CN111276186B - 基于Mg2+调控的E6型核酶识别臂驱动DNA电路的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了基于Mg²⁺调控的E6型核酶识别臂驱动DNA电路的方法，其具体为：在Mg²⁺的控制下，E6型核酶的构象发生变化，被碱基分隔在两端的识别臂可以实现连续的DNA链的功能，与带有toehold的DNA双链底物杂交，进行链置换反应，从而输出信号。首先，使用Mg²⁺作为开关，利用E6型核酶识别臂的变构建立基本的DNA逻辑门。其次，将逻辑门进行组合级联，构建双层级联电路。最后，对双层级联电路进行优化改进，设计DNA自催化电路。该方法拓展了E6型核酶的功能，优化了其在逻辑计算中产生信号的速度。本发明为实现更复杂的逻辑计算提供了新思路，并为检测和生物传感探索了新的方向。

Description

基于Mg2+调控的E6型核酶识别臂驱动DNA电路的方法

技术领域

本发明涉及DNA计算领域，具体涉及一种基于DNA链置换和DNA核酶技术的DNA分子逻辑电路及其构建方法。

背景技术

由于DNA分子独特的可编程性和并行性，使得DNA计算在纳米技术领域中占有重要地位。而各种逻辑运算器件在DNA计算有很大的应用潜力。DNA核酶的出现使得逻辑运算领域的成果更加多样。由于DNA核酶具有高度特异性和催化效能，通常作为DNA链切割工具参与DNA计算反应，为DNA计算领域提供了技术支持。目前，DNA核酶参与构建了各种逻辑电路，包括逻辑运算电路，组合级联电路，反馈电路和催化循环电路等，实现不同复杂性的分子信息处理。

在常见的DNA核酶参与构建的逻辑电路中，DNA核酶的作用是切割特定的且由RNA修饰的DNA单链来完成信号的产生和传输，其反应条件繁琐，功能单一。

发明内容

为了简化反应条件，拓展DNA核酶在电路中的功能，采用更直接的方法来实现信号输送，在Mg²⁺的控制下，E6型核酶的构象发生变化，被碱基分隔在两端的识别臂可以实现连续DNA链的功能，与带有toehold的DNA双链底物杂交，进行链置换反应，从而输出信号，这改善了依赖DNA核酶切割产生输出信号的单一模式，同时优化了信号传递的效率。

为实现上述目的，本申请的技术方案为：基于Mg²⁺调控的E6型核酶识别臂驱动DNA电路的方法，其具体实现步骤为：

首先，基于在Mg²⁺的控制下，使E6型核酶的构象发生变化，被碱基分隔在两端的识别臂变得连续，实现对E6型核酶功能的调控，如图2所示。

然后，根据具体DNA逻辑门的输入与输出特点，对特异性底物进行结构调整，构造具体的DNA逻辑门，此处给出3个基本DNA逻辑门的构造方法；YES逻辑门为E6型核酶识别臂构象变化计算原理的直接应用，在Mg²⁺的作用下，识别臂t和d变得连续，与特异性双链底物d0/t*d*发生杂交，以t*为基板结合，最终释放出荧光修饰的链d0；无Mg²⁺存在时，E6型核酶不会发生构象变化，识别臂t和d无法相遇，反应不能进行，具体的实现步骤如图3A所示；对比YES逻辑门，OR逻辑门将特异性底物的toehold进行了改进，使底物两端都有E6型核酶识别臂的结合位点，输入链E10和E20能分别从特异性底物d0/t*d*b*的两端置换链d0，实现信号传递；无Mg²⁺存在时，E6型核酶不会发生构象变化，反应不能进行，计算过程如图4A所示；在OR逻辑门的基础上，延长特异性底物，来实现AND逻辑门运算。输入信号为E1和E2，特异性底物d1d2/t1*d1*d2*t2*只有在两输入都存在的情况下，与输入链杂交释放出荧光信号链d1d2；无Mg²⁺存在时，E1和E2无法完成置换过程，如图5A所示。

