CN108710780B - 一种基于链置换调控e6核酶功能的dna网络构造方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种基于链置换调控E6核酶功能的DNA网络构造方法。该方法依据E6核酶的发卡状二级结构和催化核心保守域序列，通过链置换技术，实现E6核酶功能的调控；利用E6核酶的底物结合臂，添加RNA修饰的DNA底物，形成分支环状结构，构造DNA逻辑计算单元；通过改造DNA逻辑计算单元构造DNA逻辑门；最后连接DNA逻辑门，形成DNA网络。该方法不破坏E6核酶的序列完整性，DNA逻辑计算单元具有结构稳定、可定制、模块化、低泄漏、抗干扰的特点，可以广泛应用于生物计算、DNA纳米结构。
Description
技术领域
本发明属于生物计算领域，涉及DNA链置换技术和DNA核酶，具体涉及一种基于链置换调控E6核酶功能的DNA网络构造方法。
背景技术
随着分子生物学技术的发展，生物计算得到了广泛的关注。近年来，随着链置换技术的应用，生物计算相继实现了生物分子逻辑门、生物分子电路、DNA分子机器等基本计算功能，生物计算逐渐由理论研究进入了实用化研究阶段。目前大多数基于DNA分子的生物计算动态操作均依赖于DNA网络中DNA序列的链交换反应(strand-exchange reaction)，在反应进程中不可避免的存在着诸如泄漏、干扰等现象，难以实现更复杂问题的求解，同时DNA网络的构造难以实现结构可定制的模块化设计，给DNA网络的应用带来了困难。
DNA核酶是一段特定的DNA序列，可以对结合的DNA底物(RNA修饰)进行特异性切割，是一种重要的DNA分子编辑工具，其对底物的切割可以视为是对DNA序列上的信息变换，在DNA网络构造中具有重要应用。目前，在DNA网络逻辑计算单元的构造中，DNA核酶的应用主要有两种方式，一是DNA核酶拼装，即利用碱基互补性质，将不同的DNA序列拼装成DNA核酶，DNA核酶由多条DNA序列构成；二是利用DNA核酶对底物的切割功能，利用切割的底物作为报告链(reporter)，将DNA核酶作为一种结果检测的手段。
在上述两种方式中，DNA核酶序列的拼装破坏了DNA核酶序列的完整性，加重了泄漏和DNA序列之间的干扰，难以实现DNA网络构造的模块化和规模化；后者仅仅是应用于结果检测，未利用DNA核酶本身是DNA序列的特点，DNA核酶未参与逻辑计算单元的功能构造。
发明内容
本发明为解决上述技术问题所采用的技术方案为提供一种基于链置换调控E6核酶功能的DNA网络构造方法。该方法包括以下步骤：
步骤1：依据E6核酶的发卡状二级结构，以E6核酶的催化核心保守域序列为链置换的立足点和域，通过链置换改变E6核酶的发卡状催化核心构型，实现E6核酶功能的调控；
步骤2：在E6核酶发卡状催化核心失活的情况下，添加RNA修饰的DNA底物，构造具有分支环状结构的DNA逻辑计算单元；
步骤3：对具有分支环状结构的DNA逻辑计算单元进行结构定制：修改分支部分的底物DNA序列结构、环状部分中E6核酶的发卡茎环结构以及核酶功能抑制链的DNA序列结构，使之在功能上满足特定逻辑门的输入与输出要求，构造具体的DNA逻辑门；
步骤4：对DNA逻辑门，延长分支环状结构中的分支部分对应的RNA修饰的DNA底物的长度，形成粘性末端，作为下游DNA逻辑计算单元链置换的域，以实现DNA逻辑门的连接，构造出DNA网络。
步骤1中，基于E6核酶构造出的稳定的分支环状结构，该结构在E6核酶催化核心处形成环状结构，在E6核酶底物结合臂处形成分支结构。
步骤2中，在DNA逻辑计算单元的构造中，E6核酶序列保持完整性，不破坏E6核酶的磷酸二酯键。
本发明一种基于链置换调控E6核酶功能的DNA网络构造方法中的DNA逻辑计算单元具有可定制，模块化的特点，易于实现DNA逻辑门的连接，同时具有结构稳定、低泄漏、抗干扰的特点。
