 있다. 차단은 3'-OH를 제거하거나 다이데옥시뉴클레오티드와 같은 3'-OH가 없는 뉴클레오티드를 사용함으로써 성취될 수 있다.
용어 "소광"은 메커니즘과 무관하게, 제 2 화합물에 의해 유발된 제 1 화합물의 형광의 감소를 의미한다. 소광은 통상적으로 화합물이 가깝게 있는 것을 필요로 한다. 본 발명에 사용된 대로, 화합물 또는 화합물의 형광이 소광된다고 말하며, 두 어법은 동일한 현상을 의미하는 것으로 이해된다.
본 발명에 사용된 용어 "반응성" 및 "약물 반응성"은 비-반응성을 포함하는, 약물의 치료 효과와 관련된, 암세포와 같은 미생물 또는 병든 세포의 저항성, 민감성, 취약성, 내성 및/또는 다른 표현형 특징을 의미할 수 있다. 약물 반응성은, 암세포와 같은 표적화된 미생물 또는 병든 세포에 대한 약물의 효과(예를 들어, 박테리아 사망 또는 세포 사망)에 따라 직접적으로 및/또는 미생물에 의해 유발된 감염 질환의 하나 이상의 양태에 대한 약물의 효과(예를 들어, 질환 또는 질환의 하나 이상의 증상의 예방, 완화, 경감 및/또는 제거)에 따라 간접적으로 평가될 수 있다. 일부 바람직한 양태에서, 시스템과 방법은 하나 이상의 약물에 대한 저항성을 탐지하기 위해 제공되며, 저항성은 유전가능한(유전적) 저항성을 의미한다.
용어 "서열-특이적 올리고뉴클레오티드" 및 "SSO"는 올리고뉴클레오티드 프로브를 의미하며, 혼성화 영역은 탐지될 서열에 정확하게 상보적이다. 이것은 "엄격한 혼성화"로서 공지되어 있다. 프로브가 정확하게 상보적 표적 서열에만 혼성화될 엄격한 혼성화 조건의 사용은 특이적 표적 서열의 탐지를 가능하게 한다. 엄격한 혼성화 조건은 당업계에 주지되어 있다(예를 들어, 참조로 본 발명에 포함된 Sambrook, et al., 1985, molecular cloning - A Laboratory Manual, Cold Springs Harbor, N.Y. 참조). 엄격한 조건은 서열 의존성이며 다른 상황에서 다를 것이다.
핵산과 관련하여 본 발명에 사용된 용어 "서열 변이"는 상응하는 핵산의 서열(예를 들어, 게놈 DNA의 동일한 게놈 또는 다른 부분을 나타내는 서열)의 차이를 의미한다. 일부 실시태양에서, 본 발명에 제공된 다양한 방법에 따라 탐지된 서열 변이는 표적 핵산과 참조 핵산 사이의 단일 뉴클레오티드의 동일성의 차이로부터 기인하는 "단일 뉴클레오티드 다형체"("SNPS")이다. 다른 실시태양에서, 본 발명에 제공된 다양한 방법에 따라 탐지된 서열 변이는 "다중 뉴클레오티드 다형체"를 포함한다. 일부 실시태양에서, 참조 핵산은 비-약물 저항성 표현형에 해당하며 약물 저항성 표현형은 약물 저항 암세포와 같이, 미생물 또는 병든 세포에 의해 감염된 피험자로부터의 생물학적 생물의 참조 핵산과 표적 핵산 사이의 서열을 동정함으로써 본 발명에 제공된 방법에 따라 탐지된다.
본 발명에 언급된 "피험자"는 실험동물(예를 들어, 생쥐, 쥐, 토끼 등) 및 인간을 포함하나 이에 제한되지 않는 미생물을 호스팅할 수 있는 임의의 유기체일 수 있다. 다양한 실시태양에서, 피험자는 감염성 질병을 앓고 있는 인간 환자이다. 다른 실시태양에서, 피험자는 인간 환자와 같은, 유기체 자체이다.
용어 "하부서열"은 다른 서열 내에 함유된 뉴클레오티드 서열을 의미한다.
Tm은 올리고뉴클레오티드의 50%가 분리되는 온도(예를 들어, 정해진 이온 강도 및 pH하에서)이다. 혼성화 조건의 엄격함을 완화하면 서열 미스매치가 허용이다; 이용된 미스매치의 정도는 혼성화 조건의 적절한 조절에 의해 제어될 수 있다.
용어 "가변 서열 요소"는 암 또는 심장 질환과 같은 특정 질환에 대한 저항성, 민감성 및/또는 약물 반응성 또는 경향의 다른 양태 또는 눈 색깔 또는 머리카락 색깔과 같은 더욱 평범한 표현형 특징과 관련이 있는 것으로 알려진 적어도 하나의 서열 변이를 포함하는 일련의 인접 뉴클레오티드로 구성된 핵산(예를 들어, DNA 또는 RNA)의 영역을 의미한다. 예를 들어, 약물 저항성과 관련된 서열 변이는 약물 결합 위치와 같은, 약물 반응성의 구조적 및/또는 기능적 결정체인 상응하는 단백질의 위치를 암호화하는 핵산의 영역에서 주로 발생할 것이다. 공지된 변이를 포함하는 가변 서열 요소(및 주변 뉴클레오티드)는 단백질의 구조적으로 및/또는 기능적으로 관련된 부분(예를 들어, 약물 결합 영역을 포함하는 주머니, 주름 또는 다른 구조)을 암호화할 것이며 가변 서열 요소 내의 추가적이고, 특징적이지 않은 변이는 공지된 변이와 동일한 표현형과 결합할 것이다.
본 발명에 정의한 대로, "5' ----> 3' 뉴클레아제 활성" 또는 "5' to 3' 뉴클레아제 활성"은 뉴클레오티드가 연속적 방식으로 올리고뉴클레오티드의 5' 말단으로부터 제거되는 일부 DNA 폴리머라제와 통상적으로 관련된 5' to 3' 엑소뉴클레아제 활성(즉, 대장균 DNA 폴리머라제 I는 이런 활성을 가지는 반면, 클레나우 단편은 갖지 않는다), 또는 절단이 5' 말단 또는 둘다로부터 하나 초과의 포스포다이에스터 결합(뉴클레오티드)을 일으키는 5' to 3' 엔도뉴클레아제 활성을 포함하는 주형 특이적 핵산 폴리머라제의 활성을 의미한다.
용어 "반응 혼합물"은 반응을 실행하는데 필요한 시약을 함유하는 용액을 의미한다. 증폭을 실생하는데 필요한 시약을 함유하는 용액을 의미하는 "증폭 반응 혼합물"은 통상적으로 적절한 버퍼에 올리고뉴클레오티드 프라이머 및 DNA 폴리머라제를 함유한다. 특정 반응을 위한 반응 혼합물은 문헌에 주지되어 있다.
"단일 반응"은 단지 한 생성물이 단일 반응 용기에서 테스트되는 반응을 의미한다.
"이중 반응"은 두 생성물이 단일 반응 용기에서 테스트되는 반응을 의미한다.
"다중 반응"은 단지 한 생성물이 단일 반응 용기에서 테스트되는 반응을 의미한다.
일반적으로, 본 발명 및 특히 첨부된 청구항(예를 들어, 첨부된 청구항의 본문)에 사용된 용어는 "개방" 용어(예를 들어, 용어 "포함하는"은 "포함하나 이에 제한되지 않는"으로 해석되어야 하며, 용어 "가지는"은 "적어도 가지는"으로 해석되어야 하며, 용어 "포함한다"는 "포함하나 이에 제한되지 않는다" 등으로 해석되어야 한다)로 일반적으로 의도된다는 것은 당업자에게 이해될 것이다. 소개된 청구항 열거의 구체적인 숫자가 의도되는 경우, 이런 의도는 청구항에서 정확하게 열거될 것이며, 이런 열거의 부존재시에 이런 의도는 존재하지 않는다는 것을 당업자가 추가로 이해할 것이다. 예를 들어, 이해에 대한 보조로서, 다음 첨부된 청구항은 청구항 열거를 소개하기 위해 도입구 "적어도 하나" 및 "하나 이상"의 사용을 함유할 수 있다. 그러나, 이런 문구의 사용은 부정관사 "a" 또는 "an"에 의한 청구항 열거의 소개는, 동일한 청구항이 도입구 "하나 이상" 또는 "적어도 하나" 및 "a" 또는 "an"과 같은 부정관사를 포함하는 경우에도, 단지 하나의 이런 열거를 함유하는 실시태양에 대한 이런 소개된 청구항 인용을 함유하는 임의의 특정 청구항을 제한하는 것을 암시하는 것으로 해석되지 않아야 한다(예를 들어, "a" 및/또는 "an"는 "적어도 하나" 또는 "하나 이상"을 의미하는 것으로 해석되어야 한다); 청구항 인용을 소개하기 위해 사용된 정관사의 사용에도 동일하게 적용된다. 또한, 소개된 청구항 인용의 구체적인 숫자가 명백하게 인용된 경우에도, 당업자는 이런 열거는 적어도 인용된 숫자(예를 들어, 다른 한정어 없이, "2개의 열거"의 꾸밈 없는 열거는 적어도 2개의 열거 또는 2개 이상의 열거를 의미한다)를 의미하는 것으로 해석되어야 한다는 것을 인식할 것이다.
또한, "A, B 및 C 등의 적어도 하나"와 유사한 관행이 사용되는 경우에, 일반적으로 이런 해석은 당업자가 관행을 이해하는 것과 같은 의미로 의도된다(예를 들어, "A, B 및 C의 적어도 하나를 가진 시스템"은 A 단독, B 단독, C 단독, A 및 B, A 및 C, B 및 C 및/또는 A, B 및 C 등을 가진 시스템을 포함하나 이에 제한되지 않을 것이다). "A, B 및 C 등의 적어도 하나"와 유사한 관행이 사용되는 경우에, 일반적으로 이런 해석은 당업자가 관행을 이해하는 것과 같은 의미로 의도된다(예를 들어, "A, B 및 C의 적어도 하나를 가진 시스템"은 A 단독, B 단독, C 단독, A 및 B, A 및 C, B 및 C 및/또는 A, B 및 C 등을 가진 시스템을 포함하나 이에 제한되지 않을 것이다). 상세한 설명, 청구항 또는 도면에서 실제로 임의의 이접 접속사 단어 및/또는 둘 이상의 선택적 용어를 제공하는 문구는 용어들의 하나, 용어들의 각각 또는 두 용어를 포함하는 가능성을 고려하는 것으로 이해되어야 한다. 예를 들어, 문구 "A 또는 B"는 "A" 또는 "B" 또는 "A 및 B"의 가능성을 포함하는 것으로 이해될 것이다.
또한, 본 발명의 특징 또는 양태는 마쿠시 그룹의 관점으로 기술되는 경우, 당업자는 명세서가 또한 마퀴시 그룹의 임의의 개별 일원 또는 일원들의 하부그룹의 관점으로 기술된다는 것을 인식할 것이다.
당업자가 이해하는 것과 같이, 임의의 목적 및 모든 목적을 위해서, 기술된 설명의 관점에서와 같이, 본 발명에 개시된 모든 범위는 또한 임의의 및 모든 가능한 하부-범위 및 이의 하부-범위의 조합을 포함한다. 임의의 나열된 범위는 적어도 동일한 범위가 1/2, 1/3, 1/4, 1/5, 1/10 등으로 나뉘는 것을 충분하게 기술하고 가능하게 하는 것으로 쉽게 인식될 수 있다. 비-제한적인 예로서, 본 발명에서 논의된 각 범위는 하부 1/3, 중간 1/3, 상부 1/3 등으로 쉽게 나뉠 수 있다. 당업자가 이해할 것과 같이, "최대", "적어도" 등과 같은 모든 용어는 열거된 숫자를 포함하며 위에서 논의한 대로 하부-범위로 뒤이어 나뉠 수 있는 범위를 의미한다. 마지막으로, 당업자가 이해할 것과 같이, 범위는 각각의 개별 일원을 포함한다. 따라서, 예를 들어, 1-3개 세포를 가진 그룹은 1개, 2개 또는 3개 세포를 가진 그룹을 의미한다. 유사하게, 1-5개 세포를 가진 그룹은 1개, 2개, 3개, 4개 또는 5개 세포 등을 가진 그룹을 의미한다.
동적 플럭스 증폭
일반적으로, 본 발명은 "동적 플럭스 증폭" 또는 "DFA"로 이하에서 불리는 DNA 증폭의 방법과 함께 이를 사용하기 위한 핵산뿐만 아니라 장치, 시스템 및 방법에 관한 것이다. DFA는 모든 목적을 위해 전문이 본 명세서에 포함되는 US7838235에 개시된다. 표적 핵산으로 프라이머의 어닐링, 표적 핵산의 증폭 및 증폭된 표적 핵산 생성물의 변성을 위한 정확한 온도 범위를 달성하기 위해 올리고뉴클레오티드 프라이머 디자인 및 표적 서열 디자인을 조합하여 사용하는 것을 포함하는 핵산 서열의 개선된 증폭을 위한 방법이 기술된다.
일반적으로, DFA는 DNA 및 RNA 증폭의 특정 기술을 의미한다. DFA는 DNA 증폭이 꽤 좁은 온도 범위 내에서 일어날 수 있다는 사실의 이점을 가진다. 일단 관심 서열의 Tm이 측정되면, DNA 샘플은 그 온도 또는 그 온도보다 1℃ 내지 5℃ 이상으로 가열될 수 있다. 이것은 가열과 냉각 사이클의 상부 변수를 정의한다. 프라이머 또는 프로브의 Tm(어느 것이나 더 낮은 Tm을 가짐)은 1℃ 내지 5℃ 내에서 가열과 냉각 사이클의 하부 변수를 정의한다.
DFA를 실시할 때, 관심 서열의 Tm과 가능한 한 가까운 Tm을 가진 프라이머를 사용하는 것일 일반적으로 바람직하여 온도는 좁은 범위 내에서 순환될 수 있다. 이런 좁은 순환의 결과는 전체 DNA 가닥의 완벽한 또는 거의 완벽한 변성과 반대로 관심 서열을 포함하는 상보적 핵산들 사이의 이중체의 동적 개방과 밀폐이다.
본 현존하는 프라이머(예를 들어, 테스트된 프라이머) 표적 핵산 생성물은 더 적은 비특이적 생성물을 함유한다. 따라서, 증폭된 표적 핵산 생성물은 본 발명에 기술된 대로 정량적 PCR 및 지노타이핑 표적 탐지 응용분야에 대해 전체적으로 더욱 특이적이며 민감할 수 있다.
올리고뉴클레오티드 프라이머의 "합리적인 디자인"은 원하는 용융 온도(Tm)를 가지는 프라이머의 계산, 실험 또는 컴퓨터 사용을 통한 선택을 포함할 수 있다. 합리적인 디자인은 원하는 Tm을 얻기 위해 적절한 %GC를 가진 특이적 프라이머 서열의 선택을 포함할 수 있다. 또한, 합리적인 디자인은 인터뉴클레오티드 변형, 염기 변형 및 뉴클레오티드 변형을 포함하는 프라이머에 대한 변형을 포함할 수 있다.
DFA 프라이머 디자인 방법
일부 실시태양에서, 표적 핵산 상에 관심 가변 서열 요소를 측면에 위치시키는 PCR용 프라이머를 선택하기 위한 방법들이 제공된다.
일부 실시태양에서, 프라이머는 표적 핵산(표적: 표적 Tm)의 Tm의 좁은 범위 내에 있는 표적 핵산(프라이머: 표적 Tm)에 의한 Tm을 갖도록 선택된다. 표적 핵산의 이런 증폭에 사용된 구체적으로 좁은 온도 범위는 표적 핵산의 용융 프로파일에 의존하며, 따라서, 표적 핵산의 서열이 증폭된다. 이와 같이, 좁은 온도 범위는 표적 핵산으로 혼성화될 때 충분하게 높은 Tm 값을 가진 특정 프라이머를 동정 및/또는 생성하기 위해서 표적 온도 범위로서 사용될 수 있다.
DFA 프라이머 디자인 - 겹쳐지는 어닐링 /변성 곡선
따라서, 프라이머의 Tm 값은 표적 핵산의 어닐링 및/또는 변성의 온도 범위 내에서 겹쳐질 수 있다(도 1a 참조). 도 1a는 표적 핵산의 Tm의 범위 내의 Tm을 갖는 프라이머의 디자인을 예시하기 위해 도 1b와 대조될 수 있다. 도 1b는 프라이머와 표적 핵산에 의한 통상적인 증폭이 온도 겹침이 없으며 증폭된 생성물을 생산하기 위해서, 증폭 동안, 변성, 어닐링 및 신장 사이클에 상응하는 극한 온도 변화를 필요로 한다. 이런 극한 온도 범위는 도 2에 도시된 바와 같이 원치않는 생성물의 형성을 허용한다.
DFA 프라이머 디자인 - 반복적 디자인
일부 실시태양에서, 반복적 디자인 방법은 증폭 및/또는 탐지될 특이적 표적 핵산 서열을 위한 프라이머를 선택 및/또는 최적화하도록 제공된다. 유리하게는, 반복적 방법은 표적 핵산 및 표적 핵산과 혼성화된 올리고뉴클레오티드 프라이머가 어닐링 및 변성의 동적 유동에 있는 좁은 범위의 열적 조건을 사용함으로써 특이적 표적 핵산의 형성을 가능하게 한다. 어닐링 및 변성의 이런 동적 유동은 비특이적 증폭 생성물의 형성에서 동등한 감소에 의해 표적 핵산의 특이적 증폭을 초래할 수 있다. 프라이머를 선택 및/또는 최적화하는 이런 반복적 방법의 암시는 (형광 표지를 가진 프로브와 같은) 더욱 고가의 맞춤 올리고뉴클레오티드 프로브 대신에 저가 염료의 사용을 제공하며, 표적 핵산의 서열을 분석하는데 사용될 정량적 PCR 또는 고해상도 변성을 허용할 수 있다. 또한, 반복적 방법은 증폭 생성물의 형성을 위한 정교한 열적으로 제어된 장비의 부존재하에서 기능하는 프라이머를 제공할 수 있다.
즉, 프라이머는 표적 핵산을 증폭하기 위해서 좁은 온도 범위 내에서 작동할 수 있어서, 핵산 증폭이 훨씬 넓은 범위의 용도에서 사용되게 한다. 공지된 서열의 DNA의 이론적 Tm을 계산하기 위한 여러 방법, 예를 들어, Rychlik and Rhoads, Nucleic Acids Res. 17:8543-8551 (1989); Sambrook, J. etal., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989); Breslauer et al., Proc Natl Acad. Sci. 83: 3746-3750 (1986); SantaLucia, J Jr. (1998) "A unified view of polymer, dumbbell, and oligonucleotide DNA nearest-neighbor thermodynamics." Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 1460-1465 (Abstract). Mismatches: Allawi, HT & SantaLucia, J Jr. (1997) "Thermodynamics and NMR of Internal G·T Mismatches in DNA" Biochemistry 36, 10581-10594에 의해 기술된 방법이 당업계에 기술되었다.
이런 반복적 방법은 최초 표적 핵산 서열을 표적 앰플리콘으로서 동정하는 단계를 포함할 수 있으며, 표적 핵산 서열은 가능한 약물 저항성과 같은 특정 생물학적 활성과 관련될 수 있다. 표적 핵산 서열은 증폭된 생성물을 생산하도록 증폭되며, 증폭된 생성물(예를 들어, 앰플리콘)의 Tm 값은 통상적인 용융 곡선 분석을 사용하여 측정된다. 용융 곡선 분석은 표적 핵산의 증폭에 사용하기 위한 새로운 프라이머 또는 프라이머 세트를 측정하거나 계산하는데 사용된다.
측정된 또는 계산된 프라이머는 증폭된 생성물의 용융에 의해 생성된 용융 피크의 범위 내의 프라이머 Tm 값으로 디자인된다. 그런 후에 프라이머는 설계된 프라이머 Tm 값을 갖도록 제조되거나 합성된다.
DFA 프라이머 디자인 - 올리고뉴클레오티드 화학적 변형
일부 실시태양에서, 프라이머는 올리고뉴클레오티드를 화학적으로 변형시킴으로써 표적 핵산의 Tm의 좁은 범위 내에 있는 Tm을 갖도록 구성될 수 있다. 주지된 올리고뉴클레오티드 합성 화학 반응은 프라이머의 Tm 값을 증가시키는데 사용될 수 있어서 프라이머는 표적 핵산의 Tm의 온도 범위와 일치한다. 이런 화학 반응은 변형된 염기(예를 들어, 슈퍼 G, A, T, C), LNA 또는 PNA 또는 다른 이런 올리고뉴클레오티드 안정화 화학 반응을 사용할 수 있다. 또한, 이런 용도에 사용될 수 있는 추가 올리고뉴클레오티드 혼성화 안정화 화학 반응이 개발될 수 있다.
예를 들어, 두 통상적인 포스포다이에스터 연결 화학 반응 및 LNA 화학 반응에 의해 합성된 프라이머는 표적 핵산 서열의 Tm 값과 근사한 프라이머 Tm 값을 제공하는데 사용되었다. 그러나, 특정 표적 핵산이 프라이머의 Tm 값보다 낮은 Tm 값을 가질 수 있고, 혼성화 불안정화 화학 반응은 프라이머 Tm 값을 감소시키도록 포함될 필요가 있어서 프라이머 Tm 값은 표적 핵산 서열의 Tm 값의 범위 내에 있다.
