CN107217100B

CN107217100B - 基于dna酶嵌合引物的核酸筛查生物传感器

Info

Publication number: CN107217100B
Application number: CN201710515929.1A
Authority: CN
Inventors: 罗云波; 许文涛; 黄昆仑; 王晨光; 程楠; 徐瑗聪; 朱龙佼; 朱鹏宇
Original assignee: China Agricultural University
Current assignee: China Agricultural University
Priority date: 2017-06-29
Filing date: 2017-06-29
Publication date: 2020-11-24
Anticipated expiration: 2037-06-29
Also published as: CN107217100A

Abstract

本发明涉及基于DNA酶嵌合引物的核酸筛查生物传感器。本发明通过设计含有DNAzyme序列的通用引物，一次性扩增多个靶标。利用扩增产物中的DNAzyme结构进行核酸比色检测。整个技术操作简便，不依赖昂贵仪器且对操作人员要求低，方法准确无污染，能够有效快速的筛选出核酸分子，可实现对待测样品中的现场快速检测。

Description

基于DNA酶嵌合引物的核酸筛查生物传感器

技术领域

本发明涉及一种生物物种鉴定方法，根据PCR和DNA酶的特性，设计了一种基于DNA酶显色技术的产物识别技术，并依此建立一种快速灵敏的核酸筛查生物传感器。

背景技术

随着生命科学与分析技术的发展，核酸固有的局限性使其检测面临着新的挑战。在生物医学分析及研究中会遇到灵敏度低和特异性差、待检测核酸片段较短或者不能直接扩增等问题，因此，发展核酸探针信号放大检测技术，实现高灵敏、高特异性检测显得尤为重要。下面重点介绍核酸探针与信号放大技术相结合的方法，包括聚合酶链式(PCR)放大技术、滚环(RCA)放大技术、链置换(SDA)放大技术、杂交链反应(HCR)放大技术及DNAzyme信号放大等。PCR是近年来应用最广的分子生物学技术，被广泛用于分子诊断，靶标检测，分子克隆等领域。然而，传统PCR检测技术主要通过琼脂糖凝胶电泳检测，染料检测等方式，不仅需要专业的仪器设备，而且费时费力。PCR复杂的产物识别方法严重妨碍了其应用于快速检测领域。随着功能核酸的发展，许多功能核酸因其独特的结构及其具有的物理化学特性被应用到分子生物学研究中。近年来，功能核酸被用于构建生物传感器，从而开发出多种针对DNA/RNA，重金属，生物毒素等靶标的快速、高效、灵敏的检测技术。

脱氧核酶(DNAzyme)是通过指数富集配体的系统进化技术由体外筛选分离得到的核酸序列，具有剪切RNA分子或DNA分子、T4聚核苷酸激酶样活性、DNA连接酶样活性、催化活性等多种生物催化功能。它具有很高的化学稳定性、造价低廉、容易合成和修饰的优点。DNAzyme已经广泛应用于催化一系列化学和生物反应中。G-四聚体是催化DNAzyme一种。G-四聚体可以和阳离子卟啉如Cu(II)卟啉、Zn(II)卟啉、Fe(III)卟啉等作用，使离子卟啉和鸟嘌呤配位结合。G-四聚体可以作为载体和TMPyP4结合，通过高亲和力核酸适体的靶向识别作用，定向运载到细胞表面，利用在其光照下产生单线态氧，实现对癌细胞的治疗；G-四聚体也可以与血晶素hemin结合，形成G-四聚体/血晶素的复合结构，这种结构具有类似过氧化物酶的催化活性，可以催化过氧化氢H₂O₂氧化，从而使ABTS生成有色产物ABTS^.-，在颜色上呈现无色到绿色的变化，能够快速判断信号放大效果。

发明内容

本发明目的是开发一种基于PCR放大技术和DNAzyme显色技术的生物传感器，达到高通量筛查分子靶标的目标。

本发明通过设计含有DNAzyme序列的通用引物，一次性扩增多个靶标。利用扩增产物中的DNAzyme结构进行核酸比色检测。整个技术操作简便，不依赖昂贵仪器且对操作人员要求低，方法准确无污染，能够有效快速的筛选出核酸分子，可实现对待测样品中的现场快速检测。