附图说明
图1一种基于链置换调控E6核酶功能的DNA网络构造方法流程图。
图2链置换调控E6核酶功能原理示意图。
图3 DNA逻辑计算单元构造方法示意图。
图4 DNA YES逻辑门构造方法示意图。
图5 DNA OR逻辑门构造方法示意图。
图6 DNA AND逻辑门构造方法示意图。
图7 DNA级联网络构造方法示意图。
图8 DNA反馈网络构造方法示意图。
图9 DNA YES逻辑门PAGE电泳检测结果。
图10 DNA YES逻辑门荧光检测结果。
图11 DNA OR逻辑门PAGE电泳检测结果。
图12 DNA OR逻辑门荧光检测结果。
图13 DNA AND逻辑门PAGE电泳检测结果。
图14 DNA AND逻辑门荧光检测结果。
图15 DNA级联网络PAGE电泳检测结果。
图16 DNA级联网络荧光检测结果。
图17 DNA反馈网络PAGE电泳检测结果。
图18 DNA反馈网络荧光检测结果。
具体实施方式
以下结合附图和具体的实施方式对本发明作进一步的说明。
如图1所示，一种基于链置换调控E6核酶功能的DNA网络构造方法流程图。本发明提供一种可定制的模块化DNA网络构造方法。该方法通过链置换调控E6核酶的功能，构造DNA逻辑计算单元，进而构造DNA逻辑门，最终实现DNA逻辑门的连接，构造DNA网络。该方法具体包括以下步骤：
首先基于E6核酶的发卡状功能构型，利用E6核酶催化核心的保守域序列作为链置换的立足点(toehold)，以E6核酶催化核心的发卡茎为链置换的域(domain)，通过链置换实现E6核酶发卡二级结构的构型变换，实现E6核酶功能的调控。如图2，对于E6核酶z，当加入核酶功能抑制链t时，以z的催化核心保守域序列作为立足点(toehold)，发卡茎为域(domain)，通过链置换将z的发卡结构打开，形成双链结构z/t，再将RNA修饰的DNA底物r加入，此时由于z的催化核心构型的变化，E6核酶z不能对底物进行切割—E6核酶失去功能，从而形成稳定的分支环状结构z/t/r；对分支环状结构z/t/r，加入核酶功能激活链i，i通过链置换将核酶功能抑制链t置换出，此时E6核酶序列z中的发卡通过碱基互补再次形成催化核心，E6核酶功能激活，将其结合的底物r切割，切割后片段O脱落—片段O的3’-端为RNA碱基rA，形成输出，底物r的剩余片段形成序列L与E6核酶z互补。此外，可在底物r的两端分别修饰BHQ猝灭基团与荧光基团，用于荧光检测。
其次，构造具有分支环状结构的DNA逻辑计算单元。如图3，由上述链置换调控E6核酶功能的方法，DNA逻辑计算单元的基本构成为分支环状结构，其中中间凸起部分为该结构的环状部分—用于调控E6核酶功能，两侧双链部分为该结构的分支部分—用于实现与下游DNA逻辑门的连接，考虑到DNA逻辑门的连接，底物r的5’-端长度可以定制，以满足下游链置换调控的立足点(toehold)与域(domain)的长度要求。
然后，根据特定逻辑门的输入与输出特点，对分支环状结构中的环状部分的核酶功能抑制链t进行结构定制，构造具体的DNA逻辑门。此处给出3个基本DNA逻辑门的构造方法，但本发明的保护范围不限于以下3个DNA逻辑门。