DFA 프라이머 디자인 - 용융 곡선 분석
일부 실시태양에서, 표적 핵산 서열의 특이적 증폭을 위한 온도 범위를 최소화하기 위해 프라이머의 디자인을 개량하기 위한 방법이 제공된다. 이와 같이, 표적 핵산은 표준 반응 열 사이클링 조건에 의해 증폭되어 표적 핵산 서열이 증폭되는 것을 보장한다. SYBR, LCGreen, LCGreen+, Eva 염료 등과 같은 이중-가닥 DNA 결합 염료에 의한 실시간 PCR을 사용하여 증폭이 관찰된다.
증폭된 표적 핵산은 표적 핵산 서열의 실제 Tm 값을 측정하기 위해 용융 곡선 분석된다. -dF/dT로 표현될 수 있는 용융 피크는 증폭된 표적 핵산을 용융시킴으로써 발생되며 정해진 온도 범위를 가로지르는 분포 곡선과 유사한 범위를 가질 수 있다. 저온 종료시에, 증폭된 표적 핵산 주형은 부분적으로 변성된다. 최고 온도에서 증폭된 표적 핵산의 전체 샘플은 변성된다. 증폭 절차 동안 표적 핵산을 변성시키는데 필요한 온도는 이런 온도 분포 내에 있다.
최초에, 최고 온도는 더욱 완벽한 변성을 보장하도록 권장된다. 뒤이어, 분포 곡선의 최저 온도는 임의의 반복적 변화가 프라이머에 가해지기 전에 증폭에 사용하기 위한 디자인된 프라이머의 세트에 대한 최초 Tm으로서 사용될 수 있다.
최초 프라이머가 함께 사용될 수 있는 좁은 온도 범위의 확인은 임의의 특정 핵산 표적에 대한 이상적인 어닐링 및 변성 온도의 설정을 확인하기 위해 늘 증가하는 어닐링 온도 및 늘 감소하는 변성 온도의 직렬 또는 병렬 실험에서 실행될 수 있다.
선택적으로, 개별 프라이머는 증폭된 주형에 첨가될 수 있고 추가 용융 곡선 분석은 결합된 프라이머 및 주형 용융 곡선에 대해 실행될 수 있다.
어떠한 경우에도, 프라이머의 Tm은 표적 핵산 서열의 Tm을 함유하는 좁은 온도 범위와 겹쳐지도록 구성될 수 있다. 표적 핵산 서열이 구체적이고 효율적으로 증폭되는 이런 실험으로부터의 최고 어닐링 온도는 현존하는 프라이머(예를 들어, 테스트된 프라이머)에 대한 최적 어닐링 온도를 정하는 온도로 생각될 수 있다. 이런 동일한 프라이머 또는 약간 변형된 프라이머는 추가 혼성화 안정화 화학 반응에 의해 재합성될 수 있다. 원하는 방향으로 Tm을 변화시키기 위한 프라이머에 대한 변형은 프라이머 Tm이 표적 핵산 서열의 Tm을 포함하는 좁은 온도 범위와 겹쳐진다. 이것은 Integrated DNA Technologies로부터 구입가능한 LNA 디자인 도구와 같은 온라인 디자인 도구를 사용하여 성취될 수 있다. 이런 디자인 도구는 표적 핵산 서열의 용융 곡선과 더 잘 겹쳐지도록 프리이머의 Tm을 올리는데 필요한 필수 LNA 변형의 수를 측정하는데 사용될 수 있다.
프라이머 Tm 값이 표적 핵산 서열의 최고 용융 온도보다 높은 경우에, 프라이머가 더 낮은 Tm을 갖도록 재디자인하는 것일 필요할 수 있다. 선택적으로, 증폭 프로토콜(예를 들어, PCR)에서 사용된 2가 및/또는 1가 양이온 염 또는 다른 불안정화제(예를 들어, AgCl, DMSO 등)의 양은 이런 올리고뉴클레오티드의 혼성화를 주형으로 불안정화시키도록 감소될 수 있다. 어떠한 경우에도, 프라이머 Tm의 감소는 일부 경우에 필요할 수 있다.
DFA 프라이머 디자인 - GC 함량 변형
일부 실시태양에서, 프라이머 Tm은 프라이머 서열의 GC 함량을 바꿈으로써 변형될 수 있다. GC 함량을 변화시킴으로써, 프라이머 Tm은 선택적으로 변화될 수 있다. 주로, GC 함량을 증가시키면 Tm을 증가시키고, GC 함량을 감소시키면 Tm을 감소시킨다. 그러나, Tm을 과도하게 증가시킬 높은 GC 함량이 바람직한 경우도 존재한다. 이런 경우에, 불안정화제는 높은 GC 함량 프라이머의 포함을 가능하게 하거나 높은 GC 함량 표적 핵산 서열의 사용하기 위해 사용될 수 있다. 불안정화제는 증폭 절차의 온도를 선택적으로 감소시킬 수 있다. 불안정화제의 예는 DMSO, AgCl 및 기타를 포함한다.
DFA 열 사이클링 범위
일부 실시태양에서, 프라이머는 표적 핵산 증폭 또는 풍부화 프로토콜은 열 사이클링 동안 최소화된 온도 차이에서 실행될 수 있도록 제조될 수 있다. 이것은 열 사이클링이 좁은 온도 범위 내에서 실행되게 하여 특정 생성물의 형성을 촉진한다.
열 사이클링의 한 범위는 표적 핵산 Tm의 약 15℃ 내 또는 표적 핵산 Tm의 10℃ 내, 또는 표적 핵산 Tm의 5℃ 내, 또는 표적 핵산 Tm의 22℃ 내, 또는 표적 핵산 Tm의 1℃ 내 또는 표적 핵산 Tm과 실질적으로 동일한 Tm일 수 있다.
일부 실시태양에서, 표적 핵산의 증폭을 위한 열 사이클링 조건은 표적 핵산 서열의 Tm 피크 +/- 약 1℃ 내지 15℃의 범위에 이른다.
일부 실시태양에서, 표적 핵산의 증폭을 위한 열 사이클링 조건은 표적 핵산 서열의 Tm 피크 +/- 약 1℃ 내지 10℃의 범위에 이른다.
일부 실시태양에서, 표적 핵산의 증폭을 위한 열 사이클링 조건은 표적 핵산 서열의 Tm 피크 +/- 약 1℃ 내지 5℃의 범위에 이른다.
일부 실시태양에서, 표적 핵산의 증폭을 위한 열 사이클링 조건은 표적 핵산 서열의 Tm 피크 +/- 약 5℃ 내지 15℃의 범위에 이른다.
일부 실시태양에서, 표적 핵산의 증폭을 위한 열 사이클링 조건은 표적 핵산 서열의 Tm 피크 +/- 약 5℃ 내지 10℃의 범위에 이른다.
일부 실시태양에서, 표적 핵산의 증폭을 위한 열 사이클링 조건은 표적 핵산 서열의 Tm 피크 +/- 약 5℃의 범위에 이른다.
일부 실시태양에서, 표적 핵산의 증폭을 위한 열 사이클링 조건은 표적 핵산 서열의 Tm 피크 +/- 약 2.5℃의 범위에 이른다.
이런 좁은 온도 범위는 PCR 증폭(변성, 어닐링 및 신장)의 정상 단계에 해당하는 온도들 사이에 열 사이클링 없이 특이적 표적 핵산을 증폭할 수 있게 한다.
또한, 선택된 온도로 설정될 수 있거나 오븐, 가열 블럭 등과 같은 좁은 온도 범위 내에서 변할 수 있는 상업용 온도-제어 장비에서 증폭과 풍부화를 실행하는 것이 가능하다.
도 3은 도 2에 도시된 것과 동일한 표적 핵산 서열에 의한 좁은 온도 범위 PCR 증폭의 그래프를 예시하나, 도 3은 더욱 구체적인 생성물 형성과 덜 원치않는 생성물이 형성되는 것을 도시한다.
일부 실시태양에서, 열 사이클링의 온도는 증폭을 표적 핵산 서열을 증폭하는 것에 실질적으로 제한하기 위해 좁은 온도 범위에서 선택될 수 있다. 이와 같이, 열 사이클링 조건은 어닐링 온도를 앰플리콘에 대한 용융 피크의 더 낮은 온도 기준과 실질적으로 동일하게 변형시킴으로써 표적 핵산 서열을 증폭하도록 변형될 수 있다. 또한, 열 사이클링 조건은 어닐링 온도를 앰플리콘의 용융 피크의 더 높은 온도 기준과 실질적으로 동일하게 변형시킴으로써 표적 핵산 서열을 증폭하도록 변형될 수 있다.
일부 실시태양에서, 프라이머 Tm은 표적 핵산의 증폭이 약 75℃ 내지 약 90℃ 범위인 온도에서 실행될 수 있도록 선택될 수 있다. 이런 온도 범위 또는 그 안의 좁혀진 5℃ 내지 10℃ 범위가 증폭(예를 들어, PCR) 과정 동안 비-특이적 생성물의 형성을 감소시키도록 DNA 및/또는 RNA 표적 핵산 서열의 증폭에 사용될 수 있다.
일부 실시태양에서, 프라이머 Tm은 증폭이 적절한 생성물 형성을 보장하기 위해 표적 핵산 서열의 Tm 범위에서 등온 증폭 조건에서 실행되도록 선택될 수 있다.
일부 실시태양에서, 본 발명은 표적 핵산 서열의 Tm으로부터 좁은 범위 내에 있는 표적 핵산에 의해 Tm을 가진 프라이머 세트를 디자인하는 방법을 포함한다. 이와 같이, 프라이머 세트는 프라이머 Tm이 표적 핵산 서열의 Tm의 분포 곡선과 겹쳐지도록 디자인될 수 있다. 예를 들어, 프라이머 세트는 프라이머 Tm이 표적 핵산 서열에 대한 Tm의 분포 곡선과 겹쳐지도록 실시간 PCR 분석에서 사용될 수 있어서 좁은 온도 범위는 표적 핵산 서열을 증폭하는데 사용될 수 있다.
DFA pH 변형
일부 실시태양에서, 표적 핵산 서열을 증폭하기 위한 프로토콜의 조건은 다른 핵산에 비해서 표적 핵산을 선택적으로 증폭하는 특이성을 증가시키는데 적절한 pH로 변형될 수 있다. 이와 같이, 적절한 pH의 사용은 표적 핵산 서열을 선택적으로 증폭하는 능력을 증가시킬 수 있다. 이것은 화학적으로 불활성화된 열 안정성 DNA 폴리머라제의 활성화를 가능하게 할 수 있는 증폭 버퍼의 사용을 포함할 수 있다. 또한, 선택된 증폭 버퍼에 의해 pH를 조절하는 것은 증폭 프로토콜이 본 발명에서 열거된 온도 범위와 같이, 감소된 온도에서 실행되도록 허용할 수 있다.
일부 실시태양에서, 증폭 버퍼의 pH는 화학적으로 불활성화된 효소의 활성 상태로의 변환을 허용하도록 조절될 수 있다. 이와 같이, 효소는 약 산성 조건에서 활성화될 수 있다; 그러나, 염기성 pH 값은 일부 효소에 사용될 수 있다. 산-활성화 효소의 경우, 표준 트리스-베이스드 PCR 버퍼는 현저한 온도 의존성(예를 들어, ℃당 0.028 pH 단위만큼 감소)을 가질 수 있다. 불활성화 상태로부터 효소의 완벽한 활성화(예를 들어, 화학적으로 불활성화된 열 안정성 DNA 폴리머라제)는 약 7 미만, 더욱 바람직하게는 약 6.75 미만 및 가장 바람직하게는 6.5 미만의 pH를 필요로 할 수 있다.
일부 실시태양에서, 증폭 프로토콜은 증폭이 더 낮은 활성화 온도에서 실행될 수 있도록 더 낮은 pH 버퍼의 사용을 포함한다. 예를 들어, 95℃ 아래 매 10℃에 대해, 효소 활성화 온도는 0.3 pH 단위만큼 감소될 수 있다. 그러나, 이런 접근법에 대한 제한은 오로지 증폭된 주형의 실시간 탐지에 대해 사용된 염료 화학 반응의 기능이다(예를 들어, 플루오레신-기반 탐지는 pH 7.3 아래의 현저하게 감소된 형광을 가진다).
앰플리콘 크기의 DFA 조절
일부 실시태양에서, 프라이머의 디자인 및/또는 증폭 조건은 표적 핵산 서열의 크기가 증폭되도록 조절하도록 조절될 수 있다. 이것은 앰플리콘의 크기는 단지 혼합된 프라이머의 크기보다 현저하게 크도록 프라이머의 디자인 및/또는 증폭 조건을 조절하는 단계를 포함할 수 있다. 이것은 프라이머보다 1-3 뉴클레오티드 긴 또는 프라이머보다 2배 큰 또는 프라이머보다 5배 큰 및 더욱 바람직하게는 프라이머보다 10배 큰 앰플리콘을 포함할 수 있다.
DFA 어레이
일부 실시태양에서, 본 발명에 기술된 대로 디자인된 프라이머는 출발 재료의 다른 농도에 의한 증폭 절차의 어레이에 사용될 수 있다. 즉, 출발 재료는 다양한 농도에서 어레이로 분할될 수 있고, 프라이머는 출발 재료와 함께 본 발명에 기술된 대로 좁은 온도 증폭 프로토콜을 위해 사용될 수 있다.
출발 재료의 다양한 농도의 어레이와 함께 프라이머 및 좁은 온도 증폭 프로토콜의 사용은 출발 재료에서 표적 핵산의 양의 정량화에 사용될 수 있다.
도 4는 표적 재료의 양이 정량화될 수 있도록 출발 재료의 다양한 농도의 어레이와 함께 프라이머 및 프로토콜의 사용을 도시하는 그래프이다.
표적 핵산 증폭 풍부화
일부 실시태양에서, 본 발명에 제공된 방법은 표적 핵산을 증폭 또는 풍부하게 하는 단계를 포함한다. 이런 방법은 전체 게놈 증폭 및 전체 전사체(Transcriptome) 증폭의 주지된 방법과 실질적으로 유사한 절차를 포함할 수 있다.
이것은 게놈 라이브러리 생성 단계에 의해 게놈을 증폭하는 단계 및 뒤이은 라이브러리 증폭 단계를 포함할 수 있다. 또한, 라이브러리 생성 단계는 DNA 폴리머라제 또는 역전사효소와 함께 본 발명에 기술된 특이적 프라이머 또는 특이적 프라이머의 혼합물을 사용할 수 있다. 특이적 프라이머 혼합물은 혼합물 내에서 다른 프라이머에 자가-혼성화 및/또는 혼성화하는 능력을 제거하나, 프라이머가 표적 핵산 서열을 효율적이고 빈번하게 준비하게 하는 능력을 제거하도록 프라이머에 의해 디자인될 수 있다.
일부 실시태양에서, 종들에 대한 전체 표준 게놈에 대해 종들의 개별 일원에 대한 유전자 발현 프로파일을 동시에 측정하는 방법이 제공된다. 이 방법은 게놈 재료의 액체 샘플을 기질의 반응 챔버의 어레이로 분산시키는 단계를 포함할 수 있다. 어레이는 전체 표준 게놈을 따라 각 표적 핵산 서열에 대한 프라이머 세트 및 프로브를 포함할 수 있다. 액체 샘플은 실질적으로 일원의 모든 유전 재료를 포함할 수 있다. 반응 챔버의 각각은 표적 핵산 서열과 폴리머라제의 적어도 하나에 대한 프라이머 세트 및 프로브를 포함할 수 있다. 상기 방법은 어레이에서 액체 샘플을 증폭하는 단계, 프로브의 적어도 하나에 의해 방출된 신호를 탐지하는 단계, 및 신호에 반응하여 유전자 발현 프로파일을 동정하는 단계를 더 포함할 수 있다.
이런 직접 용해된 DNA 샘플을 사용하고 이를 전체 게놈 증폭 절차에서 사용된 것과 유사한 반응 성분과 혼합하면 상보적 핵산의 "호흡" 또는 "유동"으로 불린 뉴클레오티드의 동적 개방 및 폐쇄를 가능하게 한다. 이런 유동은 특이적 프라이머 및 프로브에만 의해 및 특이적 프라이머 및 프로브에 의한 결합에 의한 접근을 가능하게 하는데, 이는 유동에서 단지 이런 영역만이 프라이머 또는 프로브에 의해 심문될 수 있기 때문이다. 이것은 증폭은 전체적으로 특이적이며 뒤이어 비-특이적 생성물(NSP)의 형성이 실질적으로 제거되게 만든다.
DFA 기술은 다양한 DNA 주형에 대하여 평가되었고, DFA는 30-66%로부터 G+C 함량 주형의 넓은 범위에 걸쳐 작동한다는 것이 측정되었고, DFA 기술은 민감성에서 PCR에 필적하며 비-특이적 생성물(NSP)의 형성 없이 실행되었다. DFA는 다음 탐지 기술: 실시간 PCR(dsDNA 결합 염료), 겔-전기영동, 화학발광, 측색법 및 ELISA에 적합하게 되었다.
표적 핵산의 특이적 증폭을 위한 프라이머 및 태그
다음은 표적 서열을 넘어서는 반응의 신장을 현저하게 억제할 뿐만 아니라 특정 표적 앰플리콘 또는 앰플리콘들을 생성하는데 필요한 열 사이클 온도 범위를 좁히기 위해 기존의 증폭 프라이머가 변형되게 하는 핵산 서열의 신속한 증폭 방법에 관한 것이다. 도 5에 도시된 바와 같이, 상기 방법은 반응이 표적 서열의 변성 온도에 근접한 온도로 가열됨에 따라 "기포"(16)의 생성을 구현한다. 표적 서열의 변이 온도 또는 Tm 또는 Tm 근처에서 표적 서열 변성의 개시가 표적 서열의 말단에 인접하거나 근처인 서열(20)의 변성 온도보다 작다고 가정하면, 인접 서열(20)은 이중 가닥으로 남아있어, 표적 서열이 변성됨에 따라 DNA 가닥에 "기포(16)"를 형성시킨다. 이 기포는 표적 서열에 인접한 서열의 변성 온도에 따라, 표적 서열 및 표적 서열 이외의 가능한 서열을 포함할 것이다. 기포(16)에서, DNA(24)의 절반 가닥의 길이는 DNA(28)의 상보적인 가닥의 길이로부터 분리되어있는 반면, 인접한 서열(20)은 표적 서열보다 어닐링되거나 실질적으로 더 혼성화된 상태로 유지된다.
도 6은 DNA(24)의 제 1 가닥에 어닐링된 제 1 프라이머(32)를 갖는 기포(16)를 도시한다. 제 2 프라이머(38)는 DNA(28)의 제 2 가닥에 어닐링된다. 제 1 차단 태그(42)는 상보적 또는 실질적으로 유사한 올리고 뉴클레오티드 서열을 포함하는데, 이는 이 태그(42)의 디자인은 제 1 프라이머(32)에 어닐링된 제 1 DNA 가닥(24)의 일부에 상보적인 제 2 DNA 가닥(28)의 일부인, 반대 가닥(28) 표적 영역 말단에 태그(42)의 어닐링을 최적화하는 가변 길이 및 잠재적으로 뉴클레오티드 또는 백본 변형을 함유할 것이기 때문이다. 이런 배열은 차단 태그(42)가 제 1 프라이머(32)에 어닐링된 제 1 DNA 가닥(24)에 상보적인 제 2 DNA 가닥(28)의 일부에 어닐링되게 한다. 제 2 차단 태그(46)는 제 2 프라이머(38)에 첨가되었다. 제 2 차단 태그(46)는 제 2 프라이머(38)에 어닐링된 제 2 DNA 가닥(28)의 일부에 상보적인 제 1 DNA 가닥(24)의 일부에 상보적인 올리고뉴클레오티드 서열을 포함한다. 이런 배열은 차단 태그(46)가 제 2 프라이머(38)에 어닐링된 제 2 DNA 가닥(28)에 상보적인 제 1 DNA 가닥(28)의 일부에 어닐링되게 한다. 이러한 방식으로 차단 태그를 사용하면 인접한 서열(20)로부터 기포(16)를 필수적으로 밀봉함으로써 기포(16)를 넘어서는 반응의 신장을 억제한다.
도 7은 반응의 신장 단계를 도시한다. 제 1 프라이머(32)는 제 2 차단 태그(46)의 방향으로 신장되었다. 반대 가닥 프라이머(32)로부터 태그(46)의 5' 말단 방향으로 신장 서열을 형성하는 제 1 프라이머(32)는 제 2 차단 태그(46)를 넘어서 쉽게 신장될 수 없다. 이것은 차단 태그(46)의 부 존재시에 존재할 수 있는 것보다 더 짧은 신장부(50)를 생성한다. 이와 유사하게, 제 2 프라이머(38)는 제 1 차단 태그 (42)를 넘어서 쉽게 신장될 수 없으며, 존재할 수 있는 것보다 더 짧은 신장 부(54)를 생성한다. 차단 태그(42 및 46)는 태그(42 및 46)가 신장될 때 폴리머라제에 의해 절단되는 것을 방지하기 위해서 절단가능한 화학제를 포함할 수 있다.