为了实现本发明目的，本发明首先提供一种DNA酶(即脱氧核酶，DNAzyme)，其序列为5’-AGGGTTGGGCGGGATGGG 3’(即SEQ ID:NO.1)。

本发明上述DNA酶也可作为通用引物(ue-universal primer)用于多重PCR反应体系或检测转基因成分。

进一步地，本发明还提供用于检测(是否含有)转基因成分的引物组，包括以下任一组引物或几组引物，还包括上述DNA酶(即脱氧核酶，DNAzyme，即SEQ ID:NO.1；作为通用引物)：

第一组引物：

第二组引物：

第三组引物：

本发明还包括含有上述引物组(SEQ ID NO:1-7)的检测装置，所述检测装置包括核酸筛查试剂盒、核酸生物筛查传感器。

本发明核酸生物筛查传感器的设计思路是：首先将DNAzyme序列的互补序列嵌合到PCR特异引物中，DNAzyme序列作为通用引物(ue-universal primer)序列添加到反应中。PCR扩增过程中，通用引物中的DNAzyme序列形成双链DNA片段。由于双链DNAzyme序列无法完成显色反应检测，含有靶标序列的反应体系没有颜色变化。而阴性反应因为含有大量的单链DNAzyme序列，因此能够实现较强的比色反应，反应体系由无色变为绿色，从而区分出阳性扩增样品。

进一步地，为了达到良好的显色效果，上述核酸筛查生物传感器或核酸筛查试剂盒，还含有将所述DNAzyme的3’端删除3个碱基的引物，其核苷酸序列为：5’-AGGGTTGGGCGGGAT 3’(即SEQ ID:NO.8)。

优选地，所述将DNAzyme的3’端删除3个碱基的引物(即SEQ ID:NO.8)与DNAzyme的比例为(1:1)-(5:1)，更优选为1:1(0.2:0.2μM)。

本发明还包括上述引物组(SEQ ID NO:1-7)、检测装置(核酸筛查试剂盒或核酸筛查生物传感器)在检测(是否含有)转基因成分中的应用。

本发明还提供一种基于多重PCR和DNAzyme比色技术筛查转基因成分的方法，包括：

1)待测样品提取DNA；

2)以提取DNA为模板，以上述引物组中的任一组引物或几组引物(SEQ ID NO:2-7)为特异引物，以上述引物组中的DNAzyme作为通用引物或者以上述DNAzyme与所述将DNAzyme的3’端删除3个碱基的引物(即SEQ ID:NO.8)的混合物为通用引物，进行PCR扩增；

优选地，所述将DNAzyme的3’端删除3个碱基的引物(即SEQ ID:NO.8)与DNAzyme的比例为(1:1)-(5:1)，更优选为1:1(0.2μM:0.2μM)；

3)结果判断：反应体系没有颜色变化的为含有转基因；反应体系由无色变为绿色的为不含转基因。

进一步地，所述PCR反应体系如下表所示：

进一步地，所述待测样品含有P35S，tNOS或EPSPS基因。

本发明具有以下优点：

1、首次将DNAzyme应用在多重PCR反应体系中。

2、本传感器的结果判读程序简单快速，适合现场快速诊断。

3、本传感器具有良好的特异性，能够对市售食品的进行有效的核酸诊断分析。

4、本传感器具有良好的灵敏度，检测限为1％。

5、本传感器能够对样品进行样品的高通量筛查检测，可以一次快速检测多个靶标。

附图说明

图1表示实施例1中生物传感器设计原理。

图2表示实施例1中生物传感器优化结果。

图3表示实施例1中生物传感器灵敏度分析结果。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW,Molecular Cloning:a Laboratory Manual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。

实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购买得到的常规产品。

以下所用PCR反应体系：

实施例1

1、实验材料：实验中所用到的靶标为转基因作物，分别为MON87460，MON810，MON87701，MON87705，GT73，MON888302，H7-1，MON89788，J101and TT51-1，均有实验室保存。多重PCR核酸筛查试剂盒购自大连宝生物公司。磷酸缓冲液(10mM磷酸二氢钾，100mM氯化钾，2mM氯化镁，0.003％(v)Triton X-100，pH＝7.0)。储存缓冲液(1.843g磷酸氢二钠，0.933g柠檬酸，100mL，pH 4.0)。