YES逻辑门(图4)为DNA逻辑计算单元的直接应用，由于YES逻辑运算为单输入与单输出，故直接以核酶功能激活链i1为YES逻辑门的输入，当且仅当链i1存在时，逻辑计算单元z1/t1/r1中的链t被置换出来，逻辑计算单元被触发，核酶z1功能激活，切割底物r1，切割后的游离片段o1形成YES逻辑门的输出；对比图3中具有分支环状结构的DNA逻辑计算单元，OR逻辑门(图5)对分支环状结构中的核酶功能抑制链t进行结构定制，在核酶功能抑制链t的3’-端添加新的立足点(toehold)形成新的核酶功能抑制链t2，以满足OR运算的两输入要求，此时核酶功能激活链i2与i3作为OR逻辑门的两个输入，由于链i2和i3均可以通过链置换将核酶功能抑制链t置换出来，所以当链i2和i3中任一链存在时均可以实现核酶功能的激活，切割底物r1，切割后的游离片段o1作为OR逻辑门的输出；AND逻辑门(图6)对图3中的核酶功能抑制链t进行定制—拆分为两条DNA链t3和t4，以满足AND逻辑门的两输入要求，以链i4和i5作为AND门的两个输入，其中链i4可以通过链置换将t3置换出，链i5可以通过链置换将t4置换出，由于核酶z2的功能受限于t3和t4的共同作用，所以只有当链i4和i5同时存在时，核酶z3的功能才能被激活，切割底物r1，切割后的游离片段o1作为AND逻辑门的输出。
最后，基于图3中的分支环状结构，对分支环状结构中的分支部分进行定制，通过延长底物r的5’-端序列，实现DNA逻辑门的连接，并以DNA逻辑计算单元作为基本网络构造模块，构造模块化的DNA网络。此处给出2种基本DNA网络的构造方法，但本发明的保护范围不限于以下2种DNA网络。图7为级联网络的基本构造方法，Unit1和Unit2为两个基本的DNA逻辑计算单元，其中Unit2即为YES逻辑门的直接应用，Unit1对YES逻辑门中的分支部分进行了定制，对比Unit2的右侧分支，Unit1延长了右侧分支中底物r2的5’-端，同时加上了保护链R1(protector R1)。将图7中两个逻辑计算单元Unit1和Unit2作为两个模块混合时，即构成DNA级联网络。该网络以Unit1的输入链i6作为网络的输入，当链i6存在时，该DNA网络被触发：首先链i6触发Unit1，底物r2被核酶z3切割，形成游离片段i1`/R1，然后i1`/R1构成Unit2的输入，触发Unit2，Unit2中的核酶z1切割底物r1形成游离片段o1，游离片段o1即为该级联网络的输出。图8为反馈网络的基本构造方法，Unit1和Unit2为反馈网络中的两个基本的DNA逻辑计算单元，其中Unit1即为图7中的Unit1，Unit2对分支环状结构中的分支部分进行定制——延长了底物的5’-端，形成粘性末端。将图8中两个逻辑计算单元Unit1和Unit2作为两个模块混合时，即构成DNA反馈网络。该网络以Unit1的输入链i6作为网络的输入，当链i6存在时，该DNA网络被触发：首先链i6触发Unit1，底物r2被核酶z3切割，形成游离片段i1`/R1，然后i1`/R1构成Unit2的输入，触发Unit2，Unit2中的核酶z1切割底物r1形成游离片段i6`，游离片段i6`继续作为Unit1的输入，实现Unit2对Unit1的反馈，构成反馈网络，该反馈网络的输出为i1`/t1。
本发明的有益效果通过以下实验(实施例)进一步的说明。
实施例中的DNA序列、RNA修饰的DNA底物购自上海生工，其中DNA序列经过PAGE纯化，RNA修饰的DNA序列经过HPLC纯化，荧光修饰底物的位置为3’-端BHQ修饰，5’-端FAM修饰。实施例中的分子序列见表1。
实施例中应用的试剂为：EDTA2Na、Tris、冰乙酸、醋酸镁、过硫酸铵、聚丙烯酰胺、N,N'-甲叉双丙烯酰胺、四甲基乙二胺和Stains all。1×TAE/Mg2+缓冲液：40mmol/L Tris，20mmol/L乙酸，1mmol/L EDTA2Na，12.5mmol/L醋酸镁,pH＝8.0。浓度为40％的丙烯酰胺母液：190g丙烯酰胺和10g N,N'-甲叉双丙烯酰胺，37℃水溶后,加去离子水定容至500mL。
所有DNA链及RNA修饰的DNA链经Nanodrop 2000分光光度计(Thermo FisherScientific Inc.USA)进行浓度测定。荧光信号采用实时荧光PCR仪(Agilent，G8830A)检测，最大吸收波长为550nm，最大发射波长为564nm。