도 8a는 증폭의 제 1 사이클로부터의 두 개의 신장 생성물을 도시한다. 태그(태그 42 또는 태그 46 중 어느 하나)가 프라이머(프라이머 32 또는 프라이머 38)로 전이되는 지점은 전이를 나타내기 위해 T로 지정된다. 전이는 프라이머와 태그 사이의 전이이다. 전이는 단일 뉴클레오티드, 탄소 사슬, (에포크 삼중 기능성 링커와 같은) 다기능 모이어티 또는 변형된 뉴클레오티드 또는 백본일 수 있다. 전환은 또한 형광체, MGB 또는 당업자에게 공지된 화학 물질 또는 화학 물질의 조합일 수 있다. 전환은 기포의 말단에서 수소 결합을 함께 유지하는 지점에 위치될 수 있다. 열 사이클링 반응의 제 1 사이클로부터의 태그 차단 초기 형성 생성물은 프라이머와 태그를 가진 완전한 생성물이 완전히 합성될 때까지 후속 사이클에서 어닐링하는 모든 새로운 프라이머와 단지 부분적인 상보성을 갖는다.
도 8b는 제 1 신장부(50)의 말단에 어닐링된 새로운 프라이머(58)를 도시한다. 제 1 신장부(50)가 기포의 말단까지 신장되지 않았기 때문에, 완전한 보체를 새로운 프라이머(58)로 복제하지 않았다. 결과적으로, 새로운 프라이머(58)의 일부만이 제 1 신장부(50)에 어닐링되어, 어닐링되지 않은 프라이머의 "오버행 (overhang)(62)"를 생성한다. 새로운 프라이머(58)는 태그(66)를 포함한다(새로운 프라이머(58) 및 태그(66)는 프라이머(38) 및 태그(46)와 서열이 동일하다는 것에 유의한다). 새로운 프라이머(58)는 제 1 프라이머(32) 및 이의 태그(42)의 길이를 신장하여 제 1 태그(42), 제 1 프라이머(32) 및 제 1 신장부(50)의 완전한 상보적인 복제물을 형성하는 제 3 신장부(70)를 형성한다. 이 제 2 신장부(70)는 새로운 프라이머(58) 및 이의 태그(66)로부터 부가되기 때문에, 표적 서열과 프라이머의 말단에 부가된 두 개의 태그의 완전한 복제물을 형성한다. 유사하게, 신장부(54)를 갖는 반대 가닥은 새로운 프라이머(32-T-42)에 혼성화될 것이며, 프라이머(32) 및 태그(42)의 신장부는 그 가닥의 신장부(79)를 생성한다(도 8c).
도 9는 제 3 신장부(70)의 서열에 상보적인 태그(74) 및 프라이머(78)를 도시한다. 태그(74) 및 프라이머(78)는 제 3 신장부(70)에 완전한 보체를 갖기 때문에, 전체 태그 및 프라이머(78)는 제 3 신장부(70)에 어닐링한다(프라이머(78) 및 태그(74)는 프라이머(32) 및 태그(42)와 서열이 동일하다는 것에 유의한다). 그런 후에 프라이머(78)는 태그(66)의 말단까지 연장되어 표적 서열과 태그의 또 다른 완전한 복제물을 완성한다.
프라이머는 사이클 1에서 완전한 신장을 달성하지 않기 때문에, 프라이머는 사이클 2에서 완전한 결합 위치를 갖지 않는다. 이것이 잠재적으로 상이하고 대부분은 낮은 사이클 2에 대한 어닐링 온도를 생성한다. 뉴클레오티드 변형에 의해, 제 1 프라이머(32)의 Tm은 반대 가닥 태그의 존재에 의한 서열의 '차단'의 함수로서 길이가 절단되는 초기 형성된 부분 생성물에 대한 이의 3' 대부분의 충분한 어닐링을 보장하기 위해 조절될 수 있고, 이어서, 완전한 제 1 프라이머(32)와 온도가 다를 것이다. 저온 또는 고온 및 온도 사이의 상승 속도는 사이클 2에 대한 설계된 테스트 온도의 설계 목표를 달성하기 위해 사이클 1에 대한 어닐링 온도와 완전히 다르도록 조정될 수 있다. 프라이머, 태그 및 표적 서열의 완전한 신장이 사이클 2에서 달성되면, 후속 사이클의 어닐링 온도는 프라이머가 태그 없이 사용된 경우 어닐링 온도보다 더 높거나 낮을 수 있고, 또는 어닐링의 속도는 다시 뉴클레오티드 변형에 의해 변형될 수 있으며, 완전히 어닐링된 올리고 뉴클레오티드의 Tm은 더 긴 어닐링된 서열의 효과를 제한하도록 조절될 수 있다. 따라서, 본 방법의 생성물의 이런 특징을 수용하기 위해, 증폭 생성물의 생성과 프라이머의 일치 부분이 반응의 제 1 몇몇 사이클에서 중합 반응을 어닐링하고 개시하는 충분한 열 안정성을 하기 위해 어닐링 온도를 변화시키는 것이 충분하다. 최저 한도에서, 낮아진 어닐링 온도의 단일 사이클이 필수적이다. 이러한 방식으로, 프라이머의 Tm은 표적 핵산 서열의 Tm과 관련하여 조절될 수 있다. 프라이머의 이론적인 Tm은 Integrated DNA Technologies의 LNA 설계 도구와 같은 온라인 설계 도구를 사용하여 미리 결정될 수 있다. 이러한 설계 도구는 표적 핵산 서열의 용융 곡선과 더 잘 중첩되도록 프라이머의 Tm을 높이는데 필요한 필수 LNA 변형의 수를 추정하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 프라이머 Tm 값이 표적 핵산 서열의 최고 용융 온도보다 큰 경우, 더 낮은 Tm을 갖도록 프라이머를 재설계하는 것이 필요할 수 있다. 일부 실시태양에서, 프라이머 Tm은 프라이머 서열이 될 표적 주형의 특정 %GC 영역을 변경 또는 선택함으로써 변형될 수 있다. %GC를 변경하면, 프라이머 Tm은 최적의 DFA 성능을 위해 열 사이클 범위 내에서 더 잘 맞도록 선택적으로 변경될 수 있다. 일반적으로 %GC를 증가시키면 Tm을 증가시킬 수 있고 %GC를 감소시키면 Tm을 감소시킬 수 있다. 그러나, Tm을 과도하게 증가시키는 높은 %GC가 요구되는 경우가 있다. 이런 경우, 불안정화제는 사용하여 높은 %GC 함량 프라이머의 포함 또는 높은 %GC 표적 핵산 서열의 사용을 가능하게 하도록 사용될 수 있다. 불안정화제는 증폭 과정의 온도를 선택적으로 감소시킬 수 있다. 불안정화제의 예는 DMSO, AgCl 및 기타를 포함한다.
주형에 부가된 부가적인 태그의 설계에 대한 주의는 초기 표적 서열의 온도는, 초기 표적 서열의 온도, 주형의 변성 온도를 더 낮추도록 설계될 수 있으나, 초기 표적 서열의 온도, 주형의 변성 온도를 상승시킬 수 있다. 전반적으로, 반응은 주형의 Tm과 프라이머의 Tm 사이의 다음 관계에 따라야 한다: 태그가 부가된 주형의 Tm과 태그가 없는 주형의 Tm 사이의 차는 태그가 부가된 프라이머의 Tm 및 태그가 없는 프라이머의 Tm 사이의 차보다 적다. 이것은 주형의 Tm이 태그 첨가의 결과로서 어느 정도 증가하는 경향이 있는 반면, 프라이머에 대한 Tm은 태그 첨가의 결과로서 더 많은 양만큼 증가하는 경향이 있다는 것을 의미한다. 이것은 반응에 대한 열 사이클링 조건의 최종 한정을 초래한다. 한 열 프로파일의 예는 다음과 같다:
88℃ - 75℃(△13℃)의 하나 이상의 사이클
88℃ - 70℃(△18℃)의 하나 이상의 사이클
89℃ - 78℃(△11℃)의 하나 이상의 사이클
한편, 가상의 사이클링 온도는 다음과 같을 수 있다:
변성 온도 어닐링 온도
사이클 1 88℃ 75℃
사이클 2 88℃ 70℃
사이클 3 89℃ 78℃
사이클 3에 의해, 주형의 변성 온도는 1℃ 증가하였고, 태그를 갖는 프라이머의 어닐링 온도는 초기 어닐링 온도보다 3℃ 증가하였다.
표적 서열의 증폭을 위한 예시적인 프라이머 및 태그에 대해서는 실시예 1을 참조한다.
다른 실시태양에서, 도 10에 도시된 바와 같이, 프라이머(84)에 태그(80)가 부가된다. 이 실시태양에서, 태그(80)는 표적 서열(88)에 인접한 임의의 DNA 가닥에 해당하지 않고, 오히려 약간의 임의의 올리고뉴클레오티드 서열을 나타낸다. 임의의 올리고뉴클레오티드 서열은 반응에서 임의의 다른 올리고뉴클레오티드 서열과 반응하지 않도록 설계된다. 제 1 사이클에서, 프라이머(84)는 표적 서열(88)에 결합하고 표적 서열(88)을 완전히 가로질러 신장되어, 프라이머(84), 신장부(90) 및 태그(80)를 포함하는 올리고뉴클레오티드(94)를 생성한다. 제 1 사이클에서, 태그(80)는 표적 서열(88)에 결합하지 않는다. 도 11에 도시된 제 2 사이클에서, 올리고뉴클레오티드(94)는 새로운 프라이머(96) 및 태그(98)에 결합한다. 새로운 태그(98)는 올리고뉴클레오티드(94) 상에 결합하는 상보적인 서열을 갖지 않는다. 프라이머(96)는 올리고뉴클레오티드(94)의 말단까지 연장되어, 올리고뉴클레오티드 (94)의 태그(80), 프라이머(84) 및 신장부(90)의 재생물을 포함하는 복제 올리고 뉴클레오티드(99)를 생성한다. 이 복제 올리고뉴클레오티드는 한 말단 상에 태그(80)의 복제물 및 반대 말단 상에 태그(98)를 포함한다.
도 12는 이런 방법의 제 3 사이클을 도시한다. 제 3 사이클에서, 새로운 태그(100) 및 프라이머(104)는 복제된 올리고뉴클레오티드(99)에 결합한다(새로운 프라이머(104) 및 태그(100)는 프라이머(84) 및 태그(80)와 서열이 동일하다는 것에 유의한다). 프라이머 신장부 (106)는 태그(98)의 말단까지 신장되어 완전한 복제물을 생성한다.
다른 실시태양에서, 기포 구조의 형성을 촉진하고 동시에 기포를 넘어 초기 증폭된 가닥의 신장을 차단하는 역할을 제공하기 위해 프라이머에 태그를 첨가하는 것은 인접한 3개 또는 그 이상의 시스토신 잔기 또는 0개 또는 그 사이에 몇몇 염기를 가진 자연 발생 스트레치(naturally occurring stretches)의 구아노신 잔기에 대한 포함에 의해 완성된다.
이런 스트레치는 DFA 기포를 함께 보유하고 기포를 넘어서는 초기 증폭된 가닥의 신장을 방지하는 구아노신 사중체 구조를 형성하는 데 사용될 수 있다.
G-사중체는 G 스트레치의 분리된 평행 가닥, 분자간 다이머 또는 분자내 접힘과 같은 여러 방식으로 형성할 수 있다. 도 13은 G-사중체의 형성을 위한 하나의 메커니즘의 초기 단계를 도시한다. 이 메커니즘에서, 프라이머(130)는 표적 기포(134)의 한 말단과 접촉하도록 설계되며, 기포는 주로 GC 서열을 포함한다. 프라이머(130)는 표적의 GC 서열을 보완하기 위한 GC 서열로 설계된다. 그러나, 높은 GC 함량을 포함하는 영역에서 호그스틴 쌍을 형성하기 위한 G와 G의 비 통상적인 혼성화 때문에, 높은 GC 함량을 가진 영역은 도 14에 도시된 바와 같이, 가닥을 접는 과정을 통해 G 사중체를 형성하여 G를 G와 정렬시킨다. 이것이 도 15에 도시된 G 사중체 형성을 초래한다. 변위된 C 서열(138)은 표적에서 임의의 상보적인 서열에 결합되지 않으며, 기포를 지나치는 프라이머의 임의의 신장에 대한 고체 차단제로서 작용하는 접힌 형태로 비틀린다.
도 16에 도시된 다른 실시태양에서, G의 서열(140)은 3' 말단에 인접하고 프라이머(130)의 사중체 형성 영역에 인접한 프라이머 내부에 부가된다. G의 이 서열(140)은 표적(148)의 제 1 가닥 상에서 이에 인접한 C의 서열(144)에 끌어 당겨진다. 이런 인력은 프라이머에 추가된 운동력을 제공하여, 도 17에 도시된 바와 같이 G 사중체를 형성한다.
도 6-17의 실시태양에 기초한 현존하는 PCR 올리고뉴클레오티드 프라이머를 변형시키는 방법은 폴리머라제 분석 설계 분야의 당업자에 의해 용이하게 성취될 수 있다.
다중 증폭
PCR은 전통적으로 상당히 넓은 단일 열 사이클링 범위에서 수행되어 왔다. 일반적으로, 범위는 대략 60℃ 내지 90℃-95℃이다. 이 관행의 결과로, 전통적인 PCR의 프라이머 설계는 특정 표적 또는 앰플리콘의 용융 또는 어닐링 온도에 대한 관계 없이, 표적 서열에 해당하는 프라이머 세트를 설계하는 것과 관련이 있다. 그러나, 상이한 표적에 해당하는 프라이머는 당해 서열에서 상대적인 GC 및 AT 농도에 따라 상이한 변성 및 어닐링 프로파일을 가질 수 있다는 것이 관찰되었다. 이 관찰은 차례로 전통적인 60℃ 내지 90℃- 95℃보다 좁은 범위 내에서 열 사이클링을 허용하는 특정 온도 범위 내에서 열 사이클링에 대해 프라이머를 설계하는 능력을 유도하였다.
그러나, 표적 변성 및 프라이머 어닐링 온도를 맞춤 설계할 수 있는 동시에 열 사이클링 범위를 좁힐 수 있는 다른 결과는 상이한 표적의 증폭이 상이한 온도 범위에서 연속적으로 반응 용기를 열 사이클링함으로써 단일 반응 용기 내에서 수행되게 한다. 이 능력은 여러 가지 잠재적인 응용분야를 가지며, 그 중 일부는 아래에 설명된다.
차세대 염기서열분석(Next Generation Sequencing)
차세대 염기서열분석은 DNA의 전체 가닥을 염기서열분석하는 과정에 주어진 용어이다. 차세대 염기서열분석은 초기 단계에서 PCR을 이용하여 충분한 샘플 DNA를 증폭하여 연속적으로 염기서열분석한다. 샘플 DNA를 증폭하는데 사용된 PCR 방법은 일반적으로 95℃ 내지 60℃의 온도 범위에서 열 순환한다. 차세대 염기서열분석을 최적으로 수행하기 위해, 초기 PCR 증폭 과정은 이상적으로 전체 게놈 핵산을 똑같이 증폭시켜야 한다. 그러나, 종래의 PCR은 이를 달성 할 수 없다. 샘플 DNA를 증폭하는데 사용된 PCR 방법은 일반적으로 95℃ 내지 60℃의 온도 범위에서 열 순환한다. 따라서, 예를 들어, 높은 %AT(낮은 %GC) 영역은 대체로 60℃보다 실질적으로 낮은 어닐링 온도로 가장 효율적으로 증폭한다. PCR은 일반적으로 60℃ 이하에서 수행되지 않으므로 높은 %AT(낮은 %GC) 영역은 통상적인 PCR에 의해 낮은 증폭 효율을 경험한다. 표적 농축을 추가로 혼란시키면, 높은 %AT(낮은 %GC) 영역은 또한 겔 전기영동 크기 배제 공정으로부터의 낮은 회수율로 인해 어려움을 겪는다. 반면에 높은 %GC 영역은 95℃ 이상의 온도에서 최적으로 변성되는 성질로 인해 통상적인 PCR에 의해 낮은 증폭 효율을 경험한다. 통상적인 PCR은 일반적으로 95℃ 이상의 온도에서는 실행되지 않는다. 다양한 영역의 고르지 않은 증폭은 농축 편향 (enrichment bias)이라고 알려져 있다. 농축 편향 문제는 단순히 95℃ 이상 및 60℃ 이하의 온도를 포함하도록 열 사이클링 범위를 증가시킴으로써 쉽게 해결될 수 없다. 이런 극한 범위는 부적합하게 높은 수준의 비특이적 생성물을 생성하는 경향이 있으며, 서열 정보를 조립하기 위해 실질적으로 더 큰 게놈 범위 및 데이터 분석을 필요로한다.
PCR 농축으로 인한 농축 편향의 문제는, 모든 주형 영역에 대한 증폭 효율의 평균을 산출하도록 작업하는 분자 군집 제제의 사용에 의해 일반적으로 처리되었다. 농축 편향은 더 높은 농도의 높은 %AT(낮은 %GC)와 높은 %GC 주형을 사용함으로써 개선될 수 있다. 종종, TMAC와 같은 안정제가 %AT(낮은 %GC) 영역을 안정화하는데 사용된다. 베타인과 같은 불안정화제는 높은 % GC 영역을 불안정하게 하는데 사용된다. 또한, 카파 바이오시스템(Kapa Biosystems) HiFiTM 폴리머라제와 같은 반응 효율을 가진 폴리머라제가 또한 증폭 효율 차이를 제거하는 것을 돕도록 사용될 수 있다. 이런 보상 방법은 농축 편향을 완화하는데 모두 다소 효과적이다. 그러나, 이들은 모두 반응에 복잡성과 비용을 추가하는 것을 포함하는 원치 않는 부작용의 단점을 가지고 있다. 주형 농축은 약 200 염기쌍 생성물 이하의 PCR에 가장 적합하다. PCR에 의한 농축에 이상적으로 적합한 것과 같은 짧은 앰플리콘은 유전자 또는 전체 게놈일 때 전체 염기서열분석 표적 부위를 정확하게 포함하도록 위해 더 많은 수의 판독을 필요로하며, 짧은 판독 길이에 의한 높은 수의 데이터 스트림은 염기서열분석 결과의 분석이 긴 데이터 처리 시간이 필요로 한다는 것을 의미한다.
따라서, 증폭 반응에 추가의 화학 물질을 첨가하는 것에 의존하지 않는 농축 편향을 보상하거나 제거하는 방법을 갖는 것이 유용할 것이다.
더 큰 앰플리콘 길이를 생성시킨 농축 편향을 보상하거나 제거하는 방법을 갖는 것이 또한 유용할 것이다. 예를 들어, 400 염기쌍 길이의 앰플리콘을 생성하는 방법은 200 염기쌍 길이의 앰플리콘을 생성하는 방법보다 절반의 판독을 필요로 할 것이다.
다음은 반응에 추가의 화학 물질을 첨가할 필요없이 보상 편향을 감소시키거나 제거하는 게놈 서열을 증폭시키는 방법을 기술한다. 상기 방법은 400 염기쌍 이상의 앰플리콘의 생성에 적합하며, 필요한 판독 횟수를 줄이고, 시퀀싱 데이터를 처리하고 컴파일하는 시간을 단축시킨다.
이 방법은 증폭 과정을 두 개 이상의 부분으로 나누며, 각 부분은 구별된 열 프로파일을 사용한다. 개시된 방법은 이런 표적 서열 또는 대표적인 %GC 함량 영역을 위해 지정된 열 프로파일의 일부를 갖는 표적 서열(들) 또는 대표적인 %GC 함량 영역을 증폭시키는데 가장 효율적인 특정 온도 범위에서 열 순환을 허용한다. 열 프로파일의 다른 부분은 다른 표적 서열(들) 또는 다른 %GC 함량 영역의 증폭을 위해 지정될 수 있다.
도 19에 도시된 한 실시태양에서, 높은 %AT(낮은 % GC) 함량을 가진 영역에 해당하는 프라이머는 60℃ 이하의 온도에서 열 순환하도록 설계된다. 높은 %GC 함량을 가진 영역에 해당하는 프라이머는 95℃ 이상의 온도에서 열 순환하도록 설계된다. 마지막으로, 전통적인 PCR 범위 내에서 열 순환하도록 설계된 프라이머는 잔여 영역을 증폭시키는데 사용된다.
그런 다음 DNA는 각 범위 내에서 순차적으로 열 사이클될 것이다. 이 분석을 위한 하나의 예시적인 열 사이클링 프로파일은 결과를 생성하는 데 필요한 만큼의 순환 동안 45℃ 내지 60℃; 결과를 생성하는 데 필요한 만큼의 순환 동안 60℃ 내지 95℃; 및 결과를 생성하는 데 필요한 만큼의 순환 동안 95℃ 내지 99℃일 수 있다. 이런 프로파일은 검사될 프라이머 디자인과 DNA에 따라, 온도와 순환의 횟수에 따라 변할 수 있다. 예를 들어, 한 실시태양에서, 순환의 횟수는 한 온도 범위로부터 다른 온도 범위까지 변한다. 또한 특정 온도 적합성 폴리머라제가 열 사이클링의 각 온도 범위에 대해 선택된다. 저온에서 고온 또는 고온에서 저온으로의 열 사이클링 프로파일의 특정 순서는 목표 및 농축, 증폭 및 궁극적으로 서열화된 표적 영역에 따라 변할 수 있다. 또한, 이 방법은 열 사이클링 범위 사이에 어느 정도의 중첩을 포함할 수도 있다. 예를 들어 열 사이클링 매개변수의 세트는 50℃ - 65℃, 60℃ - 95℃ 및 90℃ - 105℃를 포함할 수 있다.