接着，把YES逻辑门的特异性底物toehold一侧延长三个碱基长度，便于其在完成YES逻辑门的运算以后与下一级YES逻辑门级联，降低反应中的泄漏。第二级YES逻辑门的输入酶Eab暂时处于失活状态，由第一级逻辑门的输出激发其活性，接着进行第二级YES逻辑门的反应；运用同样的原理，设计了YES逻辑门和AND逻辑门的级联，第一层YES逻辑门释放出信号链V，释放E6型核酶P*R*，P*R*与T*Q*一起完成第二级AND逻辑门反应，释放最终的输出信号Unite3，实现YES-AND级联电路，以上过程分别如图6A、7A所示。

最后，利用组装核酶的原理，结合本发明所提出的方法，构建了DNA自催化电路。过程如图8A所示，输入链为R*T*，与Z1Y1和Z2Y2组装成E6型核酶，参与到反应中。与其他的DNA链进行置换等一轮反应以后，又能生成R*T*，实现电路的自催化。

本发明由于采用以上技术方案，能够取得如下的技术效果：

1、本发明利用Mg²⁺对E6型核酶构象变化的调控作用，用其作为电路的开关调节输出信号强度；

2、本发明丰富了原始E6型核酶必须切割以生成引发下游反应的链的单一方式，增加了E6型核酶传输信号的方法，拓展了E6型核酶在电路中的功能。这样既降低了操作难度和复杂度，又提高了E6型核酶在生化反应中的效率；

3、本发明将特异性底物修饰的RNA由其他DNA碱基所取代，在一定程度上降低了逻辑电路的成本。

附图说明

图1为本发明的实现流程图；

图2为E6型核酶识别臂构象变化示意图；

图3为YES逻辑门及实验结果；

图4为OR逻辑门及实验结果

图5为AND逻辑门及实验结果

图6为YES-YES级联电路及实验结果

图7为YES-AND级联电路及实验结果

图8为DNA自催化电路及实验结果

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施中的技术方案进行清楚、完整的描述，可以理解的是，所描述的实例仅仅是本发明的一部分实例，而不是全部的实施例。基于本发明的实施例，本领域的技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明的保护范围。

实施例中所使用的的所有DNA链均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。没有修饰的DNA链通过PAGE纯化，带有荧光团和猝灭团修饰的DNA链用高效液相色谱法(HPLC)纯化。实施例中的分子序列见表1。所有DNA链按照说明书加入相应的纯水配成100uM作为原液,使用Nanodrop2000进行浓度测定，在波长260nm处记录数据。具体实例中的链是通过在缓慢退火的过程中混合几种DNA链而形成的。按照实例所需要的比例将DNA链加入1xTAE/Mg²⁺缓冲液(40mM的Tris醋酸盐，20mM冰乙酸，2mM的EDTA2Na.2H₂O，12.5mM的(Mg(AC)₂)4H₂O，pH8.0),无Mg离子实验中DNA链加入1xTAE/无Mg²⁺缓冲液(40mM的Tris醋酸盐，20mM冰乙酸，2mM的EDTA2Na.2H₂O，pH8.0)，DNA链添加至终浓度为8uM，溶液总体积50uL。将混合物在95℃下反应5分钟，接着每分钟温度下降0.5℃，146个循环后，温度降至22℃，完成退火。随后，将逻辑结构加入EP试管中，放入PCR中25℃反应，根据实例不同调整反应时长。

实施例的结果检测分别采用PAGE凝胶电泳和荧光信号检测两种方式。电泳检测中，泳道所点的溶液浓度为1uM,反应体系30uL，即系统点样量为30p。溶液环境根据实例需求有1xTAE/Mg2+缓冲液和1xTAE/无Mg2+缓冲液。实例所用的电泳仪是北京六一公司的DYY-6D型电泳仪器。将实例的逻辑电路和所需的对比道分别加入EP管中，在25℃下反应一小时以上。反应结束的溶液混合60％的甘油6uL。恒定电压70v，电泳时长2小时40分钟。实验中采集没有输入链的溶液荧光强度作为初始点，接着加入输入链，并持续记录荧光强度变化，采样间隔从6s到2min不等。荧光实验所用仪器为实时荧光定量PCR(安捷伦Mx3005P)。