所有DNA逻辑计算单元通过两次退火制备：首先将核酶功能抑制链与E6核酶在1×TAE/Mg2+缓冲液中混合进行第一次退火(95℃4分钟，65℃30分钟，50℃30分钟，37℃30分钟，22℃30分钟，20℃保存)，然后加入RNA修饰的底物，20℃下经过4小时的常温退火。链置换反应条件为1×TAE/Mg2+缓冲液，20℃2小时。荧光检测条件为1×TAE/Mg2+缓冲液，25℃。
实施例的结果检测分别采用PAGE凝胶电泳和荧光信号检测两种方式。
表1实施例中用到的DNA序列
实施例1 DNA YES逻辑门
根据图4中DNA YES逻辑门的构造方法，图9给出YES逻辑门的PAGE凝胶电泳结果分析，由泳道1与泳道2的对比，由序列z1、t1、r1组成的YES逻辑门能够稳定生成，泳道3显示了E6核酶对RNA修饰底物r1的切割效果，当加入逻辑门触发链i1时，YES逻辑门给出正确的输出—链o1(泳道5)。图10为对应YES逻辑门的荧光检测结果，对比没有输入时(Input＝0)的荧光信号强度，YES逻辑门在有输入(Input＝1)情况下，荧光信号强度得到大幅度增强(Output＝1)，说明YES逻辑门能够对输入做出正确的响应。
实施例2 DNA OR逻辑门
根据图5中DNA OR逻辑门的构造方法，图11为OR逻辑门的PAGE凝胶电泳结果分析，通过对比泳道1和泳道2可知，由序列z1、t2、r1组成的OR逻辑门能够稳定生成，当加入触发链i2(泳道5)和i3(泳道6)时，OR逻辑门均能正确输出，同时当两个输入链均存在时，OR逻辑门亦能做出正确的响应(泳道7)。图12为OR逻辑门的荧光检测结果，对比没有输入的情况(Input＝00)，OR逻辑门在任意输入存在时(Input＝10、01、11)，荧光信号强度均大幅增强(Output＝1)，说明OR逻辑门对OR运算的四种输入均能给出正确的计算结果。
实施例3 DNA AND逻辑门
根据图6中DNA AND逻辑门的构造方法，图13为AND逻辑门的PAGE凝胶电泳结果分析，比较泳道1与泳道2的电泳带，由序列z2、t3、t4、r1组成的AND逻辑门能够稳定生成，当AND门没有输入(泳道1)、只有输入i4(泳道3)或只有输入i5(泳道5)时，E6核酶z2不能切割底物，即此时没有输出，当两个输入链i4和i5同时存在时(泳道5)，E6核酶z2能够切割底物，此时AND门的输出为1。图14为AND逻辑门的荧光检测结果，当AND逻辑门的两个输入均存在时(Input＝11)，荧光信号强度大幅增强(Output＝1)，而对其余输入情况(Input＝00，01,10)，荧光信号强度剧烈减弱(Output＝0)，说明AND逻辑门对AND运算的四种输入均能给出正确的计算结果。
实施例4 DNA级联网络
根据图7中DNA级联网络的构造方法，图15为DNA级联网络的PAGE凝胶电泳结果分析，泳道2和泳道4中的电泳条带说明该网络中两个逻辑计算单元Unit1和Unit2能够稳定生成，逻辑计算单元Unit1对于输入链i6能够做出正确响应(泳道3)，逻辑计算单元Unit2对于输入链i6不能做出响应(泳道5)，说明了逻辑计算单元Unit2的稳定性和抗干扰性，但是逻辑计算单元Unit2能够对Unit1的输出做出响应(泳道6)，说明了Unit2对于输入的敏感性，泳道7中稳定存在的两条电泳带说明Unit1和Unit2混合时彼此不干扰，说明了本发明中逻辑计算单元构造的稳定性和抗干扰性，泳道8为Unit1与Unit2级联构成DNA级联网络时对网络输入链i6的响应，对比泳道7，泳道8中两个逻辑计算单元对应的电泳带均下移，说明该DNA级联网络能够对网络的输入做出正确的响应。图16为DNA级联网络的荧光检测结果，当Unit1和Unit2混合，在没有输入时(No Input)，荧光信号强度弱，当有输入时(Input)，荧光信号强度显著增加，说明该DNA级联网络在没有输入时，能够保持稳定的初始状态，同时能够对网络输入做出显著的响应。