도 20에 도시된 이런 분석을 위한 다른 열 사이클링 프로파일은 결과를 생성하는데 필요한 만큼의 순환 동안 95℃ 내지 99℃; 결과를 생성하는데 필요한 만큼의 순환 동안 60℃ 내지 95℃; 및 결과를 생성하는데 필요한 만큼의 순환 동안 45℃ 내지 60℃일 수 있다. 이런 프로파일은 검사될 프라이머 디자인과 DNA에 따라, 온도와 순환의 횟수에 따라 변할 수 있다. 예를 들어, 한 실시태양에서, 순환의 횟수는 한 온도 범위로부터 다른 온도 범위까지 변한다. 또한 특정 온도 적합성 폴리머라제가 열 사이클링의 각 온도 범위에 대해 선택된다. 저온에서 고온 또는 고온에서 저온으로의 열 사이클링 프로파일의 특정 순서는 목표 및 농축, 증폭 및 궁극적으로 서열화된 표적 영역에 따라 변할 수 있다. 또한, 이 방법은 열 사이클링 범위 사이에 어느 정도의 중첩을 포함할 수도 있다. 예를 들어 열 사이클링 매개변수의 세트는 50℃ - 65℃, 60℃ - 95℃ 및 90℃ - 105℃를 포함할 수 있다.
도 21에 도시된 한 대안적인 실시태양에서, 한 세트의 프라이머는 약 45℃ 내지 약 72℃로 열 사이클하도록 설계되고, 또 다른 한 세트의 프라이머는 약 72℃ 내지 약 99℃로 열 사이클하도록 설계된다. 이어서, 표적 핵산은 40회 사이클 동안 또는 결과를 생성하는데 필요한 만큼의 사이클 동안 약 45℃ 내지 약 72℃ 내에서 열 사이클될 수 있고 40회 사이클 동안 또는 결과를 생성하는데 필요한 만큼의 사이클 동안 약 72℃ 내지 약 99℃에서 열 사이클될 수 있다.
도 22에 도시된 또 다른 실시태양에서, 프라이머는 약 54℃ 내지 약 63℃; 약 63℃ 내지 약 81℃; 및 약 81℃ 내지 약 99℃에서 열 사이클하도록 설계된다.
온도 의존성 다중화
증폭 과정의 일부로서 특정 표적 프라이머에 대한 다중 온도 범위를 사용하는 방법은 표적 탐지 및 분석의 부분적 온도 의존적 방법을 만드는데 사용될 수 있다. 도 23에 도시된 한 실시태양에서, 5개의 상이한 유기체에 해당하는 프라이머는 5개 표적의 각각에 대한 온도 범위인 5개의 상이한 온도 범위에서 열 순환하도록 설계된다. 형광 염료, 전기 화학적 지시자, 또는 다른 탐지 화학물질 또는 방법(다중 탐지 방법의 조합일 수 있음)은 5개의 표적 각각에 대해 사용될 수 있다. 혼합물은 각 온도 범위 내에서 연속적으로 열 순환된다. 사이클링 순서는 낮은 곳에서 높은 곳으로(도 23) 또는 높은 곳에서 낮은 곳으로(도 24) 또는 임의의 다른 순서로 될 수 있다. 각 온도 범위에서 증폭 중에 판독값을 얻을 수 있다. 양성 결과가 얻어지는 온도 범위는 어느 표적이 증폭되는 지를 밝혀준다. 물론, 다양한 탐지 화학물질이 결합될 수 있으며, 다중 형광 염료, 전기 화학적 지시자, 표적 고정화 전략 또는 이의 임의의 조합이 가능하다. 온도 의존성 다중화와 함께 사용될 수 있는 탐지 화학물질의 실시태양은 아래에 기술된다.
이 방법은 프라이머 및 프로브를 설계할 뿐만 아니라 그 결과를 판독하기 위한 열 순환기 방법을 단순화하는 관점에서 단순한 다중화를 허용한다. 이 방법은 또한 종래의 다중화에 비해 이점을 제공하는데 이는 종래의 다중화에서, 모든 다른 대상이 동시에 증폭되기 때문에 기존의 다중화보다 이점을 제공한다. 이것은 모든 프라이머가 동시에 활성화되어 잠재적으로 상호작용할 수 있음을 의미한다. 이런 현상은 종종 설계상의 어려움을 야기한다. 여러 온도 열 사이클링에 의해, 각각의 프라이머 세트는 자신의 열 사이클링 범위에서만 사용되며, 다른 프라이머와 경쟁하거나 결합되지 않는다. 여러 온도의 열 사이클링을 수행하는데 사용될 수 있는 하나의 열 사이클링 순서는 최저 시작하여 최고로 연속적으로 이동하는, 각각의 온도 범위에서 연속적인 열 사이클링을 포함한다. 열 사이클링의 이런 패턴은 열적으로 불안정한 핵산 폴리머라제 또는 역전사 효소가 저온에서 후속 증폭 프로토콜에 필요하기 전에 고열에 의해 파괴되지 않는 것을 보장한다. 더 높은 온도 표적에서 시작하여 더 낮은 온도 표적에 대해 작용하는 열 사이클링 프로토콜 및 열 프로파일은 또한 관심 탐지 프로토콜의 표적의 완료 후 내부 반응 제어의 증폭을 생성하는데 매우 적합할 수 있다.
진단 시험에서, 샘플의 정확한 처리 및/또는 DNA 또는 RNA 증폭의 억제 부족을 입증하는 대조군 증폭을 포함하는 것이 바람직하고 종종 요구된다. 내부 대조군으로서, 이 증폭은 다른 쌍의 프라이머와 주형을 사용할 수 있거나 독특한 내부 서열을 갖는 표적 서열의 증폭에 사용된 것과 동일한 프라이머를 사용할 수 있다. 대조군 증폭이 표적 증폭(내부 대조군)과 동일한 반응 용기 내에서 발생할 때, 앰플 리콘 사이의 경쟁이 일어나, 감도가 감소될 수 있다. 다중 온도 열 사이클링은 먼저 열 사이클링 온도 범위 내에서 표적 종을 증폭하고, 완료 후, 내부 대조군의 증폭을 가능하게 하도록 열 사이클링 온도 범위를 변경함으로써 이 문제를 해결한다. 이러한 순차적인 열 사이클링은 이산 열 순환 매개변수가 각 앰플리콘에 대해 최적화된 XCR의 속성에 의해 가능하다. 유사하게, 별개의 표적 종의 다중 증폭에서, 감도는 다중 열 순환 프로파일을 사용하여 유지될 수 있어서, 앰플리콘은 서로 경쟁하지 않는다.
초기 신장 후 더 높은 Tm을 갖는 프라이머를 사용함으로써, 좁은 열 사이클링 매개변수는 신장의 초기 라운드 이후 유지될 수 있어서, 더 높은 특이성과 더 빠른 증폭 속도를 가능하게 한다. 이 접근법의 또 다른 이점은 높은 농도의 대조군 주형 또는 유기체가 감도의 손실, 재현성의 증가 및 제 2 (대조군) 열 사이클링 기간에 필요한 시간의 감소 없이 증폭에 존재할 수 있다는 것이다. 마지막으로, GC-풍부 프라이머 꼬리의 예기치않은 효과가 주목되었다(실시예 4 참조): 어닐링/신장 온도가 예측된 Tm보다 훨씬 더 높게 유지되는 경우에도 증가된 증폭 효율. 이런 관찰은 표적 앰플리콘뿐만 아니라 대조군 앰플리콘에 첨가된 GC-풍부 프라이머 꼬리의 유용성을 제시한다: 초기 증폭 후, 어닐링/신장 온도가 상승되어 사이클링 시간을 단축하고, Ct에 대한 시간을 빠르게 하고 다중 온도 열 사이클링을 사용하는 소정의 테스트에 대한 턴어라운드(turnaround)를 감소시킨다.
DFA를 위한 프로브 및 프라이머 및 온도 의존성 다중화
DFA 프로브 및 프라이머의 뚜렷한 특징은 표적 서열의 Tm에 근사한 용융 온도(Tm)의 소유이다. 이런 작동 변수를 만족시키기 위해서, 프라이머 및 프로브는 일반적으로 PCR 증폭에서 사용된 것보다 높은 Tm을 소유해야만 한다. 그 결과, PCR에 사용된 공통적인 프로브 디자인은, 특히 실시간 리드아웃이 바람직한 경우에, DFA와 작동하지 않을 것이다. 한편, 다음은 프라이머 및 프로브 디자인뿐만 아니라 DFA 및 온도 의존성 다중화와 사용될 수 있는 프로브 및 프라이머 조합을 기술한다.
하나 이상의 실시태양에서, 기술된 기술은 DFA 및 온도 의존성 다중화와 작용하기 위해 현존하는 프로브 및 프라이머 기술의 변형을 필요로 한다.
다른 실시태양에서, 기술된 기술은 DFA 및 온도 의존성 다중화 작동에 필요한 프로브와 프라이머의 숫자를 최소화한다. 올리고뉴클레오티드는 반응 동안 존재하는 다른 올리고뉴클레오티드의 숫자를 제한하도록 구성되고 사용될 수 있다.
여러 특이적 프로브 디자인 및 프로브 표지 조합은 문헌에서 논의되며 당업자에게 공지되어 있다. 이들은 다음 특허에 설명된 기술을 포함하나 이에 제한되지 않는다: 전문이 특정 참조로서 각각 포함된 U.S. 5,491,063; U.S. 5,538,848; U.S. 5,571,673; U.S. 5,573,906, 및 5,804,375.
i. DFA 절단 프로브 기술 - 고려사항
예시적 이유로서, 본 발명의 한 실시태양은 도 32에 일반적으로 예시되고 다음과 같이 설명된 절단 프로브 기술을 기초로 한다. 절단 프로브 기술은 절단되지 않은 표지화된 올리고뉴클레오티드를 절단된 단편으로부터 구별하도록 사용될 수 있는 임의의 여러 기술을 의미한다. 이런 방식으로, 절단 프로브 기술은 상류 및 하류 올리고뉴클레오티드에 상보적인 서열을 함유하는 핵산 샘플의 동정을 허용한다.
본 DFA 절단 프로브 기술 실시태양은 현존하는 절단 프로브 기술의 변형이다. 배경 목적을 위해, 절단 프로브 기술은 다음과 같이 기술된다. 절단 프로브 기술은 5' to 3' 뉴클레아제 활성을 기초로 하며 이에 의해 핵산 폴리머라제는 모노뉴클레오티드 또는 소형 올리고뉴클레오티드를 표적 올리고뉴클레오티드에 어닐링된 올리고뉴클레오티드(예를 들어, 하류 올리고뉴클레오티드)로부터 절단시킬 수 있다. 절단이 효율적으로 일어나도록 하기 위해서, 상류 올리고뉴클레오티드는 동일한 표적 올리고뉴클레오티드에 어닐링되어야 한다.
이런 상류 올리고뉴클레오티드의 3' 말단은 핵산 폴리머라제에 대한 최초 결합 위치를 제공한다. 결합된 폴리머라제가 하류 올리고뉴클레오티드의 5' 말단과 만나자마자, 폴리머라제는 이로부터 모노뉴클레오티드 또는 소형 올리고뉴클레오티드를 절단할 수 있다.
두 개의 올리고뉴클레오티드는 상보적 표적 핵산 상에 가깝게 어닐링되도록 디자인될 수 있어서 상류 올리고뉴클레오티드의 3' 말단에 대한 핵산 폴리머라제의 결합은 자동적으로 이를 "중합-비의존성 절단"으로 공지된 과정에서 하류 올리고뉴클레오티드의 5' 말단과 접촉시킨다.
선택적으로, 두 올리고뉴클레오티드가 주형 핵산 표적의 더욱 멀리 이격된 영역에 어닐링되는 경우, 중합은 핵산 폴리머라제가 하류 올리고뉴클레오티드의 5' 말단과 만나기 전에 일어나야 한다. 중합이 지속됨에 따라, 폴리머라제는 점진적으로 하류 올리고뉴클레오티드의 5' 말단으로부터 모노뉴클레오티드 또는 소형 올리고뉴클레오티드를 절단시킨다. 이런 절단은 하류 올리고뉴클레오티드의 나머지가 "중합-의존성 절단"으로 불리는 과정에서 주형 분자로부터 절단되는 정도까지 불안정화될 때까지 지속된다.
실제로, 상류 올리고뉴클레오티드는 프라이머를 포함하며 하류 올리고뉴클레오티드는 프로브를 포함한다.
프로브는 뉴클레아제 활성에 의해 절단된 적어도 하나의 표지를 함유한다. 일부 실시태양에서, 프로브는 상류 표지 및 하류 표지를 포함한다. 상류 표지는 형광 염료 또는 소광제를 포함하며 하류 표지는 형광 염료 또는 소광제를 포함하여, 프로브가 용액에 있을 때, 형광 염료로부터의 신호는 소광제에 의해 억제된다. 따라서, 상류 표지는 형광 염료를 포함하며, 하류 표지는 소광제를 포함하며 반대의 경우도 마찬가지이다.
프로브 및 프라이머의 표적 올리고뉴클레오티드에 대한 결합이 발생할 때, 폴리머라제는 형광 염료 또는 소광제를 절단하거나 또는 이를 용액 속에 방출하여 염료가 더이상 소광제에 영향을 받지 않으며 형광을 발할 수 있다.
DFA의 경우에 프로브 기술 폴리머라제를 사용하기 위해 프라이머와 프로브 조합을 디자인하는데, 다음 인자는 반드시 고려되어야 한다.
첫째, DFA의 중심 특징 중 하나는 프라이머의 Tm과 관심 서열의 Tm 사이가 가깝게 위치하는 것이기 때문에, 프라이머는 PCR에 사용된 프라이머보다 자주 더 길어야 한다. 실시태양에서, 프라이머는 자주 대개 50개 염기쌍이다.
둘째, 프로브는 또한 프라이머의 온도와 대략 동일하거나 약간 높은 온도에서 어닐링되기 때문에, 프로브는 PCR에 사용된 프로브보다 자주 더 길어야 한다. 실시태양에서, 프로브는 50개 염기쌍 이상이어야 한다.
셋째, 이런 길이의 프로브 및 프라이머를 수용하기 위해서, 표적 서열은 PCR의 길이보다 길어야만 한다. 이런 길이는 개별 프로브 및 프라이머의 GC 함량에 따라 다소 변할 수 있다.
더 긴 프로브 길이는 다음 이유 때문에 DFA에 의한 현존 절단 프로브 화학 반응을 사용하는데 문제를 일으킨다. 소광은 일반적으로 다음 식: F = 1/r3를 따른다.
따라서, 현존 절단 프로브 화학 반응의 경우에, 소광제는 일반적으로 프로브가 용액에 있을 때, 소광이 효과적으로 일어나는 형광체에 방사상으로 충분하게 가깝다. DFA 프로브의 경우에, 소광제는 일반적으로 프로브가 용액에 있을 때 소광하도록 형광체에 방사상으로 충분하게 가깝지 않다.
따라서, 전통적인 절단 프로브 화학 반응의 경우에, 절단 프로브와 여전히 용액에 있는 프로브를 구별하는 것은 불가능하다.
이런 문제에 대한 해결책은 본 발명에서 "혼성 헤어핀/절단 프로브" 또는 간단히 "혼성 프로브"로 불린다.
ii. DFA 절단 프로브 기술 - 혼성 헤어핀/절단 프로브
구체적으로, 이런 혼성 헤어핀/절단 프로브는 프로브를 포함하는 올리고뉴클레오티드가 상보적 서열의 적어도 한 쌍을 함유한다는 점에서 전통적인 헤어핀 프로브와 유사하다. 프로브가 용액에 있을 때, 상보적 서열은 서로 분자내에서 혼성화되어, 프로브가 헤어핀 유사 형태를 갖게 하여 소광제를 형광체와 충분히 방사상으로 가깝게 위치시켜 형광체로부터의 신호를 소광한다.
다음은 헤어핀을 형성할 DFA 올리고뉴클레오티드 프로브에 대한 예시적 서열을 포함한다.
mfold 실시예 1의 접힘 염기 1 내지 72의 구조 1( SEQ ID NO: 1)
Figure pct00001
mfold 실시예 2의 접힘 염기 1 내지 67의 구조 1( SEQ ID NO: 2)
Figure pct00002
mfold 실시예 3의 접힘 염기 1 내지 83의 구조 1( SEQ ID NO: 3)
mfold 실시예 3의 접힘 염기 1 내지 83의 구조 2( SEQ ID NO: 4)
Figure pct00004
mfold 실시예 4의 접힘 염기 1 내지 67의 구조 1( SEQ ID NO: 5)
Figure pct00005
LTSOW _ SNP2CT _ xm1의 접힘 염기 1 내지 38의 구조 1( SEQ ID NO: 6)
Figure pct00006
LTSOW _ TERT _XM1 75-90의 접힘 염기 1 내지 36의 구조 7( SEQ ID NO: 7)
Figure pct00007
LTSOW _ RNAseP _XM1의 접힘 염기 1 내지 30의 구조 1( SEQ ID NO: 8)
Figure pct00008
LTSOW _CC3_XM1의 접힘 염기 1 내지 42의 구조 1( SEQ ID NO: 9)
Figure pct00009
LTSOW _ CYPD2D _XM1의 접힘 염기 1 내지 45의 구조 1( SEQ ID NO: 10)
Figure pct00010
mfold version 3.5
M. Zuker, Rensselaer Polytechnic Institute
그러나, 혼성 프로브는 다음 방식으로 전통적인 헤어핀 프로브와 다르다. 전통적인 헤어핀 프로브와 달리, 혼성 프로브는 프로브가 어닐링되는 DNA 가닥 상의 반대 서열에 상보적인 말단 상의 서열을 포함한다. 이것이 프로브가 절단 프로브의 동일한 또는 유사한 방식으로 표적 서열에 완벽하게 어닐링되게 한다. 따라서, 절단 프로브와 같이, 혼성 프로브는 폴리머라제가 서열을 신장함에 따라 절단된다. 이것은 전통적인 헤어핀 프로브의 말단은 이들의 반대 표적 서열과 상보적이지 않도록 고의로 디자인된다는 점에서 전통적인 헤어핀 프로브와 다르다. 이것은 폴리머라제가 프로브 아래로 이동하도록 이루어진다.
다른 실시태양에서, 프라이머 및 프로브의 용융 온도는 단일 - 또는 이중 - 가닥 DNA와 결합하는 결합제에 의해 공유적으로 올리고뉴클레오티드 길이를 현저하게 증가시키지 않고 증가될 수 있어서, Tm을 증가시킨다. 마이너 그루브 접합제(minor groove binder)로 공지된 종류의 물질은 나선형 DNA와 결합하고 안정화시키며, 제한된 온도 범위 내에서 프로브로서 사용되었다. Tm을 증가시킴으로써, 더 짧은 프라이머 및 프로브는 DFA 온도 범위 내에서 작동할 수 있다. PCR 온도 범위의 경우, 이런 접근법의 한 예는 마이너 그루브 접합제의 사용이다. 단일 가닥 및 이중 가닥 DNA 모두에 결합하는 것들을 포함하는 다른 종류의 물질이 아래에서 예로서 고려된다.
( SEQ ID NO: 11)
Figure pct00011
위에 도시한 대로, 프라이머 또는 프로브는 인접한 DNA에 결합하고 프라이머/프로브 Tm을 증가시키는 공유 결합 모이어티("*"로 표지됨)를 가진다. 안정화 모이어티는 ds 또는 ssDNA에 결합할 수 있다.
다른 실시태양에서, Tm을 증가시키는 올리고뉴클레오티드 주쇄 또는 염기 변형은 올리고뉴클레오티드 길이를 증가시키지 않고 DFA 범위 속으로 프라이머/프로브 Tm을 이동시키는데 사용될 수 있다.
이런 변형은 LNA, PNA, 다이티오포스페이트 결합, 2'-O-메틸, 2'-플루오로와 같은 2' 당 변형, 5-할로피리딘, 5-메틸 피리미딘과 같은 염기 변형, 추가 수소 결합을 만드는 염기, 슈퍼 G, 2-아미노 퓨린과 같은 다른 퓨린 염기 변형 등을 포함하나 이에 제한되지 않는다.
iii. DFA 프로브 기술 - FRET 프로브
도 33에 도시된 절단 프로브 기술의 다른 실시태양에서, 바토페난트롤린-RU II 복합체가 표지 분자로서 사용된다. 이런 복합체는 적절한 에너지 도너 분자로부터 Ru 복합체까지 에너지 전이를 허용하는 표지 분자의 상호작용 쌍의 일부일 수 있다. 에너지 전이의 효율은 도너 및 억셉터 분자 사이의 거리에 매우 의존하기 때문에, 이런 에너지 전이 시스템은 분자 상호작용을 연구하는데 유용하다.