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实施例1 YES逻辑门

根据图3A中YES逻辑门的构造方法，图3B给出YES逻辑门的PAGE凝胶电泳结果分析，当加入逻辑门触发酶E6时，YES逻辑门给出正确的输出——Unit1(L4，8，12)。图3C为对应YES逻辑门的荧光检测结果，对比没有输入时(Input＝0)的荧光信号强度，YES逻辑门在有输入(Input＝1)情况下，荧光信号强度得到大幅度增强(Output＝1)，说明YES逻辑门能够对输入做出正确的响应。图3D为Mg²⁺浓度对输出信号强度的影响，随着Mg²⁺浓度的增加，荧光强度也逐渐增加。

实施例2 OR逻辑门

根据图4A中OR逻辑门的构造方法，图4B为OR逻辑门的PAGE凝胶电泳结果分析，当加入触发链E10(L5)和E20(L6)时，OR逻辑门均能正确输出，同时当两个输入链均存在时，OR逻辑门亦能做出正确的响应(L7)。图4C为不添加Mg²⁺的胶片，此时OR逻辑门中的DNA链没有结合，不能做出正确的响应。图4D为OR逻辑门的荧光检测结果，对比没有输入的情况(Input＝00)，OR逻辑门在任意输入存在时(Input＝10、01、11)，荧光信号强度均大幅增强(Output＝1)，说明OR逻辑门对OR运算的四种输入均能给出正确的计算结果,OR逻辑门能够稳定生成。图4D为Mg²⁺浓度对输出信号强度的影响，随着Mg²⁺浓度的增加，荧光强度也逐渐增加。

实施例3 AND逻辑门

根据图5A中AND逻辑门的构造方法，图5B为AND逻辑门的真值表，图5C为AND逻辑门的PAGE凝胶电泳结果分析，当AND门没有输入(L3)、只有输入E1(L4)或只有输入E2(L5)时，此时没有输出(L7)，当两个输入链E1和E2同时存在时(L6)，AND门的输出为1。图5D为AND逻辑门的荧光检测结果，当AND逻辑门的两个输入均存在时(Input＝11)，荧光信号强度大幅增强(Output＝1)，而对其余输入情况(Input＝00，01，10)，荧光信号强度变化微弱(Output＝0)，说明AND逻辑门对AND运算的四种输入均能给出正确的计算结果。图5E为Mg²⁺浓度对输出信号强度的影响，随着Mg²⁺浓度的增加，荧光强度也逐渐增加。

实施例4 YES-YES级联电路

根据图6A中YES-YES级联电路的构造方法，图6B为YES-YES级联电路的PAGE凝胶电泳结果分析，对比输出信号(L7)，逻辑计算电路对于输入链Emn能够做出正确响应(L9)，而没有输入链时，电路没有做出响应(L10)，说明该DNA级联网络能够对网络的输入做出正确的响应。图6C为DNA级联网络的荧光检测结果，在没有输入时(NoInput)，荧光信号强度弱，当有输入时(Input)，荧光信号强度显著增加，说明该YES-YES级联电路在没有输入时，能够保持稳定的初始状态，同时能够对网络输入做出显著的响应。图6D为Mg²⁺浓度对输出信号强度的影响，随着Mg²⁺浓度的增加，荧光强度也逐渐增加。

实施例5 YES-AND级联电路

根据图7A中YES-AND级联电路的构造方法，图7B为逻辑电路的真值表，图7C为PAGE凝胶电泳结果分析，当YES-AND级联电路没有输入(L6)、只有输入EZ1Z2(L7)或只有输入ET*Q*(L8)时，此时没有输出信号(L10)，当两个输入链EZ1Z2和ET*Q*同时存在时(L9)，逻辑电路的输出为1。图7D为YES-AND级联电路的荧光检测结果，当级联电路的两个输入均存在时(Input＝11)，荧光信号强度大幅增强(Output＝1)，而对其余输入情况(Input＝00，01，10)，荧光信号强度变化微弱(Output＝0)，说明该YES-AND级联电路对输入做出了正确的响应。图7E为Mg²⁺浓度对输出信号强度的影响，随着Mg²⁺浓度的增加，荧光强度也逐渐增加。