实施例5 DNA反馈网络
根据图8中DNA反馈网络的构造方法，图17为DNA反馈网络的PAGE凝胶电泳结果分析，泳道2和泳道4中的电泳带显示出该反馈网络中两个逻辑计算单元Unit1和Unit2能够稳定生成，泳道3说明Unit1能够对输入链i6做出正确的响应，而Unit2对i6未做出响应(泳道5)，说明了Unit2的稳定性，但Unit2对Unit1的输出能够做出正确响应(泳道6)，说明了Unit2对输入的敏感性，泳道7的电泳带分布显示出Unit1和Unit2组成的反馈网络的初始状态的稳定性——两个逻辑计算单元之间不产生干扰，对比泳道7，泳道8显示了该反馈网络对网络输入i6的正确响应。图18为DNA反馈网络的荧光信号检测结果，由于反馈作用是一种相互加强的反应，轻微的泄漏均会导致荧光信号强度达到饱和，但是当该反馈网络没有输入时(No Input)，荧光信号强度没有达到饱和，说明了该反馈网络的稳定性和抗干扰性，当有输入时(Input)，网络的荧光信号强度达到饱和，说明该反馈网络对输入做出了正确的响应。
本发明与现有技术方法相比具有以下优点：
1、不破坏E6核酶的磷酸二酯键，保持E6核酶DNA序列的完整性，可以避免DNA核酶多条DNA序列拼装中的序列干扰问题；
2、DNA逻辑计算单元将计算操作与作为信号输出的底物形成稳定的分支环状结构，可以有效降低链交换反应中的泄漏，提高网络构造的稳定性；
3、可定制的DNA逻辑门构造，可以实现模块化的DNA网络构造。
序列表
<110> 大连大学
<120> 一种基于链置换调控E6核酶功能的DNA网络构造方法
<160> 19
<170> SIPOSequenceListing 1.0
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<400> 19
gacggtacta t 11
Claims (2)
1.一种基于链置换调控E6核酶功能的DNA网络构造方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
步骤1：依据E6核酶的发卡状二级结构，以E6核酶的催化核心保守域序列为链置换的立足点和域，通过链置换改变E6核酶的发卡状催化核心构型，实现E6核酶功能的调控；
步骤2：在E6核酶发卡状催化核心失活的情况下，添加RNA修饰的DNA底物，构造具有分支环状结构的DNA逻辑计算单元，该分支环状结构在E6核酶催化核心处形成环状结构，在E6核酶底物结合臂处形成分支结构；
步骤3：对具有分支环状结构的DNA逻辑计算单元进行结构定制：根据特定逻辑门的输入与输出特点，对分支环状结构中的环状部分的核酶功能抑制链t进行结构定制，构造具体的DNA逻辑门，具体的逻辑门有三种，分别为YES逻辑门、OR逻辑门、AND逻辑门；
步骤4：对DNA逻辑门，延长分支环状结构中的分支部分对应的RNA修饰的DNA底物的长度，形成粘性末端，作为下游DNA逻辑计算单元链置换的域，以实现DNA逻辑门的连接，构造出DNA网络。
2.如权利要求1所述的一种基于链置换调控E6核酶功能的DNA网络构造方法，其特征在于，在DNA逻辑计算单元的构造中，E6核酶序列保持完整性，不破坏E6核酶的磷酸二酯键。
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2018
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