Ru 복합체로서 사용하기 위한 적절한 종류의 억셉터 분자는 루마진 발색단 그룹의 분자이다. 이런 조합을 사용하여, 에너지 전이는 Ru 복합체가 루마진 발색단으로부터 적절한 거리에 떨어져 있는 Ru 바토페난트롤린 복합체 및 루마진 발색단 사이에서 탐지될 수 있다. 폴리머라제 절단 기술과 함께 사용될 때, 두 표지 중 하나는 프로브로부터 절단되고, 표적 서열의 증폭이 성취되었는지를 측정하는데 유용한 발광의 변화가 탐지될 수 있다.
도 34는 이중 혼성화 프로브 및 프라이머 조합을 도시한다. 이런 실시태양은 두 서열 특이적 프라이머 이외에 두 서열-특이적 올리고뉴클레오티드 프로브를 포함한다. 프로브는 형광 공명 에너지 전이(FRET)에 참여할 수 있는 염료의 쌍을 포함하며, 도너 염료는 한 프로브에 부착되며 억셉터 염료는 다른 프로브에 부착되며, 도너 염료 및 억셉터 염료 모두는 프로브가 표적 서열에 부착될 때, FRET에 참여하도록 서로 충분히 가깝게 위치하도록 위치된다. 프로브 및 프라이머 모두는 XCR에 대한 온도 필요조건을 충족한다.
도 35는 FRET에 참여할 수 있는 프라이머/프로브 조합을 도시한다. 서열-특이적 올리고뉴클레오티드 프라이머 및 서열-특이적 올리고뉴클레오티드 프로브는, 주로 프라이머에 의해 형성된 가닥에 상보적인 프로브에 의해, 표적의 인접한 서열에 결합하도록 디자인되어, 프로브는 신장된 표지된 프라이머로부터 합성된 상보적 가닥에 어닐링된다.
이런 길이의 프로브 및 프라이머를 함유하는 분석법을 디자인하면 이런 길이의 프로브 및 프라이머는 DFA에 필요한 표적 서열의 Tm의 좁은 범위 내에서 Tm을 소유하도록 디자인될 수 없다고 일반적으로 생각되는 점에서 예상치 못한 결과를 초래한다. 그러나, DFA를 위한 적절한 Tm 범위를 가진 프로브 및 프라이머는 쉽게 디자인될 수 있다는 것이 발견되었다.
프라이머 / 프라이머 XCR 탐지 화학
HybBeacon 및 HyGlow 프로브와 같은 현존하는 프로브 탐지 화학으로부터의 관찰은 조밀한 2차 구조로의 프로브의 고유 접힘 및 형광 염료의 동반하는 상대적 소수성은 서로 실제 접촉하지 않는 경우 이런 형광 모이어티가 가깝게 위치하도록 한다. 이것은 접힌 올리고뉴클레오티드 및 이들의 부착된 염료에 대해 일반적으로 엔트로피적으로 선호하는 형태로부터 발생하는 것으로 생각된다.
XCR은 전통적인 PCR 기술의 속도의 거의 10x로 DNA 또는 RNA 주형을 증폭하는 능력을 입증하였다. 이런 속도로 증폭을 실행하는데 대한 하나의 실질적인 제한은 증폭 프로토콜 동안 프로브 기반 탐지를 합체시켜야 하는 필요이다. 필요한 추가 시간의 주요 원인은 프로브의 혼성화에 대한 필요이며, 5' 뉴클레아제 XCR 프로브의 경우에, 추가 시간은 프로브가 절단되어 소광제로부터 염료의 소광을 방출하는데 필요하였다.
다음은 HybBeacon 및 HyGlow 기술의 장점을 이용하는 실시간 증폭에서 형광을 탐지하는 방법을 기술하며, 형광 소광은 올리고뉴클레오티드의 이의 상보적 주형에 결합함으로써 방출된다.
이런 디자인에 따라, 형광 올리고뉴클레오티드가 프로브가 되는 대신에, 형광 분자는 증폭을 일으키는데 사용된 프라이머이다.
주요 이점은 프라이머가 본질적으로 어닐링되고 주형 상에서 '신장되어' 프라이밍 복합체의 개시시에 형광 소광을 방출하기 때문에, 형광 프로브가 결합하게 하는 추가 시간이 필요하지 않다는 것이다. 프라이머의 길이를 따라 대략 이격된 6-9개 뉴클레오티드 이격된 염료를 가지나 3' 말단 상에 염료 없이 충분한 뉴클레오티드가 남겨진 포워드 및 리버스 프라이머를 도시하는 도 36 참조. 프라이머가 이들의 보체에 결합될 때, 형광 소광이 방출되어 탐지가능한 신호가 생성된다.
형광 프라이머는 이런 디자인에서 여러 목적을 수행한다. 먼저, 2개의 형광 신호가 생성되는데, 포워드 프라이머에 대한 하나는 적절한 주형에 결합되고 리버스 프라이머에 대한 하는 반대 가닥 주형에 결합된다.
프라이머는 다른 유사 프라이머와 신장 생성물, 프라이머-다이머를 형성하고, 프라이머 상의 염료는 소광의 방출을 예방하는데 충분힌 가깝게 위치해야 하며 따라서 소광된 상태로 유지되어 이런 프라이머-다이머 복합체로부터 형광 신호를 생산하지 않는다.
두 개의 다르게 표지된 프라이머는 프라이머-다이머 복합체를 형성하며, 이들의 소광은 약해지지 않을 것이나, 오히려 FRET 복합체가 형성될 것이며, 프라이머-다이머 복합체의 형성을 나타내는 신호는 더 낮은 에너지 파장(표준 FRET 신호)에서 방출을 가진 더 높은 에너지 파장에서 여기에 의해 관찰될 수 있을 것이다. 소광된 포워드 프라이머-다이머 복합체, 소광된 리버스 프라이머-다이머 복합체, 및 FRET 신호를 통해 탐지할 수 있는 포워드 및 리버스 프라이머의 일체 결합으로부터 형성된 프라임-다이머 복합체를 예시하는 도 37 참조.
특정 상황하에서, 주형 의존성 비-특이적 생성물이 제조될 때, 단일 프라이머가 주형의 프라이밍을 개시하는 것이 가능할 수 있다. 이런 생성물은 단일 형광 염료 신호를 생산할 것이다. 포워드 프라이머 주형 형성 신호, 및 리버스 프라이머 주형 형성 신호 및 포워드 및 리버스 프라이머가 표적 주형을 생산할 때 발생된 신호를 예시하는 도 38 참조.
두 염료 표지 프라이머를 가진 정확한 생성물은 동일한 반응 형성 효율을 가진 두 뚜렷한 염료로부터의 형광 신호의 형성을 보여줄 것인데 이는 증폭 생성물의 형성에서 서로 직접 연결될 것이며 두 형광 채널에서 동시에 관찰될 수 있기 때문이다. 도 39 참조.
이런 디자인 전략의 다른 데이터 평가 이점은 증폭 생성물이 형성되고 두 형광 신호가 증폭 생성물에 의해 생성되는 것이다. 유사 프라이머가 소광될 것과 같이, FRET을 초래하는 임의의 프라이머-다이머 신호는 증폭 신호의 기준 정규화를 가능하게 하도록 형성된 신호로부터 제거될 수 있다. 도 40 참조.
종합적으로, 이런 기술의 이점은 증폭 동안 프로브가 혼성화는 것 또는 프로브가 절단될 것을 더 이상 기다릴 필요가 없게 됨으로써 XCR 속도를 제한하지 않을 것이라는 점이다.
XCR 이외에, 이런 디자인은 또한 PCR 분석에 적합하다; 그러나, 이런 화학이 사용되지 못했고 분명하지 않았던 이유는, SYBR Green 1과 같은 이중 가닥 DNA 결합 염료는 진단 테스팅 방법에 적합한 것으로 대부분 무시되어 온 경우와 같이, PCR이 상당한 비-특이적인 생성물 형성 및 단지 프라이머의 사용으로 손해를 본다는 것이다.
삼중체 형성 영역 프로브 디자인
다른 실시태양에서, 본 발명은 DFA 또는 온도 의존성 다중화와 사용하기에 적합한 다중 프로브 기술을 제공한다.
이 실시태양은 반응의 프로브가 반응의 증폭 부분에 참여할 필요를 제거함으로써 필요한 올리고(예를 들어, 프라이머 및 프로브)의 수를 감소시킨다.
대부분의 현재 프로브 기술은 증폭된 서열을 위한 프로브에 개별 또는 여러 올리고뉴클레오티드를 사용한다. 이런 올리고뉴클레오티드 프로브는 DNA 증폭의 과정에서 관심 서열에 결합한다.
반대로, 증폭은 서열 특이적 프라이머에 첨가된 삼중체 형성 영역(TFR)을 사용하여 탐지될 수 있다. 본 발명은 TFR에서 각각의 특이적 생성물과 상호작용하도록 디자인된 삼중체 형성 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용하여 형성된 특정 생성물을 기초로 한 형광의 독특한 색을 생산한다. 이것은 반응에 존재하는 올리고뉴클레오티드의 수를 감소시킨다,
삼중체 형성 프로브는 증폭 반응에서 참여하지 않으며 현존 프로브 기술이 나타내는 경향을 가지는 방식으로 반응을 늦추지 않는다.
두 개의 다른 겹치지 않는 올리고뉴클레오티드가 동일한 선형 상보적 핵산 서열의 다른 영역에 어닐링되고 한 올리고뉴클레오티드의 3' 말단이 다른 것의 5' 말단으로 향할 때, 전자는 "상류" 올리고뉴클레오티드로 불릴 수 있고 후자는 "하류" 올리고뉴클레오티드로 불릴 수 있다.
본 발명의 실시는, 달리 나타내지 않는 한, 문헌에서 충분히 설명된 분자 생물학, 미생물학, 및 재조합 DNA 기술뿐만 아니라 전문이 참조로 본 발명에 포함된 미국특허 7,838,235에 개시된 방법을 사용할 것이다.
한 실시태양에서, 핵산 증폭 생성물을 위한 삼중체 형성 올리고뉴클레오티드 프로브 기반 탐지 화학이 사용된다.
인공적 서열 삼중체 형성 영역(TFR)이 디자인된 올리고뉴클레오티드에 첨가되어 삼중체 형성 프라이머를 생성한다.
본 발명에 사용된 대로, 삼중체 형성 영역 또는 TFR은 DNA의 제 3 가닥이 이중 가닥 TFR에 결합하여 삼중체로 알려진 삼중 가닥 길이의 DNA를 형성한다는 점에서, 후그스틴(Hoogsteen) 또는 삼중체 염기 쌍 형성에 도움이 되는 특정 DNA 서열을 의미한다.
다음은 삼중체 형성 영역을 형성하는 서열의 예시적 예이다:
5' - GTGTGGGAAGAGGGGGAXGAGGGGGAGGAGC - 3' ( SEQ ID NO: 32)
3' - CACACCCCTTCTCCCTXCTCCCCTCCGTCG - 5' ( SEQ ID NO: 33)
5' - GTGTGGGAAGAGGGGGAXGAGGGGGAGGAGC - 3' ( SEQ ID NO: 34)
3' - CACACCCCTTCTCCCTXCTCCCCTCCGTCG - 5' ( SEQ ID NO: 35)
한 실시태양에서, TFR은 디자인된 프라이머의 5' 말단 상에 위치된다.
대안적 실시태양에서, TFR은 디자인된 프라이머의 5' 말단에 가깝게 위치된다.
다른 실시태양에서, TFR은 디자인된 프라이머의 내부의 임의의 위치에 위치된다.
다른 실시태양에서, TFR은 디자인된 프라이머의 3' 말단 상에 위치된다.
다른 실시태양에서, TFR은 디자인된 프라이머의 3' 말단에 가깝게 위치된다.
삼중체 형성 프라이머는 소정의 DNA 서열에 상보적이며 DNA 폴리머라제에 의한 복제를 개시하는데 필요한 DNA 또는 RNA의 단편일 수 있다.
삼중체 형성 올리고뉴클레오티드는 삼중체 형성 올리고뉴클레오티드 프로브(TFO) 프로브를 포함할 수 있다. TFO 프로브는 이중 가닥 핵산 서열의 적절한 서열 삼중체 형성 영역에 복합체화될 수 있으며, 따라서, TFO 프로브가 일부 방식으로, 발색단에 의해 표지화될 때, TFO 프로브는 임의의 핵산 서열을 동정하는데 사용될 수 있다.
한 실시태양에서, 삼중체 형성 영역(TFR 프라이머)을 포함하는 프라이머는 형광 염료를 소유할 수 있다.
도 41에 도시된 바와 같이, TFR 프라이머는 표적 서열의 증폭에 참여하여, 표적 서열의 길이를 따라 및 표적 서열에 첨부된 삼중체 형성 DNA의 가닥을 형성한다.
단계 1은 올리고뉴클레오티드 프라이머에 결합된 표적 서열의 변성 DNA의 단일 가닥을 묘사한다. 올리고뉴클레오티드 프라이머는 표적 서열과 일치하지 않는 태그 말단 서열을 포함한다. 태그 말단 서열은 하나 이상의 삼중체 형성 서열을 포함한다.
단계 2는 증폭 과정의 신장 단계를 묘사한다. 이런 단계 동안, 프라이머는 3' 말단 쪽으로 신장되어 다음 사이클을 위한 표적을 생성한다.
단계 3은 표적으로부터 변성된 신장된 프라이머를 묘사한다.
단계 4는 신장된 TFR 프라이머에 어닐링된 태그를 갖지 않은 프라이머를 묘사한다.
단계 5는 삼중체 형성 영역을 가진 이중 가닥 DNA 서열을 생성하는 태그를 갖지 않은 프라이머의 신장 단계를 묘사한다.
다음 탐지 방법은 TFO 프로브가 증폭된 DNA의 이중 가닥 삼중체 형성 영역과 결합했는지를 측정하는데 사용될 수 있어서, DNA가 관심 서열을 소유하는지를 나타낸다.
도 42에 도시된 바와 같이, 삼중체 형성 올리고뉴클레오티드는 다음 방식으로 생성된다. 단일 가닥 TFO는 증폭 과정 동안 생성된 표적 서열에서 삼중체 형성 영역에 결합하도록 디자인된다. 형광 에너지 전달(FRET)에 참여할 수 있는 염료는 삼중체 TFO 프로브에 부착된다. 이런 예에서, 염료는 도너 염료이다. 다음은 TFR을 가진 이중 가닥 DNA에 삼중체를 형성하는 단일 가닥 DNA의 두 예이다:
5' - GGAGGGGGAGAAGGGAGAAGGG - 3' ( SEQ ID NO: 36)
3' - CCTCCCCCTCTTCCCTCTTCCC - 5' ( SEQ ID NO: 37)
5' - GGTGGGGGTGTTGGGTGTTGGG - 3' TFO ( SEQ ID NO: 38)
3'- GGGTTGTGGGTTGTGGGGGTGG - 5' TFO ( SEQ ID NO: 39)
5' - GTGTGGGAAGAGGGGGAXGAGGGGGAGGAGC - 3' ( SEQ ID NO: 40)
3' - CACACCCCTTCTCCCTXCTCCCCTCCGTCG - 5' ( SEQ ID NO: 41)
도 42에 도시된 바와 같이, TFO 프로브의 3' 말단은 TFO 프로브가 증폭 과정에 참여하는 것을 막기 위해 인산염으로 씌워진다. TFO 프로브는 또한 증폭 반응 동안 올리고뉴클레오티드 신장을 예방하기 위해 당업자에게 공지된 형광 염료, 비-신장가능한 링커 또는 임의의 다른 적절한 원자 또는 분자에 의해 씌워질 수 있다. 도너 염료는 프로브의 3' 말단에 부착되거나 3' 말단에 가깝게 부착될 수 있다. 도너 염료는 TFO 프로브의 5' 말단과 3' 말단 사이의 임의의 곳에 부착될 수 있다. 염료가 TFO 프로브에 부착될 때, 삼중체 형성 형광 프로브(TFFP)를 포함한다.
도 43은 삼중체 형성 영역을 포함하는 이중 가닥 DNA 서열을 도시한다. 이중 가닥 DNA 서열은 수용체 염료를 소유한다. TFFP의 TFR은 이중 가닥 DNA의 삼중체 형성 영역에 부착된다.
한 실시태양에서, TFFP는 반응의 온도가 프라이머의 어닐링 온도 이하일 때에만 증폭된 DNA에 어닐링된다. 따라서, 삼중체 형성 형광 프로브는 반응에 참여하지 않는다. TFFP는 증폭된 서열에 결합되고 빛이 생성물에 비춰질 때, TFFP 상의 도너 염료는 공명한다. 도너 염료가 공명할 때, 도너 염료는 이중 가닥 DNA 상에 위치된 억셉터 염료에 에너지를 전달하여, 억셉터 염료가 특정 파장에서 형광하게 하여, 그 파장에 해당하는 색의 빛을 방출한다. 이것은 관심 서열이 테스트 샘플에 존재하였고 증폭되었다는 것을 나타낸다.
다른 실시태양에서, 억셉터 염료는 TFFP에 부착되고 도너 염료는 증폭된 이중 가닥 DNA 생성물에 부착된다. 이 실시태양에서, 억셉터 염료는 관심 서열이 증폭되었을 때 형광된다.
다른 실시태양에서, 복수의 프라이머가 사용될 수 있고, 각 프라이머는 다른 관심 서열에 결합하거나 특이적으로 증폭하도록 디자인된다. 각 프라이머는 부착된 다른 억셉터 염료를 가지며 그 결과 각각의 억셉터 염료는 다른 파장에서 형광한다. 삼중체 형성 형광 프로브는 증폭된 생성물의 삼중체 형성 영역에 결합할 것이다. 삼중체 형성 프로브에 부착된 도너 염료는, 어느 생성물이 증폭되었는지에 따라, 증폭된 생성물 상의 억셉터 염료가 특정 색을 형광하게 할 것이다. 이런 방식으로, 복수의 다른 서열은 한 번에 테스트될 것이다. 이런 실시태양은 한 반응 용기에서 복수의 다른 잠재적 관심 서열이 테스트되게 할 것이다. 한 반응 용기에서 복수의 다른 잠재적 관심 서열에 대한 테스팅은 다중화로 공지되어 있다.
다중 프로브 조합의 다른 실시태양에서, 억셉터 염료는 TFFP에 부착될 수 있고 도너 염료는 증폭된 이중 가닥 DNA 생성물에 부착될 수 있다. 이런 실시태양에서, 각각의 프라이머는 다른 색의 도너 염료를 가질 수 있어서, TFO 프로브에 부착된 억셉터 염료는, 어느 프라이머가 관심 서열을 증폭하는지에 따라,다른 색에서 형광할 것이다.
다른 실시태양에서, TFO 프로브는 프라이머의 Tm와 대략 동일한 온도 또는 약간 더 높거나 낮은 온도에서 어닐링되도록 디자인된다. 이런 실시태양은 실시간으로 증폭 결과의 해석을 가능하게 한다.
자연적으로 발생하는 TFR을 가진 삼중체 형성 영역 프로브 디자인
다른 실시태양은 관심 서열 자체 내에 또는 인접하게 위치된 자연적으로 발생하는 삼중체 형성 영역을 이용한다. 다음은 이중 가닥 DNA에서 자연적으로 발생하는 TFR 서열의 예이다.
5' TTTTTTCCCGTCC 3' ( SEQ ID NO: 42)
3' AAAAAGGGCAGG 5' ( SEQ ID NO: 43)
5' GGCGAGGGGGGAGCGGG 3' ( SEQ ID NO: 44)
3' CCGCTCCCCCCTCGCCC 5' ( SEQ ID NO: 45)
5' GGAGGTGGGGGAG 3' ( SEQ ID NO: 46)
3' CCTCCACCCCCTC 5' (SEQ ID NO: 47)
5' GGAGGTGGGGGAG 3' ( SEQ ID NO: 48)
3' CCTCCACCCCCCTC 5' ( SEQ ID NO: 49)
5' GGAGAAGGTGAGGAAGAAGAAGAGGAAGAA 3' ( SEQ ID NO: 50)
이 실시태양에서, 프라이머는 자연적으로 발생하는 삼중체 형성 영역뿐만 아니라 관심 서열과 결합하도록 디자인된다.
이런 방식으로, DNA의 삼중체 형성 영역은 관심 서열이 증폭됨에 따라 탐지가능한 수준으로 증폭된다. 프라이머는 이에 부착된 억셉터 염료를 가진다. 자연적으로 발생하는 관심 서열에 상보적인 서열을 가지는 삼중체 형성 프로브가 생성된다.
다중화 방법의 다른 실시태양에서, 특정 관심 서열을 테스트하도록 디자인된 프라이머의 각 세트는 자신의 독특한 색의 염료 이외에 자신의 독특한 TFR 염기 쌍을 포함한다. 한 실시태양에서, 염료는 도너 염료일 것이다. 복수의 TFO 프로브가 디자인되며, 이의 각 세트는 증폭된 생성물의 하나의 특정 TFR과 일치하는 TFR을 포함한다. 프로브의 각 세트는 또한 자신의 독특한 억셉터 염료 색을 포함한다. 어느 생성물이 증폭되는지는 어느 프로브가 이와 결합할 것을 결정한다. 어느 프로브가 증폭된 생성물에 부착되고, 어느 관심 서열이 샘플에 존재하는지는 프로브가 TFO 프로브의 염료에 의해 FRET가 진행될 때 프로브의 형광의 색에 의해 측정된다.