2、基因组提取：按照植物基因组DNA提取核酸筛查试剂盒(天根，北京)进行提取，说明书如下：

(1)取植物干重组织约30mg，加入液氮充分碾磨。

(2)将研磨好的粉末迅速转移到预先装有700μl 65℃预热缓冲液GP1的离心管中(实验前在预热的GP1中加入巯基乙醇，使其终浓度为0.1％)，迅速颠倒混匀后，将离心管放在65℃水浴20min，水浴过程中颠倒离心管以混合样品数次。

(3)加入700μl氯仿，充分混匀，12，000rpm离心5min。注:若提取富含多酚或淀粉的植物组织，可在第3步前，用酚:氯仿/1:1进行等体积抽提。

(4)小心地将上一步所得上层水相转入一个新的离心管中，加入700μl缓冲液GP2，充分混匀。

(5)将混匀的液体转入吸附柱CB3中，12，000rpm离心30s，弃掉废液。(吸附柱容积为700μl左右，可分次加入离心。)

(6)向吸附柱CB3中加入500μl缓冲液GD(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，12，000rpm离心30s，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。

(7)向吸附柱CB3中加入600μl漂洗液PW(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，12，000rpm离心30s，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。

(8)重复操作步骤7。

(9)将吸附柱CB3放回收集管中，12，000rpm离心2min，倒掉废液。将吸附柱CB3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。

(10)将吸附柱CB3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加50-200μl洗脱缓冲液TE，室温放置2-5min，12，000rpm离心2min，将溶液收集到离心管中。

3、引物设计：

通过Primer Express 3.0设计软件(美国生命技术公司)针对转基因产品中的筛选基因P35S，tNOS和EPSPS基因设计PCR引物。

定性PCR所用引物

4、传感器设计

设计思路：核酸筛查传感器首先将DNAzyme序列的互补序列嵌合到PCR特异引物中，DNAzyme序列作为通用引物序列添加到反应中。PCR扩增过程中，通用引物中的DNAzyme序列形成双链DNA片段。由于双链DNAzyme序列无法完成显色反应检测，含有靶标序列的反应体系没有颜色变化。而阴性反应因为含有大量的单链DNAzyme序列，因此能够实现较强的比色反应，反应体系由无色变为绿色，从而区分出阳性扩增样品。

如图1所示，核酸筛查传感器首先将DNAzyme序列的互补序列(图1A圆圈中长链浅色部分)嵌合到PCR特异引物中，DNAzyme序列(图1A圆圈中杂乱短链)作为通用引物序列添加到反应中。PCR扩增过程中，通用引物中的DNAzyme序列形成双链DNA片段。PCR后加入80μL磷酸缓冲液和10μL氯高铁血红素(图1浅色椭圆)，37℃孵育20min，而后加入30μL储存缓冲液即可肉眼观察颜色变化效果。由于双链DNAzyme序列无法完成显色反应检测，含有靶标序列的反应体系没有颜色变化。而阴性反应因为含有大量的单链DNAzyme序列，因此能够实现较强的比色反应，反应体系由无色变为绿色，从而区分出阳性扩增样品。

5、反应体系优化：为了达到良好的显色效果，本发明设计了不同DNAzyme序列长度的通用引物以及通用引物的混合比例。通过优化发现，3’端删除3个碱基的通用引物和原始通用引物混合且混合比例在在(1:1)-(5:1)为佳，尤以1:1(0.2μM:0.2μM)时效果最好。优化后的传感器能够实现分子靶标的肉眼识别。结果见图2；其中，图A1和图A2表示不同通用引物和混合比例的比色值(浅色为优化结果，深色为对应阴性比色结果)；图B表示不同通用引物的比色情况；图C表示不同引物混合比例的比色情况(与图A2相对应)。

6、传感器特异性分析

利用实验室保存的转基因样品和市售食品进行传感器的特异性分析。通过实验室保存的转基因样品和超市购买的食品的检测，充分体现了本传感器的特异性。通过逻辑门的运算可以最终判断出样品中是否含有转基因成分，从而完成多靶标的高通量筛查效果。本发明选取的P35S，tNOS和EPSPS能够覆盖90％商业化的转基因作物，因此能够有效地筛查市场中的转基因成分。结果见下表。