实施例6 DNA自催化电路

根据图8A中DNA自催化电路的构造方法，图8B为DNA自催化电路的荧光检测结果，当DNA自催化电路的输入R*T*存在时，荧光信号强度大幅增强(Figure8B,curve2)，而对没有输入的情况，荧光信号强度变化微弱(Output＝0)，说明DNA自催化电路对输入做出了正确的响应。图8C为Mg²⁺浓度对输出信号强度的影响，随着Mg²⁺浓度的增加，荧光强度也逐渐增加。

本申请提出了一种可通用的模块化DNA电路构造方法。该方法通过Mg²⁺调控E6型核酶的构象变化，构造DNA逻辑门，接着实现DNA逻辑门的连接，构造DNA级联电路。该方法中的DNA逻辑门具有可通用，模块化的特点，易于实现DNA逻辑门的连接，为大规模级联电路的构建提供了技术支持，同时具有结构稳定、低泄漏、抗干扰的特点。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，并不用于限制本发明，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和变型，这些改进和变型也应视为本发明的保护范围。

Claims (2)

1.基于Mg²⁺调控的E6型核酶识别臂驱动DNA电路的方法，其特征在于：信号传输方式中使用Mg²⁺作为信号开关，信号产生方式为E6型核酶的识别臂去发生链置换反应，输出信号为E6型核酶的特异性底物释放DNA链；具体实现步骤如下：

步骤1：溶液中处于单链状态的E6型核酶，在Mg²⁺的调控下，发生构象变化，被碱基分隔在两端的识别臂相遇从而变得连续；

步骤2：通过调整E6型核酶特异性底物的结构来构建不同的逻辑计算单元，使之满足逻辑计算的输入与输出要求，构造DNA逻辑门；

步骤3：对单个的DNA逻辑门，延长特异性底物，在另一侧形成粘性末端，作为下游DNA逻辑计算单元发生链置换的domain域，实现DNA逻辑门的级联，从而形成逻辑电路；

步骤2构建不同的逻辑计算单元，具体实现方法为：YES逻辑门在Mg²⁺的作用下，识别臂t和d变得连续，与特异性双链底物d0/t*d*发生杂交，以t*为基板结合，最终释放出荧光修饰的链d0；OR逻辑门将特异性底物的toehold进行了改进，使底物两端都有E6型核酶识别臂的结合位点，输入链E10和E20能分别从特异性底物d0/t*d*b*的两端置换链d0，实现信号传递；在OR逻辑门的基础上，延长特异性底物，来实现AND逻辑门运算，输入信号为E1和E2，特异性底物d1d2/t1*d1*d2*t2*只有在两输入都存在的情况下，与输入链杂交释放出荧光信号链d1d2；

把YES逻辑门的特异性底物toehold一侧延长三个碱基长度，便于其在完成YES逻辑门的运算以后与下一级YES逻辑门级联，第二级YES逻辑门的输入酶Eab暂时处于失活状态，由第一级逻辑门的输出激发其活性，接着进行第二级YES逻辑门的反应；

YES逻辑门和AND逻辑门的级联具体过程为：第一层YES逻辑门释放出信号链V，释放E6型核酶P*R*，P*R*与T*Q*一起完成第二级AND逻辑门反应，释放最终的输出信号Unite 3，实现YES-AND级联电路。

2.根据权利要求1所述基于Mg²⁺调控的E6型核酶识别臂驱动DNA电路的方法，其特征在于：步骤S3中构建了DNA自催化电路，过程为：输入链为R*T*，与Z1Y1和Z2Y2组装成E6型核酶，参与到反应中，与其他的DNA链进行下一轮反应以后，又能生成R*T*，实现电路的自催化。

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