다른 실시태양에서, 탐지 방법은 삼중체 DNA 구조에 우선적으로 결합하는 특수 DNA 결합 염료의 사용을 포함할 수 있다. 한 실시태양에서, 염료는 티아졸 오렌지를 포함한다. 다른 실시태양에서, 염료는 시아닌 40 염료를 포함한다. 본 발명에 설명한 염료 이외에, 당업자에게 공지된, 삼중체 DNA 구조에 우선적으로 결합하는 임의의 다른 염료가 사용될 수 있다. 이런 삼중체 결합 염료는 프라이머 상에 또는 생성물 자체의 내부에 염료 표지화된 TFR과 조합하여 사용되어 특이적으로 형성된 표적 서열(들)의 존재를 나타낼 수 있는 FRET 기반 신호를 생산할 수 있다.
다른 방법은 DNA 결합 염료에 결합하는 TFO 프로브를 필요로 한다. 이들은, 제한 없이 다음을 포함할 것이다: Sybr Green 1; Sybr Gold; Eva Green; LightCycler Green I; LightCycler Green II; Toto/Yoyo/Toyo; 및 당업자에게 공지된 혼성화된 DNA 구조에 결합하는 다른 DNA 결합 염료. 도 44에 도시된 바와 같이, TFO 프로브 상의 특정 위치, 이런 예에서, TFO 프로브의 말단에 대한 공유 결합에 의해 제약된 결합 염료는 TFO 프로브가 결합되어, TFO 프로브를 증폭 관심 서열에 부착된 염료에 가깝게 놓는 경우 혼성화된 DNA 구조에만 결합할 수 있다. 따라서, 형광 신호는 증폭이 발생하는 것을 나타낸다.
또 다른 실시태양에서, Cy2 또는 당업자에게 공지된 다른 사중체 결합 염료가 사용될 수 있다.
다른 실시태양에서, TFO 프로브는 길이를 따라 임의의 곳에 위치된 형광 염료 및 소광제와 합성될 수 있다. 도 45에 도시된 바와 같이, 이 실시태양은 헤어핀 염료 및 소광제 형태를 사용한다. TFO 프로브가 관심 서열에 결합하자마자, 프로브의 헤어핀 구조가 제거되고, 소광제가 염료로부터 충분하게 멀어지게 되어 염료의 형광을 억제하는 것은 더 이상 불가능하게 되는 결과를 초래한다. 이것은 관심 서열이 증폭된 경우 특정 색의 형광이 방출되게 한다. 특이적 형광 신호 변화는 반응 혼합물에서 임의의 다른 생성물의 것과 구별가능한 한 문제가 되지 않는다. 탐지될 수 있는 전체 반응 수는 반응이 실행되는 장치 플랫폼에만 의존하여 구별될 수 있다.
도 46에 도시된 바와 같이, 다른 실시태양에서, 동일한 TFR 서열을 가진 둘 이상의 프라이머는 TFR 서열에 상보적인 서열을 포함하는 TFR 서열과 함께 사용될 수 있다. 도 46은 3개의 다른 TFR 프라이머를 도시하며, 각각은 다른 색 염료를 가진다. 단계 2에서, 적색 염료를 포함하는 프라이머는 관심 서열에 결합되었고 증폭되었다. 단계 3에서, TFR 프로브는 삼중체에 우선적으로 결합하는 결합 염료의 존재하에서 TFR에 결합되었다 이런 결합 염료는 티아졸 오렌지, 시안 40 또는 당업자에게 공지된 임의의 다른 삼중체 결합 염료를 포함할 수 있다. 결합 염료는 부착된 발색단과 함께 FRET에 참여하여, 적색 염료를 포함하는 프라이머에 상보적인 서열이 증폭되었다는 것을 나타낸다.
다른 실시태양에서, 생성물은 삼중체 생성물의 색, 용융 온도 또는 색과 용융 온도 모두의 조합에 의해 구별될 수 있다. 도 47은 6개 프라이머가 각각 둘의 3개의 세트로 나뉜 실시태양을 도시한다. 두 프라이머의 각 세트는 동일한 TFR 서열을 포함하며 세 세트는 3개의 다른 TFR 서열을 포함하여 프라이머의 3개의 세트의 각각은 다른 용융 온도를 갖는다는 이유로 다른 두 개와 구별된다. 각 세트 내의 두 TFR 공유 프라이머는 다른 색 염료를 가진다. 이 방법은 또한 프라이머의 쌍 중 하나의 TFR에 결합하는 서열을 포함하는 프로브의 3개 세트를 사용하는 단계를 포함한다. 그런 후에 생성물은 용융 온도 및 색의 독특한 조합을 기반으로 구별될 것이다. 구별하는 생성물의 이런 다양한 방법은 정량적, 지노타이핑 또는 단순한 표적 탐지로서 증폭된 생성물의 탐지에서 삼중체 DNA 형성의 사용을 가능하게 할 것이다.
다음은 DFA의 독특한 특징을 이용하도록 디자인된 프라이머 및 프로브 기술의 다른 실시태양이다. 이런 실시태양에서, 한 쌍의 프라이머의 각 프라이머는 형광 공명 에너지 전달(FRET)에 참여할 수 있는 염료로 표지화된다. 도 48에 도시된 바와 같이, 도너 염료는 제 1 프라이머의 3' 말단 근처에 부착되는 반면, 억셉터 염료는 제 2 프라이머의 3' 말단 근처에 부착된다. 어닐링 단계에서, 프라이머는 거의 테일-투-테일 배열로 표적 서열에 혼성화되어, FRET이 일어나도록 염료를 충분히 가깝게 가져온다. 억셉터 형광의 양은 존재하는 DFA 생성물의 양에 비례한다.
DNA 서열의 표적 서열을 증폭 및/또는 탐지하기 위한 본 발명의 분석 키트는 i) 본 발명에 기술된 프라이머 및 프로브, 및 ii) 버퍼, dNTPs, 및 효소를 포함할 수 있다. 이런 시약은 복수의 분석을 실행하도록 충분한 양으로 존재한다.
추가 삼중체 형성 영역 프로브 디자인
삼중체 형성 올리고뉴클레오티드는 PCR, XCR, RAMP, HDA, NEAR, 온도 의존성 다중화 또는 다량의 증폭된 이중 가닥 DNA를 초래하는 임의의 다른 증폭 기술로부터 증폭 생성물의 탐지를 위한 독특한 방법을 제공한다.
본 발명자는 프라이머의 길이를 따라 어딘가에 부착된 인공 TFR의 도입을 기술하였다. 더욱 흥미로운 것은 놀랍게도 풍부한 삼중체 형성 영역(TFR)의 자연 발생이다. 예를 들어, 2백만 염기쌍 게놈을 가진 스트렙토콕커스 아갈락티애는 16개 염기쌍 이상의 29개나 되는 TFR을 가진다. 이런 TFR의 상대적으로 높은 풍부함은 이런 TFR(호모퓨린 또는 호모피리미딘 신장)을 원하는 핵산의 증폭에 대한 잠재적인 진단 마커로서 사용하는 것을 가능하게 한다.
TFO는 완벽한 이중 가닥 신장이 생성물의 TFR 부분을 통해 일어나는 반응 동안 임의의 지점에서 증폭된 이중 가닥 DNA에 결합될 것이다.
유리하게는, 이런 결합 사건은 증폭의 여러 단계에서 관찰될 수 있고, 따라서, 다른 혼성화 화학 반응과 달리, 실시간 리드아웃이 신장되지 않은 단일 가닥 DNA가 프로브 결합을 위해 노출되는 반응의 최저 온도에서 일어나도록 의무를 지우지 않을 것이다.
형광 판독을 위해 더 고온을 사용할 수 있게 되는 한 뚜렷한 장점은 비교적 낮은 반응 온도에서 연장된 시간 동안 유지함으로써 비-특이적 생성물 형성을 조장하지 않는 동등한 이점에 의해 반응이 최대 속도까지 가속될 수 있다는 것이다.
사이클링 프로브 기술
증폭 생성물을 탐지하는 또 다른 방법은 종단점 분석을 제공함으로써 DFA의 속도를 이용하는 사이클링 프로브 기술을 사용한다. 미국 특허 제 5,660,988호(모든 목적을 위해 전문이 본 명세서에 포함됨)에 기술된 사이클링 프로브 기술은 소위 신호 증폭 방법에 사용되는 기술이다. 미국 특허 제 5,660,988호에 기술된 바와 같이, 사이클링 프로브는 표적에 결합하고 이어서 효소에 의해 절단된다. 사이클링 프로브가 절단되면 다른 사이클링 프로브가 표적에 결합하고 차례로 절단된다. 이 과정은 모든 프로브가 사용될 때까지 반복될 수 있다. 본 발명에 기술된 방법에서, 사이클링 프로브는 진행되는 반응에 대한 열 사이클링 프로파일의 최저 Tm보다 낮은 Tm을 갖도록 설계된다. 일단 반응이 진행되면, 반응 온도는 사이클링 프로브의 Tm과 같거나 더 낮은 지점으로 낮아진다. 양성 결과의 경우, 사이클링 프로브가 결합하여 신호가 생성될 때까지 연속적으로 절단된다. 대안적으로, 리보뉴클레오티드를 함유하는 프로브는 초기 열 사이클링 동안 기능할 수 있으며, RNAse 또는 폴리머라제의 엑소뉴클레아제 활성에 의해 절단될 수 있다.
실시예
실시예 1: 태그를 가진 프라이머를 사용하는 표적 서열의 증폭
표적 서열을 증폭하기 위해 DAF와 함께 사용하도록 다음 프라이머를 생성하였다.
살모넬라 FORw / otag ( SEQ ID NO: 12):
CGACGACCCTTCTTTTTCCTCAATACTGAGCGGCTG, Tm 75.8℃ @ 4mM Mg 및 0.5μM 프라이머
살모넬라 REVw / otag ( SEQ ID NO: 13):
CGCTGCCGGTATTTGTTATTTTATCGGTGGTTTTAAGCGTACTCTTCTATTTTAAATTCC, Tm 75.2℃ @ 4mM Mg 및 0.5μM 프라이머
살모넬라 FORw /tag ( SEQ ID NO: 14):
CGTCGCGACGACCCTTCTTTTTCCTCAATACTGAGCGGCTG, 태그에 밑줄이 그어진다.
살모넬라 REVw /tag ( SEQ ID NO: 15):
CAGCGCGCTGCCGGTATTTGTTATTTTATCGGTGGTTTTAAGCGTACTCTTCTATTTTAAATTCC, 태그에 밑줄이 그어진다.
제 1 프라이머 결합을 위한 표적 (SEQ ID NO: 16):
CGACGACCCTTCTTTTTCCTCAATACTGAGCGGCTGCTCGCCTTTGCTGGTTTTAGGTTTGGCGGCGCTA
CGTTTTGCTTCACGGAATTTAAAATAGAAGAGTACGCTTAAAACCACCGATAAAATAACAAATACCGGCA
GCG, 86.5℃ @ 4mM Mg
제 1 신장 이후를 위한 어닐링 온도:
ACCCTTCTTTTTCCTCAATACTGAGCGGCTG ( SEQ ID NO: 17), 73.3℃
CCGGTATTTGTTATTTTATCGGTGGTTTTAAGCGTACTCTTCTATTTTAAATTCC ( SEQ ID NO: 18), 73.3℃
제 2 프라이머 결합에 대한 표적( SEQ ID NO: 19):
ACCCTTCTTTTTCCTCAATACTGAGCGGCTGCTCGCCTTTGCTGGTTTTAGGTTTGGCGGCGCTACGTTT
TGCTTCACGGAATTTAAAATAGAAGAGTACGCTTAAAACCACCGATAAAATAACAAATACCGG, 85.2℃ @ 4mM Mg
완전한 프라이머 w/tag 결합에 대한 표적( SEQ ID NO: 20):
CGTCGCGACGACCCTTCTTTTTCCTCAATACTGAGCGGCTGCTCGCCTTTGCTGGTTTTAGGTT
TGGCGGCGCTACGTTTTGCTTCACGGAATTTAAAATAGAAGAGTACGCTTAAAACCACCGATAA
AATAACAAATACCGGCAGCGCGCTG, 87.8℃ @ 4mM Mg
실시예 2: G- 사중체를 형성하는 태그를 가진 프라이머를 사용하는 표적 서열의 증폭
다음은 DFA 증폭 기포 유지하고 기포를 넘어서는 신장을 차단하는 역할을 하는 잠재적인 G-사중체의 예이다.
마이코박테리움 아비움 subsp . 파라투베르쿨로시스 str . k10 완전 게놈, 서열 ID: gb|AE016958.1| ( SEQ ID NO: 21):
5'-TCGAATCCCTCTCCCCGCCCGGGCGGTACGACGCGCCGAGGAAGCGGTGCACCAGGGCGC
GCTCGGCGGCCGGGTCCTTGAGCGGCCAGCCCCATAACGCCAGGAAGACGCGGATCAGCC
ACTGCGCCGCCAGCGGGTCGTCGTGGCCGGGCCCGAGCATCTCGGCGGCCAGGGCCGTCA-3'
( SEQ ID NO: 22): 5'-TACCGCCCGGGCCCGGGCGGTACGACGCGCCGA-3'
( SEQ ID NO: 23): 5'-GGCCGGGCCCGGGCCCGGCCACGACGACCCGCT-3'
도 18은 기포를 넘어서는 신장을 차단하는 G-사중체 구조를 형성하기 위한 마이코박테리움 아비움 서열에 대한 상기 프라이머의 혼성화를 나타낸다.
실시예 3: 표적 및 대조군 서열의 온도 의존성 다중화
마이코박테리아 표적의 증폭을 위한 내부 통제의 개발을 위해 다중-온도 프로토콜을 따른다. 이 경우에, 대조군 앰플리콘은 변성에 대해 94℃ 및 어닐링/신장에 대해 84℃인 표적 앰플리콘에 대해 유사한 열 사이클링 특성을 가진다. 그러나, 프라이머(Mfo1275fmut2, Mfo1490rmut2)는 뉴클레오티드 미스매치를 도입하여 표적 DNA, 마이코박테리움 포르투이텀(Mycobacterium fortuitum) 서열(Mfo 주형)은 <80℃이다. 그러나, 미스매치를 지우는 신장의 초기 라운드 이후, 예측된 Tm은 86℃로 돌아간다. 주형에 대한 프라이머의 초기 낮은 친화력은, 도 25에 나타낸 바와 같이, 94℃-85℃에서 80회 사이클 동안 명백한 증폭이 없다 - 표적 마이코박테리아 종이 증폭될 열 사이클링 프로파일. 표적 사이클링이 완료된 후, 80회 사이클, 어닐링/신장 온도는 5 사이클 동안 75℃로 하향 변경되어, 대조군 프라이머에 의한 프라이밍을 가능하게 하고, 77℃로 복귀되어 내부 대조군 종을 증폭시킨다. 이런 경우에, 대조군 주형의 1 x 107 내지 12 x 109 복제물은 정지되고, 약 40 사이클의 Ct로 열 사이클링의 제 2 단계에 의해 활성화되고 증폭된다.
열 사이클링 조건은 95℃ - 84℃ x 80회 사이클, 캐치하기 위한 93℃ - 72℃ x 5회 사이클, 93℃- 77℃ x 40 사이클이다.
투입은 1 x 109, 1 x 107 복제물 M. fortuitum 합성 주형이다.
방법: 폴리머라제에 의한 초기 신장 이후 초기 Tm을 낮추고 높은 Tm으로 되돌아가는 돌연변이를 도입한다.
프라이머 서열:
Mfo1275fmut2( SEQ ID NO: 24):
CGTGCACACCCGGCCAAGGTCGTTGCGGCCCAGAG(밑줄 친 염기는 주형에 대해 불일치된다), 프리 캐치 Tm = 80℃ + 3' 미스매치의 효과(소프트웨어에 의해 예측되지 않음); 포스트 캐치 Tm = 85℃; 야생형 Tm = 86℃
Mfo1490rmut2( SEQ ID NO: 25): ACGGCGTTTTCGATTGTCGGATCCACCCCGGAGGCCCTGCTCACC(밑줄 친 염기는 주형에 대해 불일치된다), 프리 캐치 Tm = 80℃; 포스트 캐치 Tm = 86℃; 야생형 Tm = 86℃
Mfo 주형( SEQ ID NO: 26): CGTGCACACCCGGCCGAGGTCGTTGCGGCCGAGATCGACTCGGTCGCCCCGCGCCAGCGAGTGCCCGCGATCGACGGTGACCAGGGCCTCCGGGCTGGATCCGACAATCGAAAACGCCGT, Tm=97℃
결과: 대조군 주형은 80회 사이클 동안 증폭되지 않고 유지되며, 온도 변화 이후, 대조군 주형은 ~40회 사이클 후 증폭된다.
실시예 4: 5 ' 꼬리를 포함하는 프라이머에 의한 온도 의존성 다중화
이 실시예에서, 내부 대조군 프라이머는 주형에 대한 미스매치를 도입하지 않지만, 70℃의 낮은 예측된 Tm을 가진다. 이들 프라이머(SPWXMF_mut4 및 SPWXMR_mut4)의 각각은 표적 서열에 결합하지 않는 5' GC-풍부 꼬리를 갖지만, 증폭의 제 1 라운드에서 폴리머라제에 의해 신장될 때, Tm은 76℃가 된다. 실시예 3에서와 같이, 이들 프라이머는 89℃ - 76℃의 50회 사이클을 통해 주형을 증폭시키지 않는다. 50 사이클 후에, 어닐링/신장 온도를 10회 사이클 동안 72℃로 감소시킨 다음, 76℃로 복귀시키고, 그 후 증폭이 대조군 주형에 대해 보인다(도 26 참조). "캐치(catch)"란 용어는 증폭 생성물이 완전 신장을 성취하도록 시작하는 지점을 의미한다.
열 사이클링 조건은 89℃ - 76℃ x 50회 사이클, 89℃ - 72℃ x 10회 사이클, 89℃ - 76℃ x 60회 사이클이다.
투입은 10X 희석된 Saflager W-34/70 효모(Spw) 게놈 DNA이다.
방법: 미스매치 염기 없음, 캐치가 이루어진 후 Tm을 증가시키는 5' 꼬리에 의한 짧아진 프라이머.
프라이머 서열:
SPWXMF_mut4(SEQ ID NO: 27):
CCA GCC ACC CAC CAA TTC CTG TGC CAG AT(밑줄 친 염기는 5' 꼬리이다), 프리 캐치 Tm 70℃, 포스트 캐치 77℃
SPWXMR_mut4(SEQ ID NO: 28):
ACC GGA GGT CAC TTT TGA TGG CCA TGG GTC TAT(밑줄 친 염기는 5' 꼬리이다), 프리-캐치 70℃, 포스트 캐치 76℃
주형 (SEQ ID NO: 29):
CTC GTT AGA GGG GCT AAA GCT AAC CCA CCA ATT CCT GTG CCA GAG AAT ATA TAG GGC GGT GCA TGA ACA ATA GCC GGT AGG TAT GTC AGA AAA CCT CCA ATG CCA AAC ATT ACT CCT TGA CAC CGC CTA TAT TTA GAC CCA TGG CCA TCA AAA GTG ACC CGA GCA CCA TCG TTT GTT G, Tm = 87℃
결과: 대조군 주형은 50회 사이클 동안 증폭되지 않고 유지되며, 온도 변화 이후, 대조군 주형은 ~30회 사이클 후 증폭된다.
실시예 5: 표적 및 대조군 서열의 온도 의존성 다중화
다음은 세모편모충 표적 및 반응 대조군 주형 곤충병원세균을 가진 이중 실시예를 포함한다.
하나의 반응 용기에서 다수의 표적을 조합하여 각각의 표적이 열 프로파일의 개별 단계에서 증폭되는 방법이 기술된다. 이 실시예에서, 세모편모충은 원하는 진단 표적 유기체를 나타내고, 대조군 주형 곤충병원세균은 추출 대조군 또는 내부 공정 대조군으로서 작용한다. 설계된 대로, 세모편모충은 더 높은 온도 설계로 열 프로파일의 초기 단계에서 증폭되고 충분한 수의 열 사이클 후, 반응은 반응 대조군 표적을 증폭시키는 적절한 조건으로 전환된다.