传感器特异性分析

7、传感器灵敏度分析

为了评定传感器的灵敏性，将转基因样品MON87460和MON88302的基因组DNA浓度稀释成6个梯度，100％，50％20％，10％，1％和0.1％，进行通用引物多重PCR和DNAzyme比色研究。结果显示，本传感器可以检测最低1％含量的转基因样品，即180个拷贝数。虽然本传感器的灵敏度没有很大的提高，但是其对于样品的初筛和质量控制依然有很大的应用价值。结果见图3。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 中国农业大学

<120> 基于DNA酶嵌合引物的核酸筛查生物传感器

<130> KHP171113743.8

<160> 8

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

agggttgggc gggatggg 18

<210> 2

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

tcccaacccg ccctacccca tcattgcgat aaaggaaagg c 41

<210> 3

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

tcccaacccg ccctaccctg ctttgaagac gtggttgga 39

<210> 4

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

tcccaacccg ccctacccga atcctgttgc cggtcttg 38

<210> 5

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

tcccaacccg ccctaccctt atcctagttt gcgcgcta 38

<210> 6

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

tcccaacccg ccctacccac ggtgaccgtc ttccagttac 40

<210> 7

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

tcccaacccg ccctacccga acaagcaagg cagcaacca 39

<210> 8

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

agggttgggc gggat 15

Claims

1.用于检测转基因成分的引物组，其特征在于，包括以下三组引物，还包括DNA酶：

第一组引物：

引物ue-CaMV 35S-F：5’-TCCCAACCCGCCCTACCCCATCATTGCGATAAAGGAAAGGC 3’ ；

引物ue-CaMV 35S-R：5’-TCCCAACCCGCCCTACCCTGCTTTGAAGACGTGGTTGGA 3’ ；

第二组引物：

引物ue-NOS-F：5’-TCCCAACCCGCCCTACCCGAATCCTGTTGCCGGTCTTG 3’ ；

引物ue-NOS-R：5’-TCCCAACCCGCCCTACCCTTATCCTAGTTTGCGCGCTA 3’；

第三组引物：

引物ue-CP4-EPSPS-F：5’-TCCCAACCCGCCCTACCCACGGTGACCGTCTTCCAGTTAC 3’ ；

引物ue-CP4-EPSPS-R：5’-TCCCAACCCGCCCTACCCGAACAAGCAAGGCAGCAACCA 3’ ；

DNA酶：

ue-universal primer：5’- AGGGTTGGGCGGGATGGG 3’ 。

2.含有权利要求1所述引物组的检测装置，所述检测装置为核酸筛查试剂盒或核酸生物筛查传感器。

3.根据权利要求2所述的检测装置，其特征在于，还含有一个引物，其核苷酸序列如SEQID: NO.8所示。

4.根据权利要求3所述的检测装置，其特征在于，所述核苷酸序列如SEQ ID: NO.8所示的引物与所述DNA酶的比例为1:1。

5.权利要求1所述引物组或权利要求2-4任一项所述检测装置在检测转基因成分中的应用。

6.一种筛查转基因成分的方法，包括：

1）待测样品提取DNA；

2）以提取DNA为模板，以权利要求1所述引物组为特异引物，以权利要求1所述DNA酶作为通用引物或者以权利要求1所述DNA酶与序列为SEQ ID: NO.8所示引物的混合物为通用引物，进行PCR扩增；

3）结果判断：反应体系没有颜色变化的为含有CaMV 35S，tNOS或CP4-EPSPS基因。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤2）中所述序列为SEQ ID: NO.8所示引物与权利要求1所述DNA酶的比例为1:1。

8.根据权利要求6或7所述的方法，其特征在于， PCR反应体系如下：ddH₂O 16.3μL，10 xmultiplex buffer 2.5μL，2.5mM dNTPs 2μL，10μM Primer-F 1μL，10μM Primer-R 1μL，10x enzyme mix 2.5μL，模板DNA 50-100ng，Total 25μL。