곤충병원세균 ATCC 19061 ( SEQ ID NO: 30):
TTTATTTTTTAGTTATCAATATATCTGAGTTTTATTTTTTAGCTACAGTGTTTTTATTTGTTTTTTTAGCAGCCTTACTTAACAGTATTTTGTTAATATCAACATATATAAGATATATTATTATTTCTTTACTATGCTCAATAACTCTATCTTTACATTTAGATATATTACCATCATTTGATTTAATATTTTTCTTGCCTATATTTATTTTTGTTTTTATCTATAAATTTAATCTCGTCAAAAAAAGACTATAATTATATTGATTAATTTAAGTTTTCAGATGATATAATCAAATTTTATTCCAATAATACCAATCATCACTGAAATTGCTTAATTTATACTGAAGATTTGGTTATGTATTAAATAGTTAATTCTTATCATATACTCCCT
예시적 포워드 프라이머 서열( SEQ ID NO: 31): TTTTTAGTTATCAATATATCTGAGTTTTATTTTTTAGCTACAGTGTTTTTATTTGTTTTTTTAGCAGCCTTACTTAACAGTATTTTGTTAATATCAACATATATAAGAT, Tm = 74℃
예시적 포워드 프라이머 서열( SEQ ID NO: 51):
TTTTTAGTTATCAATATATCTGAGTTTTATTTTTTAGC, Tm = 62.2℃
예시적 포워드 프라이머 서열( SEQ ID NO: 52):
ATCTTATATATGTTGATATTAACAAAATACTGTTAAGT, Tm = 62.3℃
예시적 프로브 서열( SEQ ID NO: 53):
CAGTGTTTTTATTTGTTTTTTTAGCAGCCT, Tm = 65.2℃
세모편모충 372 (SEQ ID NO: 54):
CGGTAGGTGAACCTGCCGTTGGATCAGTTTCGTTAATAATTACAAACATATTTTTTTAATGTCTATAACTATTTATACAAAATTAAACACATAATCTAAAAAATTTAGACCTTAGGCAATGGATGTCTTGGCTTCTTACACGATGAAGAACGTTGCATAATGCGATAAGCGGCTGGATTAGCTTTCTTTGCGACAAGTTCGATCTTTGAATGCACATTGCGCGCCGTTTTAGCTTGCTAGAACACGCATATATGTTACAGTAACCCATATTAATTTAATACCAAATTCTCTTTTTAAGCAAAAGAGCGAAAAACAAATATGTATTAACAAAAGGGTTCTGTCTCATATAGGAAGACCCGCTGAACTGAAGCA
세모편모충 266 ( SEQ ID NO: 55):
AGACCTTAGGCAATGGATGTCTTGGCTTCTTACACGATGAAGAACGTTGCATAATGCGATAAGCGGCTGGATTAGCTTTCTTTGCGACAAGTTCGATCTTTGAATGCACATTGCGCGCCGTTTTAGCTTGCTAGAACACGCATATATGTTACAGTAACCCATATTAATTTAATACCAAATTCTCTTTTTAAGCAAAAGAGCGAAAAACAAATATGTATTAACAAAAGGGTTCTGTCTCATATAGGAAGACCCGCTGAACTGAAGCA, Tm = 85.3℃
예시적 포워드 서열(SEQ ID NO: 56) :
AGACCTTAGGCAATGGATGTCTTGGCTTCTTACACGATGAAGAACG, Tm = 77.3℃
예시적 리버스 서열( SEQ ID NO: 57):
TGCTTCAGTTCAGCGGGTCTTCCTATATGAGACAGAACCCTT, Tm = 77.3℃
예시적 프로브 서열( SEQ ID NO: 58):
AAGCGGCTGGATTAGCTTTCTTTGCGACAAGTTCGATCTTTGAATGCACATTGCGCGCCG, Tm = 83.1℃
세모편모충 표적 및 반응 대조군 주형 곤충병원세균의 증폭에 대한 가능한 열 프로파일은 도 27-31에 도시된다.
실시예 6: 소에서 세모편모충을 탐지하기 위한 세모편모충 프라이머에 의한 온도 의존성 다중화
다음 프라이머 및 프로브는 소에서 세모편모충을 탐지하기 위한 세모편모충 프라이머에 의한 온도 의존성 다중화에서 사용된다.
TFXMF(SEQ ID NO: 56): AGACCTTAGGCAATGGATGTCTTGGCTTCTTACACGATGAAGAACG
TFXMR ( SEQ ID NO: 57):
TGCTTCAGTTCAGCGGGTCTTCCTATATGAGACAGAACCCTT
TFXMP2 ( SEQ ID NO: 59): AAGCGGCTGGATTAGCTTTCTTTGCGACAAGTTCGATCTTTGAATGCACATTGCGCGCGCCG
증폭을 위한 샘플은 불 조직(Bull tissue)에서 유래한다. 열 사이클링은 세모편모충 표적을 증폭시키기 위해 약 89℃ 내지 약 74℃이다. 열 사이클링은 곤충병원세균을 증폭하기 위해 약 63℃ 내지 약 78℃이다.
당업자는 이런 과정 및 본 발명에 개시된 다른 과정 및 방법을 위해, 과정과 방법에서 실행된 기능이 다른 순서로 실행될 수 있다는 것을 알 것이다. 또한, 약술한 단계 및 작업은 예로서 제공되며, 단계 및 작업의 일부는 선택적이며, 더 적은 단계와 작업으로 혼합되거나 개시된 실시태양의 본질을 벗어나지 않고 추가 단계와 작업으로 확대될 수 있다.
본 발명은 다양한 양태의 예시로서 의도되는 본 출원에 기술된 특정 실시태양의 관점에서 제한되지 않는다. 당업자에게 명백할 것과 같이, 여러 변형과 변화가 본 발명의 취지와 범위를 벗어나지 않고 이루어질 수 있다. 본 발명에 열거된 것들 이외에, 본 발명의 범위 내의 기능적으로 균등한 방법과 장치는 상기 상세한 설명으로부터 당업자에게 명백해질 것이다. 이런 변형과 변화는 첨부된 청구항의 범위 내인 것으로 의도된다. 본 발명은, 청구항에 권리가 주어지는 균등물의 전체 범위와 함께, 첨부된 청구항에 의해서만 제한된다. 본 발명은 당연히 변할 수 있는 특정 방법, 시약, 화합물, 조성물 또는 생물학적 시스템에 제한되지 않는 것으로 이해되어야 한다. 본 발명에 사용된 용어는 단지 특정 실시태양을 기술하는 목적을 위한 것이며, 제한되는 것을 의도하지 않는다는 것이 이해되어야 한다. 출원인은 2014년 10월9일, 다중 프로브(Multiplex Probes)라는 제목으로 출원된 미국 특허출원 No. 14/510,939를 모든 목적을 위해 전문을 참조로 포함한다. 또한, 출원인은 2010년 11월 22일, 서열 변화를 탐지하기 위한 핵산의 고해상도 분석을 위한 시스템 및 방법이라는 제목으로 출원된 미국 특허출원 No. 12/951,710를 모든 목적을 위해 전문을 참조로 포함한다. 출원인은 또한 2008년 3월 28일, 서열 변화를 탐지하기 위한 핵산의 고해상도 분석을 위한 시스템 및 방법이라는 제목으로 출원되어, 2010년 11월 23일 미국 특허 No. 7,838,235로 등록된 미국 특허출원 No. 12/058,637을 모든 목적을 위해 전문을 참조로 포함한다.
본 발명에 인용된 모든 참조문헌, 논문, 공개공보, 특허, 특허공개공보 및 특허출원은 모든 목적을 위해 전문이 참조로 포함된다. 그러나, 본 발명에 인용된 모든 참조문헌, 논문, 공개공보, 특허, 특허공개공보 및 특허출원의 언급은 이들이 전세계의 임의의 나라에서 유효한 종래 기술을 구성하거나 또는 일반적인 상식의 일부를 형성하는 것이 아니며 이의 인정 또는 임의의 형태의 암시로 해석되지 않아야 한다.
SEQUENCE LISTING <110> Fluoresentric, Inc. Caplin, Brian Hicke, Brian Green, Bryson <120> DNA AMPLIFICATION TECHNOLOGY <130> FLUO-004_03WO <150> 62/023,123 <151> 2014-07-10 <150> 62/075,769 <151> 2014-11-05 <150> 62/115,559 <151> 2015-02-12 <160> 59 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 72 <212> DNA <213> artificial <220> <223> Folded hairpin-like probe example <400> 1 acctccaatg ccaaacatta ctccttgact caatgtttcc tgtgccagca tgcgcttatt 60 agacccatgg cc 72 <210> 2 <211> 67 <212> DNA <213> artificial <220> <223> Folded hairpin-like probe example <400> 2 agcactcagt tattctgctg gtgcacttgc cagttgcatg ggcctcatat acaacaggat 60 gggggct 67 <210> 3 <211> 83 <212> DNA <213> artificial <220> <223> Folded hairpin-like probe example <400> 3 atggacgtgg cttagcgtat atttatgctg atggaaaaat ggtaaacgaa gctttagttc 60 gtcaaggctt ggctaaagtt gct 83 <210> 4 <211> 83 <212> DNA <213> artificial <220> <223> Folded hairpin-like probe example <400> 4 atggacgtgg cttagcgtat atttatgctg atggaaaaat ggtaaacgaa gctttagttc 60 gtcaaggctt ggctaaagtt gct 83 <210> 5 <211> 67 <212> DNA <213> artificial <220> <223> Folded hairpin-like probe example <400> 5 agcactcagt tattctgctg gtgcacttgc cagttgcatg ggcctcatat acaacaggat 60 gggggct 67 <210> 6 <211> 38 <212> DNA <213> artificial <220> <223> Folded hairpin-like probe example <400> 6 tggcaatccc aggttttctt ttctacctgt ttgctcaa 38 <210> 7 <211> 36 <212> DNA <213> artificial <220> <223> Folded hairpin-like probe example <400> 7 cagacccatc ccccaggtga gggactatgg cctcct 36 <210> 8 <211> 30 <212> DNA <213> artificial <220> <223> Folded hairpin-like probe example <400> 8 tcaatggctg aggtgaggta ccccgcaggg 30 <210> 9 <211> 42 <212> DNA <213> artificial <220> <223> Folded hairpin-like probe example <400> 9 tttgctctga gagttccccc tgtcccctcc accttccctc ag 42 <210> 10 <211> 45 <212> DNA <213> artificial <220> <223> Folded hairpin-like probe example <400> 10 tgcaagagtc accaaaattg ccgagaggcc ccagttagca tccca 45 <210> 11 <211> 47 <212> DNA <213> artificial <220> <223> Made in lab <400> 11 gatcgatgct agctatggcc cctcagagcc ggctctgagg ggccata 47 <210> 12 <211> 36 <212> DNA <213> artificial <220> <223> Salmonella forward primer without tag <400> 12 cgacgaccct tctttttcct caatactgag cggctg 36 <210> 13 <211> 60 <212> DNA <213> artificial <220> <223> Salmonella reverse primer without tag <400> 13 cgctgccggt atttgttatt ttatcggtgg ttttaagcgt actcttctat tttaaattcc 60 <210> 14 <211> 41 <212> DNA <213> artificial <220> <223> Salmonella forward primer with tag <400> 14 cgtcgcgacg acccttcttt ttcctcaata ctgagcggct g 41 <210> 15 <211> 65 <212> DNA <213> artificial <220> <223> Salmonella reverse primer with tag <400> 15 cagcgcgctg ccggtatttg ttattttatc ggtggtttta agcgtactct tctattttaa 60 attcc 65 <210> 16 <211> 143 <212> DNA <213> artificial <220> <223> target sequence for first primer binding <400> 16 cgacgaccct tctttttcct caatactgag cggctgctcg cctttgctgg ttttaggttt 60 ggcggcgcta cgttttgctt cacggaattt aaaatagaag agtacgctta aaaccaccga 120 taaaataaca aataccggca gcg 143 <210> 17 <211> 31 <212> DNA <213> artificial <220> <223> shorter Salmonella forward primer without tag <400> 17 acccttcttt ttcctcaata ctgagcggct g 31 <210> 18 <211> 55 <212> DNA <213> artificial <220> <223> shorter Salmonella reverse primer without tag <400> 18 ccggtatttg ttattttatc ggtggtttta agcgtactct tctattttaa attcc 55 <210> 19 <211> 133 <212> DNA <213> artificial <220> <223> target for second primer binding <400> 19 acccttcttt ttcctcaata ctgagcggct gctcgccttt gctggtttta ggtttggcgg 60 cgctacgttt tgcttcacgg aatttaaaat agaagagtac gcttaaaacc accgataaaa 120 taacaaatac cgg 133 <210> 20 <211> 153 <212> DNA <213> artificial <220> <223> target for complete primer with tag binding <400> 20 cgtcgcgacg acccttcttt ttcctcaata ctgagcggct gctcgccttt gctggtttta 60 ggtttggcgg cgctacgttt tgcttcacgg aatttaaaat agaagagtac gcttaaaacc 120 accgataaaa taacaaatac cggcagcgcg ctg 153 <210> 21 <211> 180 <212> DNA <213> Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis str. k10 <400> 21 tcgaatccct ctccccgccc gggcggtacg acgcgccgag gaagcggtgc accagggcgc 60 gctcggcggc cgggtccttg agcggccagc cccataacgc caggaagacg cggatcagcc 120 actgcgccgc cagcgggtcg tcgtggccgg gcccgagcat ctcggcggcc agggccgtca 180 <210> 22 <211> 33 <212> DNA <213> artificial <220> <223> forward primer to amplify M. avium target <400> 22 taccgcccgg gcccgggcgg tacgacgcgc cga 33 <210> 23 <211> 33 <212> DNA <213> artificial <220> <223> reverse primer to amplify M. avium target <400> 23 ggccgggccc gggcccggcc acgacgaccc gct 33 <210> 24 <211> 35 <212> DNA <213> artificial <220> <223> Mfo1275fmut2 primer <400> 24 cgtgcacacc cggccaaggt cgttgcggcc cagag 35 <210> 25 <211> 45 <212> DNA <213> artificial <220> <223> Mfo1490rmut2 primer <400> 25 acggcgtttt cgattgtcgg atccaccccg gaggccctgc tcacc 45 <210> 26 <211> 120 <212> DNA <213> artificial <220> <223> M. fortuitum synthetic template <400> 26 cgtgcacacc cggccgaggt cgttgcggcc gagatcgact cggtcgcccc gcgccagcga 60 gtgcccgcga tcgacggtga ccagggcctc cgggctggat ccgacaatcg aaaacgccgt 120 <210> 27 <211> 29 <212> DNA <213> artificial <220> <223> SPWXMF_mut4 primer <400> 27 ccagccaccc accaattcct gtgccagat 29 <210> 28 <211> 33 <212> DNA <213> artificial <220> <223> SPWXMR_mut4 primer <400> 28 accggaggtc acttttgatg gccatgggtc tat 33 <210> 29 <211> 178 <212> DNA <213> artificial <220> <223> template for SPWXM primers <400> 29 ctcgttagag gggctaaagc taacccacca attcctgtgc cagagaatat atagggcggt 60 gcatgaacaa tagccggtag gtatgtcaga aaacctccaa tgccaaacat tactccttga 120 caccgcctat atttagaccc atggccatca aaagtgaccc gagcaccatc gtttgttg 178 <210> 30 <211> 390 <212> DNA <213> Xenorhabdus nematophila <400> 30 tttatttttt agttatcaat atatctgagt tttatttttt agctacagtg tttttatttg 60 tttttttagc agccttactt aacagtattt tgttaatatc aacatatata agatatatta 120 ttatttcttt actatgctca ataactctat ctttacattt agatatatta ccatcatttg 180 atttaatatt tttcttgcct atatttattt ttgtttttat ctataaattt aatctcgtca 240 aaaaaagact ataattatat tgattaattt aagttttcag atgatataat caaattttat 300 tccaataata ccaatcatca ctgaaattgc ttaatttata ctgaagattt ggttatgtat 360 taaatagtta attcttatca tatactccct 390 <210> 31 <211> 109 <212> DNA <213> artificial <220> <223> exemplary forward primer for X. nematophila target <400> 31 tttttagtta tcaatatatc tgagttttat tttttagcta cagtgttttt atttgttttt 60 ttagcagcct tacttaacag tattttgtta atatcaacat atataagat 109 <210> 32 <211> 31 <212> DNA <213> artificial <220> <223> Triplex forming region sequence <220> <221> misc_feature <222> (18)..(18) <220> <221> misc_feature <222> (18)..(18) <223> n is a, c, g, or t <400> 32 gtgtgggaag aggggganga gggggaggag c 31 <210> 33 <211> 30 <212> DNA <213> artificial <220> <223> Triplex forming region sequence <220> <221> misc_feature <222> (14)..(14) <220> <221> misc_feature <222> (14)..(14) <223> n is a, c, g, or t <400> 33 gctgcctccc ctcntccctc ttccccacac 30 <210> 34 <211> 31 <212> DNA <213> artificial <220> <223> Triplex forming region sequence <220> <221> misc_feature <222> (18)..(18) <220> <221> misc_feature <222> (18)..(18) <223> n is a, c, g, or t <400> 34 gtgtgggaag aggggganga gggggaggag c 31 <210> 35 <211> 30 <212> DNA <213> artificial <220> <223> Triplex forming region sequence <220> <221> misc_feature <222> (14)..(14) <220> <221> misc_feature <222> (14)..(14) <223> n is a, c, g, or t <400> 35 gctgcctccc ctcntccctc ttccccacac 30 <210> 36 <211> 22 <212> DNA <213> artificial <220> <223> Triplex forming sequence <400> 36 ggagggggag aagggagaag gg 22 <210> 37 <211> 22 <212> DNA <213> artificial <220> <223> Triplex forming sequence <400> 37 cccttctccc ttctccccct cc 22 <210> 38 <211> 22 <212> DNA <213> artificial <220> <223> Triplex forming sequence <400> 38 ggtgggggtg ttgggtgttg gg 22 <210> 39 <211> 22 <212> DNA <213> artificial <220> <223> Triplex forming sequence <400> 39 ggtgggggtg ttgggtgttg gg 22 <210> 40 <211> 31 <212> DNA <213> artificial <220> <223> Triplex forming sequence <220> <221> misc_feature <222> (18)..(18) <220> <221> misc_feature <222> (18)..(18) <223> n is a, c, g, or t <400> 40 gtgtgggaag aggggganga gggggaggag c 31 <210> 41 <211> 30 <212> DNA <213> artificial <220> <223> Triplex forming sequence <220> <221> misc_feature <222> (14)..(14) <220> <221> misc_feature <222> (14)..(14) <223> n is a, c, g, or t <400> 41 gctgcctccc ctcntccctc ttccccacac 30 <210> 42 <211> 13 <212> DNA <213> unknown <220> <223> Naturally occurring TFR sequence in double stranded DNA <400> 42 ttttttcccg tcc 13 <210> 43 <211> 12 <212> DNA <213> unknown <220> <223> Naturally occurring TFR sequence in double stranded DNA <400> 43 ggacgggaaa aa 12 <210> 44 <211> 17 <212> DNA <213> Spirometra erinaceieuropaei <400> 44 ggcgaggggg gagcggg 17 <210> 45 <211> 17 <212> DNA <213> Toxocara canis <400> 45 cccgctcccc cctcgcc 17 <210> 46 <211> 13 <212> DNA <213> unknown <220> <223> Naturally occurring TFR sequence in double stranded DNA <400> 46 ggaggtgggg gag 13 <210> 47 <211> 13 <212> DNA <213> unknown <220> <223> Naturally occurring TFR sequence in double stranded DNA <400> 47 ctcccccacc tcc 13 <210> 48 <211> 13 <212> DNA <213> unknown <220> <223> Naturally occurring TFR sequence in double stranded DNA <400> 48 ggaggtgggg gag 13 <210> 49 <211> 14 <212> DNA <213> unknown <220> <223> Naturally occurring TFR sequence in double stranded DNA <400> 49 ctccccccac ctcc 14 <210> 50 <211> 30 <212> DNA <213> Streptococcus dysgalactiae <400> 50 ggagaaggtg aggaagaaga agaggaagaa 30 <210> 51 <211> 38 <212> DNA <213> artificial <220> <223> exemplary forward primer for X. nematophila target <400> 51 tttttagtta tcaatatatc tgagttttat tttttagc 38 <210> 52 <211> 38 <212> DNA <213> artificial <220> <223> exemplary reverse primer for X. nematophila target <400> 52 atcttatata tgttgatatt aacaaaatac tgttaagt 38 <210> 53 <211> 30 <212> DNA <213> artificial <220> <223> exemplary probe for X. nematophila target <400> 53 cagtgttttt atttgttttt ttagcagcct 30 <210> 54 <211> 372 <212> DNA <213> Trichomonas foetus <400> 54 cggtaggtga acctgccgtt ggatcagttt cgttaataat tacaaacata tttttttaat 60 gtctataact atttatacaa aattaaacac ataatctaaa aaatttagac cttaggcaat 120 ggatgtcttg gcttcttaca cgatgaagaa cgttgcataa tgcgataagc ggctggatta 180 gctttctttg cgacaagttc gatctttgaa tgcacattgc gcgccgtttt agcttgctag 240 aacacgcata tatgttacag taacccatat taatttaata ccaaattctc tttttaagca 300 aaagagcgaa aaacaaatat gtattaacaa aagggttctg tctcatatag gaagacccgc 360 tgaactgaag ca 372 <210> 55 <211> 266 <212> DNA <213> Trichomonas foetus <400> 55 agaccttagg caatggatgt cttggcttct tacacgatga agaacgttgc ataatgcgat 60 aagcggctgg attagctttc tttgcgacaa gttcgatctt tgaatgcaca ttgcgcgccg 120 ttttagcttg ctagaacacg catatatgtt acagtaaccc atattaattt aataccaaat 180 tctcttttta agcaaaagag cgaaaaacaa atatgtatta acaaaagggt tctgtctcat 240 ataggaagac ccgctgaact gaagca 266 <210> 56 <211> 46 <212> DNA <213> artificial <220> <223> exemplary forward primer for Trichomonas <400> 56 agaccttagg caatggatgt cttggcttct tacacgatga agaacg 46 <210> 57 <211> 42 <212> DNA <213> artificial <220> <223> exemplary reverse primer for Trichomonas <400> 57 tgcttcagtt cagcgggtct tcctatatga gacagaaccc tt 42 <210> 58 <211> 60 <212> DNA <213> artificial <220> <223> exemplary probe for Trichomonas <400> 58 aagcggctgg attagctttc tttgcgacaa gttcgatctt tgaatgcaca ttgcgcgccg 60 <210> 59 <211> 62 <212> DNA <213> artificial <220> <223> exemplary probe for Trichomonas <400> 59 aagcggctgg attagctttc tttgcgacaa gttcgatctt tgaatgcaca ttgcgcgcgc 60 cg 62

Claims (79)

  1. 제 1 영역, 여기서 제 1 영역은 표적 핵산 서열의 가닥에 상보적이고 프라이머의 3 '말단에 위치된다; 및
    제 2 영역, 여기서 제 2 영역은 프라이머의 5 '말단에 위치된다;
    을 포함하는 중합효소 연쇄 반응(PCR)에서 표적 핵산 서열의 증폭을 위한 올리고뉴클레오티드 프라이머로서
    여기서 올리고뉴클레오티드 프라이머의 용융온도(Tm)는 제 1 영역만을 갖는 올리고뉴클레오티드 프라이머의 Tm과 비교하여 증가되는 올리고뉴클레오티드 프라이머.
  2. 제 1 항에 있어서,
    프라이머는 제 1 및 제 2 영역 사이의 전이를 포함하는 올리고뉴클레오티드 프라이머.
  3. 제 2 항에 있어서,
    전이는 단일 뉴클레오티드, 탄소 사슬, 다기능 모이어티, 변형 뉴클레오티드, 변형 백본 또는 이의 조합을 포함하는 올리고뉴클레오티드 프라이머.
  4. 제 1 항에 있어서,
    올리고뉴클레오티드 프라이머의 용융 온도(Tm)는 표적 핵산 서열의 Tm의 적어도 15℃ 내인 올리고뉴클레오티드 프라이머.
  5. 제 1 항에 있어서,
    올리고뉴클레오티드 프라이머의 용융 온도(Tm)는 표적 핵산 서열의 Tm의 적어도 10℃ 내인 올리고뉴클레오티드 프라이머.
  6. 제 1 항에 있어서,
    올리고뉴클레오티드 프라이머의 용융 온도(Tm)는 표적 핵산 서열의 Tm의 적어도 5℃ 내인 올리고뉴클레오티드 프라이머.
  7. 제 1 항에 있어서,
    올리고뉴클레오티드 프라이머의 용융 온도(Tm)는 표적 핵산 서열의 Tm의 적어도 2.5℃ 내인 올리고뉴클레오티드 프라이머.
  8. 제 1 항에 있어서,
    올리고뉴클레오티드 프라이머의 용융 온도(Tm)는 표적 핵산 서열의 Tm과 동일한 올리고뉴클레오티드 프라이머.
  9. 제 1 항에 있어서,
    제 2 영역은 올리고뉴클레오티드 프라이머의 표적 핵산 영역에 대한 어닐링을 최적화하기 위한 뉴클레오티드 또는 주쇄 변형을 포함하는 올리고뉴클레오티드 프라이머.
  10. 제 1 항에 있어서,
    제 2 영역은 표적 핵산 서열의 어느 한 가닥에 상보적이지 않은 임의의 서열인 올리고뉴클레오티드 프라이머.
  11. 제 1 항에 있어서,
    제 2 영역은 제 1 영역이 상보적인 표적 핵산 서열의 가닥에 반대인 표적 핵산 서열의 가닥에 상보적인 올리고뉴클레오티드 프라이머.
  12. 제 11 항에 있어서,
    제 2 영역은 폴리머라제에 의한 절단을 억제하기 위한 절단가능한 화학제를 포함하는 올리고뉴클레오티드 프라이머.
  13. 제 1 항에 있어서,
    프라이머는 구아노신 뉴클레오티드의 제 1 서열에 인접한 시토신 뉴클레오티드의 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드 프라이머.
  14. 제 13 항에 있어서,
    시토신과 구아노신 뉴클레오티드 사이의 뉴클레오티드의 수는 5 미만인 올리고뉴클레오티드 프라이머.
  15. 제 13 항에 있어서,
    시토신과 구아노신 뉴클레오티드 사이의 뉴클레오티드의 수는 4 미만인 올리고뉴클레오티드 프라이머.
  16. 제 13 항에 있어서,
    시토신과 구아노신 뉴클레오티드 사이의 뉴클레오티드의 수는 3 미만인 올리고뉴클레오티드 프라이머.
  17. 제 13 항에 있어서,
    시토신과 구아노신 뉴클레오티드 사이의 뉴클레오티드의 수는 2 미만인 올리고뉴클레오티드 프라이머.
  18. 제 13 항에 있어서,
    시토신과 구아노신 뉴클레오티드 사이의 뉴클레오티드의 수는 0인 올리고뉴클레오티드 프라이머.
  19. 제 13 항에 있어서,
    프라이머는 구아노신 사중체 구조를 형성하는 올리고뉴클레오티드 프라이머.
  20. 제 13 항에 있어서,
    프라이머는 구아노신 뉴클레오티드의 제 1 서열에 인접한 구아노신 뉴클레오티드의 제 2 서열을 추가로 포함하는 올리고뉴클레오티드 프라이머.
  21. 제 20 항에 있어서,
    구아노신 뉴클레오티드의 제 2 서열은 프라이머를 이동시키고 구아노신 사중체 구조를 형성하는 올리고뉴클레오티드 프라이머.
  22. DNA의 하나 이상의 단편으로부터의 표적 핵산 서열을 동정하는 단계;
    제 1 영역 및 제 2 영역을 가진 올리고뉴클레오티드 프라이머를 설계하는 단계를 포함하는 중합효소 연쇄 반응(PCR)에서 표적 핵산 서열의 증폭을 위한 올리고뉴클레오티드 프라이머의 용융 온도(Tm)를 증가시키는 방법으로서, 제 1 영역은 표적 핵산 서열의 가닥에 상보적이고 프라이머의 3' 말단에 위치하고 제 2 영역은 프라이머의 5' 말단에 위치하며;
    올리고뉴클레오티드 프라이머의 Tm은 제 1 영역만을 가진 올리고뉴클레오티드 프라이머의 Tm과 비교하여 증가되는 방법.
  23. 제 22 항에 있어서,
    제 1 영역 및 제 2 영역을 가진 올리고뉴클레오티드 프라이머의 용융 온도(Tm)는 표적 핵산 서열의 Tm의 적어도 15℃ 내인 방법.
  24. 제 22 항에 있어서,
    제 1 영역 및 제 2 영역을 가진 올리고뉴클레오티드 프라이머의 용융 온도(Tm)는 표적 핵산 서열의 Tm의 적어도 10℃ 내인 방법.
  25. 제 22 항에 있어서,
    제 1 영역 및 제 2 영역을 가진 올리고뉴클레오티드 프라이머의 용융 온도(Tm)는 표적 핵산 서열의 Tm의 적어도 5℃ 내인 방법.
  26. 제 22 항에 있어서,
    제 1 영역 및 제 2 영역을 가진 올리고뉴클레오티드 프라이머의 용융 온도(Tm)는 표적 핵산 서열의 Tm의 적어도 2.5℃ 내인 방법.
  27. 제 22 항에 있어서,
    제 1 영역 및 제 2 영역을 가진 올리고뉴클레오티드 프라이머의 용융 온도(Tm)는 표적 핵산 서열의 Tm과 동일한 방법.
  28. 제 22 항에 있어서,
    제 2 영역은 표적 핵산 서열의 어느 한 가닥에 상보적이지 않은 임의의 서열인 방법.
  29. 제 22 항에 있어서,
    제 2 영역은 제 1 영역이 상보적인 표적 핵산 서열의 가닥에 반대인 표적 핵산 서열의 가닥에 상보적인 방법.
  30. 표적 및 비 표적 핵산 서열을 포함하는 DNA의 하나 이상의 단편으로부터 표적 핵산 서열을 동정하는 단계;
    제 1 항, 제 10 항, 제 11 항 및 제 13 항 중 어느 한 항의 제 1 올리고뉴클레오티드 프라이머 및 제 2 올리고뉴클레오티드 프라이머를 얻는 단계; 및
    표적 핵산 서열 및 제 1 및 제 2 올리고뉴클레오티드 프라이머를 열 사이클링함으로써 표적 핵산 서열을 증폭시키는 단계를 포함하는 핵산 서열 증폭 방법으로서,
    여기서 열 사이클링은
    (ⅰ) 표적 핵산을 변성하는 단계;
    (ii) 제 1 올리고뉴클레오티드 프라이머를 변성된 표적 핵산의 제 1 가닥에 혼성화하고 제 2 올리고뉴클레오티드 프라이머를 변성된 표적 핵산의 제 2 가닥에 혼성화하는 단계;
    (ⅲ) 폴리머라제로 중합함으로써 제 1 및 제 2 올리고뉴클레오티드 프라이머를 신장시켜 표적 핵산의 2개의 새로운 가닥을 생성하는 단계;
    (iv) 표적 핵산의 제 1 및 제 2 가닥으로부터 두 개의 새로운 가닥을 변성하는 단계;
    (v) 제 1 올리고뉴클레오티드 프라이머를 표적 핵산의 제 1 가닥 및 하나의 새로운 가닥에 혼성화하고 제 2 올리고뉴클레오티드 프라이머를 표적 핵산의 제 2 가닥 및 다른 새로운 가닥에 혼성화하는 단계;
    (vi) 폴리머라제로 중합함으로써 제 1 및 제 2 올리고뉴클레오티드 프라이머를 신장시켜 표적 핵산의 4개의 추가 새로운 가닥을 생성하는 단계;
    (vii) 단계 (i) 내지 (vi)을 반복하여 제 1 및 제 2 올리고뉴클레오티드 프라이머의 제 2 영역을 혼입한 표적 핵산의 다중 가닥을 생성하는 단계를 포함하며,
    열 사이클링에서의 상부 열 사이클 온도는 비 표적 변성을 최소화하고 표적 변성을 최대화하도록 선택되는 방법.
  31. 제 30 항에 있어서,
    열 사이클링은 변성된 표적 핵산 서열 및 인접한 어닐링된 비 표적 핵산 서열로 이루어진 기포를 생성하는 방법.
  32. 제 31 항에 있어서,
    올리고뉴클레오티드 프라이머는 기포를 넘어서는 표적 핵산 서열의 증폭을 방지하는 방법.
  33. DNA의 하나 이상의 단편으로부터 2개 이상의 표적 핵산 서열을 동정하는 단계;
    각각의 표적 핵산 서열에 특이적인 한 쌍의 올리고뉴클레오티드 프라이머를 얻는 단계로서, 각 쌍의 올리고뉴클레오티드 프라이머는 이의 표적 핵산 서열의 변성 곡선(TD)과 중첩하는 어닐링 곡선(TA)을 가져서, 이런 방식으로 올리고뉴클레오티드 프라이머의 쌍의 더 높은 용융 온도와 이의 표적 핵산 서열의 용융 온도 사이의 온도 범위를 최소화한다;
    각 쌍의 올리고뉴클레오티드 프라이머 및 이의 표적 핵산 서열을 특정 온도 범위 내에서 열 사이클링함으로써 각각의 표적 핵산 서열을 증폭시키는 단계로서, 상이한 온도 범위에서 연속적인 열 사이클링이 2개 이상의 표적 핵산 서열의 증폭을 유도한다; 및
    2개 이상의 증폭된 표적 핵산 서열을 탐지하는 단계를 포함하는 샘플에서 2개 이상의 표적 핵산 서열을 증폭하고 탐지하는 방법.
  34. 제 33 항에 있어서,
    각각의 증폭된 표적 핵산 서열은 약 400 bp 이상인 방법.
  35. 제 33 항에 있어서,
    하나 이상의 온도 적합한 폴리머라제가 각각의 온도 범위에 대해 선택되는 방법.
  36. 제 33 항에 있어서,
    하나 이상의 표적 핵산 서열은 내부 대조군인 방법.
  37. 제 36 항에 있어서,
    내부 대조군에 특이적인 한 쌍의 올리고뉴클레오티드 프라이머는 표적 핵산 서열과 상이한 온도 범위에서 내부 대조군의 증폭을 허용하는 미스매치를 제외하고 표적 핵산 서열에 특이적인 한 쌍의 올리고뉴클레오티드 프라이머와 동일한 방법.
  38. 제 33 항에 있어서,
    각 쌍의 올리고뉴클레오티드 프라이머는 자체 열 사이클링 온도 범위에서만 사용되는 방법.
  39. 제 33 항에 있어서,
    각 온도 범위에서 열 사이클링은 각 표적 핵산 서열의 증폭에 필요한 여러 사이클을 포함하는 방법.
  40. 제 33 항에 있어서,
    열 사이클링은 최저 온도 범위에서 시작하여 최고 온도 범위로 이동하는 온도 범위에서 연속적으로 사이클링하는 단계를 포함하는 방법.
  41. 제 33 항에 있어서,
    열 사이클링은 가장 높은 온도 범위에서 시작하여 최저 온도 범위로 이동하는 온도 범위에서 연속적으로 사이클링하는 단계를 포함하는 방법.
  42. 제 33 항에 있어서,
    하나 이상의 온도 범위들 사이에 중첩이 존재하는 방법.
  43. 제 42 항에 있어서,
    열 사이클링은 약 50℃ 내지 약 65℃, 약 60℃ 내지 약 95℃ 및 약 90℃ 내지 약 105℃의 온도 범위를 포함하는 방법.
  44. 제 42 항에 있어서,
    열 사이클링은 약 45℃ 내지 약 72℃ 및 약 72℃ 내지 약 99℃의 온도 범위를 포함하는 방법.
  45. 제 42 항에 있어서,
    열 사이클링은 약 54℃ 내지 약 63℃, 약 63℃ 내지 약 81℃ 및 약 81℃ 내지 약 99℃의 온도 범위를 포함하는 방법.
  46. 제 33 항에 있어서,
    탐지하는 단계는 형광 염료, 전기 화학적 지시자, 표적 고정화 전략 또는 이의 임의의 조합을 사용하는 것을 포함하는 방법.
  47. 제 33 항에 있어서,
    증폭 단계는 각 쌍의 올리고뉴클레오티드 프라이머, 이의 표적 핵산 서열 및 표적 핵산 서열에 상보적이고 절단가능한 서열을 가진 올리고뉴클레오티드 프로브를 열 사이클링하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  48. 제 47 항에 있어서,
    각각의 올리고뉴클레오티드 프로브는 각 프로브의 5' 또는 3' 말단에 상호교환 가능하게 위치된 형광 염료 및 소광제를 포함하는 방법.
  49. 제 48 항에 있어서,
    각 올리고뉴클레오티드 프로브는 각 프로브의 5' 또는 3' 말단에 상호교환 가능하게 위치된 동일한 형광 염료를 포함하는 방법.
  50. 제 47 항에 있어서,
    각 올리고뉴클레오티드 프로브의 절단 가능한 서열은 중합 독립적 절단에 의해 또는 폴리머라제에 의한 중합 의존성 절단에 의해 절단되는 방법.
  51. 제 47 항에 있어서,
    하나 이상의 올리고뉴클레오티드 프로브는 하이브리드 헤어핀/절단 프로브인 방법.
  52. 제 47 항 내지 제 51 항 중 어느 한 항에 있어서,
    탐지 단계는 상기 프로브의 절단으로부터 생성된 신호를 탐지하는 단계를 포함하는 방법.
  53. 제 33 항에 있어서,
    각 쌍의 올리고뉴클레오티드 프라이머의 하나 또는 모두는 삼중체 형성 영역(TFR)을 포함하는 방법.
  54. 제 53 항에 있어서,
    TFR 프라이머는 표적 핵산 서열이 TFR 프라이머의 서열과 상보성을 갖는 서열을 포함할 때 삼중체 형성 DNA의 가닥을 생성하는 방법.
  55. 제 53 항에 있어서,
    표적 핵산 서열은 천연 삼중체 형성 영역을 포함하는 방법.
  56. 제 53 항에 있어서,
    하나 이상의 TFR에 혼성화하여, 하나 이상의 TFR 프라이머에 의한 표적 핵산 서열의 증폭 과정 동안 생성된 이중 가닥 DNA 서열에서 삼중체를 형성하는 하나 이상의 삼중체 형성 올리고뉴클레오티드(TFO) 프로브를 추가로 포함하는 방법.
  57. 제 56 항에 있어서,
    각각의 TFO 프로브는 형광 모이어티, 방사성 모이어티, 컬러 모이어티, 형광 리포터 모이어티, 형광 소광 모이어티, 한 쌍의 형광 공명 에너지 전달 모이어티의 하나 및 이의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 표지 모이어티를 포함하는 방법.
  58. 제 57 항에 있어서,
    표지 모이어티는 각각의 TFO 프로브에 대해 동일한 방법.
  59. 제 56 항에 있어서,
    3' 말단으로부터의 신장을 억제하는 TFO 프로브의 3 '말단에 캡을 더 포함하는 방법.
  60. 제 53 항에 있어서,
    올리고뉴클레오티드 프라이머의 각 쌍의 하나 또는 모두는 표지를 더 포함하는 방법.
  61. 제 56 항에 있어서,
    하나 이상의 TFO 프로브는 삼중체 형성 형광 프로브(TFFP)인 방법.
  62. 제 56 항에 있어서,
    하나 이상의 TFO 프로브는 삼중체 형성 형광 프로브(TFFP)이고 이중 가닥 DNA는 리셉터 염료를 갖는 방법.
  63. 제 56 항에 있어서,
    이중 가닥 DNA는 제 1 표지를 갖고 TFO 프로브는 제 2 표지를 가지며, 제 1 표지 및 제 2 표지는 가까운 결합시 탐지 가능한 방출을 제공하는 방법.
  64. 제 56 항에 있어서,
    TFO 프로브는 TFR 프라이머의 Tm과 거의 동일하거나 더 낮은 온도에서 어닐링하도록 설계되는 방법.
  65. 제 56 항에 있어서,
    혼성화된 삼중체 DNA와 결합하는 하나 이상의 비특이적 DNA 결합 염료를 더 포함하는 방법.
  66. 제 56 항에 있어서,
    하나 이상의 사중체 결합 염료를 더 포함하는 방법.
  67. 제 56 항에 있어서,
    TFO 프로브는 형광 염료 및 소광제를 포함하는 방법.
  68. 제 56 항에 있어서,
    TFO 프로브는 헤어핀 형태의 형광 염료 및 소광제를 포함하는 방법.
  69. 제 1 항, 제 10 항, 제 11 항 및 제 13 항 중 어느 한 항의 올리고뉴클레오티드 프라이머를 포함하는 키트.
  70. 제 47 항에 있어서,
    2개 이상의 표적 핵산 서열은 세모편모충(Trichomonas) 서열 및 곤충병원세균(Xenorhabdus nematophila) 서열을 포함하는 방법.
  71. 제 70 항에 있어서,
    곤충병원세균 서열은 대조 서열인 방법.
  72. 제 70 항에 있어서,
    세포편모충 서열에 특이적인 올리고뉴클레오티드 프라이머의 쌍은 SEQ ID NO: 56 및 SEQ ID NO: 57을 포함하는 방법.
  73. 제 70 항에 있어서,
    세포편모충 서열에 상보적인 올리고뉴클레오티드 프로브는 SEQ ID NO: 59를 포함하는 방법.
  74. 제 70 항에 있어서,
    곤충병원세균 서열에 특이적인 올리고뉴클레오티드 프라이머의 쌍은 SEQ ID NO: 51 및 SEQ ID NO: 52를 포함하는 방법.
  75. 제 70 항에 있어서,
    곤충병원세균 서열에 상보적인 올리고뉴클레오티드 프로브는 SEQ ID NO: 53을 포함하는 방법.
  76. 제 70 항에 있어서,
    열 사이클링은 약 89℃ 내지 약 74℃ 및 약 63℃ 내지 약 78℃의 온도 범위를 포함하는 방법.
  77. 제 76 항에 있어서,
    약 89℃ 내지 약 74℃의 열 사이클링은 세모편모충 서열을 증폭시키는 방법.
  78. 제 76 항에 있어서,
    약 63℃ 내지 약 78℃의 열 사이클링은 곤충병원세균 서열을 증폭시키는 방법.
  79. 세모편모충 표적 핵산 서열에 특이적인 한 쌍의 올리고뉴클레오티드 프라이머를 얻는 단계;
    곤충병원세균 대조 핵산 서열에 특이적인 한 쌍의 올리고뉴클레오티드 프라이머를 얻는 단계로서, 각 쌍의 올리고뉴클레오티드 프라이머는 이의 표적 핵산 서열의 변성 곡선(TD)과 중첩하는 어닐링 곡선(TA)을 가져서, 이런 방식으로 올리고뉴클레오티드 프라이머의 쌍의 더 높은 용융 온도와 이의 표적 핵산 서열의 용융 온도 사이의 온도 범위를 최소화한다;
    각 쌍의 올리고뉴클레오티드 프라이머 및 이의 표적 핵산 서열을 특정 온도 범위 내에서 열 사이클링함으로써 각각의 표적 핵산 서열을 증폭시키는 단계로서, 상이한 온도 범위에서 연속적인 열 사이클링이 세모편모충 및 곤충병원세균 서열의 증폭을 유도한다; 및
    증폭된 표적 핵산 서열을 탐지하는 단계를 포함하는 소에서 세모편모충을 탐지하는 방법.
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